治疗性抗体的生产过程中，不同理化因素导致的翻译后修饰（post-translationalmodification，PTM）增加了抗体结构和功能上的异质性。在蛋白质的众多翻译后修饰中，糖基化（glycosylation）是非常重要的一种。糖基化的位点、糖型种类及丰度都可能影响分子的稳定性以及在体内与Fc受体的相互作用，从而影响产品的有效性、安全性和质量稳定性。因此糖基化被普遍认为是单抗药物的关键质量属性之一。绝大部分单抗由CHO、SP2/0和NS0细胞表达，N-糖基化是最普遍的糖基化形式。通常在内质网进行核心糖化，即用寡糖基转移酶（oligosaccharyltransferase，OST）催化，将一段预先合成好的糖链（核心糖链）转移到目的蛋白Asn-X-（Ser/Thr）序列中的Asn上，其中X代表除Pro外的任何氨基酸。在IgG型抗体中，这种基序主要位于重链的CH2-结构域，并且大多抗体的糖基化位点只在重链Fc上的约N297位（西妥昔除外）。图 1 IgG基本结构A：红色表示N297糖基化位点；B：hIgG-Fc晶体结构以及N糖基化结构[1]N-糖的结构真核细胞中，N糖基化主要在内质网(ER)和高尔基体中合成 [2]。这两个细胞器中共有几十种功能不同的糖基转移酶和糖苷酶，它们依次对不断增长的寡糖进行修饰。在内质网的早期合成中N-糖基化都是保守的，其核心结构是由3个甘露糖（Man）和2个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）组成的五糖分子核心结构（asn-GlcNAc2Man3-）。在后续的加工过程中，通过在核心结构上添加一些其他末端的糖残基进一步延长，增加了糖基化的异质性。根据添加岩藻糖（Fuc）、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖（Gal）和唾液酸（Sia）等单糖的数量及排列顺序、分叉方式不同可以将主要糖型分为图2中的几种形式。图2 治疗型抗体的主要N-糖基化类型糖基化对抗体属性的影响单克隆抗体上的N-聚糖结构对维持抗体构象和稳定性有重要的作用，从而影响其与Fcγ受体的结合亲和力，进而导致免疫效应器功能变化[3]。抗体的Fc端的糖基化修饰位点通常是Fc受体（ADCC机制）和C1q(CDC机制)的结合位点，通过对糖基化的调整可以增加Fc受体和C1q与抗体的结合，从而增加抗体ADCC和CDC活性。IgG-Fc晶体结构显示寡糖被包裹在两个CH2结构域内，糖型结构和Fc结构域存在多个疏水性相互作用，糖基化修饰还可以阻碍蛋白酶与抗体的结合，从而增加抗体的稳定性。通过点突变去除Fc结构域的糖基化位点，会发现CH2构域会稍微扩大，并在热加速实验中表现为更敏感且容易聚集，并且其ADCC和CDC效应消失，对蛋白酶敏感性增强而不稳定。抗体的糖基化修饰中，对抗体的Fc功能及PK/PD有重大影响的聚糖包括甘露糖（Man）、岩藻糖（Fuc）、唾液酸（Sia）和半乳糖（Gal）。其中，高唾液酸化修饰对抗体PK有显著影响。无唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoproteinreceptor, ASGPR）通过结合糖蛋白的末端半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺，可通过内吞作用介导糖蛋白的降解而降低糖蛋白的半衰期，当糖蛋白的糖链在半乳糖修饰终止时或去唾液酸化后，则其便可以被无唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）识别，从而导致半衰期的大幅减少。而高唾液酸化后红细胞生成素（erythropoietin, EPO）等糖蛋白可避免其半乳糖暴露从而延长其半衰期。同时也有研究表明高唾液酸化修饰可通过影响抗体空间构象而延长半衰期[4]。高唾液酸化IgG有助于提高抗炎效应。由人血分离的天然抗体制备而成的静注人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）中，可起到抗炎作用的成分主要是其中含有高唾液酸的组分，Anthony 等进一步证明其主要发挥作用的组分为具有高唾液酸化N-糖的Fc，若用唾液酸酶去除IVIG的唾液酸，IVIG则完全失去抗炎作用。高唾液酸化使Fc结构变得更为紧密，使其与FcγR的结合力变弱，与一种免疫负调节的受体DC-SIGN（dendritic cell-specific intercellularadhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN）结合力则变强，从而起到抗炎作用，上调免疫细胞表面抑制型FcγRIIb受体的表达从而起到抗炎作用[5]。2020年被强生65亿美元收购的生物科技公司MOMENTA，就基于其高唾液酸化平台来增加唾液酸化修饰用于增强促炎作用或者延长半衰期，其中M254为MOMENTA开发的高唾液酸化修饰的IVIg（tetra-Fc-sialylated IVIg，s4 IVIg），通过体外糖基化工具处理大大提高唾液酸修饰含量，经酶体外处理后，s4 IVIG的比例提高到99%以上。促炎作用显著增加，显示出了巨大的临床潜力，目前M254用于治疗ITP的Ⅰ、Ⅱ期临床试验已完成（NCT03866577）。在K/BxN小鼠血清诱导的关节炎、胶原抗体诱导的关节炎、ITP和获得性大疱性表皮松解症4种独立疾病小鼠模型中，s4 IVIg都显示出10倍于普通IVIg的抗炎活性，该研究证实了通过增加IgG唾液酸化来提高IVIg的抗炎作用是可行的[6]。高唾液酸化修饰在提高促炎作用的同时，并没有改变IVIG的组成、药代动力学和组织分布等属性。末端半乳糖基对抗体效应功能的影响目前了解得相对较少。有研究表明CDC效应是由补体蛋白C1q与IgG抗体Fc段结合后引发，末端半乳糖含量增加可以提高CDC效应，采用糖苷酶处理去除半乳糖基可以减少补体的溶解活性。还有研究表明，末端半乳糖化可诱导CH2结构域构象变化，导致其结合的FcγR增加；高半乳糖和去岩藻糖改造的抗体其ADCC活性较未改造前增加78倍；提高的半乳糖化可能导致Fc段CH2结构域之间空间距离增大，暴露出更多的氨基酸序列与FcγRⅢa结合。因此，综合以上研究基本表明末端半乳糖可以提高CDC效应，但目前CHO细胞表达的抗体其末端半乳糖化水平普遍较低，尚未有提高半乳糖化水平的工程细胞株报道[7]。生产工艺对单抗产品糖基化的影响抗体类药物的糖基化修饰对抗体的产品质量至关重要，因此需要对糖型表征及调控深入理解，并确保在生产过程中对其进行严格的控制。影响治疗性抗体糖链构型的因素众多，其中CHO细胞由于生长旺盛，能够提供与人类细胞相似的糖基化模式而被广泛使用。不过CHO细胞株在唾液酸和半乳糖之间的连接方面与人类细胞不同，因为CHO细胞缺乏α-2，6唾液酸转移酶，只产生α-2，3-连接的唾液酸化多糖，而人类细胞同时产生α-2，3-和α-2，6-连接的唾液酸化多糖，而更偏爱后者。缺乏α-2，6-唾液酸转移酶会导致唾液酸化不足，影响抗体分子的循环寿命。另一个显著的区别是没有功能性的GnTIII酶来阻止GlcNAc的残基的添加。除了宿主细胞株外，发酵过程中可能影响治疗性抗体最终糖链模式的其他参数包括葡萄糖含量、溶解氧、生物反应器pH、丁酸钠、氨含量、二氧化碳浓度、温度等。下图总结了不同培养操作条件的影响[8]。传统方法学的不足以及体外糖基化工具的优势抗体糖基化修饰的复杂性给抗体活性的评估也带来了难度，这体现在半乳糖基化修饰及唾液酸化修饰对单抗生物学活性影响研究的文献中的结论往往存在争议。有文献报道，不同的半乳糖基水平不影响ADCC活性，然而也有研究中观察到了半乳糖基化水平和FcγRIIIA结合之间的正相关。一些研究表明末端唾液酸会影响Fcγ受体的结合和抗炎活性或通过降低了对FcγRIIIA结合活性降低ADCC活性，然而，还有一些研究表明唾液酸对FcγR相互作用没有影响。单抗糖型的复杂性以及不同糖型之间对生物学活性影响的权重不同而存在相互消补，可能是引起这些争议的原因。由于抗体糖基化翻译后修饰的复杂性，以及传统方法中通过采用工程化细胞株优化生产工艺来调整糖型，往往会导致糖基化过程中产生不必要的变异，而不能获得预期的糖型，以及在工艺放大的过程中，参数的调整往往会导致蛋白质糖型产生不必要的差异化，因此传统方法优化糖型成本高、周期长，还有可能要在产量之间进行取舍。罗氏诊断体外糖基化工具（In Vitro Glycoengineering，IVGE）的出现为上述难题提供了解决方案。使用IVGE，样本本身可能仍表现出糖基化修饰异质性，但可以引入选择性更改，例如从低水平转换为高水平的半乳糖基化修饰。该技术中针对不同糖基化修饰的转变采用不同的糖基转移酶，IVGE通过使用诸如唾液酸酶或半乳糖苷酶的糖苷酶，可以很容易地实现末端聚糖的切割，或者活化的糖（例如CMP-NANA，UDP-GAL）和特定酶（例如siallyl-或Galactosylancosylancsylancsylansferase）实现末端聚糖的添加。该技术可以有机整合到下游纯化工艺中，而不需要多细胞培养工艺进行调控。长久以来，由于糖基转移酶（IVGE的基本试剂）产量不足且质量不高，IVGE未能广泛应用，直到罗氏诊断与罗氏制药共同开发了唾液酰转移酶和半乳糖基转移酶，才使得生物制药行业能够使用IVGE来显著改善治疗蛋白的糖基化谱。罗氏研究人员通过使用IVGE，采用同一批样品对其末端对聚糖结构的处理，获得低半乳糖基化修饰的G0F、高半乳糖基化修饰G2F和高唾液酸化修饰的G2S1F和G2S2F样品，通过SPR、FcγR亲和柱层析和ADCC活性测定进行生物学活性测定。结果表明，高半乳糖基化修饰和高唾液酸化修饰对FcγRI结合没有影响；高半乳糖基化修饰和高唾液酸化修饰倾向于增加与FcγRIIA_R131的结合，末端半乳糖基化修饰的存在增加了FcγRIIIA_V158结合并因此增强了ADCC活性，而末端唾液酸化修饰含量的变化对ADCC活性没有影响[9]。罗氏诊断开发的体外糖基化工具，已经证明可以将糖型优化与发酵参数独立分开，从而对每种糖型进行更大的控制采纳体外糖基化工艺，特定糖型的富集在独立于细胞培养之外的下游工艺。使用IVGE可以在体外为治疗性蛋白添加半乳糖和唾液酸，从而能够更好地控制并产生更均一的糖型，实现更快的开发以及对生产工艺的优化。同时在保证最大产量的前提下，使用IVGE还能进一步优化最佳半乳糖基化或唾液酸化形式。总体来看，罗氏诊断体外糖基化工具（IVGE）可帮助节省时间和成本，包括控制生成聚糖变体，助力开发更均一糖型的蛋白质，优化糖基化而不影响其他CQA或产品产量，改善批间一致性，从而降低产品质量参差不齐和因此导致生产延迟的风险。此外，使用IVGE还可以生成无法用传统方法学生成的糖型，并简化分析流程。罗氏诊断开发的糖基转移酶和活化糖均可满足GMP要求和无动物源性生产，同时也能满足临床需求。此外，其基于ELISA方法的酶残留检测试剂盒正在开发中。如需咨询相关产品请扫描左边二维码[1]Yagi Hirokazu and Yanaka Saeko and Kato Koichi. Structure and Dynamics of Immunoglobulin G Glycoproteins.[J]. Advances in experimental medicine and biology,2018,1104:219-235..[2]Liu L. Antibody Glycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins[J].Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,104(6): 1866–1884.[3]Kiyoshi M, Tsumoto K, Ishii-Watabe A,et al.Glycosylation of IgG-Fc: a molecular perspective[J]. International Immunology,2017,29(7): 311–317.[4]Bas M, Terrier A,Jacque E,et al.Fc Sialylation Prolongs Serum Half-Life of Therapeutic Antibodies[J]. The Journal of Immunology, 2019, 202(5): 1582–1594.[5]徐刚领, 韦薇, 罗建辉, 白玉.单抗药物N-糖基化修饰对结构功能影响及相关药学问题考量. 药学学报, 2020, 55(6): 1345-1350.[6]Washburn Nathaniel, et al. Controlled tetra-Fc sialylation of IVIg results in a drug candidate with consistent enhanced anti-inflammatory activity.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, 112(11):E1297-306.[7]王冲.单克隆抗体糖基化修饰研究进展[J]. 现代免疫学, 2017, 37(3):6.[8]Batra,Jyoti,and Anurag S Rathore.“Glycosylation of monoclonal antibody products: Current status and future prospects.”Biotechnology progress vol.32,5(2016):1091-1102. doi:10.1002/btpr.2366[9]Thomann M, Schlothauer T, Dashivets T,et al.In Vitro Glycoengineering of IgG1 and Its Effect on Fc Receptor Binding and ADCC Activity[J]. R. Chammas. PLOS ONE, 2015, 10(8): e0134949.[10]罗氏官网：https://custombiotech.roche.com/global/en/portfolio/in-vitro-glycoengineering.html识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。
