Shanghai Xinyi Pharmaceutical Co. Ltd.

编辑：丹青 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的主要亚型之一，临床典型症状包括腹痛、慢性腹泻、便血和体质量减轻。UC与生活方式、饮食模式、遗传易感性和免疫失衡密切相关，近年来全球发病率不断上升[1]。UC通常具有复发性的病程，不仅严重损害患者的工作能力和生活质量，还增加了抑郁、焦虑等精神疾病的发病率[2]。心理症状是IBD的重要共病，其对中枢神经系统（central nervous system，CNS）的肠外影响已得到广泛认可。肠道屏障结构和功能的改变会诱发神经炎症反应，进而导致情绪和行为障碍的发生[3]。据报道，在IBD活动期，抑郁和焦虑症的患病率持续增加，抑郁症患者的IBD发病率也更高，表明两者背后存在共同的生物学基础[4]。IBD所致肠道屏障损伤及全身炎症反应，可通过循环促炎因子直接作用于CNS诱发神经炎症，并改变情绪调节相关的神经递质代谢，诱发抑郁样行为；反之，抑郁所致的神经免疫紊乱、肠道菌群失衡及肠-脑轴下行易化效应等机制加重IBD的炎症和病程。两者相互驱动，最终导致肠道炎症与情绪障碍持续共存、互为加重。 研究表明，肠道内的先天免疫细胞介导宿主防御反应、炎症调节和组织修复过程，而免疫失衡是诱发UC的关键因素[5]。其中Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号转导和转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路是细胞功能的关键通讯枢纽，在自身免疫性疾病背景下具有重要意义。多项研究观察到UC患者血清和结肠组织中促炎细胞因子的水平与肠黏膜损伤程度呈正相关，且肠道损伤状态与JAK2/ STAT3蛋白的异常表达密切相关[6]。当前研究多聚焦于免疫炎症、肠道菌群失衡、黏膜屏障功能障碍、铁死亡及氧化应激等领域，但其与CNS的互作机制仍不清楚。研究表明，高脂饮食引起的肠道屏障损伤可以通过调节肠道微生物群落的平衡来修复[7]。UC患者的肠道菌群可下调神经肽信号通路的基因表达，从而在接受粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）的小鼠中诱导焦虑样和抑郁样行为[8]。而来自健康青少年的FMT则可显著改善抑郁模型小鼠的抑郁样行为，表明大脑通过复杂的肠-脑轴与肠道进行双向交流[9]。 目前临床上常用的UC治疗药物为糖皮质激素和免疫调节剂，长期应用会引起严重的不良反应。中药由于临床应用广泛、不良反应少，在IBD治疗中显示出潜在优势。枳术宽中胶囊（Zhizhu Kuanzhong Capsule，ZZKZ）是一种源自汉代张仲景所著《金匮要略》中经典方剂枳术汤的中成药，由白术、枳壳、柴胡、山楂4味中药组成，具有健脾和胃、理气止痛等功效。研究表明柴胡和枳壳可以缓解焦虑和抑郁[10-11]。白术可以促进其多糖被肠道细菌消化，从而改善紊乱的肠道菌群[12]。此外，白术和山楂具有护胃、抗炎和促消化的作用[13-14]。临床上，ZZKZ广泛应用于功能性消化不良、餐后不适综合征、胃食管反流及便秘等胃肠道疾病的治疗，并能够有效缓解伴随的焦虑和抑郁等精神症状[15-18]。最近研究表明，ZZKZ对功能性消化不良患者的益处可能与其促进胃排空和对特定中枢神经系统通路的调节作用有关[19]。然而，目前关于ZZKZ的研究多集中于临床疗效观察，其在缓解胃肠道组织损伤及改善伴随情绪障碍方面的具体作用机制尚未阐明，在一定程度上制约了其更广泛的临床应用与深入开发。本研究通过构建葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC小鼠模型，系统评价了ZZKZ对UC及其伴随抑郁样行为的改善作用，采用液质联用技术进行成分鉴定并结合网络药理学筛选潜在作用靶点与信号通路，利用分子对接及分子动力学模拟验证主要活性成分与核心靶点的结合特性。同时通过整合肠道菌群分析与血清非靶向代谢组学，阐明其调节肠道微生态及代谢通路的作用特点，以揭示其潜在作用机制。本研究为阐释中医药治疗UC及相关情绪障碍的作用机制提供了新的实验依据。 1  材料 1.1  动物 SPF级雄性BALB/c小鼠36只，8周龄，体质量20～23 g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号SCXK（鄂）2020-0018，动物质量合格证号42000600060657。小鼠在室温（22±2）℃、相对湿度60%、12 h明暗循环的受控条件下适应饲养7 d，自由进食饮水。动物实验经湖北中医药大学动物伦理委员会批准（批准号20230222）。 1.2  药品与试剂 ZZKZ（国药准字Z20020003‌，批号231008）由郎致集团双仁制药有限公司提供；DSS（批号160110）购自美国MP Biomedicals公司；柳氮磺吡啶肠溶片（sulfasalazine，SASP，批号09220718）购自上海信谊药业有限公司；β-actin抗体（批号AC251110096）、Occludin抗体（批号00123202）、Claudin-1抗体（批号00143561）、紧密连接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）抗体（批号00173684）购自武汉三鹰生物技术有限公司；JAK2抗体（批号R24775）、p-JAK2抗体（批号R381556）、STAT3抗体（批号200964）、p-STAT3抗体（批号310019）购自成都正能生物技术有限公司；人尿素粪便隐血试剂盒（批号20221104）购自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈、甲酸和乙酸铵均为色谱级，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；HRP二抗（批号15526003EE）购自BioWorld公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号20241025）、阿利新蓝-过碘酸-雪夫（Alcian blue-periodic acid-Schiff，AB-PAS）染色试剂盒（批号20250730）购自Biosharp公司。 1.3  仪器 Ultimate 3000型超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱系统（UPLC-LTQ/Orbitrap HRMS，美国Thermo Fisher Scientific公司）；WD-9415C型超声波清洗器（北京六一生物科技有限公司）；ES225SM-DR型电子天平（上海精科实业有限公司）；D3024R型低温离心机（美国Scilogex公司）；SWE-C6型样品快速研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。 2  方法 2.1  ZZKZ的UPLC-HRMS分析 精确称取ZZKZ内容物200 mg，溶解于10 mL 80%甲醇中，超声提取30 min，提取液于9 000×g离心10 min，取上清液进行分析。采用Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～20 min，95%～70% A；20～30 min，70%～35% A；30～35 min，35% A；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样体积2 μL。采用高分辨质谱在正、负离子模式进行数据采集，离子源电压为3.5 kv，毛离子传输管温度为320 ℃，辅助气加热温度为350 ℃，鞘气体积流量为35 L/min，辅助气体积流量为15 L/min，检测模式为Full MS-ddMS2，一级质谱扫描范围m/z50～1 000，分辨率为60 000，二级质谱采用高能碰撞解离（high energy collision dissociation，HCD）模式，分辨率为15 000，HCD裂解能量35 V。 2.2  网络药理学分析 通过中药系统药理数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://old. tcmsp-e.com/tcmsp.php）和SwissADME筛选成分，在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）中检索化合物对应的典型SMILES，并将其导入到SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch）中获取靶点。筛选和去重后，获得ZZKZ活性成分的潜在靶点。以“ulcerative colitis”和“depression”为检索词，从GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、TTD数据库（http://db. idrblab.net/）和OMIM数据库（https://www.omim. org/）筛选疾病相关靶点，使用UniProt数据库对靶点进行标准化。使用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，Venny 2.1软件筛选ZZKZ、UC和抑郁的重叠靶点。基于STRING数据库（https://cn.string-db.org/）构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并使用CytoHubba插件进行筛选，将PPI数据导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。使用Metascape数据库（https://metascape.org/）进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，GO分析包含生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞成分（cellular component，CC），选择P值最大的前10个GO条目和前20个KEGG通路，通过微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）将结果可视化为条形图和气泡图。 2.3  分子对接与分子动力学模拟 从PubChem数据库检索活性成分的结构，并使用AutoDock Tools（https:/autodock.scrips.edu/）进行电荷最小化和可旋转键检测。从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取相关靶点的结构，并去除其结合的小分子和水分子。采用配体对接模拟来评估化合物与关键靶点之间的结合活性。根据受体的活性位点确定对接盒范围。使用AutoDock Vina进行受体-配体对接，对接分数越高，表明化合物与靶点的结合亲和力越强。使用PyMOL软件进行可视化。使用GROMACS 2022.3软件进行分子动力学模拟。 2.4  动物分组、造模与给药 将BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组及ZZKZ低、中、高剂量（0.4、0.8、1.6 g/kg，分别为临床等效剂量的0.5、1、2倍）组和SASP（250 mg/kg）组，每组6只。除对照组外，其余小鼠连续8 d自由饮用3.5% DSS溶液建立UC模型。造模第2天起，各给药组ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积水，1次/d。给药7 d后，通过颈椎脱臼法处死小鼠，收集血液、肠道内容物、脑、脾脏和结肠组织，于−80 ℃保存。 2.5  疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分的测定 每天固定时间记录小鼠体质量并观察粪便情况及其是否带血。采用隐血试剂盒评估粪便隐血的存在。根据体质量减轻程度、排泄物的黏度和小鼠的粪便潜血指数测定DAI评分[20]。动物处死后测量结肠长度，称定脾脏质量并计算脾脏指数。 2.6  旷场实验 在弱光下进行旷场实验以监测小鼠的探索行为。将小鼠放置于45 cm×45 cm×30 cm的方形盒子中央区域，记录其5 min内的运动轨迹、运动总距离和平均运动速度。每只小鼠测试后，在箱体中喷洒75%乙醇并擦拭干净，以避免气味干扰。 2.7  糖水偏好实验 实验前，小鼠禁食禁水24 h。适应期每个笼子放置1瓶1%蔗糖溶液和1瓶水，12 h后交换2个瓶子的位置。测试开始时，每只小鼠单独置于1个笼子中，放置1瓶1%蔗糖溶液和1瓶水2 h，实验期间交换1次2个瓶子的位置。记录测试前后瓶子中蔗糖溶液和水的质量，计算糖水偏好指数。 糖水偏好指数＝蔗糖摄入量/(蔗糖摄入量＋水摄入量) 2.8  HE染色观察结肠组织和脑组织病理变化 取结肠组织和脑组织，于4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h，PBS充分漂洗去除残留固定液；经常规脱水、透明、石蜡浸蜡包埋，制备厚度为4μm的石蜡切片。切片经烘烤、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，进行HE染色，透明处理和封片后，于显微镜下观察并拍照。 2.9  AB-PAS染色观察结肠组织黏液分泌 小鼠结肠组织经固定、切片、脱蜡后，进行PAS氧化、Schiff试剂染色、苏木素染色和脱水处理，封闭，于显微镜下观察并拍照。 2.10  qRT-PCR检测结肠组织和脑组织中炎症因子的表达 取小鼠结肠组织和脑组织，按照试剂盒说明书提取组织中总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。以β-actin为内参基因，采用2−∆∆Ct法计算肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6的mRNA相对表达量。引物序列见表1。 2.11  16S rRNA测序 收集对照组、模型组和ZZKZ高剂量组小鼠肠道内容物，通过16S rRNA基因测序检测肠道菌群。采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法从样本中提取基因组DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取质量，随后使用NanoDrop 1000分光光度计测量DNA浓度。对小鼠结肠组织中的高度可变区V4区进行扩增，引物为515F（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）和806R（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’），鉴定细菌多样性。PCR产物通过凝胶电泳验证后，扩增产物被纯化并定量。根据所扩增的区域构建文库，并基于Illumina测序平台对文库进行双端测序。对测序数据进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种分类分析。对OTUs进行丰度分析、α多样性计算以及Venn图和花瓣图构建。同时使用主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）直观显示各组间微生物群落的差异。此外，选择线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）和线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）等统计方法对各组样本间物种组成和群落结构的差异进行显著性检验。 2.12  血清非靶向代谢组学 将100 μL血清样本与300 μL甲醇混匀，涡旋振荡后，冰上孵育5 min，4 ℃、15 000×g离心20 min，收集上清液用于LC-MS分析。采用Hypersil Gold C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～1.5 min，98% A；1.5～3 min，98%～15% A；3～10 min，15%～0 A；柱温40 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样体积2 μL。采用电喷雾离子源（electrospray ionization source，ESI），喷雾电压3.5 kV，鞘气体积流量35 psi（1 psi＝6.895 kPa），辅助气体积流量10 L/min，离子传输管温度320 ℃，离子导入射频电平60，辅助气加热器温度350 ℃，质谱扫描范围m/z100～1 500，MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。随后使用MetaboAnalyst 6.0（https:// www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）在线平台对差异代谢物进行富集分析。结合KEGG数据库的检索结果和相关文献对比，系统分析差异代谢物涉及的代谢通路及其生物学意义。 2.13  Western blotting检测结肠组织JAK2、p-JAK2、STAT-3、p-STAT3、ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达 取结肠组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解，裂解液于4℃、12 000×g离心5 min，收集上清液，使用BCA蛋白测定试剂盒进行定量。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1.5 h后，加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗，室温孵育1 h。加入ECL化学发光试剂显影，多功能扫描仪扫描条带，使用Image J软件分析条带的灰度值。 2.14  统计学分析 数据以表示，使用Prism 10.1.2软件通过单因素方差分析和t检验评估组间差异的显著性。 3  结果 3.1  ZZKZ的成分分析 对ZZKZ进行UPLC-HRMS分析，分别于正、负离子模式下获取总离子流图（图1）。通过自建质谱数据库比对共鉴定出35种化合物（表2），包括20种黄酮（苷）类、5种酚酸类、6种三萜（皂苷）类、3种倍半萜内酯和1种生物碱，其中25种成分经对照品比对确证结构。 3.2  ZZKZ改善DSS诱导的UC小鼠结肠损伤 小鼠自由饮用3.5% DSS溶液建立UC模型（图2-A），考察ZZKZ对UC小鼠结肠损伤的改善作用。模型组小鼠表现出严重的体质量下降、腹泻和肠道出血；而ZZKZ治疗能够明显逆转小鼠结肠缩短和体质量下降（图2-B～D，P＜0.05、0.01），降低DAI评分（图2-E，P＜0.01），并降低小鼠的脾脏指数（图2-F，P＜0.01）。HE染色结果（图2-G、H）显示，ZZKZ治疗显著缓解了UC小鼠的结肠损伤，ZZKZ高剂量组和SASP组小鼠的组织病理评分显著降低（P＜0.01）。AB-PAS染色常用于区分酸性黏液和中性黏液，显微镜下中酸性黏液呈蓝色，中性黏液呈紫红色，细胞核呈蓝色。AB-PAS染色结果（图2-G）显示，模型组小鼠结肠组织酸性黏液和中性黏液分泌明显减少；与模型组比较，ZZKZ高剂量组和SASP组小鼠结肠组织酸性黏液和中性黏液分泌明显增加。炎症因子过度表达是UC的显著特征。如图2-I～K所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达水平均显著降低（P＜0.01）。以上结果表明ZZKZ对DSS引起的肠道炎症具有保护作用。 3.3  ZZKZ改善DSS诱导的UC小鼠抑郁样行为 对小鼠进行行为学测试以评估UC伴发的抑郁样行为及ZZKZ的干预效果。如图3-A～C所示，在旷场实验中，模型组小鼠的自发运动和探索行为均少于对照组，表现为运动总距离和平均运动速度均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，ZZKZ高剂量组和SASP组小鼠运动总距离和平均运动速度均显著升高（P＜0.05、0.01）。如图3-D所示，在糖水偏好实验中，与对照组比较，模型组小鼠的糖水偏好指数显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠的糖水偏好指数显著升高（P＜0.01）。行为学测试结果表明，ZZKZ具有显著的抗抑郁作用，可改善UC小鼠的快感缺乏和行为绝望。 HE染色结果（图3-E、F）显示，对照组小鼠的海马神经元结构完整且排列有序，而模型组小鼠的齿状回（dentate gyrus，DG）、CA1和CA3亚区神经元染色明显加深，伴随神经元分散、核浓缩及部分核破坏与碎裂，海马神经元损伤评分显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，SASP组受损海马神经元得到修复（P＜0.05），细胞水肿和空泡化减少；ZZKZ各剂量组对海马神经元损伤均有不同程度的缓解，表明ZZKZ能够改善DSS诱导的UC小鼠海马组织病理损伤。如图3-G～I所示，与对照组比较，模型组小鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组脑组织IL-1β和IL-6的基因表达水平均显著降低（P＜0.01），ZZKZ中、高剂量组和SASP组脑组织TNF-α的基因表达水平显著降低（P＜0.05）。 3.4  ZZKZ对DSS诱导的UC小鼠肠道菌群失调的影响 鉴于肠道微生物群与UC发病机制的关系密切，缓解肠道菌群失调已成为UC潜在的新型治疗策略。通过基因测序分析，评估ZZKZ对DSS诱导的UC小鼠肠道菌群的影响。从对照组、模型组和ZZKZ高剂量组的粪便样本分析中，共获得了989个OTUs。Venn图（图4-A）显示3组共有229个核心OTUs。其中，对照组和ZZKZ高剂量组有64个独特OTUs，模型组和对照组有36个独特OTUs。表明ZZKZ干预后的菌群结构更接近对照组，且与正常小鼠相比，UC导致OTUs数量减少。如图4-B所示，在门水平上，模型组表现出典型的菌群失调特征，变形菌门（Proteobacteria）和弯曲杆菌（Campylobacter）的丰度显著升高，而拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度显著降低。然而，ZZKZ干预明显逆转了上述菌群异常，恢复了拟杆菌门的丰度。PCoA和物种丰度聚类热图（图4-C、D）证实，ZZKZ高剂量组菌群的整体分布与对照组更为相似。α多样性分析（图4-E）显示，与对照组比较，模型组Observed_features、Chao1、Shannon、Simpson和Pielou指数降低，Dominance指数升高；给予ZZKZ干预后，Observed_features、Chao1、Shannon、Simpson和Pielou指数均升高，Dominance指数降低。LEfSe分析（图4-F）确定了组间差异显著的菌群生物标志物，与对照组比较，模型组丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和坦纳菌Tannerella的丰度显著升高；ZZKZ干预后其丰度显著降低。LDA结果（图4-G）显示，有害菌变形菌门（Proteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）在模型组中显著富集，而有益菌厚壁菌门（Firmicutes）和副杆菌属Parabacteroides在对照组和ZZKZ高剂量组中显著富集。以上结果表明，ZZKZ干预后小鼠肠道菌群的组成和多样性指数更接近正常状态，ZZKZ逆转了UC病理状态导致的微生物丰富度和均匀度的下降，重建肠道微生态平衡，缓解肠道炎症。 3.5  血清代谢组学分析结果 采用UPLC-HRMS分析血清代谢物谱，探讨ZZKZ调控的代谢途径和潜在机制。由于代谢物的复杂性，单独使用无监督方法主成分分析（principal component analysis，PCA）可能无法实现有效区分。因此，采用有监督方法偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。PLS-DA和聚类分析结果（图5-A～D）显示，ZZKZ高剂量组和模型组之间存在显著差异，且ZZKZ高剂量组与对照组相似，表明ZZKZ对UC具有缓解作用。置换检验结果显示，PLS-DA模型有效，没有过拟合。Venn图（图5-E）显示，3组共有496种代谢物，其中对照组vs模型组与ZZKZ高剂量组vs模型组有51种共同的差异代谢物，主要是甘油磷脂、脂肪酰基和鞘脂，表明脂质代谢紊乱是结肠炎的关键代谢特征之一。基于变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1.0和P＜0.05的标准，结合正、负离子模式，在对照组vs模型组中鉴定出239种差异代谢物（图5-F），其中111种上调和128种下调；在模型组与ZZKZ高剂量组中鉴定出308种差异代谢物（图5-G），其中54种上调和254种下调，反映了UC小鼠和健康小鼠血清代谢物丰度的差异。代谢物热图（图5-H）显示，与模型组比较，ZZKZ高剂量组2′-O-甲基尿苷、吲哚乳酸、果胶内酯C和霉菌孢菌素谷氨酰胺醇水平升高，5-O-甲基维斯明苷、原胆酸、组氨酰脯氨酸、羟脯氨酰赖氨酸、7-脱氢胆固醇等水平降低。差异代谢物的富集分析（图5-I）显示，显著富集的通路包括重度抑郁障碍相关通路、胆汁酸和不饱和脂肪酸的生物合成与代谢通路，均与UC和抑郁高度相关。 3.6  网络药理学分析结果 通过筛选共获得了55种ZZKZ的活性成分。对各中药对应的靶点进行筛选和去重后，获得了834个ZZKZ活性成分的潜在靶点。检索结果显示，UC有6 027个靶点，抑郁有5 551个靶点。通过整合ZZKZ活性成分的预测基因与UC和抑郁相关基因，共鉴定出379个潜在治疗靶点（图6-A）。使用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络（图6-B），该网络由437个节点和2 970条边组成。PPI网络图包含313个节点和1 692条边，表明相交基因之间存在相互作用关系，通过度值对前20个基因进行排序，结果见图6-C。GO分析获得1 937个BP条目、77个CC条目和169个MF条目，BP条目涉及对激素刺激的细胞反应、细胞表面受体连接的蛋白质酪氨酸激酶信号通路等，CC条目与膜筏和膜微结构域相关，MF条目涉及受体-配体活性、蛋白激酶激活活性和组蛋白激酶活性。每个类别中P值最小的前10个条目见图6-D。KEGG富集分析共获得201条通路。使用气泡图可视化前20条KEGG通路（图6-E），涉及JAK/STAT信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路和紧密连接等。 3.7  分子对接与分子动力学模拟结果 分子对接结果通常伴随着较大的不确定性，而分子动力学模拟可以通过计算机模拟验证对接结果，从而提供更准确的构象。将关键靶点JAK2和STAT3分别与4种主要活性成分（白术内酯I、橙皮素、熊果酸和异鼠李素）进行对接，使用PyMOL软件进行可视化（图7-A～D）。所有配体-靶点复合物的结合自由能≤−6 kcal/mol（1 kcal/mol＝4.182 kJ/mol），表明这些相互作用具有高稳定性。以上活性成分与靶点之间的相互作用已有报道，如白术内酯I通过恢复肠道屏障功能障碍缓解UC，熊果酸通过抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）缓解UC，橙皮素通过阻断受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3（receptor interacting serine threonine kinase 3，RIPK3）/混合谱系激酶样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）的表达保护屏障[21-23]。 选择结合能较低的熊果酸进行分子动力学模拟，如图7-E所示，复合物的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）在前10 ns内迅速上升后趋于稳定，整体维持在0.35～0.40 nm，表明复合物在初期经历了一定的构象调整以达到能量平衡，此后体系结构保持稳定。配体RMSD稳定在0.05～0.12 nm（图7-F），无明显漂移或突变，表明配体在结合位点内保持相对固定的位置，没有发生显著的构象重排或脱离。如图7-G所示，回转半径（radius of gyration，Rg）值在1.95～2.00 nm波动，且无明显上升趋势，表明蛋白在模拟过程中未发生显著的松弛或塌陷，构象紧密稳定。溶剂可及表面积（solvent-accessible surface area，SASA）稳定在135～145 nm2（图7-H），无剧烈波动，表明体系在模拟过程中溶剂可及性恒定，复合物的构象及表面暴露区域稳定。大部分残基均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）在0.10～0.25 nm（图7-I），仅少数区域（如N/C端或环区）达到0.3～0.4 nm，整体波动较小，表明主链结构稳定，仅柔性环区存在正常构象运动。氢键数量在1～3个动态波动（图7-J），且在整个100 ns过程中均有稳定存在，表明配体与蛋白之间形成了持续的氢键网络。MM/PBSA计算表明JAK2-熊果酸复合物的结合自由能（−26.51 kcal/mol）显著为负，表明配体与蛋白之间结合稳定、亲和力强。范德华力（−36.94 kcal/mol）是主要的驱动因素，体现疏水相互作用的重要性。静电作用（−15.67 kcal/mol）提供了额外的结合稳定性。尽管极性溶剂化能带来一定能量惩罚（30.86 kcal/mol），但总体结合自由能仍表现为强烈有利。上述结果初步证实了JAK2与熊果酸之间的结合相对稳定，推测其可能是ZZKZ发挥治疗作用的主要活性成分之一。 3.8  ZZKZ通过抑制JAK2/STAT3信号通路改善UC小鼠的肠道屏障损伤 肠黏膜损伤常伴有肠道屏障破坏和炎症反应。紧密连接蛋白是维持肠道屏障完整性的重要结构，ZO-1、Occludin和Claudin是其中3种主要蛋白，在维持肠道屏障功能方面发挥着核心作用。JAK-STAT信号通路是一种应激诱导的炎症通路，其激活后JAK2和STAT3的磷酸化水平升高。采用Western blotting检测紧密连接蛋白和JAK2/STAT3通路相关蛋白的表达，结果如图8所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织中Occludin、ZO-1和Claudin-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，ZZKZ中、高剂量组和SASP组Occludin、ZO-1和Claudin-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），ZZKZ高剂量组和SASP组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），表明ZZKZ可能通过抑制JAK2/ STAT3通路的激活来缓解DSS诱导的UC小鼠肠道屏障损伤。 4  讨论 UC在中医体系中可归入“痢疾”“肠澼”等病证范畴，其病位在大肠，核心在脾胃，病程缠绵，患者常伴有焦虑、抑郁等情志障碍，对应中医“郁证”。UC合并焦虑抑郁的发病机制，以及情志因素在UC发生发展中的作用尚不明确。但流行病学调查显示UC患者中抑郁、焦虑等精神障碍的患病率显著升高，而精神类药物作为UC的辅助治疗，在临床实践中已取得一定疗效，提示肠道和中枢之间存在双向交互作用[20]。相对于化学药的单一靶点治疗，中药特有的多成分、多靶点和多途径的作用模式不仅能治疗UC，还能缓解其并发症状。ZZKZ虽非治疗UC的传统方剂，但其“健脾和胃、理气消痞”的功效与UC脾虚气滞和湿热阻滞的核心病机高度契合。方中白术健脾燥湿、枳实理气消滞、柴胡升清疏肝、山楂化瘀导滞，兼顾UC伴发的情志不舒，体现了“消补兼施、调畅气机”的治疗思路。本研究证实，ZZKZ可通过调节JAK2/STAT3通路和肠道菌群来改善UC病理损伤和肠黏膜屏障，同时缓解并发的抑郁症状，揭示ZZKZ可作为UC伴抑郁的辅助治疗手段。 肠道菌群失调和代谢紊乱在UC和精神障碍中都起着重要作用。肠道菌群失调是UC的一个核心特征，通常表现为微生物多样性降低和组成失衡，进而诱发肠黏膜损伤[24-25]。本研究中，模型组变形菌门丰度升高和拟杆菌门丰度降低，与UC患者门水平菌群失调的特征高度一致[26]。研究发现，补充乳酸杆菌等益生菌可以通过影响小鼠的肠道屏障功能和肠道菌群来缓解UC，而通过FMT调节肠道菌群及其代谢产物可能对UC患者有益[27]。本研究结果显示，ZZKZ干预可以富集厚壁菌门和副杆菌属等有益菌。值得注意的是，厚壁菌门内的乳酸杆菌属可以降低UC的发病率[28]。此外，越来越多的证据支持补充益生菌在临床人群中减少焦虑和抑郁症状的有效性。在动物实验中，乳酸杆菌降低了应激诱导的皮质酮水平以及焦虑和抑郁相关行为[29]。ZZKZ降低了丹毒丝菌目等有害菌的丰度，通过双向调节修复菌群失调，为肠道黏膜屏障的保护奠定了基础，这与文献报道一致[30]。 肠道菌群失调可以通过“菌群-代谢物-神经内分泌”轴干扰中枢神经系统并诱导抑郁样行为。本研究发现ZZKZ调控的关键差异代谢物主要靶向该轴的2个关键通路：①在色氨酸代谢衍生的吲哚通路中，由肠道细菌产生的色氨酸代谢物3-吲哚乳酸，激活肠道上皮细胞中的芳香烃受体信号以缓解DSS诱导的结肠炎，3-吲哚乳酸还增加了血清5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和犬尿喹啉酸水平，改善下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍，上调脑源性神经营养因子的表达，并通过催产素信号减少小鼠的抑郁样行为[31-33]。②在胆汁酸信号通路中，肝脏合成的胆酸被肠道菌群转化为次级胆汁酸（secondary bile acid，SBAs），其中由7α-脱羟菌产生的脱氧胆酸和石胆酸水平升高是菌群代谢失调的标志，补充SBAs可以通过武田G蛋白偶联受体5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）发挥抗炎作用，改善UC患者因菌群失调引起的SBA缺乏和肠道促炎状态[34]。其中，胆汁酸代谢的改善可以减少其对肠黏膜的毒性损伤，不饱和脂肪酸代谢的平衡有助于维持肠道上皮细胞膜的完整性[35]。胆汁酸代谢物如牛磺胆酸和脱氧胆酸也可以逆转5-HT代谢失衡，缓解抑郁样行为[36]。益生菌可以通过合成B族维生素来调节肠道功能和代谢紊乱，是抑郁免疫代谢表型的潜在治疗方法[37]。结合行为学测试结果，上述机制可能参与了ZZKZ对UC小鼠抑郁样行为的改善。 通过网络药理学分析从ZZKZ中筛选出白术内酯I、橙皮素、熊果酸和异鼠李素4种活性成分，作为其抗UC作用的代表性化合物，这4种成分为相关药材的代表性成分，且被预测可作用于JAK2/STAT3信号通路及相关紧密连接蛋白的调控网络。本研究将JAK2/STAT3信号通路作为探究ZZKZ抗UC作用潜在机制的主要靶点。作为转录因子的核心通路，JAK2/STAT3信号通路在调节炎症稳态中起着关键作用，并参与由促炎细胞因子介导的肠黏膜病理反应。JAK激活可以促进效应记忆T细胞分泌IL-6和TNF-α等促炎因子，促进STAT3核转位以调节炎症基因的表达，加重肠黏膜组织损伤[38]。反之，抑制JAK2/STAT3通路的转导可以发挥抗炎作用，并重塑UC小鼠受损的肠黏膜屏障[39]。分子对接结果表明白术内酯I、橙皮素、熊果酸和异鼠李素均可与JAK2、STAT3蛋白稳定结合，其中熊果酸与JAK2结合能最低，橙皮素与STAT3结合能最低。然而分子对接局限于将蛋白和配体视为刚性或半柔性结构，难以真实反映结合过程中的构象动态变化与结合稳定性，而分子动力学模拟则通过引入时间维度与原子级柔性的运动轨迹，能够更先进地评估复合物在生理环境下的动态结合模式、结合自由能及关键相互作用持续性。以与JAK2结合能最低的熊果酸为例，分子动力学模拟进一步验证了熊果酸在JAK2结合位点具有稳定动态结合特性，而其通过调控JAK/STAT信号通路发挥抗UC作用已在果蝇和小鼠等动物模型中得到验证[21,40]。Western blotting结果表明，ZZKZ缓解UC小鼠的结肠缩短症状和结肠组织病理损伤，可能是通过抑制p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达并上调紧密连接蛋白表达实现的。 综上，ZZKZ通过重塑肠道菌群、调节多种代谢通路以及JAK2/STAT3等炎症通路等多层机制以改善肠道和中枢功能。然而本研究也存在一定的局限性，由于ZZKZ是复方制剂，成分复杂，药理机制多样，尚不明确哪些活性成分在体内起关键作用。DSS诱导的UC作为急性疾病模型，造模和给药时间较短不利于ZZKZ抗抑郁效果的充分发挥。此外，UC的发病机制涉及多种信号通路，但本研究仅关注了JAK2/STAT3通路，其他信号通路的调节作用仍有待深入探索。 利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来  源：杨佳莉，唐婧月，余学成，苏文龙，陈林霖，曹国胜．枳术宽中胶囊通过调节JAK2/STAT3通路与肠脑轴改善溃疡性结肠炎及抑郁样行为  [J]. 中草药, 2026, 57(17): 6832-6847. END 文章内容仅供思路参考，不代表本刊观点，非中医药专业人员请勿试药 文章来源:中药材杂志社，本草全球转载仅为传播行业信息，不做商业用途。若转载不当，请联系：28331285@163.com删除，感谢原作者的辛劳付出。文中插入广告与本公众号无关。 本草全球服务内容  包括但不限于:  中药新药、经典名方、配方颗粒、中药CMC、美国FDA IND、中药保护品种临床试验申报、中药上市再评价、药物经济学评价、新药研发及中药类注册备案全过程咨询与委托服务;可为有关单位疑难问题提供解决方案与技术支持、开展内训等服务。凡提交至本草全球的疑难问题,均可协助解决。  联系人:田先生 13801667235

中国药科大学将迎来建校90周年华诞，“九十年九十人”专题报道栏目将寻访收集并推出杰出校友、校友创办或领导的企业等90篇成长故事，以此连接校友初心，为学子答疑拓界，展现药大人的成果与担当，为行业良性发展贡献中国药大思考。更通过这些故事折射中国医药行业发展历程、向全球传播中国药大声音、展现中国医药力量。 在仿制药话题牵动民心，讨论声甚嚣尘上的当下，曹家祥可以说是中国仿制药的“重要守门人”之一——其参与起草了国家一系列一致性评价的指南及相关标准和政策；多次受邀为多个省、市药监局进行政策与技术培训；他帮助多家国企和上市企业完成多个高难度一致性评价项目，他还是国家专家局专家、国家药监局审评中心固体制剂连续制造专家小组成员。 而这位毕业于中国药科大学的华人科学家，上大学之前最初的学术理想是“造船”、“为国造军舰”。 这是曹家祥的故事里最让人意外的地方，1977年下半年国家正式恢复高考，他作为应届高中毕业生的第一志愿曾是上海交大船舶制造、第二志愿是上海科技大学无线电通讯、第三志愿是去上海第一医学院学医。 五年后，他却读了南京药学院的药物化学专业，又去了美国读高分子化学，直到成为制药药剂领域举足轻重的专家。 “我走到今天，没有一步是我自己设计的。”采访刚开始，曹家祥就说了这句话。 整场采访里，他反复说的就是这句。每一步都是被推着走的——被时代、被政策、被家庭出身、被一个单词的误读、被一个个他无法控制的外力。但每一次被推到陌生的地方，他都把那里变成了自己的主场。 曹家祥是上海人，1959年出生，1977年2月高中毕业的时候，恢复高考的消息还是一则没有确切时间的传闻。 所以高中毕业后，他按当时上海的分配政策进了上海信谊药厂技校。原因很简单：他是家中户口本上的独子，不用去农村插队，也不能在城市进“硬档工矿”，于是被“安排”去读技校。学什么？制药；谁选的？不是他。 进技校没几个月高考恢复了，他参加了1977年的第一次高考，当时只能报三个志愿：他第一个是上海交大船舶制造，他中学就是上海市少年宫船模组成员，曾经代表上海市在长风公园为1976年后首个到访的墨西哥海军代表团做过遥控船模表演；第二是上海科技大学无线电通讯；第三是上海第一医学院医疗系。 三个志愿，全是按兴趣报的，因为曹家祥生了一双巧手，从小就喜欢组装制造，但是这三个学校和专业，一个都没录上。 “后来才知道交大和科技大都是军工专业，”他说，“我政审不过，”因为家庭成分复杂。 他的父母怀着建设新中国的爱国之情，1950s从香港回大陆工作。他的母亲是江阴爱国民族大资本家的女儿，虽然外公曾把整个家族产业捐给了国家，但在那个复杂的年代，这些过往到了高考政审这一关，家庭出身成了一道跨不过去的坎。 而他在志愿表上又填了“不服从调剂”——少年曹家祥并不想被调剂到没兴趣的专业。他一边读技校，一边准备第二年再次高考，等来的却是新规定：进了技校的学生需毕业后有两年以上工龄才可以参加高考，并只能报考相应专业。 当时技校的课程是一周在学校学习，一周在信谊药厂做工人。信谊药厂那是中国当时最好、技术最成熟的制剂厂。最终，两年技校，三年工人，一共待了五年。片剂和针剂的全部岗位曹家祥几乎都做过。那个连专业都勾着“不服从调剂”的少年，被安排着开启了自己的制药之路。 五年后，他报考了当时的南京药学院（中国药科大学的前身），作为一个有5年药剂生产经验的工人，他仔细挑选后报了药理专业，但等到他拿着药理专业的录取通知报到那天，他才发现自己被调剂到了药物化学。 “我到学校报到那天，药理专业说名单上没有我，我慌得不得了。好不容易考上大学，户口都已迁了。旁边有人说，曹家祥你在这边，药化系有你的名字。我高兴得不得了，总算有地方去了。” 他又一次“被安排”进了一个完全陌生的领域——药物化学合成，是分子层面的东西，和他过去在信谊药厂做过的所有事，那些药剂相关的工作，几乎没有关系，读书期间，过往经验对专业没有直接帮助。 但在南药的四年里，他依然凭借大其他同学五岁的成熟和个人能力，在学校的表现拔群。老师眼中他比同届学生大五岁，又有工作经验，老师直接点的名叫他做年级学生会主席、校学生会副主席。而在师弟师妹眼里，他是比有的助教老师还厉害的“风云学长”。 他的巧手和他的经验，也在大学的实验室里找到了用武之地。“我做实验比较好，因为手比较巧。”药物分析、有机合成、精制提纯、动物解剖等，任何需要双手配合的操作，他都做得较快、较准。 说起大学时的实验室，曹老师提起药大值得称道的是，从他上学时到现在，四十多年来药大一直是小班教学——30人一班，每人一套仪器。多年后他在面试求职者时，只用一两个问题就能判断对方的专业基础，其中他说到一个点：“我问高效液相的分离原理是什么？只有药大毕业的答案是接近的，药大的基础打得很扎实。” 1986年毕业后，他被分配到上海医药工业研究院，加入由童村、许文思院士和后来担任医工院院长的朱宝泉博士领导的抗生素研究室，参与国家863项目——福提霉素的发酵与提纯。 当时的项目五年一期，而这项目已经进行到了第四年。过去是由一位硕士生负责发酵产物的提取纯化，报告说已经把菌株效价从200单位提高到了450单位，项目组因此送他去日本进修。曹家祥进入抗生素室接手后，开始做放大实验，发现无论怎么提，效价都只有200多单位，他被质疑操作失误，提取时产生了降解破坏。 作为药大的学生，药化专业夯实的底子加上科学精神的严谨查证，曹家祥确认自己操作无误。开会时，他站起来说：“你们说的450单位，怎么测的？” 会上有人拿出了在上海第一医学院的HPLC（高效液相色谱仪）上打出来的色谱图，图上色谱峰混杂在一起，无法辨认。 “当时打出来的图谱上一堆峰，我说：‘你们指给我看，哪个峰是哪个东西？’” 没人指得出来。 “你们拿什么做对照？”他接着追问 “白晶霉素。” “白晶霉素和福提霉素肯定不是等价的！你中间的差异因素是多少？Factor（响应因子）是多少？” 在场管技术的室副主任听了曹家祥的话，用上海话脱口而出：“小鬼，侬结棍（厉害）。” 后来项目组找到两瓶从日本带回但已过期的福提霉素做对照，一测——确实只有200多单位，450单位是不严谨的错误数据。 曹家祥那年在医工院，是一个刚大学毕业的年轻人，面对的是项目组此前已经报上去的结论，组内两位高级工程师级别的技术权威，他没有因为对方资历深就盲从，也没有因为结论已经被认可就跟着附和。他通过观察别人的实验和操作，核验自己的实验数据和结果，找出问题产生的核心症结。 虽然最后项目因此取消，但医工院没有因为他是新人就压制他，而是接受了事实。 “医工院当时能够实事求是地对待这问题，没有压制我，这个对我影响很大。”曹家祥说。 他不是为了挑战权威而挑战，只是秉承着科学严谨的态度去做实验，一个二十七岁的年轻人，敢在那种场合把自己的结论摆出来，底气、锋芒和学术态度，都在事实里。 1989年底，曹家祥赴美留学，“那时候，稍微有点理想的都想出去学点东西。”他说，但最终出国进修的研究生专业方向，却有个“大乌龙”。 当时没有互联网，没有现在这么便捷的渠道了解美国的高校和专业，他通过越洋电话联系了先他一年去美国的表弟，让他帮忙找好的药物化学专业「Pharmaceutical Chemistry」或者「Medicinal Chemistry」。表弟当时对化学专业英文单词不熟，只记住一个“P打头的 Chemistry”。表弟当时就读的底特律大学，有一个化学专业全球领先，专业名称就是“P+Chemistry”。表弟就帮他报了那个专业，报到后曹家祥一看，不是「Pharmaceutical Chemistry」药物化学，而是「Polymer Chemistry」高分子化学，他又进入了一个完全陌生的专业。 高分子化学和药物化学是完全两回事，他过去学的全是小分子，高分子是大分子，是两个完全不同的领域。 “全英文从零开始，读得很苦很累，”他说，“概念都不懂，不仅要从头开始学，还是翻着字典学。” 但他的动手能力再次发挥了作用，他的导师Kurt C. Frisch博士是国际聚氨酯高分子权威，当时聚氨酯材料刚开始要被引入医药行业，他的导师受托为Ciba Vision研发隐形眼镜材料，他参与了这个项目。项目中需要操作工业级的机器，完成聚氨酯和聚腈水凝胶的（IPN）网络结构互穿，对动手操作要求极高，动手能力极强的曹家祥不仅能精准操作机器，也能完成化学公式的精确计算。项目最终完成了新型高分子隐形眼镜材料的处方和工艺研发，并取得了优秀的成果。曹家祥也引起了Ciba Vision当时的竞争对手博士伦的注意，对方主动邀请他加入——那时他还没毕业，就成为第一个在博士伦研发中心工作的大陆华人科学家。 最终他选择不读博士，拿到硕士学位就投身工作。如果读高分子博士，毕业大概率要去底特律的三大汽车厂，做高分子油漆、内装、轮胎。“我不想去汽车行业，”他说，“我忘不了药。” 在博士伦工作三年后，他因为家庭决定换城市换工作。因为罗切斯特城市太小，限制了他太太的工作选择（曹老师的太太同样毕业于中国药科大学和底特律大学），于是他们举家搬到了世界知名药谷——新泽西。 1997年初曹家祥加入美国先灵葆雅制药公司的研发中心制剂部，同样是该部的第一位大陆华人科学家。在那里他花了三个月完成了地氯雷他定的处方研发——在保证辅料和原料没有相容性问题的情况下，把公司传统的湿法改成了干法工艺，同时提升了释放时间，至今国内地氯雷他定的处方都是他当年研发定下的。但即便取得了这样的成功，曹家祥却因招他的领导受到内部排挤，被晾了三个月，不给他派活干。 同组一位台湾大前辈告诉他：“你的水平在这边混不合算，原研厂合成是主流，制剂是配角，你应该去仿制药企业。” 最终，在曹家祥任职PUREPAC期间，一家以专利挑战闻名业界的世界第五大仿制药公司Barr Pharmaceuticals 找到了他。COO亲自面试，最后COO问他：“你有什么问题问我？”他问：“BARR能走到现在，应该做哪个方向，能够使这个公司成功？” COO说了一句话：“高技术壁垒，高利润空间。”这句话成了他职业生涯此后十四年的注脚。 Barr当时的定位是专利挑战——原研药的专利还没到期，仿制药企业已经在研发如何用规避设计“绕过去”。挑战专利的仿制药比普通仿制药难得多：需要在化学成分、配方或制造工艺上不侵犯其专利，同时设计出能产生相同释放动力学，不字面侵权，同时在治疗效果上等同于原研药的全新配方。 曹老师在采访时跟我们说了一句让我们印象极深的话，“我坚信我不会比别人差，在美国的时候我跟我的中国同事以及外国同事都说：只要是人能做的事，我们就应该能做，除非那是上帝创造的东西。只要别人能做，我也能做！” 他曾负责全公司上百个产品的生产工艺定型，其中包括：普通仿制药产品；专利挑战和505（b）2产品；特殊不灭活不减活疫苗口服制剂；特殊高分子长效缓控释产品等。在Barr & Teva（Barr 2008年被Teva并购）工作的14年内他领导参与和完成了多个仿制药（ANDA） 产品和新药（NDA）及改良型新药（505b2）的研制，并获得FDA的批准上市。 在Barr期间，他做小试实验的效率在团队和公司是出了名的：最少的一个产品，他只做了4个小试就找到了最优方案；最多的一次，2个剂量做到27个小试也完成了。而行业平均水平是30个起步，CRO对外报价按30个小试算钱。这意味着他最多的那个，比行业的起步标准还要少。 这个数字背后不是运气——他知道材料选什么，知道设备怎么用，知道工艺参数的大致范围。等真正动手的时候，他已经把大部分试错排除掉了。 由他设计处方和工艺的特殊不灭活不减活疫苗口服制剂——腺病毒口服疫苗，是Barr公司首个自主研发的国家级生物制剂，耗时多年开发，用于预防人群集中时流行的急性呼吸道疾病，难度之高至今尚无人能仿制。 他攻克了多种激素产品线（极低剂量）仿制的技术壁垒，把几微克的活性药物成分均匀地混合进上万倍的辅料中，他靠的是对设备的理解，什么设备怎么用，精确计算把控混合时间和方式，甚至是机器该怎么调，他都懂。这份判断力，不仅来自过往工作经历积累下来的手感、经验，还来自他几十年喜欢动手、对机械的研究和热爱。 曹家祥在职期间，Barr收购了一家小公司，做的是高分子载药产品，用于妇科缓控释制剂——当时那个小公司只有概念，没有能工业化的产品。公司被收购时，一天只能手工做十几个测试样品。 Barr要找一个人接管技术，找过高分子的博士，但懂高分子的人不懂药；也找过懂药的人，但不懂高分子。最后公司找到了曹家祥——他既读过高分子，又做过药，任命很快下来。 他到了那家公司之后，没有立刻动手。一个多月，他每天只看——看他们怎么操作，看工艺设备怎么运转，看流程哪里卡住了。他不急着开会，也不指手画脚，就让所有人按原来日常运营。一个多月后，他把所有人叫到一起开了个会，当场重新安排了配料方式、机器操作顺序和中控标准。隔天，产量就从十几个变成了七百个左右——从手工试制跨进了批量生产。 关键问题在高分子材料的固化速度——配好的材料固化很快，原来的工艺在固化之前来不及完成药物配置。曹家祥从化学原理入手，调整了物料分配及操作流程，让高分子的固化速度适应工艺，解决了概念型小产到批量生产的工艺难题，从此才有后续临床试验的可能性。 两年后，他把二期做完，整个项目搬回总部又做了三期。这个产品作为NDA项目申报成功，成为一条完整的高分子材料药械生产线。Progesterone Ring和后来的NuvaRing仿制成功其所创建的连续制造药械生产线也成为曹家祥职业生涯里少有的、把他两个专业方向连接在一起的果实，药学和高分子化学之间的切换，在多年后命运般地重新交汇了。 2008年，Barr被全球最大的仿制药制造商TEVA并购，曹家祥在TEVA任北美制剂研发中心副主任，独立负责一个GMP的临床样品大试生产基地。 可以说曹家祥是当之无愧的世界级药剂专家，而就是他，帮着中国把仿制药推向了下一个台阶。 2011年，曹家祥正式辞职离开工作了十四年的Barr/TEVA，回到了家乡。 2011年，曹家祥回国，参与在江苏泰州中国医药城创建了长泰药业。他花了半年时间设计搭建了一个700平米的GMP多品种制剂中试车间，并亲自设计安装了符合FDA和CFDA GMP标准的所有设备。同时用一年半开发了八个3.2类复方新药。由于国内浮躁的行业环境和长泰公司领导人的经营理念改变，曹家祥最终离开了长泰。 2013年，曹家祥受到CEO多次邀请，加入上海睿智化学，负责新药开发的CMC工作。两年多时间里，他主持了十多个新药和一些仿制药项目，设计建造了符合FDA和CFDA标准的GMP口服制剂中试车间，多个项目通过了CFDA现场考核和国际药企的评估检查。 但他不喜欢做CRO，“像给人家装修房子，装完了门一锁，你连回去看一眼都不让。”他说“缺少积累。” 回国四年，国内不同的商业环境、行业氛围，让他不适，让他开始放空自己和思考未来，国内当时的环境让他觉得自己无用武之地。 转机出现在2016年，他正式从上海睿智化学离职的那一年，因为2015年7月12日中国CFDA正式发文启动对市售所有药品进行一致性评价，要求仿制药与原研药在质量和疗效上必须做到一致。过去十几年，国内很多仿制药虽然做到了“形似”——成分、剂量和原研药一样，但进入人体后的吸收、代谢过程是否能达到一致，以及由此带来的临床疗效和副作用风险是否能与原研药相提并论，并没有经过严格的系统性验证。一致性评价的意义，就是把这个验证变成强制门槛，只有通过评价的仿制药，才能证明自己在临床上真正可以替代原研药。它意味着淘汰不达标的、逼着药企升级、让国产仿制药真正接轨国际标准。 时值2017年中国正式加入了ICH（国际人用药品注册技术协调会），成为理事国成员的前夕，这是中国制药行业与国际接轨最重要的一步——加入之后，整个指南框架必须与美国FDA、欧盟药监体系保持一致。曹家祥被请去，参与一致性评价的指南起草：“国家药监局通过人找到我，叫我去参加他们的会议，参与制定相关政策。一致性评价的技术指南，我几乎大部参与了起草。” 但帮助国家推行一致性评价指南，帮助药厂完成一致性评价项目，远不止是“参与制定政策”那么简单。整个指南框架参考了FDA的英文版本，曹家祥被请去，一个原因是他有大量实际的、完整的经验，另一个原因是“有的英文词汇在某些重要场合使用，它的意思不一定是中国药厂领会的意思”。他不是做翻译，是做衔接——把国际通行的技术语言，转化成中国制药行业能够理解、执行的技术规范。 除了参与指南起草，曹家祥还有两个身份：国家药监局固体制剂连续制造专家小组成员，以及国家药监局审评中心高研院特聘专家，负责讲授制剂、相关工艺设备和厂房设计三门课程——全国同时讲这三个模块的人，可能只有他一个。 在固体制剂连续制造这个领域，他是国内最前沿的专家之一。他去美国Rutgers大学的CpAML中心交流和参观过，三层楼的实验室全部对他开放，“我是唯一一个进去仔细看过的中国大陆人。” 但他也清楚这项技术在国内的落地难度，之前国内连续制造推了一阵子就没了声音——投入太大，利润不够覆盖，核心传感和控制器全部依赖进口。 “我知道中国往前走得很快，”他说，“但真正完全和世界接轨，还要时间。” 回国之后，曹家祥看过太多厂，也见过太多人。那些年他跑遍了中国几乎所有的大药厂，把在美国做仿制药的几十年经验，一点点拆解，变成可以教会别人的东西。同时，也看清了差距在哪里。 关于中国制药行业的现状，他的判断是：大多数企业还在“描红本”阶段——别人的字怎么写，你就照着描。做仿制药的企业，连辅料都和原研一模一样，但有的仍不能达到一致性评价的标准。“我们在美国做仿制药，辅料可以完全不同，只要最后结果一样。” 关于CRO行业，他的判断更直接。“中国的CRO行业是畸形的，全世界没有像中国这样发展的。”比如有的企业合成业务做得很大，但合成是别人设计好路线你照着做，仅是高级代工，“反哺不了前面的创新。” 他多次说，中国在应用上很强，“能做很多个0，但前面那个1，往往不是我们自己的。”比如如果有人给你一个靶点，你能做得比别人快，这是优势，但那个靶点，终究是别人先发现的。 关于产能，他提到一组数据：中国有五千多家药厂，美国只有两百五十家左右。产能严重过剩，很多企业利润极低，“一年赚的钱只够在上海或北京买一套房。”更关键的是，这些药厂里相当一部分产品，本身达不到一致性评价的标准。行业整体体量庞大，但真正符合国际质量要求的企业和产品，集中度很低。 关于人才结构，曹家祥看到的是两极分化：顶尖的技术人才在美国，留在国内的更多是“做很多个0”。同时，缺少能把理论和落地连接起来的人才，中国出去留学的“99%以上都想学高等高境界的东西，而不想落地，都在学校里做理论研究。”国内的这批人里，真正理论扎实同时技术出色的国际顶尖人才依然稀缺。所以，中国制药行业不仅与国际存在差距，真正接轨也需要时间——这是人才结构层面的深层制约。 要补齐的东西里，曹家祥说得最重要的一样是“基础”。 采访时聊到了其中两层基础：一层是基础材料：具体到高分子材料进入制药领域，中国的高分子材料落后至少50年，他说“连鞋底的好材料都要从国外买，心脏里用的、体内植入级别的，更只能是进口的。”另一层就是前面说的人才基础：很多人理论知识强，但一到实际操作就抓瞎——因为在学校里练得少，动手能力差，到了工业现场“落不了地”。而制药，恰恰是最需要落地的行业。一致性评价把标准定好了，但如果做的人不具备把理论变成合格产品的能力，标准再高也落不了地。 这不是政策能解决的问题——它需要时间，需要一代又一代人的积累，需要让更多人在实验室和生产线上同时待足够久。曹家祥自己就是在信谊药厂的车间里蹲了五年、在药大的实验室里做了四年实验、在美国药厂生产线上泡了二十多年，才有了今天“看一眼就知道设备怎么调、算几个数字就能定工艺”的判断力。 而那些动手能力、那些判断力、那些看一眼就知道问题在哪里的直觉——是他从一个又一个被推进去的陌生领域里，亲手摸出来的。他曾经是被推着走的人，但走到最后，他成了那个站在讲台上、让别人跟着他走的人。 “我年纪越大，越相信有命运。” 采访到最后，曹家祥一直在说“顺势而为”：“人一定要顺势而为，不要去逆大流，不要以为自己能改变历史。个人永远是渺小的，你能留下一点印记，只是你做了符合大局利益的事。”他说这些话的时候，不像在讲大道理，更像在讲自己走过的路。 他讲起母亲家族——江阴要塞炮台司令部的吴家，江阴近代著名实业家，江阴的发电厂、水厂、邮局、纺织厂、面粉厂、航运、医院、学校、电灯、电话等，都是他家建的。1956年公私合营，整个家族把产业全部捐给了国家。 但这些事，他小时候并不清楚，家族的荣光早已不在，父母那一辈又经历了特殊年代，不会主动提起这些。他是这几年在国内自己去寻根，一点点翻出家族过往，才慢慢拼出祖上的轮廓。“我祖上从挑担卖药开始，做到江阴首富。外祖父也曾是燕京大学化学教授。后来，家族中还出了多位为国家做出杰出贡献的人物。” “你说我学药物化学是我选的吗？我没选过。读高分子化学是我选的吗？没有。每一步都是被推着走。但走到今天回头看，每一个挫折，最后都成了台阶。” 他停了一下，“我年纪越大，越相信有命运。不是迷信，是要有敬畏之心。” “我唯一能做的，就是不要玷污祖上留下来的东西，爱惜羽毛，不做出格的事，不要毁了家族和自己的名誉。” 最后，我们又谈回母校，曹家祥提到了一个细节，多年前他去药大讲课，在会上提出药大应该开高分子化学课，第二年学校就开了。 同样，从制药行业的人才结构性问题出发，他对母校也有着非常具体的期待：“我希望母校能持续把学生的基础打扎实，这是我们学校最大的优势。我面试的时候，南药的学生能说出HPLC的分离原理，别的学校说不出来。” 他期待药大能培养出更多能落地，能动手的人才，因为做工业、用设备、做连续制造，需要动手能力、需要对机械的理解。 “我修车、修空调、修冰箱，家里所有的东西都自己修。我在美国的车，从来不去4S店——我自己判断问题，自己修。”来采访的前几天，曹老师开的朋友的特斯拉空调出问题，他直接告诉4S店换空调蒸发箱传感器。店员说没有检查，可能换了没用。他说“没事，你换就行了，修不好我自己负责。”17块钱的成本，半小时工费，车就修好了。他跟我们分享这些平日里的动手修理时，乐在其中。” 这个他热爱的扎实的动手能力，从中学时期做船模时开始，陪伴了他整个职业生涯。他从信谊药厂出发，命运推着他进入中国药科大学，从药大实验室，到在底特律大学高分子项目组操作工业级机器，到把控Barr的几十条产线上百个产品，动手实干，和命运一起，推着他成为了今天的曹家祥——每一步都不是他选的，但每一步他都脚踏实地扎扎实实的走过。 这不是一条顺遂的路，但正如他采访最开始聊起菲尔兹奖获奖者王虹时说的一句话——“所有的挫折，最后都成了台阶。” 本文为汇聚南药专访原创内容。 欢迎转发分享至朋友圈或社群。如需全文转载， 或有合作意向等事宜，敬请通过公众号留言与我们联系。 校友故事征集 更多校友风采 点击图片 跳转报道 喜欢我们文章的朋友点个“在看”和“赞”吧，不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~ 视觉设计 | 李心悦

瑞维那新吸入溶液，又又又一家失败了。 这款知名吸入溶液，原研上市10天就被仿制企业围剿，一年多过去，首仿成功的消息至今未传来。 有失败记录的企业倒是已达4家，分别是遂成药业、复星医药、上海信谊和中曦药业。 其中除了复星和刚刚驳回的中曦药业，剩下两家遂成药业和上海信谊都已经重新提交了上市。 2025年6月10日，瑞维那新吸入溶液在国内正式获批，持有人Mylan，国内商业化由晖致负责，成为国内首个每日一次雾化吸入的长效抗胆碱药（LAMA）。它是美国FDA批准的首个每日仅一次的长效雾化支气管扩张剂，用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者维持治疗雾化支气管扩张剂。 这款药竞争相当激烈，彼时原研获批不到10天，就已经有3家仿制企业提交了上市。 成都倍特的吸入制剂子公司四川普锐特6月19日首家，广州大光与齐鲁制药紧随其后，于6月20日同天获受理，三家均为4类仿制。 瑞维那新吸入溶液对仿制企业而言是个好品种： 1、首先专利限制力低，化合物专利已到期，仅剩晶型专利，虽然到期日要到2030年，但是可轻易绕过，仿制药企业发的都是4.2类专利声明。 2、其次，作为一款真溶液，豁免临床，BE试验都不用做，成本低。 3、最后早在2023年10月，瑞维那新已被纳入药政司公示的第三批鼓励仿制药建议目录，属于政策“明确鼓励仿制”的品种之一。 国家鼓励之下，瑞维那新目前已经聚集了超50家仿制企业参与竞争：扬子江，第50家企业抢首仿！ 但以目前多家发通知件情况看来，这一品种也不是如此简单随意就能获批，晶型专利虽然专利约束力较弱，但也意味着绕开要进行工艺改动，还是有点难度。 仔细去看这四家企业的承办日期和审评结论日期，会发现只有复星医药的审评历经两百多天审评，而其余几家审评时间都非常短，大概率是自行撤回。 图源：摩熵医药 吸入制剂的通过率是比一般固体制剂低许多，就算只是吸入用真溶液也会有多家企业被下通知件。 瑞维那新吸入溶液的首家申报企业四川普锐特，在8月19日也收到了一张通知件，吸入用丙酸倍氯米松混悬液，四川普瑞特作为专业的吸入制剂平台，粉雾剂，气雾剂均有顺利获批，但依旧会有失利的情况。 不过，对于瑞维那新吸入溶液来说，总体研发难度尚可，首仿只是时间问题。 要论真正的难题，这款支气管扩张药物，最难的还是商业化。 不可否认，吸入制剂的市场非常大，中国吸入制剂市场近年来整体保持稳定，年销售规模在200亿元左右，单从品种来看，排名前十的吸入制剂，其中7款是糖皮质激素类吸入制剂，两款化痰用药，一款麻醉用药，暂时没有支气管扩张剂上榜。 晖致对这款吸入溶液的商业化态度不明，晖致显然并不想先一步进行产品推广，来等着仿制药企业摘果子，原研获批已一年，至今瑞维那新吸入溶液未挂网未公布售价，官网未更新产品，没有开出过处方，2025年甚至没有去申报国谈。 到了2026年，晖致终于是提交了国谈资料已通过初审，参照用药选择了噻托溴铵吸入喷雾剂（软雾剂），也不知是不是要正式开启商业化了。 等过段时间，瑞维那新吸入溶液或许将迎来批量获批，但获批上市不是终点，如何完成产品增量才是仿制企业真正要考虑的问题。 吸入制剂赛道火热、技术门槛高、商业化难度大，如何破解制剂工艺难点、把控申报风险、做好品种立项与市场规划？ 👉第八届中国制药工业博览会【吸入制剂大会】9月4‑5日｜苏州国际博览中心 大会聚焦吸入溶液、混悬液、粉雾剂、气雾剂研发工艺、质量控制、申报避坑、商业化落地，汇聚行业研发总工、注册专家、产业化服务商，深度拆解瑞维那新等热门品种研发卡点，分享吸入制剂合规开发与商业化实战经验。 京卫制药、润生药业、瑞思普利、美迪西、易合医药、亿索科技.... 等行业大咖，已确认出席；国家药品审评中心、中国食品药品检定研究院、复旦大学附属中山医院、中国药科大学、山东省食品药品检验研究院...众多顶尖专家到场报告。 点击图片跳转，免费报名后可解锁1v1约见机会👇 一年一度吸入制剂大会，围绕工艺开发、放大生产、商业化落地展开深度交流，汇集行业实战专家，助力企业打通吸入制剂从研发走向上市的关键环节。 同期 数十场 行业论坛，免费对外开放，无需付费即可入场学习交流。2W+制药人盛会，一年一度，不容错过👇 👉扫码进入会议小程序  查看同期所有论坛全议程 本届展会彻底重构往届对接模式，依托全新升级的1V1约见系统，打造会前、会中、会后全流程闭环的深度对接服务，直击“找品种、找资本、找供应链、找海外渠道”匹配难、沟通浅的行业痛点： 重磅企业矩阵 特设10间专属对接房，每间入驻一家行业标杆企业。助您一站式锁定产业链关键节点。 *重磅企业持续增加中，敬请期待... 甲方需求直连 现场发布真实甲方企业需求清单，涵盖原料药采购、创新管线授权、CXO合作、投融资及设备耗材采购等方向，让合作诉求一目了然。 *上下滑动查看 *以上为部分公司呈现，排名不分先后... 嘉宾面对面洽谈 汇聚产业决策层与学术带头人，为您提前勾勒现场高端人脉网络。 *嘉宾排名不分先后，按姓名首字母排序，持续增加中... 自由约见，高效会晤 所有参会人员均可通过1V1约见系统自由发起洽谈邀约。系统基于智能匹配机制，特别针对合成生物学、CGT、中药、宠物药等热门细分赛道设立专属匹配通道，集中汇聚同赛道供需双方，让企业高效锁定垂直领域的关键合作伙伴。到场即直面精准匹配的决策层，大幅提升转化效率，精准实现“找方向、搞增长、寻长期战略伙伴”的目标。  👉扫码进入会议小程序 报名后即可约见