Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

中文摘要目的   评价自制磷酸铝佐剂在不同储存条件下的稳定性，为该佐剂的储存和有效期设置提供数据支持。方法   选取连续3批产业化规模的自制磷酸铝佐剂，分别置于（5±3） ℃和（25±2） ℃储存。定期取样考察磷酸铝佐剂的主要评价指标（外观、pH值、铝含量、吸附率、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌性、细菌内毒素、砷盐、铁盐、硫酸盐、铵盐、重金属、磷铝摩尔比、零电荷点、粒径大小与分布）。结果   3批磷酸铝佐剂在2种温度下储存15个月后，外观、无菌性均合格，pH值在5.4~6.2之间，吸附率在93%~100%之间，铝含量在2.77~3.36 mg/mL之间，氯化钠含量在7.90~8.60 g/L之间，沉降上清分析在12~15 mL之间，细菌内毒素在0.5~3.0 内毒素单位/mg铝之间，磷铝摩尔比在0.82~1.13之间，累积分布达到10%、50%、90%时对应的粒径大小分别为1.75~2.53、2.87~3.98和4.94~6.90 μm，零电荷点在5.11~5.47之间，残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005%、重金属≤0.002%，佐剂各项主要评价指标均稳定且符合质量标准。结论   3批自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃和（25±2） ℃条件下保存15个月后稳定性良好，为磷酸铝佐剂储存条件及效期的制定提供了依据。正文佐剂是疫苗产品组成的一部分，佐剂的加入不仅有助于增强疫苗稳定性，还能增强其有效性。铝佐剂是人用疫苗中使用最广泛的无机佐剂，在减少抗原用量和接种次数、提高疫苗免疫持久性等方面显示出独特的优势。疫苗中常用的铝佐剂主要为氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。目前，磷酸铝佐剂已在如吸附白喉/破伤风类毒素疫苗、脑膜炎双球菌B疫苗Trumenba®、13价肺炎球菌多糖结合疫苗Prevnar 13®、20价肺炎球菌多糖结合疫苗Prevnar 20®等疫苗中应用。然而，铝佐剂的稳定性和有效性很大程度上会限制疫苗制剂的稳定性和免疫功效，需要对铝佐剂进行稳定性研究，科学制定其保存温度和效期。本研究依据《新原料药和制剂的稳定性试验》Q1A（R2）、《预防用含铝佐剂疫苗技术指导原则》等，对兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）生产的3批产业化规模磷酸铝佐剂（自制磷酸铝佐剂）进行稳定性研究，动态观察其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌性、细菌内毒素、砷盐、铁盐、重金属、硫酸盐、铵盐、磷铝摩尔比（P/Al）、零电荷点、粒径大小与分布等主要质控指标，评估其稳定性，为磷酸铝佐剂的储存条件及效期的制定提供依据。1材料与方法1.1主要试剂与仪器3批自制磷酸铝佐剂〔批号：试AP-202201001（简写为1）、试AP-202202002（2）、试AP-202203003（3），铝含量分别为2.99、2.85、3.23 mg/mL〕和佐剂-抗原作用（吸附率）测定用破伤风类毒素均由兰州公司菌苗四室提供。氯化钠、硝酸银、硫氰酸铵、硫酸铁铵、高锰酸钾、硝酸、乙二胺四乙酸二钠、三氧化二砷均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司。Mastersizer 3000粒度仪、Zetasizer Nano ZEN2600电位仪和MPT-2自动电位滴定仪均购自英国Malvern公司；sevenExcellence型pH计、S20型pH计和METTLER XS4002S电子天平均购自瑞士梅特勒-托利多公司；UV-2600型紫外-可见分光光度计购自日本岛津公司。1.2稳定性研究方案依据中国药典2020年版四部（药典四部）9402生物制品稳定性试验指导原则等要求，将3批自制磷酸铝佐剂每批分2组分别置于（5±3） ℃、（25±2） ℃储存，每间隔3个月取样检测，持续储存15个月。对不同温度、不同时间的样品进行主要评价指标检测及趋势分析。1.3主要评价指标测定参照药典四部通则3650氢氧化铝佐剂检定方法对自制磷酸铝佐剂进行下列质控项目检测。1.3.1 外观　目视检查，其外观应为白色或乳白色，半透明、黏稠乳状液，静置可形成分层。1.3.2 pH值　取混匀的自制磷酸铝佐剂10 mL，置烧杯中，室温放置，测定pH值。1.3.3 佐剂-抗原相互作用　佐剂-抗原的相互作用以佐剂对抗原的吸附率表达。（1）佐剂稀释：用生理盐水稀释自制磷酸铝佐剂至铝浓度1 mg/mL，即得供试品溶液。（2）佐剂吸附破伤风类毒素：取适量破伤风类毒素，加入0.85%氯化钠水溶液制成3 mL溶液；再加入供试品溶液约1 mL，使体系终体积为4 mL、铝终浓度0.25 mg/mL、蛋白终浓度100 μg/mL。室温吸附（2.5±0.1） h，期间每隔10 min用涡旋振荡仪振摇1次。吸附液置 2~8 ℃过夜。（3）吸附上清检测：将吸附液转移至离心管，10 000×g离心10 min，收集上清液，以Lowry法检测上清游离蛋白质含量，记录各管吸光度值并计算蛋白质含量，以各管上清液游离的蛋白质含量对应其蛋白质总量计算吸附率，计算公式如下：1.3.4 铝含量　用过量的乙二胺四乙酸二钠与供试品中的铝离子反应，再用锌滴定液滴定剩余的乙二胺四乙酸二钠。根据锌滴定液的消耗量，用下式计算供试品中的铝含量：式中V0、V1分别为空白试验及供试品消耗锌滴定液的体积，mL；c为锌滴定液的浓度，mol/L；V2 为供试品体积，mL；26.98为铝的相对原子质量。1.3.5 P/Al计算　依据药典四部通则3103磷测定法测定佐剂中磷含量，根据磷铝含量计算P/Al。1.3.6 氯化钠含量　量取供试品1.0 mL，加入0.1 mol/L硝酸银水溶液5 mL，混匀，加入8.0 mol/L硝酸10 mL，加热消化至溶液澄清。冷却至室温，加纯化水50 mL、8%硫酸铁铵指示液1 mL，用硫氰酸铵滴定液（0.05 mol/L）滴定至溶液呈淡棕红色，振摇后仍不褪色，即为终点。将滴定的结果用空白试验（可不消化）校正。计算公式：式中V0、VX分别为空白试验及供试品消耗硫氰酸铵滴定液的体积，mL；c为硫氰酸铵滴定液浓度，为0.05 mol/L乘以滴定液F值，mol/L；58.45为氯化钠的分子量。1.3.7 沉降上清分析　将供试品用生理盐水稀释至1 mg/mL，用涡旋振荡仪振摇至少30 s，取25 mL溶液静置24 h，记录沉淀体积，从总体积中减去即得上清液体积，应≤20 mL。1.3.8 无菌检查　采用药典四部通则1101无菌检查法中薄膜过滤法进行检查。1.3.9 细菌内毒素检查　依据药典四部通则1143细菌内毒素检查法中的浊度法，使用鲎试剂进行检查，单位为内毒素单位（endotoxin unit，EU）/mg铝。1.3.10 砷盐、铁盐、重金属、硫酸盐、铵盐检测　采用药典四部通则3650氢氧化铝佐剂检测方法依次检测。1.3.11 零电荷点　采用Zetasizer Nano ZEN2600电位仪和MPT-2自动电位滴定仪联合法检测自制磷酸铝佐剂的零电荷点：取一定体积的样品置于离心管中，离心、复悬，稀释至浓度为80~200 μg/mL，将样品注入样品池，用盐酸和氢氧化钠水溶液进行滴定测定零电荷点。1.3.12 粒径大小与分布　采用激光衍射法，使用Mastersizer 3000粒度仪进行测定。于样品分散器中加入超纯水，搅拌，扣除背景，加入自制磷酸铝佐剂使遮光度控制在7%~15%范围内，检测粒径大小与分布。2结果2.1（5±3） ℃储存的自制磷酸铝佐剂稳定性3批自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃放置15个月，其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌检查、细菌内毒素、P/Al、零电荷点及粒径大小与分布等参数在储存期内均无明显变化，均符合质量标准且趋势稳定，见图1、表1；残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、重金属≤0.002%、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005%，符合质量标准。2.2（25±2） ℃储存的自制磷酸铝佐剂稳定性3批自制磷酸铝佐剂在（25±2） ℃条件下放置15个月，其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌检查、细菌内毒素、P/Al、零电荷点及粒径大小与分布在储存期内均无明显变化，均符合质量标准且趋势稳定，见图2、表2；残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、重金属≤0.002%、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005% ，符合质量标准。3讨论铝佐剂被广泛应用于疫苗中以增强抗原的免疫原性，其质量和稳定性直接关系到疫苗的质量及稳定性。磷酸铝为羟基磷酸铝化合物，其表面的羟基在不同pH条件下会失去或获得质子，从而改变表面电荷。由于表面羟基被磷酸基取代的程度取决于反应物、沉淀条件及其零电荷点，而P/Al的变化会导致零电荷点值的变化，因此溶液环境的变化可导致铝佐剂表面磷酸盐的解吸或吸附，并伴随着表面电荷和抗原-佐剂相互作用的改变。市售磷酸铝佐剂的P/Al在0.7~1.2之间，零电荷点在4.5~6.5之间。在较高pH下，增加羟基浓度可以使羟基更有效地竞争铝周围的配位位点；在较低pH值下，沉淀更有利于Al-PO4键而不是Al-OH键的形成。由此产生的组分差异进一步导致聚集变化，从而影响佐剂颗粒大小。此外，佐剂表面不同基团的暴露也会导致蛋白质吸附的类型和能力差异。同样重要的是，抗原与佐剂的结合可以是几种相互作用机制的组合。抗原与铝佐剂的结合在很大程度上是通过非共价相互作用，包括静电、疏水、氢键和范德华相互作用，其中以静电吸附最为常见。一般来说，离子强度低、磷酸基团少、杂质少，有利于抗原吸附到铝佐剂表面，同时抗原与铝佐剂的稳态结合作用也受到抗原的等电点、铝佐剂的零电荷点、配方的pH值和离子强度的共同作用。测定佐剂-抗原的吸附率，有助于了解铝佐剂对抗原的吸附能力，以及在不同条件下（如不同pH值或离子强度）和长期储存下的吸附能力。佐剂-抗原吸附后不能进行高温灭菌或除菌过滤等常规除菌工艺，即磷酸铝佐剂自制备完成后应严格保持无菌状态。本研究参照国内外药典及相关文献，对自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃和（25±2） ℃放置15个月的主要评价指标进行了稳定性考察。研究结果表明，自制磷酸铝佐剂在2种温度下保存15个月的各项指标均未发生明显变化，且批间一致性良好，同时也证实了既定的无菌处理工艺及其保存容器可达到预期的无菌保障，且在储存期内容器和产品均无明显相关杂质析出，相容性较好。值得注意的是，3批佐剂pH值变化趋势稍有不同，第2和第3批佐剂的pH随着保存时间的延长都有缓慢下降的趋势，这与文献报道一致；第1批佐剂pH趋势略有不同，可能是由0点检测结果偏低造成：3个月时检测pH为6.2，往后节点pH变化也符合缓慢下降的趋势。检测系统误差也会影响pH测定，造成测定值在一定范围内波动。3批佐剂pH值在储存期内虽稍有变化，但均在标准范围内。本研究通过对佐剂稳定性的分析和综合评估，证明了自制磷酸铝佐剂在储存期内的安全性和有效性，为产品稳定性考察提供了有利数据支持。作者杜娇  洪文浩  许哲  姚钰  刘倩  冯潇  杨英英  周海飞  兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗四室， 甘肃省疫苗技术创新中心， 兰州 730046通信作者：周海飞，Email：haifeichow@163.com引用本文：杜娇, 洪文浩, 许哲, 等.自制磷酸铝佐剂稳定性研究 [J].国际生物制品学杂志, 2025, 48(1): 10-15.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240717-00050识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

中文摘要 目的   研究肺炎球菌多糖结合疫苗中各血清型肺炎球菌在液体培养基中传代培养的稳定性。 方法   在液体培养基中对各代次肺炎球菌的培养时长进行对比；对第15代次（P15）与P4（对照组）进行菌种检定与荚膜多糖抗原基因序列分析；将P15菌种按生产工艺进行发酵培养，分析培养情况和荚膜多糖抗原产量及质量，与P4代次对比。 结果   在P7—P15中，各代次培养时长相近，且P15菌种检定、抗原基因序列与P4相比无差异，序列相似度为100%；P15菌种发酵培养后，菌体生长、荚膜多糖产量与荚膜多糖相关检定指标与P4无明显差异，且均符合中国药典质量标准。 结论   用于生产肺炎球菌多糖结合疫苗的各血清型肺炎球菌在液体环境中传代培养稳定。 正文 肺炎球菌广泛分布于自然环境、人类鼻咽与动物粪便中，已鉴定出超过100个血清型，少数可对人类致病，引起脑膜炎、菌血症、肺炎等，导致免疫力低下人群死亡。虽然抗生素治疗肺炎球菌感染的效果良好，但抗生素的不合理使用导致肺炎球菌耐多药菌株不断增加，使得预防显得尤为重要。当前有2类疫苗可用于预防肺炎球菌感染，即肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗。肺炎球菌多糖疫苗在婴幼儿、老年人和免疫缺陷者等人群中免疫应答低下。这种缺陷可以通过将多糖抗原与蛋白载体缀合来克服。另外，还有一些肺炎球菌蛋白以及灭活疫苗正处于上市申报或临床试验阶段。 随着肺炎球菌疫苗数量和种类的不断增加，中国药品监管部门对疫苗产量和质量的把控越来越严格。疫苗产量和质量的稳定性由菌种和工艺稳定性决定。据调研，目前尚无对肺炎球菌传代稳定性的报道。本研究采用更接近发酵环境的液体培养基对肺炎球菌进行传代培养，对其生物学特性、荚膜多糖产量与疫苗多糖质量等方面进行分析，从而确定肺炎球菌在液体环境中的传代稳定性。 1 材料与方法 1.1 菌株 肺炎球菌菌株来自中国医学细菌保藏管理中心，各血清型菌株号见表1。 1.2 材料 1.2.1　试剂　固体菌种培养基与液体发酵培养基主要成分：大豆蛋白胨（25 kg/桶）购自法国Organotechnie公司，L-半胱氨酸盐酸盐（5 kg/袋，药用级）购自天津天药药业股份有限公司，L-色氨酸（100 g/瓶，生化试剂）购自国药集团化学试剂有限公司，L-酪氨酸（25 kg/桶， 药用级）购自天津天药药业股份有限公司，磷酸氢二钾（1 kg/袋，药用级）购自湖南九典宏阳制药有限公司，浓盐酸（500 ml/瓶，药用级）购自湖南尔康制药股份有限公司。葡萄糖发酵管、菊糖发酵管、棉子发酵管、蜜二糖生化管、山梨醇发酵管购自青岛海博生物技术有限公司，奥普托欣纸片购自温州市康泰生物科技有限公司。 1.2.2　菌种　肺炎球菌工作种子由北京民海生物科技有限公司自制，-70 ℃保存。 1.3 仪器 311二氧化碳培养箱、SORVAIL LYNX6000高速离心机购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，SP-752紫外分光光度计购自北京普希科技有限公司，VS-1300L-U洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，BLBIO-5GJ-4-H四联机械搅拌玻璃发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司，JMCDSPCONS超滤系统购自德国Merk Millipore公司。 1.4 各代次培养时长对比 将肺炎球菌工作种子第4代（P4）接种于固体菌种培养基上，为P5，培养一段时间后接种于液体发酵培养基中，为P6，此后在液体发酵培养基中连续传代培养至P15。菌浓度以694 nm处吸光度值（A694 nm）表示，P6—P15均在液体发酵培养基中培养至A694 nm达0.4~0.6时，对培养时长进行统计。 1.5 菌种检定 向P15菌液中加入体积分数30%的甘油，-70 ℃保存。对P15菌种与P4菌种（对照）进行菌种检定，检定项目包括培养特性、染色镜检、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、荚膜肿胀试验。 1.6 荚膜多糖相关基因测序 10 000×g离心收集P15菌体，委托北京诺禾致源科技股份有限公司利用Oxford Nanopore测序技术进行第3代全基因组测序。使用DNAMAN软件对P15菌种与P4菌种（对照）的荚膜多糖合成相关的基因序列进行对比。 1.7 生产适用性 1.7.1　发酵研究　将24个血清型肺炎球菌根据进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类，分别选取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验对象。 分别开启肺炎球菌P15菌种与P4菌种（对照），经1代复苏后，分别转种于150 ml液体培养基中进行2代培养，A694 nm达0.4~0.6后分别转种至2.5 L发酵罐进行分批补料发酵培养。 1.7.2　多糖纯化　发酵培养结束后，加入0.1%脱氧胆酸钠杀菌；15 000×g离心去菌体，上清液经超滤后进行酸沉（向超滤浓缩液中加入冰醋酸调pH至4.00±0.20，静置1~3 h）、醇沉（料液中加入无水乙醇静置3~24 h），再经10倍1 mmol/L醋酸钠缓冲液对离心后的上清液洗滤后得到精制多糖原液。根据中国药典2020年版三部（药典三部）通则3429免疫化学法速率散射比浊法测定多糖含量。分别对P15与P4（对照）菌种发酵液纯化后的多糖原液进行检测，参照药典三部相关方法，对多糖原液进行检测，包括固体总量、蛋白质含量（Lowry法）、核酸含量（分光光度法）、总氮（凯氏定氮法）、总磷（钼酸铵法）、分子大小〔琼脂糖凝胶（SepharoseCL-4B/SepharoseCL-2B）过滤法〕、氨基己糖（二氨基苯甲醛显色法）、甲基戊糖（半胱氨酸显色法）。 2 结果 2.1 各代次培养时长对比 P6—P15各代菌种在液体发酵培养基中培养至相同的菌浓度（A694 nm达0.4~0.6），培养时长见图1。P6菌种由固体培养转为液体培养，其生长环境发生了剧烈变化，因此部分P6菌种生长的时长大于其他代次。P7—P15各代次培养时长相近，在传代过程较稳定。 2.2 菌种检定结果 各血清型P15菌种检定结果均合格：培养特性试验结果均符合规定；染色镜检均为革兰阳性球菌；生化反应葡萄糖、菊糖、棉子糖、蜜二糖均为阳性，山梨醇为阴性；胆汁溶菌试验菌液均变透明；奥普托欣试验除33F血清型对照试验抑菌圈直径为16 mm外，其余试纸抑菌圈直径均为15 mm；荚膜肿胀试验菌体周围均可见明显无色荚膜。结果表明在液体环境中传代对肺炎球菌无影响。 2.3 荚膜多糖相关基因测序 荚膜多糖相关基因位点位于dexB和aliA之间，关键序列长约20 000 bp。对各血清型P15、P4 菌种的荚膜多糖相关基因序列进行对比，相似度均为100%。表明肺炎球菌在液体培养基环境中传代稳定。 2.4 发酵研究数据分析 分别将P15、P4（对照）菌种复苏后，用相同的发酵培养基与发酵条件进行发酵，并观察与对比同一血清型的2条发酵生长曲线，见图2。3、5、9N、17F、33F型肺炎球菌在发酵的迟缓期、对数生长期和稳定前期均无明显差异。当发酵进入对数后期或稳定前期时进行收获，收获时间点如图中标示的点所示。P15菌种收获时菌浓度与对照无明显差异。 分别对P15与P4（对照）的发酵液进行多糖含量检测，并对其发酵的多糖表达量进行计算，见表2。3、5、9N、17F、33F型P15菌种发酵表达量与P4（对照）无明显差异。 2.5 多糖纯化数据分析 由表3可知，3、5、9N、17F、33F型P15与P4（对照）的多糖原液各项指标无明显差异，且均符合药典三部23价肺炎球菌多糖疫苗标准。 3 讨论 将24个血清型肺炎球菌根据进化关系和荚膜多糖合成机制分为5类。第1类包括1、2、6A、6B、7F、17F、18C、19A、19F、22F和23F；第2类包括8、9N、9V、11A、14和15B；第3类包括10A、20和33F；第4类包括4、5和12F；第5类包括3型。本研究分别选取代表性的3、5、9N、19F和33F型肺炎球菌为试验研究对象。 肺炎球菌传代培养时，P6菌种由固体培养转为液体培养，其生长环境发生了剧烈变化，且由于不同血清型适应能力不同，因此部分P6菌种生长的时长大于其他代次。不同血清型在P7—P15各个代次中，培养至相同菌浓度（A694 nm在0.4~0.6）时，其培养时长在传代过程中都较为稳定。在检测方面，根据药典三部通则规定的形态及培养特性、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、血清凝集试验及遗传稳定性研究等方法，分别对P15与P4（对照）菌种进行检定。药典三部中规定主种子批启开后至工作种子批，传代应不超过5代；工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过5代。通过上述实验和检测结果，可以得出结论：各血清型肺炎球菌菌种在生物学特性、生化特性、血清凝集试验和分子遗传特性等方面均符合23价肺炎球菌多糖疫苗各论要求，从而证实了肺炎球菌在使用代次内传代过程中能够稳定遗传。 在遗传稳定性方面，对肺炎球菌1个代次菌种经培养收获的菌体进行了全基因组测序，并对肺炎球菌荚膜多糖合成的靶位点基因序列进行对比，相似度均为100%。使用3代测序技术对肺炎球菌荚膜多糖关键基因片段进行检测，P4与P15测序中暂未发现序列突变，通过比较不同传代水平菌种基因组的核苷酸序列确定了种子批的遗传稳定性。通过对基因组的测序结果分析可以在后续的生产和使用过程中更好地保存、管理、监测菌种。 通过控制单一变量的方法，分别将P15与P4代次复苏后的3、5、9N、17F、33F型菌种进行发酵培养，同一血清型发酵生长曲线的迟缓期、对数生长期和稳定期均无明显差异，且P15与P4菌种的发酵表达量无明显差异，均在800 μg/ml以上，从而证实了肺炎球菌在使用代次内的传代过程中具有良好的遗传稳定性。 本研究通过分析肺炎球菌菌种、发酵培养阶段生物学特性、遗传稳定性和纯化阶段产量一致性，确定了肺炎球菌多糖疫苗生产用菌种不同批次培养后菌种传代稳定性，从而保证生产过程中菌种稳定性及产品产量和质量的稳定性。 综上所述，肺炎球菌菌种建立的主种子批、工作种子批均符合中国药典要求，具有良好的细菌培养传代稳定性。这一研究为肺炎球菌疫苗的生产研究和质量控制奠定了良好的研究基础，同时也为进一步研究肺炎球菌的基因遗传和表观遗传稳定性提供了有力的依据。后续将做好生产研发菌种的传代试验以保证疫苗质量符合规程要求，增加多批次发酵的数据并进行分析，从而使研究结果和讨论有据可依，为肺炎球菌多糖结合疫苗菌株遗传稳定性相关研究奠定良好理论依据。 作者 陈淑霞  王研研  汪辉  陈晓莹  蒋春红  于肖寒  李跃龙  曹欣 北京民海生物科技有限公司，结合疫苗新技术研究北京市重点实验室，北京  102600 通信作者：曹欣， Email：caoxin@biominhai.com 引用本文：陈淑霞, 王研研, 汪辉, 等. 肺炎球菌多糖结合疫苗菌株传代稳定性研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 349-354.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240415-00015 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观，不代表本站立。

中文摘要 目的   通过考察与腮腺炎病毒原液直接接触的一次性储液袋在冻存情况下的浸出物水平，评估使用一次性储液袋冻存腮腺炎病毒原液的安全性。 方法   将使用一次性储液袋和标准肖特瓶盛装的腮腺炎病毒模拟料液放置于-60 ℃以下冰箱保存，分别于0、6、12、15个月各取出3份样品，以提取物研究中检出的丙酮、叔丁醇和异丙醇作为靶标物质进行浸出物检测及安全剂量分析。 结果   丙酮、叔丁醇和异丙醇在保存周期中均于15个月时出现检出最高峰，浸出物含量分别达到415.02、275.82和936.92 μg/L，且各检测时间节点一次性储液袋浸出物含量均低于允许日接触量或安全评估阈值。 结论   使用一次性储液袋冻存的腮腺炎病毒模拟料液的浸出物含量未超出安全范围，安全性风险小。 正文 腮腺炎病毒属于副黏病毒科，为单股RNA病毒，不耐酸且易被脂溶剂灭活。国内传统的腮腺炎病毒疫苗原液制备工艺采用原代鸡胚细胞，经由细胞培养、病毒接种及收获病毒液合并制得。腮腺炎病毒对热敏感，极不稳定，目前国内主要采用玻璃瓶冻存腮腺炎病毒原液以解决上述问题，但玻璃瓶存在密闭性差、空间占用大、转运不便且融化过程破损严重等弊端。 一次性聚乙烯储液袋是目前生物行业广泛应用于盛装液体的容器，近几年开始被用于疫苗原液冻存，该品可以有效解决玻璃瓶使用过程中的诸多不便。作为直接接触药品的容器，一次性储液袋对药品安全性、有效性及稳定性的影响受到药品行业及药监部门的关注。 腮腺炎病毒原液需要长期低温保存于容器中，浸出物有可能随时间逐渐增加。本研究将在容器容量、表面积和储液量符合实际的前提下，通过分时检测腮腺炎病毒模拟料液的相关浸出物，评估一次性储液袋储存腮腺炎病毒原液时的浸出物含量，验证其安全性和实用性。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 199培养基购自美国Gibco公司，碳酸氢钠（分析纯级）和人血白蛋白（药品）购自国药集团化学试剂有限公司。 丙酮、叔丁醇、异丙醇标准溶液购自美国Accustandard公司，10 mg/ml水溶液。内标物：氘代乙醇-d6（CAS：1516-08-1）购自比利时Acros Organics公司。 1.2 仪器与设备 25 ml肖特试剂瓶和50 ml一次性储液袋、用于保存样品的超低温冰箱（可设置至-60 ℃以下并稳定运行）均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（赛默飞）。Shimadzu QP2010ultra型气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪由清华大学分析中心提供，配备有TR-WAXMS GC色谱柱（购自美国Thermo Scientific公司，30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口250 ℃，载体为高纯氦气，流量为1 ml/min，分流比为10。升温程序：35 ℃保持4 min。离子源200 ℃，接口250 ℃。 1.3 样品盛装容器 1.3.1　空白组　采用25 ml肖特试剂瓶盛装。该肖特试剂瓶的耐化学性符合ISO3585和4796标准，目前尚无此类容器存在丙酮、叔丁醇和异丙醇溶出或潜在溶出物的报道。 1.3.2　试验组　采用50 ml一次性储液袋。该规格一次性储液袋与生产使用的20 L大容量储液袋所采用的材质均为聚乙烯CX5-14膜。 1.4 样品准备 1.4.1　各容器比表面积对比　由表1可见，50 ml储液袋的比表面积最大，为12.82 cm2/ml，处于最具有挑战性的试验环境中，而实际生产中使用的20 L储液袋的比表面积为0.70 cm2/ml，仅为50 ml储液袋比表面积的约1/18。将50 ml储液袋作为浸出物试验的样品袋，得出的试验结论最具有代表性和权威性，对于判定实际生产的安全性更可靠。 1.4.2　模拟料液配制与装载　模拟料液含注射用水、199培养基、人血白蛋白、碳酸氢钠，为腮腺炎病毒原液的最终培养液体系，与生产用原液配液比一致，除不含腮腺炎病毒外所有成分组成无任何差异；并通过加入碳酸氢钠调节pH至与实际腮腺炎病毒原液一致。空白组于25 ml肖特试剂瓶中装入25 ml模拟料液，试验组于50 ml一次性储液袋中装入25 ml模拟料液。 1.4.3　浸出物样品准备及送检　空白组和试验组均放入-60 ℃以下冰箱冻存，分别于0、6、12和15个月各取出3份送样检测。样品运输方式采用干冰运输，保证运输过程中样品无解冻。检测前将样品容器置于水浴解冻（水温30 ℃以下），待样品完全解冻后，轻柔摇晃使料液完全混匀。委托赛默飞联合北京清华大学分析中心进行丙酮、叔丁醇和异丙醇含量检测，每份样品检测1次。浸出值的计算方式为将试验组检测均值减去空白组检测均值，以去除样本中本来含有的物质的影响，如差值为负数可认为试验组对照于空白组无浸出，相对浸出数值计为0。 1.5 浸出物检测及安全剂量分析 1.5.1　浸出物检测　使用GC-MS仪对送检的空白组和试验组样品中的丙酮、叔丁醇和异丙醇进行含量检测，检测中的仪器精度和准确度达到分析痕量挥发性物质的检测要求。 1.5.2　安全剂量分析　根据ICH Q3C（R8）《杂质：残留溶剂的指导原则》中常用有机溶剂分类及残留限度的要求进行残留毒性分析，评估相关浸出物的安全剂量。 2 结果 2.1 浸出物试验结果 由表2可见，到部分节点后数据呈现负增长，而浸出值的负增长并不一定是一次性储液袋中浸出物含量的减少。测试样品在0—15个月的保存周期中（该测试周期已覆盖腮腺炎病毒原液12个月的保存周期），丙酮、叔丁醇和异丙醇均于15个月时出现检出最高峰，浸出物含量分别达到415.02、275.82和936.92 μg/L，可以判断在整个保存周期中丙酮、叔丁醇和异丙醇的浸出物含量呈现波动增加的趋势，虽然在中间部分检测节点出现了未增长的情况，但在保存至15个月的最终检测节点时，丙酮、叔丁醇和异丙醇的浸出值与0个月的浸出值相比均大幅增长。从整个保存周期和检测周期判断丙酮、叔丁醇和异丙醇3种物质的浸出值是有所上升的（见表2）。 2.2 浸出物安全剂量分析 根据ICH Q3C（R8）《杂质：残留溶剂的指导原则》，丙酮和异丙醇均为3类溶剂，叔丁醇为2类溶剂。残留的3类溶剂含量依照原则需低于0.5%，0.5%的溶剂含量相当于5 000 μg/L，而该数值远远高于本试验各时间节点中检测出的3类溶剂的最大测试浓度（非均值）721.51、321.00、2 040.35 μg/L。因叔丁醇为2类溶剂，故在此基础上以更能反映药物安全性的允许日接触量（permitted daily exposure，PDE）来进行评估，并以终产品中样品的每日最大注射量为0.5 ml计算最大摄入量。 本次试验中PDE按照较严格的静脉注射药品的要求进行计算，数据来源于化学物质毒性数据库。由表3可知，试验中检出的3种浸出物成分的最大摄入量均低于相应的PDE。实际使用中，相关疫苗产品是由病毒原液经稀释配制而成，这意味着即使在更严格的情况下，各浸出物的最大摄入量都要远远低于PDE的限值。使用一次性储液袋并不会有安全性隐患。 3 讨论 一次性储液袋与药品应具有良好的相容性，本研究遵循《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）》开展部分相容性研究，相关研究均符合国际通用标准。 检测中方法的检测灵敏度为μg/L，定量方法采用选择性离子监测方法定量，定量离子分别为丙酮（43）、叔丁醇（59）、异丙醇（45）、氘代乙醇（33），3种待测物的线性范围为质量分数（2~100）×10-8。采用内标法定量，氘代乙醇为质量分数5×10-7。另外，氘代乙醇和异丙醇的保留时间相近（在质谱图上峰重合），不过定量离子不同且非相互的特征离子，不影响定量。由于试验中使用的GC-MS仪定量限为质量分数2×10-7，为较小的数值，因此相较于数值较大的数据，本次试验中的检出数据的浮动性相对较大。数值级别较小，更加证明了浸出物含量的数量级远未达到可以造成不良影响的程度。 由于丙酮、叔丁醇和异丙醇作为提取研究中确定的研究成分，均存在吸附和蒸发作用的影响，因此检测周期中浸出物检出的数值未必一定会随着保存时间增加而增加，本次试验组的一次性储液袋为加盖密闭容器并在盖子处缠绕绝缘胶带进行密闭保护，在进行检测前不进行任何拆卸外包的动作，检测过程中也进行样品的摇匀，最大程度避免了吸附和蒸发作用对本次试验的容器影响，检测数据可信度高。 本次试验中，丙酮、叔丁醇、异丙醇3种检出成分按产品每日最大注射量0.5 ml进行计算，检测值均低于欧洲药监局推荐的1.5 μg/d的安全性阈值。同时通过USP<88>动物体内试验也确定了溶出物在大剂量注射方面的安全性。 上海生物制品研究所有限责任公司疫苗二室在进行储液袋相容性试验的同期也进行了实际储存原液及原液配制成品的相关性研究，稳定性研究显示使用一次性储液袋冻存腮腺炎病毒原液在规定的有效期内可确保符合质量标准，甚至原液保存至超效期后仍符合腮腺炎病毒原液的滴度标准，与使用原1 L玻璃瓶无明显差异，利用上述超效期原液配制的麻腮风联合减毒活疫苗成品在超保存效期的各项时间节点的检测项目均符合企业标准。即一次性储液袋对于保存腮腺炎病毒原液在安全性、有效性及稳定性方面均有很好的保障，可以替代1 L玻璃瓶作为腮腺炎病毒原液的保存容器进行最多12个月的冻存。 另外，提升单个容器的冻存装量可保证产品质量更加稳定均一，缩短制冻时间可减少病毒滴度的损耗，相较于传统1 L玻璃瓶的手工制冻方式，储液袋的机器制冻方式可减少对终产品质量产生的不利影响，这也成为一次性储液袋替代1 L玻璃瓶作为腮腺炎病毒原液保存容器的一大优势。 作者 陈晓望1 杨文震2 周锋1 张芹1 汪张建1 李贞妮1 闻捷1 许晚1 沈谊清1 1上海生物制品研究所有限责任公司疫苗二室，上海 201403；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海 201403 通信作者：沈谊清， Email：iosyq@sina.com 引用本文：陈晓望, 杨文震, 周锋, 等. 一次性储液袋冻存腮腺炎病毒原液的浸出物研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 281-284.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231208-00023 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！