Shanghai Zhicheng Biotechnology Co., Ltd.

中文摘要目的  分析重组HPV病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的二级结构。方法    取重组HPV16、18、52、58型VLP各1批，均调整蛋白浓度至250〜500 μg/ml，采用圆二色谱远紫外扫描，预测重组HPV VLP的二级结构。结果    重组HPV16 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%，反平行β折叠37.1%，平行β折叠4.5%，β转角19.2%，不规则卷曲30.3%；重组HPV18 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.9%，反平行β折叠36.9%，平行β折叠4.6%，β转角19.0%，不规则卷曲30.7%；重组HPV52 VLP二级结构的预测结果为α螺旋12.3%，反平行β折叠37.1%，平行β折叠4.7%，β转角19.0%，不规则卷曲30.2%；重组HPV58 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%，反平行β折叠35.3%，平行β折叠4.4%，β转角20.4%，不规则卷曲31.3%。结论   圆二色谱法预测了重组HPV16/18/52/58型VLP的二级结构，该技术可用于重组HPV VLP的结构确证研究。正文蛋白质是由多个氨基酸通过肽键首尾相连而成的一种复杂的生物大分子，其结构可以分为初级结构（一级结构）和高级结构（二级、三级和四级结构），初级结构是蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序，高级结构是多肽链进一步折叠形成的三维结构，即蛋白质的空间构象。每一种蛋白质都有其特定的三维结构，正确的空间构象是蛋白质发挥其生物学功能的前提，对蛋白质高级结构的分析和研究具有重要的意义。目前已有多种技术手段应用于蛋白质高级结构的分析和研究，包括X射线晶体衍射[1-3]、核磁共振[4-5]、冷冻电子显微镜[6-7］、傅里叶变换红外光谱[8]和圆二色谱（circular dichroism，CD）技术等[9]。由于相较于其他技术手段而言，CD技术简单、快速，待测样品无需复杂的样品处理过程，可在溶液状态下直接测定，因此被广泛应用于蛋白质的结构确证研究。重组 HPV 病毒样颗粒（virus-iike particle，VLP）由360个HPV L1单体蛋白组装而成，相对分子质量巨大，结构复杂，目前鲜有对其二级结构研究的报道，本研究采用CD技术预测重组HPV VLP的二级结构。1材料与方法1.1重组 HPV VLP重组HPV16 VLP（批号：RSP20190701）、重组HPV18 VLP （批号：RSP20190801）、重组 HPV52 VLP（批号：RSP20190801）和重组 HPV58 VLP（批号：RSP20190801）均由上海至成生物科技有限公司研发部制备。1.2主要试剂及仪器磷酸二氢钠、硝酸均购自国药集团化学试剂有限公司，磷酸缓冲液（phosphate buffer，PB）购自北京绿源伯德生物科技有限公司，樟脑磺酸购自美国Sigma公司，Modified Bradford蛋白定量试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。SH21-2磁力搅拌器购自上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，HYC-940C医用冷藏箱购自青岛海尔生物医疗股份有限公司，M2e多功能酶标仪购自美国 Molecular Devices 公司，Chirascan 圆二色光谱仪购自英国应用光物理公司。1.3供试品处理取重组 HPV16/18/52/58型 VLP 各 3.0 ml，分别装入透析袋中，置于5 L 20 mmol/L的PB中，2〜8 ℃搅拌透析3 h。透析后的重组各型VLP分别用0.22 μm滤膜过滤，Bradford法测定蛋白浓度，用20 mmol/L的PB调整蛋白浓度至250〜500 μg/ml。1.4圆二色光谱仪参数设定仪器参数设置如下：带宽1.0 nm，步长1.0 nm，测量波长范围190〜260 nm，每个测量点持续时间0.5 s，重复3次，比色皿光程0.5 mm，测量温度为室温。1.5重组HPV各型VLP远紫外CD扫描将比色皿用2 mol/L硝酸浸泡过夜，去离子水冲洗干净后晾干，加入供试品0.2 ml，按照1.4项设定的参数在190〜260 nm波长下进行远紫外CD扫描，采集扫描数据。1.6数据分析采用Pro-Data Viewer软件对远紫外扫描图进行减去基线和平滑处理。采用CDNN软件对供试品二级结构进行拟合计算，在Milli-Degress模式下计算出190〜260 nm的波长区间内重组HPV VLP的α螺旋、β折叠（平行和反平行）、β转角和不规则卷曲的比例。2结果2.1重组HPV16 VLP的二级结构预测重组HPV16 VLP的远紫外CD扫描图见图1，在190〜260 nm波长区间，重组HPV16 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%，反平行β折叠37.1%，平行β折叠4.5%，β转角19.2%，不规则卷曲 30.3%。2.2重组HPV18 VLP的二级结构预测重组HPV18 VLP的远紫外CD扫描图见图2，在190〜260 nm波长区间，重组HPV18 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.9%，反平行β折叠36.9%，平行β折叠4.6%，β转角19.0%，不规则卷曲 30.7%。2.3重组HPV52 VLP的二级结构预测重组HPV52 VLP的远紫外CD扫描图见图3，在190〜260 nm波长区间，重组HPV52 VLP二级结构的预测结果为α螺旋12.3%，反平行β折叠37.1%，平行β折叠4.7%，β转角19.0%，不规则卷曲30.2%。2.4重组HPV58 VLP的二级结构预测重组HPV58 VLP的远紫外CD扫描图见图4，在190〜260 nm波长区间，重组HPV58 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%，反平行β折叠35.3%，平行β折叠4.4%，β转角20.4%，不规则卷曲 31.3%。3讨论平面偏振光可以视为由两束振幅相同但旋转方向相反的左圆偏振光和右圆偏振光组成[10]。平面偏振光入射旋光活性物质后，由于旋光活性物质的不对称性，其对左圆偏振光和右圆偏振光的吸收不同，会引起左、右圆偏振光振幅上的差异，使左、右圆偏振光透过旋光活性物质后变成了椭圆偏振光，导致平面偏振光的出射振动平面偏离入射振动平面，从而形成一个角度差，这种光学现象被称为物质的圆二色性。蛋白质分子的二级结构如α螺旋、β折叠、β转角和不规则卷曲等具有不对称性，这些结构对左、右圆偏振光的吸收不同，因此可以利用CD扫描对其二级结构进行分析预测。重组HPV16/18/52/58型VLP的CD预测结果表明，4个型别的HPV VLP二级结构中均包含α螺旋、反平行β折叠、平行β折叠、β转角和不规则卷曲5种结构形式，其中反平行β折叠和不规则卷曲的比例最高，均在30%以上，平行β折叠的比例最低，约为4%。不同型别HPV VLP之间的二级结构差异较小，α螺旋的比例在11.7%〜12.3%之间，型别间的变异系数（coefficient of variation，CV）为2.4%；反平行β折叠的比例在35.3%〜37.1%之间，CV=2.4%；平行β折叠的比例在4.4%〜4.7%之间，CV=2.8%；β转角的比例在19.0%〜20.4%之间，CV=3.5%；不规则卷曲的比例在30.2%〜31.3%之间，CV=1.6%。高危型别HPV感染是宫颈癌的主要诱因，全球每年宫颈癌新发病例约60万，死亡病例约30万，严重威胁女性健康[11-13]，疫苗接种可有效预防HPV感染。目前上市的宫颈癌疫苗均由重组HPV VLP吸附佐剂后制得[14-15]，HPV VLP的正确折叠和组装直接影响宫颈癌疫苗的免疫效果，因此重组HPV VLP的结构研究对于疫苗的质量控制具有重要意义。我们后续会继续积累更多批次的HPV VLP的CD数据，并考察不同批次间HPV VLP二级结构的一致性，更好地服务于宫颈癌疫苗的质量控制。作者王文伟   楼觉人上海至成生物科技有限公司研发部，上海  200051通信作者：楼觉人，Email：loujueren1@sinopharm.com引用本文：王文伟，楼觉人. 重组HPV病毒样颗粒二级结构的圆二色谱法预测 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(6): 316-319.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221017-00069