THZ-531

细胞周期蛋白依赖性激酶12（CDK12）是癌症的重要生物标志物和潜在治疗靶点，但目前尚无高选择性抑制剂进入临床，且由于其与CDK13的高度相似性，筛选特异性抑制剂面临巨大挑战。深度学习技术在加速新药发现和提高成功率方面展现出巨大潜力。本研究中，作者设计了一种基于Transformer架构的药物-靶点相互作用（DTI）模型，融合自监督分子图与蛋白序列预训练模型，并构建了一种结合深度学习与虚拟筛选的高效工作流程。该流程能够快速筛选数百万化合物，成功识别出多个潜在的CDK12抑制剂。 背景 药物发现是一个复杂而漫长的过程，通常需要10–15年，并伴随高失败率和高成本。计算机辅助药物设计（CADD）作为重要工具，在不同阶段（如苗头化合物筛选与优化）显著提升了新药研发的效率。传统CADD方法主要依赖分子模拟技术，计算成本高，限制了其广泛应用。近年来，深度学习技术的发展推动了基于图神经网络（GNN）的CADD方法，尤其是图卷积神经网络（GCN）在分子性质预测、药物-靶点相互作用等任务上表现优异。自监督学习（SSL）近年来在图数据领域取得突破，能够从大规模无标签数据中挖掘有价值的监督信息。在先前研究中，作者曾提出了分子预训练GCN框架MolGNet，在多个数据集上实现了最先进的性能。此外，基于BERT的蛋白序列预训练模型也在蛋白质结构与功能预测等任务上取得显著进展。 CDK12是一种转录相关的细胞周期蛋白依赖性激酶，在DNA复制、转录、损伤修复等过程中发挥重要作用，并与多种癌症相关。CDK12与CDK13共享较高序列相似性，导致特异性抑制剂的开发面临挑战。目前，尚无高选择性CDK12抑制剂进入临床。 本研究结合分子预训练模型MolGNet和基于BERT的蛋白序列模型TAPE，构建了一种新型的药物-靶点亲和力预测模型，并结合分子对接技术对450万个化合物进行筛选，最终鉴定出5种潜在的高选择性CDK12抑制剂。 图1 工作流程 方法 深度学习模型：本研究使用Transformer框架融合MolGNet和TAPE预训练模型的输出，构建了一个新的DTI模型。Transformer框架广泛应用于机器翻译、计算机视觉等任务，原始Transformer模块主要包含三个注意力块：两个用于提取输入特征（自注意力模块），一个用于融合特征。本文的模型中，MolGNet的参数在DTI任务训练中重新优化，而TAPE保持不变（图2）。MolGNet输出的分子特征输入到自注意力模块，TAPE输出的氨基酸特征则直接输入到融合模块，以简化计算复杂度。融合后的特征传入全连接层，预测药物-靶标亲和力。 图2 Transformer和TAPE示意图 分子对接：蛋白质和配体通过Schrödinger Maestro中的PrepWiz和LigPrep模块预处理，采用默认设置。蛋白激酶的晶体结构（PDBID:6CKX）从RCSB PDB下载。通过Epik在pH7.0±2.0下分配质子化状态和互变体，每个化合物最多考虑32种立体异构体，其他参数默认。使用MW≤650，logP≤10，donorHB≤5，acceptHB≤12标准筛选配体。 采用HTVS和SP对接进行虚拟筛选。HTVS筛选前10%的结构进行SP对接，再从中筛选前10%的结构，使用MM-GBSA方法计算结合自由能。为选出多样化骨架的化合物，对得到的化合物进行ECFP聚类，在每个簇中选择得分最低且结合模式合理的化合物。 结果 为了验证自监督预训练方法的有效性，作者将其与TransformerCPI进行了对比。后者同样使用Transformer进行特征融合，但利用1D卷积神经网络（1D-CNN）和GCN分别提取蛋白质序列和分子特征。作者选择了DUD-e数据集上的8个靶点进行评估。结果显示，作者的模型在多个靶点上优于TransformerCPI，此外，使用预训练特征输入能够提升基于Transformer架构的DTI模型性能（表1）。为了证明模型不仅仅通过分子特征来判断亲和力，作者与仅使用分子特征进行训练且没有Transformer融合模块的MolGNet进行了对比。结果显示，融合蛋白质特征后，模型在排序活性分子方面表现出更强的能力（表1）。这意味着模型不仅仅依赖分子特征，而是结合了蛋白质特征来进行亲和力预测。 表1 模型在DUD-e中8个靶标数据中的评估 为了评估模型在CDK12靶点上的筛选能力，作者从ChEMBL数据库中检索了11个活性分子，以及最新文献中报告的5个活性分子，共16个。为了模拟真实虚拟筛选，作者将这些活性分子与Maybridge数据库中的分子混合，评估模型在CDK12靶点上的评分表现（表2）。与其他现成的DTI模型相比，作者在新的CDK12数据集筛选任务中获得了最佳的筛选性能。 表2 模型在CDK12数据中的评估 作者建立了一个结合深度学习模型和传统对接评分函数的虚拟筛选工作流程，以实现对大规模化合物库的快速筛选和高命中率。虚拟筛选使用的配体数据库包括Asinex、Chembridge、Lifechemicals、Maybridge、Otava、SPECS、ChemDiv以及MCE生物活性化合物库Plus(HY_L001P)等，共约450万个小分子输入到模型中。接着，作者保留了预测得分排名前5%的小分子（约240,000个）进行分子对接。通过Glide的HTVS和SP两种精度模式进行对接后，获得了前10%的化合物。此外，使用Schrödinger软件Prime模块中的MM-GBSA方法计算了结合自由能。最终，通过ECFP指纹对化合物进行聚类，共分为100组。在选择化合物时，主要考虑得分和结合模式（化合物是否能够与CDK12激酶铰链区域形成氢键）。在每一组中，优先选择具有最高对接得分、模型预测得分高（至少为6.5）并与CDK12铰链区域形成良好相互作用的化合物。最终，作者手动选择了92种可购买的化合物进行进一步的体外活性评估。虚拟筛选后，购买的化合物将进行体外筛选，首先进行CDK12的初步筛选。如图3所示，化合物THZ531在10μM、1μM、0.1μM浓度下的抑制率分别为33.05%、96.65%和98.66%。在10μM浓度下，有25个化合物的抑制率超过40%，在1μM浓度下，有15个化合物的抑制率超过40%。（原文中作者分析了各化合物对接得分最高的结合构象） 图3 CDK12的初步筛选 为评估本研究发现的10种小分子的新颖性，作者将其与BindingDB中筛选出的287种已知CDK12抑制剂（去除IC50、Kd或Ki大于10μM的化合物）进行相似性分析。结果显示，这10种抑制剂与已知抑制剂的相似度均低于46%，表明其具有较高的新颖性。 参考文献 Wen T, Wang J, Lu R, et al. Development, validation, and evaluation of a deep learning model to screen cyclin-dependent kinase 12 inhibitors in cancers. Eur J Med Chem. 版权信息 本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号sixiali_fox59)进行删改处理。 本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至sixiali@stonewise.cn 关注我，更多资讯早知道↓↓↓

2025年2月13日，上海英矽智能的研究团队在JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 上发表了题为Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Orally Available Covalent CDK12/13 Dual Inhibitors for the Treatment of Tumors 的文章。在这篇文章中，研究团队利用人工智能技术（PandaOmics平台）和多组学数据集，结合生物网络分析和科学文献中的文本数据，筛选出CDK12/13作为潜在的抗癌靶点，并针对胃癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、三阴性乳腺癌和结直肠癌等多种癌症类型进行了优先级排序。基于已有的CDK12/13抑制剂（如KIN004）的结构，研究者们设计并合成了一系列具有较弱共价反应性的新型小分子抑制剂，并通过结构-活性关系优化，最终发现了化合物12b。该化合物具有良好的口服生物利用度、体内抗肿瘤活性以及较低的毒性。 在体外实验中，化合物12b显示出对多种癌细胞系的增殖抑制作用，并且能够通过共价结合CDK12/13的C1039位点，抑制RNA聚合酶II C末端结构域上Ser2的磷酸化，进而下调DDR基因的表达。此外，化合物12b在体外对CDK12/13的抑制活性高于其他CDK家族成员，并且在468种激酶的Kinome面板中表现出良好的选择性。在体内实验中，化合物12b在乳腺癌和急性髓系白血病的异种移植小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤效果，且未引起明显的体重下降或其他毒性反应。此外，化合物12b在大鼠中进行了28天的重复剂量毒性研究，结果表明其具有良好的耐受性和安全性。 综上所述，化合物12b作为一种新型的CDK12/13双重抑制剂，不仅在体外和体内实验中表现出良好的抗肿瘤活性，还通过优化共价弹头的反应性降低了毒性，展现出作为多种癌症治疗药物的潜力。 CDK12和CDK13作为细胞周期依赖性激酶家族成员，在癌症发生发展中扮演着复杂且多面的角色。尽管它们与其他CDK激酶（如CDK4/6）同源，但功能上更侧重于调控基因转录而非直接驱动细胞周期进程。CDK12通过与细胞周期蛋白K（Cyclin K）结合，磷酸化RNA聚合酶II的C端结构域，影响转录延伸和mRNA加工过程。其独特之处在于选择性调控DNA损伤修复相关基因的表达，例如BRCA1、ATM和FANCI等。CDK12的过表达或激活与肿瘤的启动、生长和耐药性密切相关。例如，在HER2阳性的乳腺癌中，CDK12与HER2的共扩增比例高达90%，其高表达可激活WNT和IRS1-ErbB-PI3K等信号通路，维持肿瘤干细胞的自我更新，从而推动乳腺癌的发生和发展。此外，在胃癌中，CDK12通过促进PAK2的磷酸化激活MAPK信号通路，促进肿瘤进展。 相较之下，CDK13的功能研究尚不深入，但已知其同样参与转录调控，可能通过磷酸化不同CTD位点选择性地影响胚胎发育相关基因和原癌基因（如MYC）的表达。在某些癌症类型中，CDK13的扩增或过表达被发现与肿瘤进展和耐药性相关。例如，在急性髓系白血病中，CDK13通过调控RNA剪接因子促进癌基因异常剪接；在结直肠癌中，CDK13与Wnt/β-catenin信号通路相互作用可能驱动肿瘤干细胞特性。CDK12/13的双重抑制被发现可协同增强抗肿瘤效果，但同时可能加剧正常组织毒性，这凸显了靶向治疗的平衡难题。目前针对这两个激酶的小分子抑制剂（如THZ531）尚处于临床前研究阶段，其选择性、脱靶效应及耐药机制仍需进一步探索。 在本研究中，研究团队以KIN004（一种已知的CDK12/13双重抑制剂）为起点，设计并合成了一系列CDK12/13双重抑制剂，并进行了全面的结构-活性关系优化，并最终确定了优化的化合物12b。 图1.具有代表性的CDK12/13抑制剂或降解剂 图2.化合物12b的结构和结合模式 接下来，研究团队进一步通过实验展示了化合物12b对CDK12/13的特异性抑制作用及其生物学效应。研究者展示了化合物12b对SUM149PT细胞中 RNA聚合酶II（Pol II）C末端结构域（CTD）上Ser2磷酸化水平的影响，以及对DNA损伤标志物 γH2AX表达的影响。结果显示，化合物12b以剂量依赖性方式降低了Ser2的磷酸化水平，这表明其对CDK12/13的抑制作用，因为 CDK12/13主要负责Ser2的磷酸化。同时，化合物12b处理后，γH2AX 的表达显著增加，表明其诱导了DNA损伤。这一结果表明，化合物12b通过抑制 CDK12/13的活性，减少了Ser2的磷酸化，进而导致DNA损伤的积累（图3A）。并且，化合物12b对 Ser2磷酸化的又持续抑制作用，即使在洗脱后，Ser2 的磷酸化水平仍然保持较低，而 Ser5（CDK7的底物）和 Ser7（CDK9的底物）的磷酸化水平未受影响。这表明化合物12b对 CDK12/13的抑制作用具有持久性和选择性，而不影响其他CDK家族成员（图3B）。此外，化合物12b能够使DDR基因显著下调，从而削弱细胞的DNA修复能力，增加细胞对DNA损伤的敏感性（图3C,D）。 综上所述，化合物 12b通过抑制 CDK12/13的活性，减少了Ser2的磷酸化，进而导致DNA损伤的积累，并通过下调DDR基因的表达进一步削弱细胞的DNA修复能力。这些发现为化合物 12b作为一种有潜力的抗肿瘤药物提供了坚实的生物学基础。 图3.化合物12b对CDK12/13的特异性抑制作用 接下来，研究团队进一步展示了化合物12b在体外对CDK家族激酶以及更广泛的激酶组的选择性抑制作用。研究者通过基于发光的激酶活性检测方法，评估了化合物12b对16 种CDK/细胞周期蛋白复合物的抑制活性，结果显示，化合物12b对CDK12的抑制活性显著高于其他CDK家族成员，显示出至少2倍的选择性优势。尽管它对CDK13和CDK7也表现出一定的抑制作用，但对其他 CDK（如 CDK2、CDK4、CDK6 等）的抑制作用较弱。这种选择性表明化合物12b主要通过抑制 CDK12/13 发挥作用，而对其他CDK家族成员的影响较小（图4A）。 研究者进一步通过KinomeScan技术评估了化合物12b在468种人类激酶中的结合亲和力。结果显示，化合物12b对大多数激酶的抑制作用较弱，除了对 CDK12/13 的显著抑制外，仅对少数其他激酶（如 JNK1、JNK3）有一定的结合亲和力，但这种亲和力远低于对CDK12/13的亲和力。这种广泛的激酶组分析结果表明，化合物12b在较高浓度下对CDK12/13具有良好的选择性，而对大多数其他激酶的影响较小，进一步支持了其作为CDK12/13抑制剂的特异性（图4B）。综合来看，化合物12b对CDK12的高选择性，表明其主要通过抑制CDK12/13发挥作用，而对其他CDK家族成员的影响较小。通过KinomeScan技术验证了化合物12b在468 种激酶中的选择性，表明其对大多数其他激酶的抑制作用较弱。这些结果表明，化合物 12b是一种具有高选择性的CDK12/13抑制剂，其特异性抑制作用有助于减少潜在的脱靶毒性，从而使其成为一种有潜力的抗肿瘤药物候选物。 图4.化合物12b对CDK家族激酶以及更广泛的激酶组的选择性抑制作用 作者进一步研究了化合物12b在SUM149PT乳腺癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性和安全性。研究者首先展示了不同剂量的化合物12b对肿瘤生长的抑制效果。实验中，小鼠被随机分为多组，分别接受不同剂量的化合物12b（30mpk 和60mpk）或对照化合物 1（20mpk）的口服给药处理，每天一次，持续三周。结果显示，化合物 12b在两个剂量水平下均显著抑制了肿瘤的生长，且抑制效果呈剂量依赖性。具体来说，30mpk 剂量的12b实现了 101%的肿瘤生长抑制（TGI），而60mpk 剂量的12b实现了 114%的TGI。这一结果表明，化合物12b在体内具有强大的抗肿瘤活性，且其效果优于对照化合物 1（图5A）。接下来，研究者进一步评估了化合物12b的耐受性，通过记录小鼠的体重变化来反映。结果显示，接受化合物12b处理的小鼠在整个实验期间体重没有显著下降，表明其具有良好的耐受性，相比之下，接受对照化合物1处理的小鼠在给药后迅速出现体重下降，这表明化合物1可能具有较高的毒性。这一对比进一步证实了化合物12b在降低毒性方面的优势，尤其是在与具有更强共价反应性的化合物1相比时（图5B）。综合来看，化合物12b在两个剂量水平下均能显著抑制肿瘤生长，且效果优于对照化合物1，并且通过体重变化评估了化合物 12b的耐受性，表明其在体内具有良好的安全性和较低的毒性。 图5.化合物12b在SUM149PT乳腺癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性和耐受性 接下来作者还探究了化合物12b在MV4−11急性髓系白血病（AML）异种移植小鼠模型中的抗肿瘤作用。研究者首先展示了化合物12b在MV4-11 AML 异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果，结果显示，化合物12b在两个剂量水平下均显著抑制了肿瘤的生长，且抑制效果呈剂量依赖性。具体来说，15mpk剂量的12b实现了 31%的肿瘤生长抑制（TGI），而 30mpk 剂量的12b实现了95%的TGI。这一结果表明，化合物12b在体内具有强大的抗肿瘤活性，且高剂量下几乎完全抑制了肿瘤的生长（图6A）。研究者进一步评估了化合物12b的耐受性，通过记录小鼠的体重变化来反映。结果显示，接受化合物12b处理的小鼠在整个实验期间体重没有显著下降，表明其具有良好的耐受性。这一结果与SUM149PT乳腺癌模型中的观察结果一致，进一步证实了化合物12b在降低毒性方面的优势（图6B）。此外，研究者还探究了化合物12b在MV4-11 AML 异种移植小鼠模型中的血浆药代动力学特征。实验中，小鼠接受 30mpk 的化合物12b处理后，研究者在不同时间点（0.25、0.5、1、2、4、8 和 24 小时）采集血样，测定化合物 12b的血浆浓度。结果显示，化合物12b具有良好的口服生物利用度，其血浆浓度随时间逐渐下降，且在2小时时达到较高的药物浓度。此外，肿瘤/血浆浓度比率为 0.46，表明化合物12b在肿瘤组织中的积累较少，进一步支持了其良好的耐受性（图6C）。接下来，研究者通过Western Blot分析，展示了化合物12b在体内对CDK12/13功能的抑制作用。实验中，小鼠接受30mpk的化合物12b处理后，研究者在最后一次给药后4小时采集肿瘤组织样本，检测RNA聚合酶 II（Pol II）C末端结构域上Ser2的磷酸化水平。结果显示，化合物12b显著降低了Ser2的磷酸化水平，而Ser5（CDK7 的底物）的磷酸化水平未受影响。这一结果表明，化合物12b在体内特异性地抑制了CDK12/13的活性，而不影响其他CDK家族成员（图6D）。 图6.化合物12b在 MV4-11异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性和药代动力学特征 综上所述，这篇文章详细报道了化合物12b的发现、合成、体外和体内活性研究，以及其作为新型口服共价 CDK12/13 双重抑制剂在肿瘤治疗中的潜力。研究团队利用人工智能平台 PandaOmics 和多组学数据，筛选出 CDK12/13 作为抗癌靶点，并基于已知的 CDK12/13 抑制剂 KIN004，设计并优化了一系列具有较弱共价反应性的新型小分子抑制剂。通过结构-活性关系（SAR）研究，最终发现化合物12b具有良好的活性、选择性和较低的毒性。体外实验表明，12b 能够特异性抑制 CDK12/13 的活性，降低 RNA 聚合酶 II C 末端结构域（CTD）上 Ser2 的磷酸化水平，进而下调 DDR 基因的表达并诱导 DNA 损伤。在多种癌细胞系中，12b展现出显著的抗增殖活性。体内实验进一步证实了12b在乳腺癌和急性髓系白血病异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果，同时表现出良好的耐受性和药代动力学特性。这些综合结果表明，化合物12b是一种具有潜力的 CDK12/13 抑制剂，有望用于多种癌症的治疗。综合来看，化合物12b 作为一种新型的 CDK12/13 双重抑制剂，不仅在体外和体内实验中表现出强大的抗肿瘤活性，还通过优化共价弹头的反应性降低了毒性，展现出作为多种癌症治疗药物的潜力。这些研究结果为化合物12b的进一步临床开发提供了坚实的科学基础，有望为那些对传统 DDR 通路靶向治疗耐药的癌症患者提供新的治疗选择。 原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c01616 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓