Rinat

2022年，全球ADC药物市场规模达到75亿美元，预计今年这一数字将超过100亿美元。而其中，我们可以看到越来越多本土药企的身影。公开资料显示，国内申报临床的ADC已经达到百款。在激烈的竞争中，研发差异化受到格外重视。定点偶联和双药ADC是颇具前景的创新方向之一。下面就ADC的偶联技术和双药ADC技术展开介绍。1偶联技术概况目前，全球获批上市的ADC共有15款。这其中，只有3款采用了定点偶联。它们分别是第一三共和阿斯利康开发的Enhertu、吉利德（Immunomedics）开发的Trodelvy，以及ADC Therapeutics开发的Zynlonta。从既往研究来看，定点偶联对ADC有效性、安全性、CMC等具有重要的影响。从四个方面展开分析：1）偶联位点，与抗体结合的偶联位点选择，不能影响抗体的功能;2）连接子（Linker）的稳定性，如果过早释放payload会降低疗效，增加ADC脱靶毒性;3）药物-抗体比（DAR），优化DAR对于ADC分子整体的理化性质特别重要，同时便于CMC生产;4）偶联的反应，必须是可控、快速、有选择性。下图展示了提高DAR（A）、不同结合位点（B）、对ADC的治疗效果的影响（C）。偶联技术可分定点偶联和非定点偶联。非定点偶联更多的是从氨基和巯基的偶联，而定点偶联，则涉及特定氨基酸偶联、插入非天然氨基酸偶联、酶催化偶联、糖基化偶联。Concortis报道了一种K-Lock的赖氨酸偶联技术，该技术将细胞毒性有效载荷连接到预先设计抗体位点，从而产生位点特定的ADC。这可以有效解决非定点偶联方式引起的难题。同时，Concortis开发另一种针对Cys 的偶联技术C-Lock，该技术可以增强ADC的稳定性、较好的PK行为、减少脱靶效应。与C-Lock的化学原理类似，基于链间二硫键Cross实现位点特异性偶联，能形成一个比较均一、稳定的DAR 4，但弊端是存在一定程度的巯基错配。这方面的代表公司有Abzena、UCL cancer Institute。基因泰克，引进半胱氨实现位点特异性偶联技术，优势是偶联获得均一的DAR 2，不足是需对抗体进行多步工程化修饰。引进非天然氨基酸实现位点特异性偶联，优势是偶联获得均一的DAR 2，不足是该技术需要特殊细胞平台支持。代表公司有Ambrx、Sutro等。酶催化偶联技术通过特定酶（例如MTGase、Sortase等），获得均一DAR产品，该技术的制约因素是需去除N-295糖，或者插入酶底物；代表公司有Rinat/辉瑞、Innate Pharma、NBE therapeutics、启德生物等。糖基化工程改造实现位点特异性偶联，要对抗体进行多步反应操作，以及需开发特殊试剂和酶。代表性公司有SynAffix（乐普是生物、华东医药）、GenZyme等。综合来看，定点偶联可以取得一个比较均一的产品，但同时也都存在一些技术不足，或者具体生产时面临需提高的方面。所以需要一种可控、简便、经济的定点偶联方式。2ADC双药偶联顾名思义，双药ADC就是在一种抗体上，偶联两种不同载荷，或者同一载荷，两种不同linker。研究双药ADC意义：克服耐药因素、多机制协同、扩展适应症等。ADC作为一种外源性药物，耐药性是连续给药的一大难题。同时ADC的耐药涉及到大小分子，机制复杂，如下图所示：ADC高度依赖抗原表达，来发挥其靶向细胞毒性作用，因此ADC耐药性的一个可能机制，是长期相关抗原下调。此外，内吞、转运体、溶酶体的改变也都与ADC耐药相关。既往研究表明，载荷相关的耐药，是一个重要的研究内容（作用靶点的改变、DNA修复、凋亡相关耐药、转运体导致外排），同时亦是开发双药ADC的一个重要方向。ADC载荷，根据作用机制分类：1）拓扑异构酶类、微管蛋白抑制剂类、RNA聚合酶等；2）抗菌类、免疫调节类、蛋白降解类、DDR抑制剂等。ADC双药偶联，从Payload和抗体连接的site进行区分，一个维度是single site，包括串联和并联两种方式；另一个维度是double sites，主要是Engineered、Unnatural AA、Glycan、mTG这四类，用了两步的方式，引入两个Payload。检索文献专利，目前报道最多的，是single site的这种树枝状的方式，这方面有不少公司相关的专利披露。单点双药连接容易产生高缔合物和免疫原性。因为payload大多是脂溶性分子，疏水性较强，单点双药偶联，使ADC的高缔合物升高，药效降低，毒性增加，同时会有相关的免疫原性。双点双药连接要求更复杂的偶联技术，是Engineered、Unnatural AA、Glycan、mTG这四类偶联方式组合使用。很多专家提到ADC 药物的CMC控制，一个单点偶联控制ADC尚且如此困难，引入两套机制去做，影响参数的叠加效应会使得控制难度增加。3爱科瑞思平台对于ADC研发，爱科瑞思主要有三个技术平台：新型毒素平台、多功能连接子平台、多功能定点定量偶联平台。单药偶联DAR可以精确到4、6、8，双药偶联的DAR是6、8、10。同时，ADC的均一性和稳定性是比较好的，我们不改变抗体结构，两个药物可以进行协同。DAR4对比数据展示：爱科瑞思定点定量偶联DAR4-ADC，未纯化，HIC数据可以达92%；而Seagen随机偶联DAR4-ADC，HIC数据为47%左右。此外，我们还做了其他的组合探索，例如定点定量DAR2-ADC，HIC 数据为95%；定点定量DAR6-ADC（DAR2+DAR4），HIC 数据为85%；定点定量DAR8-ADC（DAR4+DAR4），HIC 数据为89%。总结来说，爱科瑞思多功能定点定量偶联（MuSCTM, Multifunctional Site-specific Conjugation）具有以下技术特色：1）定点、定量偶联技术，可精确控制载荷药物的DAR值为2、4、6、8、10；2）多功能, 可同时搭配不同的载荷药物payloads，制备双药ADC；3）普适性高，适用于多种抗体，多类型的linker-payload；4）不改变抗体结构，不需要引进外来因素如酶促反应等；5）操作简便，无需纯化或只需简单纯化步骤，利于规模化生产。4开发案例介绍爱科瑞思管线中，目前进展最快的是ADC2122（ZV0203）, 这也是全球首个进入临床的帕妥珠ADC产品，2021年8月启动I期临床，预计今年7月完成入组。结构上，ADC2122是采用定点定量的偶联技术，高活性微管蛋白抑制剂Duo5，通过缬氨酸-瓜氨酸二肽连接子与帕妥珠单抗定点偶联，DAR值约为2；Payload-linker与A-166相同，临床II期安全有效，安全有保障。ADC2122兼具ADC和ADCC功能，有望进入一线治疗。这得益于该药靶向可以阻断Her2的同二聚体，以及Her2与EGFR、Her3、Her4的异二聚体；同时，该药的PK与裸抗帕妥珠相同，保留帕妥珠单抗的ADCC效应。我们为ADC2122制定了不同的临床开发计划，涉及单药和多种联用治疗方案，可单独开发或与曲妥珠单抗、ARX788、A166联用。目前该项目临床一期各剂量组安全性表现优异，无DLT事件，且在低剂量组已看到初步疗效，预计今年8月完成I期入组和评估。第二个在研产品是ADC2202，靶向Her2低表达适应症人群，对标DS-8201。众所周知，DS-8201开拓了Her2低表达市场，改变了乳腺癌的治疗格局，70%乳腺癌患者均可收益。Destiny Breast04临床研究表明，DS-8201对Her2低表达甚至阴性的乳腺癌患者均有临床获益。正在进行的Destiny Breast06临床研究，将DS-8201适应范围从Her2低表达进一步扩充到Her2超低表达的乳腺癌群体（90%），甚至到所有乳腺癌患者（100%）。但是，DS-8201在临床上仍存在局限性，存在严重的副作用 ，如间质性肺炎。DS-8201与药物相关的ILD/肺炎发病的中位时间为5.4个月（范围<0.1-46.8个月）；5级发病的中位时间更短，只有3.2个月（范围，<0.1-20.8个月）。ADC2202项目设计包括：1）具有高活性的payload；2）有协同作用机制的双药，D1和D2分别作用于细胞扩增的不同关键靶点，达到协同抑制细胞生长的作用，降低肿瘤产生耐药性的可能；3）创新的定点定量偶联技术和全新的linker设计和药物释放机制，可以使双药D1和D2定点分布在抗体的铰链区，确保payload在循环中稳定，在肿瘤部位特异性释放。爱科瑞思另一个项目是ADC2154，靶向临床价值和市场前景巨大的肿瘤起始细胞。靶抗原是胚胎滋养层糖蛋白是一种N-糖基化跨膜蛋白，在胚胎滋养层细胞高表达，成人正常组织表达量低或不表达。靶抗原蛋白高表达于多种实体瘤。ADC2154选择DAR 8定点偶联，抑瘤效果显著超越化疗阳参和Dxd-ADC（DAR 8）阳参，同时安全性良好，预计今年第三季度，进行IND申报。基于爱科瑞思平台技术，2023年2月，爱科瑞思与鲁南制药双方就ADC项目达成共同开发的战略合作。根据协议，爱科瑞思和鲁南制药将发挥各自优势，就1-2个项目开展ADC药物开发合作，探索其潜在的临床前和临床效果，以及商业化开发价值，实现在新一代ADC新药研发领域上的合作共赢。— 小结 —面对激烈的ADC行业竞争，爱科瑞思的MuSCTM偶联技术脱颖而出，定点偶联、双药ADC拥有更广阔的市场前景和应用空间。该技术除支持公司的创新ADC产品开发之外，还欢迎与国内外的制药公司和生物技术公司合作，共同开发、授权使用或委托开发。

引言 疫情爆发后的三年间，跨国药企的发展或如鱼得水，或艰难经营，或痛苦转型。后疫情时代的这个三季度的季报注定是不平静的，很多机会和危险都在孕育，准备得当的公司，会迎来新的春天，而有一些则将没落和萎靡。时势造人而人主宰了公司的运势。那我们来根据季报给这些MNC公司的未来把把脉。01：高管团队写老东家（辉瑞）还是轻车熟路，熟悉的管线和人。它动一动就知道它想干嘛。众所周知的是辉瑞里面的宝贝不少，缺少的是慧眼识珠的人和能够运筹帷幄的帅才。新CEO Albert Bourla为希腊裔，学的是兽医，大家都以为辉瑞选了个青铜战士，没想到人家原来是黄金圣斗士。几位希腊裔的高层：比如Merck的传奇CEO-Roy Vagelos，再生元的CSO-George Yancopoulos, Alynam的前CEO-John Maraganore都在业界最瞩目的几家制药/生物制药公司担任政策制定者。除了希腊裔的一脉相承，Roy和George还是哥伦比亚大学的校友，George也在大力栽培他的同时希腊裔的小师弟Christos Kyratsous 和Aris Baras年纪轻轻已经是再生元的SVP。不得不说希腊人的圈子也是相当的抱团且争气，正如另一个古文明的印度。William Pao 从罗氏过来负责后期临床和药物开发。新任CFO David Denton (前任CFO Frank D'Amelio相当不错，把辉瑞的财政事务管理的井井有条，对他印象很深，尤其是对财务数字如数家珍)和新任CBIO 从咨询公司mckinsey过来的Aamir Malik顶替了John Young，Aamir能不能跨界搞好生物医药战略投资和BD，让我们拭目以待。02：研发效率和成功率    研发效率和成功率的提升，从临床一期到商业化的成功率提高到21%，近2倍于业界平均水平. 从FIH到商业化批准的研发周期也缩短到6.6年。新的疾病领域架构把6大领域划归为新的三个集团，凸显了肿瘤和疫苗领域的核心地位。毛利率约67%，汇率的影响约4%，全年研发投入预计11.5-12B2009年670亿收购惠氏，这么多年下来剩下最有价值的资产就是疫苗了。辉瑞当时的收购旨在进入冉冉升起的生物制药领域，可惜在抗体类药物一无所获，至今管线产品除了合作的Enbrel和几个生物类似药，竟然没有一款自研的抗体药物，完整的错过抗体时代最辉煌的20年。究其原因，一是当年收购靶的，还是考虑了安进，奈何人家宁死不从，拼了命用帐上的现金的回购股票，就是为了逃离辉瑞的魔掌；二是当年识人不淑，把抗体的大业委托给了一个不靠谱的Rinat。要细数辉瑞当年砸在Rinat手上的项目，都是壮观的名单，最出名的PCSK9抗体Bococizumab，每每被大家用来作为反面教材书，制药的错误典型。其他的壮烈名单包括anti-NGF, Trop2 ADC RN927C, PD-1 antibody, A beta 抗体 and more。这也许是辉瑞历史上坑爹最厉害的一个收购了。记得当年的年底研发大会，将两项顶级大奖都颁发给了Rinat, 一个是PCSK9抗体，一个是TG 酶催化的偶联ADC. 当时就和部门老大聊，这个抗体有没有做的必要性和酶催化技术的是否有产业化的可行性。老大一句话，they must have it figure out. 当年的辉瑞大佬们在Lipitor的风光中一致的mentality就是一切都在掌控中。当年对辉瑞的几个预言都是相当的准确，比如2013年预言2年内辉瑞将终止轰轰烈烈的ADC研发和遣散相关团队和2015年预言3年内辉瑞会砍掉即兴收购的生物类似药部门，都是无比的精准。对辉瑞的领导层的战略和脾性还是了解的很透彻地。研发大头 Mikael Dolsten 当年从惠氏过来，这十几年居然还没被换掉，Mikael 是那种典型的你看不出他哪里好，也说不出他哪里不好的领导，这么多年他就没有做过一场研发的总结报告或者清晰阐述其研发方针和指向标。他的班子对于药物研发的敏锐度和深度都是中人之姿。 当年的CEO Ian Read擅长商业化，至今还记得他上任时给我们研发的训话“你们研发只要争点气，批一个药，我们就能卖成blockbuster,10亿级别的药物。”老头子还是说到做到，Xeljanz，Vyndaqel，Ibrance，Xtandi ,Inlyta, Xalkori都是实现了很好的销售成绩。03：第三季度季报&管线分析季度营收22.6B, 两款新冠药物占据52.6%的营收. Prevnar, Eliquis,和Vyndaqel的收入增加，令人担忧的是Ibrance和Xeljanz在日益激烈的竞争中出现下滑趋势。去除新冠药物贡献，实际管线药物的收入略增2%。从Biohaven收购的CGRP受体拮抗剂，以口服（NURTEC）和鼻喷（Zavegepant）两种制剂形式，是唯一获批即可预防也可治疗偏头痛药物，同时鼻喷剂如果获批也是第一款此类鼻喷药物。这款药物在偏头痛这个潜力很大适应症市场，配合辉瑞强大的销售很可能成为大型重磅药物。CGRP抗体，口服小分子，鼻喷剂这个竞争也是一个经典案例。顺带提一下，这又是一款被BMS转让出去被精加工成为一款重磅药物。收购而来的S1P 抑制剂Etrasimod: 在UC, Crohn's Disease, AD等适应症的数据也将揭晓，此靶点已经有诺华以及BMS的上市药物。Jak3/pan-tec 抑制剂Ritlecitinib在头秃症的突破性疗法.RSV 全球每年患病人数64m，住院治疗人数约3百万，死亡人数约16万例。主要影响人群为65+高龄和5岁以下儿童，辉瑞针对RSV布局了两类药物，一类是疫苗，一类是病毒蛋白抑制剂。这个领域将面对激烈的竞争包括GSK的RSVPreF3, 已经递交了上市申请，这款竞品对下呼吸道感染保护率达到82.6%，在老年人重症保护率达到94.1%，值得一提的是GSK的RSV疫苗在孕妇使用的临床上遇到安全问题已经被停置。辉瑞的PreF 疫苗针对亚群A和B对中度下呼吸道感染保护率达到85.7%。AstraZeneca 和 Sanofi的RSV 抗体nirsevimab最近在EU获批上市，这款单抗临床结果表明该药有效降低受试者74.5%下呼吸道感染风险。辉瑞CEO特别支持抗体药物的价格相对昂贵且有copay, 而辉瑞的孕期疫苗相对GSK没有佐剂，安全性对比也有优势。RSVpreFVaccine Program 包括成人疫苗和孕妇疫苗旨在从母体传递免疫抗体至新生儿，实现对0-6月婴儿的保护。收购ReViral获得的抗病毒小分子药物Sisunatovir 在临床研究中，用药三天后对比安慰剂能显著降低病毒载量。LORBRENA多发性骨髓癌在美国每年新增34,000 例， 全球每年新增176,000 例. 皮下注射的 BCMA-CD3双抗elranatamab在临床研究的安全性上还是有不小的CRS和其他安全隐患。二期剂量每周一次1000μg/kg，同剂量在一期研究中获得ORR为83% (n=5/6)。这款双抗的活性应该是过强，临床用药上不仅需要预先使用辅助药物，同时将起始剂量分两次逐步间隔·3天注射的priming dose scheme，同时需要分别留院观察48hr和24hr. 总缓解率（ORR）为60.6%，但是血液毒性和CRS都是有较高的比例。这款双抗的竞争力一般。              Talzenna+Xtandi联合治疗mCRPC也是辉瑞在前列腺癌布局一枚重要棋子。小分子GLP-1 在280万的化合物库中筛出两个候选化合物:Danuglipron and PF-07081532. 前者的副作用限制了它的治疗窗口，而后者的临床数据要到24年才能揭晓。竞争对手已经强势上市，尴尬的时间差可能造成市场被对手占据统治性地位。04：结语及展望新官上任和BioNtech的mRNA合作，一战封神，大家也见识了新CEO的雷厉风行和果敢，这种All-in模式，上一次见到是默克在Keytruda上，这种巨无霸举全司之力，以及多年积攒的技术底蕴，无论是研发，生产，临床和商业化一旦能形成统一的目标，唤醒了沉睡的巨人在短期内实现疫苗开发和上市。和老同事们交流，言语间都透露了无比的自豪感。辉瑞近几年的收购和合作一改以前的大鲨鱼作风，一口倾吞，更多的是bolt-on的中小型收购，选择适合自己管线协同和优势的项目。在新冠药物提供充足的现金以后，可以预见辉瑞会在这个估值低迷期，在市场上买买买。未来的大饼，2025-2030 辉瑞将面临近专利过期带来的170亿的药物营收减少，希望通过BD带来25B的营收，和2020及未来18个月内获批的药物带来20B的营收(这个目标有点托大），还有额外内部管线的惊喜。总体算下来，就是2025-2030的五年间营收至少增加18B+X factor. 但是管线目前情况应该是很难有这样的增长潜力，所以还会是收购为主。辉瑞的市值现在265B, 股价$47.2，P/E约7.14，考虑到近期利润主要是被短期新冠药物带动而非长期的业务增长。去除这部分收入，校正的P/E大概是15. 也是市场对辉瑞其他业务的长期增长和肿瘤业绩的下滑的担忧。个人判断，还是有不错的上升空间。辉瑞的估值比较难预测，在于新冠的影响时间，病毒突变，突破频率和规模，以及政府政策。在季报会议上，Albert回答投资人对于新冠药物后续市场的预期，他以商人的角度回答，有可能保持像常规流感疫苗一样季节性波动至2030年，辉瑞的新冠收入会有持续的稳量，150亿一年不是不可能。同时由于政府停止采购，辉瑞也宣布将新冠疫苗价格提价至100-130美元,近三倍于现供应价格。Albert的商人思维还是暴露无遗，倘若疫情持续到2030，世界估计已经崩溃。辉瑞乘着新冠药物和mRNA平台的东风，当别的药企被疫情折腾的不堪，时不时传出裁人的消息，辉瑞开始了巨人的进击。Albert的团队还有待考验，毕竟长期的增长还是要看管线开发和执行，目前还没有特别明星的项目和有集中优势的领域。但是士气正盛，资金充裕，足以再接再厉打几场大战役。转载声明：本文转载自「煮酒论药」，不构成任何投资/用药建议！BiG近期活动11月18-19日，苏州BiG New Modality闭门会，创新正当时！12月21-22日，上海大咖带队，新秀集结！以创新利刃，破内卷之局扫码加入BiG生物创新社读者交流群，分享、交流纯粹的行业知识，非诚勿扰！BiGScientific Driven, Making Impact!创新生态丨医药论坛丨行业分析媒体公关丨BiG Webinar联系我们商务：Max   18662346610媒体：Kathy 17621909690

上篇主要介绍了基于半胱氨酸、赖氨酸的经典偶联技术以及新开发的创新偶联技术。本篇继续对基于羰基、酰胺、叠氮基以及基于其他一些氨基酸官能团的偶联技术做一介绍。羰基(-C(O)R)羰基(醛和酮基)不是天然存在于蛋白质中的，而是要经历与天然蛋白质官能团的完全正交的各种共轭化学反应。通过NNAA的遗传编码或酶法步骤，在单抗上很容易产生羰基。下面介绍下在ADC中应用醛和酮的两个主要的生物偶联反应。肟连接O-烷基羟胺(氨氧基)可以与醛或酮官能团发生特异性反应。氨氧基与任一基团的反应都会产生一种肟键，如果它与酮形成，它是相对稳定的，但如果与醛基团反应，则该键不太稳定。天然抗体不具有醛或酮官能团，Schultzet等人开发了基于以酮基团(对-Ac-苯丙氨酸，p-AcF)为特征的NNAA遗传编码并被Ambrx公司应用。p-AcF可以在单抗中的任何给定位置被工程化，随后的肟连接产生ADC(图1)，应用该技术产生的两款ADC产品ARX788和AGS62P1/ASP1235，已被批准用于临床。图1. 用基因编码的p-ACF与肟基偶联产生ADC另一种将酮安装到抗体中的方法是LegoChem，这也涉及抗体的工程化。在抗体轻链上首次引入 C 端 CAAX 融合后，可以在法尼基转移酶的影响下用合成的氧代异戊二烯衍生物进行随后的烷基化，该过程通常称为异戊二烯化（图2）。同样，ADC的最终生成是通过与适当的O-烷基化羟胺的酮基连接发生的。应用LegoChem技术的ADC也已进入临床，如FS-1502(LCB14-0110)。图2. LegoChem方法Hydrazino-Pictet–Spengler连接肟偶联化学的一个缺点是需要大量过量的试剂和酸性条件(pH 4.5)才能使反应以相当快的速度进行。作为另一种选择，Agarwalet等人开发了Pictet-Spengler反应的变体，在中性pH下与醛反应生成亚胺离子中间体，该中间体重排为含有非常稳定的C-C键的循环产物。基于这一Pictet-Spengler反应，开发了一种基于甲甘氨酸生成酶(FGE)作用下工程半胱氨酸(C端LCTPSR的一部分)被酶氧化成醛的策略。接下来，与细胞毒性有效载荷功能化的N，N-二甲基肼-吲哚试剂孵育会导致稳定的环状偶联物的自发形成(图3)。该方法已经应用于临床药物TRPH-222/CAT-02-106。图3. Hydrazino-Pictet–Spengler连接方法酰胺基(-C(O)NHR)到目前为止，酰胺基是蛋白质中存在的最普遍的官能团，因为蛋白质骨架中的所有氨基酸都以这种方式连接。此外，谷氨酰胺和天冬酰胺都具有含酰胺基的侧链。因此，酰胺基似乎是位点特异性偶联的一个不合逻辑的候选者，它的低反应性进一步加强了这一点。然而这一类独特的基于酰胺基的生物偶联能够被天然酶巧妙应用以在含有天然氨基酸(主要是谷氨酰胺)的酰胺基上安装一个官能团。谷氨酰胺的酰胺化谷氨酰胺转氨酶(TGase)广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物和微生物中。TGase 可以通过共价结合赖氨酸和谷氨酰胺残基侧链，主要通过催化谷氨酰胺-羧酰胺基团和赖氨酸-氨基之间异肽键的形成，形成分子间和分子内蛋白质交联复合物。在适当的条件下，TGase也可以用来选择性地将赖氨酸功能化的LD或其他具有末端氨基的LD连接到抗体中谷氨酰胺残基的侧链羧胺基团上(图4)。图4. 谷氨酰胺转氨酶作用下赖氨酸功能化的酶结合抗体需要注意的是，单抗中的天然谷氨酰胺通常不是天然TGase的底物。因此，已经采用了各种策略来实现异肽键的形成：(A)通过TGase的突变；(B)通过插入或融合含有C-端肽标签的谷氨酰胺；(C)通过酶去除抗体多糖以暴露Q。例如，Dophen公司开发了一种工程形式的TGase，正在开发针对HER2靶向的DP303c，用于治疗实体肿瘤。Rinat/Pfizer的研究人员转而使用天然TGase，结合抗体工程，在不同位置引入TGase识别序列(Q-Tag)。基于LLQGA的C端与抗体重链的融合，Pfizer将靶向TROP-2的ADC药物 PF-06664178/RN927C推进临床(现已停产)。第三种策略是由Innate Pharma探索的，该策略是基于Schibliet等人最初开发的一种基于酶促抗体脱糖来释放谷氨酰胺HC-Q295的技术。利用该技术的Innate ADC(IPH43)药物目前处于临床前阶段。转肽酶（sortase）的酰胺化反应转肽酶的主要功能是帮助蛋白质附着到细菌细胞壁上，并组装菌毛。转肽酶作用于含有 C 端细胞壁分选信号的分泌蛋白，该信号含有一个五残基识别基序，例如 LPXTG，可以与特定的寡甘氨酸受体底物发生酰胺化反应 ，从而用受体的寡甘氨酸片段取代LPXTG的末端甘氨酸。这个方法已经用于产生ADC(图5)。例如，NBE Therapeutics公司利用这一方法，通过将LPETG标签融合到重链C-末端，然后与五甘氨酸修饰的细胞毒有效载荷PNU-159,682连接，开发了已经进入临床的ADCs 药物NBE-002。同样，GeneQuantum开发了基于重链 C 端 LPGTG 的GQ-1001药物。图5. 转肽酶介导的Gly5-Linker有效载荷与C端LPXTG标记抗体的偶联叠氮基团(–N3)叠氮基团最为人所知的是其与乙炔基团的“点击反应”中的应用。点击反应也被称为铜催化叠氮-炔环加成反应(CuAAC)，现在被认为是任何成键反应的首选方法。然而，铜也会引起不必要的副反应，如组氨酸或蛋氨酸氧化，由于其毒性性质，在药物制造中很少使用。SPAAC成为了一种强有力的替代品，并且已经开发了多种环辛炔试剂。基因编码氨基酸的无金属点击NNAAs的遗传编码是一种有效的方法，可以将唯一的化学标签安装在单抗的理想位置。Sutro Biophma开发了一个无细胞蛋白表达系统，通过特定位置掺入p-叠氮甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)，适合于随后LD点击化学的偶联以此制备ADC(图6)。由于无细胞蛋白表达的效率，进行了位点扫描以确定最佳偶联位置，已被用于各种ADC项目。例如， STRO-001（DAR2 ADC，HC-F404的偶联）、STRO-002（DAR4 ADC， HC-Y180 和 HC-F404 中的偶联）。图6. p-AMF的遗传编码使其能够通过无金属点击化学而特异性的偶联酶修饰的多糖的无金属点击菌株促进的环炔与叠氮化物的环加成反应也被用于GlycoConnect，这是Synaffix开发的一项技术，其核心是将叠氮糖以酶促方式引入到天然抗体的多糖上。抗体首先在UDP 6-叠氮基GalNAc存在下经受内切糖苷酶和糖基转移酶(GalNAc-T) 两种酶的作用，以便将天然糖转化为均质的、截断的和叠氮标记的三糖(图7)。接下来，对叠氮标记的抗体进行LD偶联，以产生均一的ADC。GlycoConnectt技术目前被用于三个临床ADC药物：ADCT-601(ADC Therapeutics)、XMT-1592(Mersana Therapeutics)和MRG004A(Miracogen)。图7. UDP 6-叠氮基GalNAc存在下用内切糖苷和GalNAc-T进行多糖建模，通过连接有效载荷的无金属点击偶联获得均一的ADC用于抗体偶联的其他官能团除了目前在市场和临床ADC中使用的偶联技术。许多下一代偶联方法也正在开发中。苯酚(酪氨酸侧链)广泛的双正交标记策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚侧链上的选择性化学。酪氨酸出现在蛋白质序列的频率中等 (自然丰度为3.3%)，从而为其独特的苯酚侧链的位点选择性标记提供了机会。尽管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白质表面，但它也可以参与氢键，并且由于其氧化还原潜力，可以形成酪氨酸自由基，使电子转移。因此，酪氨酸残基经历了高度多样化的生物修饰，如硝化、氧化、交联、AMP化、卤化或糖基化。Bruinset等人报道了一种最新的方法，该方法基于从特殊设计的酪氨酸部分生成1，2-苯二酮衍生物，然后通过无金属点击环加成的环辛炔环(BCN)来形成稳定的环辛烯键。通过使用mushroom酪氨酸酶选择性地氧化可溶于溶剂的酪氨酸，在抗体表面生成1，2-苯二酮基。甲硫醚(蛋氨酸侧链)蛋氨酸是一种主要负责保护人体免受氧化应激的氨基酸。因此，与其他氨基酸残基相比，其功能化不太可能损害蛋白质的功能。另一个优势是蛋氨酸的丰度较低(约1.8%)，这降低了特定标记的概率。2017年，Lin等人报道了在一系列生物相容反应条件下，通过氧化还原化学选择性标记恶氮杂环类试剂，然后点击化学连接有效载荷，实现了高选择性、快速和稳健的蛋氨酸标记。该技术适用于鉴定整个蛋白质组中的高活性蛋氨酸，也可用于产生ADC，例如选择性结合到工程化的曲妥珠单抗Fab片段上的C-末端蛋氨酸标签。2018年，Taylor等人还报道了一种C末端工程蛋氨酸的选择性反应，该反应基于高价碘试剂的亲电反应性，以及蛋氨酸的侧链SMe基团具有完全化学选择性的点击化学。尽管在概念上两者都非常优雅，但发现所得蛋氨酸偶联物的稳定性一般，需要进一步优化才能成功应用于ADC 领域。咪唑(组氨酸侧链)与蛋氨酸一样，组氨酸是另一种相对较低的天然丰度(2.9%)和低内在亲核性的氨基酸，因此有可能成为一种潜在的适合于抗体位点特异性结合的氨基酸。2017年，Sijbrandi引入了一种新的抗体偶联方法，使用基于阳离子有机铂的连接子随机连接抗体的组氨酸，以稳定地连接LD。基于铂的连接子的结合导致ADC具有不受影响的抗体结合活性，DAR在2.5-2.7范围内，并且大约85%的有效载荷结合到Fc区域。小编小结抗体偶联技术领域正在迅速发展。虽然早期的ADC基于有效载荷连接到赖氨酸或半胱氨酸侧链上，目前仍在该领域占据主导地位。但随着近年来技术的进步，多种创新的偶联技术正在涌现，为ADC的制备拓宽了工具箱，从而有助于该领域向具有更宽的治疗窗口和更好治疗效果的ADC进一步发展，这无疑将是令人兴奋和期待的。参考文献1.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).2.Characterization of disulfide bond rebridged Fab–drug conjugates prepared using a dual maleimide pyrrolobenzodiazepine cytotoxic payload.3.Site-specific conjugation of native antibodies using engineered microbial transglutaminases.4.Structure and dynamics of a site-specific labeled Fc fragment with altered effector functions.