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根据广东疾控发布的数据，9月9日至15日，全省新增报告775例登革热病例，较上周增加73例，环比增加10.4%。无新增重症病例、死亡病例。目前，广东省已进入登革热流行季，疫情传播风险逐步增高。2024年8月，广东报告登革热1220例，相比7月（233例）增至近6倍。 实际上，今年以来，全球登革热疫情形势严峻。根据《柳叶刀》发表的一篇社论，2024年是有记录以来登革热感染最严重的一年。WHO已将登革热重新归类为3级紧急事件，需要公共卫生部门采取重大到最大程度的应对措施。所以带大家一起来了解登革热疫苗在研发过程中遇到的一些挑战。 摘要：登革热病毒（DENV）是蚊媒传播病毒中对人类健康构成最大威胁的病毒。登革热病毒有四种血清型（1-4），它们在流行地区共同循环。每种DENV血清型都能单独引起从自限性的登革热到更严重的登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS）的全谱疾病。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的数据，感染登革热的人群中有四分之一会生病。在那些出现症状的人中，症状可以从轻微到严重不等。症状可以从皮疹、眼部疼痛到更严重的登革热表现的更强烈症状。大约每20个生病的人中就有1个会发展成严重登革热，这可能导致休克、内出血和死亡。目前尚无针对登革热的特定治疗方法，仅有一种疫苗（Dengvaxia）在少数几个国家获得9至16岁儿童的许可使用。尽管Dengvaxia获得了临床使用的许可，但在儿童和未感染过登革热的个体中效果不佳，并且关键的是，在年轻的接种者中增加了发展成严重登革热的风险。目前，有多种新策略用于登革热疫苗的开发。在这篇综述中，我们对DENV疫苗领域进行了详细的概述，重点关注了9种处于研发管线中的疫苗，以提供对针对DENV疫苗策略中最先进技术发展的全面概述。 引言 登革热病毒（DENV）是全球近一半人口面临感染风险的节肢动物传播病毒中对人类健康影响最大的。登革热病毒通过感染的埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。目前，全球范围内尚无针对所有四种DENV血清型（DENV 1-4）的抗病毒治疗或疫苗获得许可。DENV的流行病学是多方面的，临床表现范围广泛，从无症状疾病到危及生命的DHF和DSS。四种DENV血清型中的每一种都能引起全谱疾病。此外，与异源DENV血清型的二次感染可能导致感染增加和疾病加重，这是通过一种称为抗体依赖性增强（ADE）的机制。感染一种DENV血清型会提供对该血清型的长期抗体（体液）和T细胞反应（细胞免疫）保护。在ADE中，随后暴露于不同的DENV血清型会导致预先存在的DENV抗体与新血清型结合，形成病毒-免疫复合物，可以通过Fcγ受体促进进入免疫细胞，导致病毒复制和病毒血症增强。由于ADE现象，开发疫苗或治疗药物时必须单独考虑每种DENV血清型。Dengvaxia已在墨西哥、菲律宾、印度尼西亚、巴西、萨尔瓦多、哥斯达黎加、巴拉圭、危地马拉、秘鲁、泰国和新加坡获得许可，2019年获得FDA许可，并经CDC ACIP批准使用，前提是所有接种者在接种疫苗前都必须显示为登革热血清阳性。尽管Dengvaxia已经商业化，但结果显示严重的副作用和低效。武田生物制品TAK-003疫苗已获得美国食品药品监督管理局的优先审查，用于预防所有四种DENV血清型引起的登革热疾病，适用于4至60岁的人群，将于2023年在印度尼西亚获得许可。因此，全球范围内仍迫切需要一种获得许可且有效的抗DENV疫苗。 登革热疫苗开发 已有多次尝试开发针对DENV的疫苗，包括减毒嵌合重组病毒、减毒活病毒、灭活病毒、重组蛋白和mRNA疫苗。每种疫苗原型在减毒特性、效力和免疫原性方面各不相同。本综述将详细讨论每种登革热疫苗的特点、效力和局限性。 Dengvaxia Sanofi Pasteur的Dengvaxia是第一个也是唯一一个商业许可的登革热疫苗，目前被20个国家推荐和使用。该疫苗是四价配方，由Sanofi Pasteur黄热病疫苗（YFV 17D）骨架组成，DENV的PrM和E蛋白取代了YFV 17D的PrM和E蛋白（图1a, b）。作为针对DENV的先锋疫苗，Dengvaxia的临床试验和现场结果受到了密切监测，特别关注ADE的可能性。在III期临床试验中，9岁以下儿童接种了三剂Dengvaxia，接种间隔为0、6和12个月（图1c）。通过在接种12个月后的25个月监测有症状的登革热感染来监测疫苗的效力。Dengvaxia在9岁以上的儿童中显示出65.6%的效力，在9岁以下的儿童中显示出44.6%的效力。Dengvaxia完成了III期效力试验，结果参差不齐。就住院治疗而言，9岁及以上的儿童住院率为80.75%，而9岁及以下的儿童住院率为55.9%。这些数据表明，Dengvaxia在9岁以下儿童中引起的保护效力较差。此外，Dengvaxia在提供保护方面的能力在四种DENV血清型方面也有所不同，就病毒学确认的有症状登革热而言。Dengvaxia对DENV1的效力为50.3%，对DENV2为42.3%，对DENV3为74.0%，对DENV4为77.4%。 图1. 由Sanofi、NIAID/Butantan、Takeda和美国陆军医疗研究物资司令部开发的减毒活疫苗。(a) Sanofi疫苗的开发。使用黄热病疫苗病毒17D (YFV 17D) 作为嵌合病毒生成的主干。YFV 17D包膜蛋白被野生型DENV血清型替换。(b) 组成Dengvaxia的四种DENV疫苗病毒的遗传构建表示。(c) 基于三剂计划的Dengvaxia免疫方案。(d) NIAID/Butantan疫苗的开发。通过在DENV1 WP、DENV2 NGC和DENV4 814669的3' UTR中引入30个核苷酸缺失，生成减毒活疫苗病毒。对于DENV3 Sleman-78株，在3' UTR中额外引入了31个核苷酸缺失。(e) LATV TV003/TV005的DENV2组分是通过嵌合生成的，其中将DENV2 NGC的prM和E基因引入DENV4Δ30的主干中。(f) 组成NIAID/Butantan LATV TV003和TV005疫苗的四种DENV疫苗构建物的表示。(g) NIAID/Butantan疫苗的接种方案。(h) Takeda减毒重组疫苗的开发。(i) Takeda DENV1、DENV3和DENV4疫苗株是通过将每种DENV血清型的prM和E蛋白引入DENV2 PDK53疫苗病毒而生成的。(j) Takeda疫苗中疫苗病毒的遗传组成的表示。(k) Takeda的免疫接种时间表。(l) TDEN疫苗配方的开发，其中四种DENV株在PDK细胞中连续传代。(m) TDEN疫苗中疫苗病毒的遗传组成的表示。图表是使用Biorender设计的。 疫苗效力因DENV血清型、接种者年龄、血清状态和接种时间而异。重要的是，DENV2的效力在CYD23临床试验中没有达到统计学意义（9.2%；95%CI −75至51.3）或在CYD14试验中（35%；95%CI：−9.2至61）。数据还显示，接种时DENV血清阴性的疫苗接种者的效力显著降低（表1）。 Dengvaxia试验的第一年长期安全性研究结果显示，Dengvaxia对住院治疗的效力是有希望的，但有一个主要的警告，即结果高度依赖于接种时的DENV暴露血清状态以及接种时的年龄。需要进一步研究以了解为什么Dengvaxia在接种时血清阴性的受试者中效力降低，以及为什么在9岁以下儿童中住院风险增加。到目前为止，这些问题仍然不清楚，并且是进一步调查的主题。 总的来说，该疫苗对DENV1和DENV2的保护较低，并且主要产生针对DENV4的抗体反应。因此，Dengvaxia实际上只作为针对DENV4的单价疫苗起作用。数据表明，Dengvaxia引起的感染性和产生的免疫原性可能不平衡。这种不平衡是由需要在12个月内给予三剂疫苗的需求所表明的。大多数通过注射给药的疫苗，包括YFV和日本脑炎病毒（JEV）以及麻疹、腮腺炎、风疹（MMR）等多价疫苗，都是作为单一主要剂量给药的。对于第一剂没有反应的接种者，可以在以后的时间进行复种。使用单一疫苗剂量的主要原因是，主要剂量引入了复制疫苗病毒，引发了能够阻断后续活病毒剂量感染和复制的中和抗体。有趣的是，如果第二剂确实引起了抗体滴度的显著增加，那可能是因为初次反应不足，无法中和疫苗病毒，随后允许在第二剂后复制。最终，一个弱的初次剂量将无法在用活疫苗病毒挑战时保护免受感染。对四种DENV血清型的血清转化频率差异很大；DENV-1为33%，DENV-4为8%，DENV3为80%，DENV4为85%。研究中的一部分接种者进一步检查了接种后病毒血症的水平。在接种后第7天，57.7%的疫苗接种者检测到病毒血症，其中86.7%是由于Dengvaxia的DENV4成分。只有1/25的接种者在单剂后恢复了Dengvaxia的DENV2成分。值得注意的是，没有任何接种者恢复了Dengvaxia的DENV1成分。疫苗中DENV血清型的感染性不平衡可能是疫苗对DENV1和DENV2效力较低的原因，并且可能是在接种时被假定为血清阴性的2-5岁接种者在第三年随访中看到住院风险增加的潜在原因。 最终，Dengvaxia临床试验的结果提出了一个问题，即Dengvaxia是否能有效提供针对DENV的异型保护，并表明仍需要一种更有效的疫苗，能够产生针对所有四种DENV血清型的异型中和抗体。此外，目标年龄组，9岁以下儿童无法接种Dengvaxia，使这一脆弱群体无法得到登革热的保护。 LATV TV003/TV005 美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）在过去15年中一直处于开发减毒四价疫苗（LATV）的前沿。鉴于对DENV的部分免疫可能会增加随后感染更严重疾病结果的风险，评估了多种单价和四价DENV疫苗，以确定具有最佳安全性、感染性和免疫原性特征的候选疫苗，总体目标是开发一种能够通过单剂量诱导对所有四种DENV血清型产生保护的LATV。通过实施重组DNA技术，采用了两种主要的减毒策略来生成疫苗病毒。第一种策略是在3'非翻译区（UTR）中包含缺失，第二种策略是生成结构基因嵌合体（图1d）。原型单价疫苗候选物rDEN4Δ30是通过在3'UTR中引入30个核苷酸（Δ30）缺失而生成的。rDEN4Δ30包含野生型DENV-4的所有结构和非结构蛋白，但通过在3'UTR中引入30个核苷酸缺失而减毒（图1f）。为了生成其他DENV疫苗，采用了类似的减毒机制。对于DENV2疫苗血清型（rDEN2/4Δ30），采用了嵌合策略，将DENV2新几内亚C病毒的prM和E基因引入rDEN4Δ30疫苗候选物（图1e）。总共评估了九种单价疫苗候选物在黄病毒素未暴露的成年志愿者中。在临床研究中评估了五种不同的四价混合制剂。对单价病毒进行的试验提供了对选择疫苗病毒至关重要的信息，这些信息涉及临床、病毒学和免疫学表型。这些信息用于指导LATV疫苗的最终开发。在这些早期研究中，观察到一些重要的发现，其中一个发现是嵌合策略对病毒复制具有高度减毒作用，同时允许一些必要的病毒复制以诱导免疫反应。当作为单价病毒测试时，rDEN2/4Δ30候选病毒在103 pfu剂量下感染了100%的受试者，但在组合成四价配方（rDEN1Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30/3Δ31, rDEN4Δ30）时，其感染性最低。 为了确保四价疫苗的所有四个组分都能诱导出对每种DENV血清型的同型抗体，平衡感染性特征至关重要。为了生成更平衡的感染性特征，开发了两种策略。第一种策略是将rDEN2/4Δ30的剂量增加十倍。这种策略在TV005配方中实施。TV003和TV005具有相同的四种单价组分，并且在rDEN2/4Δ30的剂量上有所不同，TV003在103 pfu给药，TV005在104 pfu给药。第二种策略是将血清学评估的时间从接种后42天增加到90天。将rDEN2/4Δ30的剂量增加十倍足以补偿疫苗组分的更高HID50。接种TV005的受试者在接种后血液中可检测到病毒的比例明显高于接种TV003的受试者。血清转化的频率从接受TV003的76%提高到接受TV005的97%。此外，单剂量疫苗后四价抗体反应的总体频率从TV003的74%提高到TV005的90%。 在接种后的抗病毒反应方面，可以定义为“抑制或中和随后感染所接种病毒”的无菌免疫。尽管无菌免疫并不总是实现减少疾病和发病率的最终目标所必需的，但它可以是一个可量化的临床结果，并且是疫苗成功诱导足够免疫反应的指标。如前所述，Dengvaxia需要三剂，并且必须在12个月内给药。在第一剂后观察到病毒血症，特别是在DENV-4成分后，第二剂和第三剂后较少。Dengvaxia的第二剂和第三剂导致DENV-1、DENV-2和DENV-3血清型的抗体滴度增加。这些数据表明，当给登革热血清阴性的个体接种时，Dengvaxia不能诱导对后续感染的无菌免疫。为了确定Dengvaxia观察到的突破性感染是否会发生在LATV中，TV003和TV005的第二剂在第一剂后6个月给药。在TV003的初始剂量后，75%的疫苗接种者血液中产生了可检测水平的疫苗病毒，62%的疫苗接种者出现了登革热感染特征性的皮疹。在第二剂给药后，即在TV003/TV005初始剂量后6个月，没有观察到皮疹或病毒血症。在第二剂后，只有一名受试者在24小时内产生了可检测的病毒水平。在第二剂疫苗后，对四种DENV血清型的抗体滴度平均增加了不到两倍。 在接种后180天测量了对TV003和TV005的中和抗体反应和T细胞反应，并证明足以阻止随后疫苗接种后的增强，如抗体滴度没有进一步增加所测量的。为了评估抗体水平是否能保护自然DENV感染，开发了人类DENV-2挑战模型。在十名健康的黄病毒素未暴露的受试者中评估了挑战株rDEN2Δ30。为了量化TV003对DENV-2感染的保护效力，受试者在接受TV003后6个月接受了rDEN2Δ30挑战。TV003对由rDEN2Δ30引起的病毒血症、中性粒细胞减少和皮疹提供了完全保护，并且也在评估DENV-3挑战模型，结果正在发布过程中。此外，巴西布坦坦研究所与NIAID合作，在登革热流行国家进行TV003的II期和III期临床研究。这些结果对于这种LATV在已经接触过一种或多种DENV血清型的个体中预防登革热的潜力非常令人鼓舞。 TAK-003 TAK-003（TDV）是由武田制药公司生产的减毒四价登革热疫苗，最初由美国疾病控制和预防中心矢量传播疾病司的科学家设计和构建。该疫苗基于减毒病毒和使用重组DNA技术构建的嵌合病毒。TAK-003基于减毒DENV-2病毒，为所有四种疫苗病毒提供遗传骨架。第一个重组疫苗候选物是通过将DENV-1 16 007病毒的prM和E蛋白嵌合到DENV2 PDK-53病毒中生成的。通过结合不同的野生型病毒和PDK减毒疫苗病毒，生成了各种疫苗构建体（图1h-j）。 九种嵌合病毒是通过引入DENV-1 (16007)、DENV-3 (16562)或DENV-4 (1036)的prM和E蛋白与DENV-2 (16681)以及两种遗传变体(PDK53-E和PDK53-V)来生成的。DENV-2 PDK-53即使联合给药也能均匀复制，据推测能诱导对所有四种血清型的平衡免疫。TAK-003采用0个月和3个月的剂量计划（图1k）。I期和II期研究已经证明TAK-003耐受性良好，能够诱导针对DENV 1-4的体液反应、长期抗体持久性和交叉反应以及多功能细胞反应。武田生物制品TAK-003疫苗已获得美国食品药品监督管理局的优先审查，用于预防所有四种DENV血清型引起的登革热疾病，适用于4至60岁的人群，并将于2023年在印度尼西亚获得许可。采用0-3个月剂量计划进行的临床试验显示，TAK-003在接种前血清阴性的疫苗接种者中总体效力为66.2% (95% CI, 49.1–77.5%)。针对住院登革热的效力为90.4%，针对登革出血热(DHF)的效力为85.9%。在一项探索性分析中，累积效力被分为三个部分进行评估。第一部分在第二剂后12个月进行随访以评估主要终点，第二部分增加6个月以评估次要终点，第三部分是对长期效力和安全性进行持续3年的评估。对DENV-1 (69.0%)、DENV-2 (90.8%)、DENV-3 (51.4%)和DENV-4进行了累积血清型特异性效力分析，后者显示结果不确定。疫苗效力在不同年龄组之间差异很大。在6-11岁的儿童中，效力为75.4%，而在4-5岁的儿童中效力为55.9%。在第一年，TAK-003对病毒学确认的登革热(VCD)的总体效力为80.2% (95 CI, 73.3–85.3%)。在第二年，针对VCD的总体效力下降到56.2%。在第二剂后长达2年的时间里，共报告了15例严重登革热或DHF病例，针对DHF的累积效力为81.2%。在基线血清阴性组中，从9、15和27个月的几何平均抗体滴度分析显示，随时间推移DENV-2的几何平均滴度呈下降趋势(GMT)。DENV-1、-3和-4的GMT在疫苗接种者中保持稳定。血清阳性率在9个月时为91.3%，在27个月时为85.9%。总体而言，在4-16岁的儿童中，在接种疫苗后27个月，TAK-003预防了72.7%的有症状登革热病例、89.2%的住院登革热和81.2%的DHF。在基线血清阴性的疫苗接种者中，累积效力为67%，在血清阳性个体中为74.8%。至关重要的是，针对构成TAK-003基础的DENV-2的效力下降不容忽视，这表明TAK-003可能无法完全复制自然感染所提供的保护。此外，第二年的数据表明，在6-11岁(60.6%)和12-16岁(71.2)的儿童中，与4-5岁(24.5%)的儿童相比，效力更高。 TDEN F17/F19 沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)与葛兰素史克公司(GSK)合作开发了一种减毒四价登革热(TDEN)疫苗。该疫苗由四种DENV菌株组成，DENV-1 (45AZ5)、DENV-2 (S16803)、DENV-3 (CH53489)和DENV-4 (341750)（图1l, m），并以6个月间隔给黄病毒素未暴露的成人接种两剂（图1n）。所有四种病毒都是从自然感染中获得的，通过在C6/36细胞中分离并通过在PDK细胞中连续传代而减毒。总共有16种四价配方，其中13和14号配方被选中进行进一步评估。为了优化中和抗体反应，开发了一种新配方F17pre，该配方使用了更高代PDK细胞传代的DENV-1和更低代PDK细胞传代的DENV-4。F17pre被设计为F17配方的前体。F13、F14和F17pre进行了II期临床试验。在初次接种后第10天，分别有75%、31%和31%的受试者出现病毒血症。在接种第二剂疫苗后，没有检测到任何受试者的病毒血症。对配方进行了中和抗体反应测量，分别有36%、40%和63%的接种者在接种两剂13、14和F17后产生了四价中和抗体。在波多黎各进行的一项随机II期临床试验中，F17在第二剂后引发了更高滴度的中和抗体，并在初次接种的受试者中实现了对所有血清型的100%血清转化。为了评估TDEN F17疫苗的安全性和免疫原性特征，在对DENV 1-4和JEV未暴露的6-7岁泰国儿童中进行了一项试点研究。研究结果显示，该疫苗安全且具有免疫原性，因此该研究推进到12-15个月大婴儿的I/II期试验。总共有52.6%的疫苗接种者对四种DENV血清型产生了血清转化。TDEN F17已被证明在12个月至50岁的疫苗接种者中安全且能引发免疫反应，当以两剂方案给药时。TDEN F17目前正在对6至9岁的儿童进行I/II期临床研究，这些儿童之前已接种过该疫苗。5年的随访将评估两剂方案的免疫原性，以及在第二剂后1年接种的第三剂的免疫原性。 DPIV 四价登革热纯化灭活疫苗(DPIV)由沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)开发，并由WRAIR试验生物生产设施生产，并由葛兰素史克(GSK)佐剂系统佐剂。该疫苗以28天间隔分两次给药（图2c）。最初的疫苗开发始于DENV-2 S16803菌株，该菌株是从患者身上分离出来的，并在Vero细胞中扩增。这种纯化灭活病毒(PIV)在给小鼠接种时是安全的，小鼠在第二剂后实现了100%的血清转化。PIV随后在恒河猴上进行了测试，结果证明是安全且具有免疫原性的。随后，基于灭活病毒的四价配方被开发出来，使用DENV-1 Westpac 74、DENV-2 S16803、DENV-3 CH53489和TVP360作为DENV-4组分（图1a, b）。病毒在Vero细胞中扩增，经过甲醛灭活，并使用0.01%明矾(氢氧化铝)作为佐剂。免疫接种计划包括一剂TPIV，然后是一剂四价减毒活疫苗(TLAV)的加强剂量。TPIV/TLAV的组合在接种后8个月对DENV-3挑战提供了完全保护。在随后的实验中，用TPIV初免引发了针对所有四种DENV血清型的中和抗体。在对四种DENV血清型中的每一种进行挑战后，接种疫苗的动物没有出现病毒血症。为了找到DPIV的最佳佐剂，疫苗开发商使用了AS01E (3-O-desacyl-单磷脂A)和AS03B (油包水)来克服因灭活引起的免疫原性问题。在一项I期临床试验中，用AS01E/AS03B佐剂的DPIV发现疫苗在登革热血清阴性成人中引发了针对所有四种DENV血清型的中和抗体反应，但这种反应随时间减少。观察到的两剂疫苗接种的体液反应是强大的，但目前尚不清楚DPIV是否能够提供针对DENV的持久免疫。疫苗的灭活性质可能会在非结构蛋白的免疫反应方面产生障碍。 在进行的一项研究中发现，接种DPIV后，免疫系统仅针对包膜和衣壳蛋白。最终，疫苗无法在接种疫苗的恒河猴中进行的挑战试验中控制DENV感染。重要的是，接种DPIV导致接种的猴子出现病毒血症、AST、IL-10、IL-18水平增加。这些数据表明，接种疫苗可能触发了DENV感染的抗体依赖性增强。 TVDV 四价登革热DNA疫苗（TVDV）由美国陆军医疗研究与物资司令部开发[49]。TVDV是一种基于DNA的疫苗，其中prM和E蛋白编码序列克隆在VR1012质粒中，并与VAXFECTIN作为佐剂共同给药（图2d, e），采用三剂免疫方案（图2f）。DENV-1菌株是从西太平洋74菌株生成的，当克隆到VR1012质粒并给恒河猴接种时，被证明在挑战试验中保护猴子并在I期临床试验中被发现具有免疫原性。DENV-2抗原是通过替换原始DENV-2构建物中的DENV-2跨膜和细胞质序列为小鼠溶酶体相关膜蛋白的序列来生成的。DENV-3抗原来源于亚洲病毒株。临床前测试表明，DENV3疫苗株引发了中和抗体，适度水平的特异性IgG并在挑战试验中提供了部分保护。DENV-4的遗传结构与DENV-2相似，但缺乏关于DENV-4组分在其单价形式的临床前测试的报告。Vaxfectin被用作佐剂以提高疫苗的免疫原性。通过将编码DENV 1-4的prM和E基因的各个单价质粒等量结合并克隆到VR1012质粒中来制备疫苗构建物。在接受了两剂疫苗配方的白兔中对TVDV进行了安全性和免疫原性评估。动物显示出对所有四种DENV血清型的血清转化。在最新进行的40名黄病毒素未暴露的疫苗接种者中进行的I期临床试验中，TVDV被证明是安全的并引发了IFN-γ抗DENV T细胞反应。 V180 V180疫苗是一种基于DENV E和prM糖蛋白重组形式的四价疫苗。该疫苗目前处于I期临床试验中，由默克公司生产。每种DENV血清型的遗传构建是通过基于逆转录酶（RT）-PCR扩增编码prM和80% E蛋白（截断E蛋白）的病毒序列，然后克隆到pMttΔXho载体中（图2g, h）。使用的病毒株有DENV1 258 848和DENV1泰国AHF82-80，DENV2株PR159/S1，DENV3株CH53489和D3H87，以及DENV4株H241和多米尼加，疫苗采用三剂计划（图2i）。在一项评估疫苗安全性、耐受性和免疫原性的I期、随机、安慰剂对照、双盲研究中发现，两种未添加佐剂的V180和一种添加了铝佐剂的V180没有引发强烈的免疫反应，而与ISCOMATRIX联合给药的六种V180配方引发了强烈的免疫原性（GMT ≥150）。目前尚不清楚V180引发的抗体滴度水平是否会提供任何临床益处，因为尚未为疫苗定义抵御DENV所需的中和抗体的确切水平。 图2. 沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)、美国陆军医疗研究与物资司令部和默克公司开发的减毒活疫苗。(a) DPIV的开发。每种DENV血清型都被纯化并通过甲醛灭活。(b) 产生的病毒粒子的表示。(c) 基于两剂计划的DPIV免疫方案。(d) TVDV疫苗的开发。代表DENV 1-4型的prM和E蛋白编码区域被克隆到VR1012质粒中，并与VAXFECTIN共同给药。(e) 表示产生的四个DENV质粒构建物的图解。(f) TVDV的疫苗方案，包括在第0天开始的三剂方案，第30天和第90天结束。(g) 默克公司V180疫苗的开发。为每种DENV血清型生成了病毒序列的遗传构建物，编码prM和80%的E蛋白。(h) 产生的蛋白被克隆到pMttΔXho载体中，并在果蝇细胞培养中培养，然后进行纯化。(i) V180的疫苗方案，采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第30天，最后一剂在第90天。图表是使用Biorender设计的。 DSV4 DSV4是一种四价病毒样颗粒疫苗，旨在展示DENV包膜蛋白的域III。DSV4是通过使用所有四种DENV血清型和乙型肝炎表面（S）抗原的EDIII的框内融合而设计的，并与未融合的S抗原共同表达形成镶嵌病毒样颗粒（VLPs），并采用三剂计划（图3d, e）给予。DSV4在小鼠中诱导了针对所有四种DENV血清型的中和抗体水平，并在DENV4挑战中提供了保护。 E80 mRNA疫苗 E80 mRNA疫苗是由中国科学院开发的一种改良的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗。疫苗设计包括Cap1 (N7mGpppAm)序列，随后是人IgE的信号肽序列，然后是E80蛋白，3' UTR和3' polyA尾（图3a）。含有改良核苷1-甲基假尿嘧啶-5/-三磷酸的修饰RNA是化学合成的，并包装成LNPs（图3b）。LNP由四种脂质组成：d-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂质，摩尔比为50:10:38.5:1.5。HEK293T细胞对E蛋白表达阳性率为52%。疫苗采用三剂计划（图3c）。E80-mRNA在小鼠中诱导了高水平的中和抗体滴度，平均PRNT50为13,000。E80-mRNA在接种疫苗的免疫能力小鼠中对DENV-2挑战提供了无菌免疫，并在感染DENV-1、DENV-3和DENV-4的K562细胞中引发了降低的ADE活性。 图3. E80-mRNA和DSV4疫苗的开发。(a) E80-mRNA的开发。RNA序列包含一个Cap1 (N7mGpppAm)序列，随后是一个人IgE的信号肽序列，然后是E80蛋白，一个3' UTR和一个3' polyA尾。(b) 修饰RNA包装成LNP的表示。LNP由四种脂质组成，d-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂质。(c) E80-mRNA的接种方案。疫苗采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第14天，最后一剂在第28天。(d) DSV4疫苗的开发。DSV4是使用每种血清型DENV EDIII的框内融合和乙型肝炎表面（s）抗原设计，与未融合的S抗原共表达形成镶嵌病毒样颗粒(VLPs) (e) DSV4的接种方案。疫苗采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第30天，第三剂在第90天。 DENV疫苗开发的挑战 开发有效的登革热疫苗取决于疫苗能够针对所有四种抗原不同的DENV血清型有效，同时引发对所有四种血清型的同等水平保护。疫苗无法引发对所有四种血清型的同等水平中和抗体可能导致ADE的诱导。因此，ADE在开发成功的DENV疫苗方面提出了挑战。已有报告称特定范围的DENV抗体滴度与严重登革热疾病的风险相关，但主要风险因素是人类以前感染过异源性DENV血清型。 目前用于研究登革热的动物模型包括非人灵长类动物（NHP）、免疫缺陷小鼠和人源化小鼠。在这些动物模型中，AG129免疫缺陷小鼠是最常用的，它们具有一定的抗病毒免疫能力，但先天免疫反应受到抑制，常用于研究体内病原机制和对DENV挑战的反应。AG129小鼠的一个主要挑战是它们缺乏干扰素（IFN）α/β和γ受体以及抗病毒免疫反应。由于无法发展出完整的免疫反应，AG129小鼠不是验证登革热疫苗效力和疫苗诱导的保护的合适模型，尽管它们在确定疫苗诱导的病毒血症水平方面非常有用。因此，缺乏一种能够重现对登革热病毒免疫反应的经济实惠的动物。 关于登革热疫苗接种期间如何引发抗体反应的关键问题仍然没有答案。除了T细胞反应外，细胞介导免疫（CMI）研究一直是登革热疫苗领域的讨论焦点。在2008年由世界卫生组织（WHO）牵头的咨询会议上，建议进行CMI的探索性研究。然而，对所有登革热疫苗实施单一通用标准以量化保护相关性是具有挑战性的。登革热疫苗之间的根本差异导致了为DENV感染定义适当的保护相关性的困难。例如，灭活疫苗可能与活疫苗相比引发根本不同的抗体反应，即使在两种不同疫苗的个体中实现了相同的中和抗体（nAb）滴度，这两种疫苗的保护功能和抗体反应的质量在体内可能不同。另一个关键区别是，一些DENV疫苗缺乏DENV非结构基因或衣壳蛋白。这一点至关重要，因为CD8+ T细胞主要针对非结构（NS）蛋白。不含DENV NS蛋白的减毒活疫苗在T细胞反应的质量和性质上有所不同。值得注意的是，包含所有DENV蛋白的减毒活疫苗已被证明能引发与自然感染诱导的反应类似的CD8+ T细胞反应。此外，CD4+ T细胞能够发挥细胞毒性功能，这可能在预防严重疾病中发挥关键作用。 最终评论 近几十年来，登革热对全球健康造成的负担急剧增加。对安全有效的登革热疫苗的需求从未如此迫切。在这一期“10Q in virology”特别问题中，我们对登革热疫苗开发的最新技术进行了全面审查，并强调了登革热领域仍然没有答案的最重要问题：每种血清型对DENV感染的严重性和疫苗效力的贡献是什么？理想的疫苗应该提供针对所有四种血清型的长期保护，在所有群体中有效，并能够安全地给无论血清状态如何的个体接种。 根据临床试验的现有数据，NIAID LATV TV003/TV005疫苗是开发中最有希望的疫苗。它在接种者中提供了强大的中和抗体水平，对所有四种血清型进行了血清转化，并且以单剂量给药，使其在发展中国家进行管理具有功能性。鉴于没有单一或通用的保护相关性来评估DENV疫苗的效力，使用挑战模型在评估疫苗效力时变得至关重要，我们建议使用挑战模型成为评估DENV疫苗保护相关性的标准。除了使用挑战模型外，NIAID LATV TV003/TV005还研究了每种单独疫苗成分在血清型背景下的免疫原性。 我们团队目前的研究正在评估每种疫苗血清型在先天免疫原性背景下的贡献。我们团队的成员能够确定定义对挑战病毒反应的先天免疫特征。先天免疫反应介导T细胞和B细胞记忆以及因此保护性免疫反应的质量和数量。DENV因其对抗先天免疫反应的能力而被广泛描述。有趣的是，先天免疫反应在DENV疫苗设计中历来被低估。在先天免疫的背景下，树突状细胞（DCs）在感应病毒病原体和通过刺激T淋巴细胞激活适应性免疫反应中起着关键作用。众所周知，在DENV感染期间，DCs成为感染的主要靶细胞。DENV的非结构（NS）蛋白已被描述为它们通过针对I型干扰素反应的机制（如cGAS-STING途径的拮抗作用等）来对抗人类细胞中的先天免疫反应。鉴于先天免疫反应的诱导对于适应性免疫的诱导是必要的，因此在疫苗设计中应考虑调节先天免疫反应的DENV NS蛋白的作用。除了DENV NS蛋白针对先天免疫系统外，DENV NS蛋白还包含针对CD8+和CD4+ T细胞的关键表位。CD4+ T细胞主要针对衣壳和E蛋白，而CD8+ T细胞主要针对NS3和衣壳。结构和非结构蛋白都诱导T细胞介导的免疫反应，因为T细胞表位分布在结构和非结构蛋白中。已经描述，在DENV疫苗接种期间，最初接种后引发高水平先天免疫细胞因子IP-10的个体在DENV挑战模型中对随后的DENV感染显示出更高水平的保护。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。