Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

中文摘要 目的   探究应用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法从去冷沉淀血浆上清液（cryoprecipitate reduced plasma supernatant，CRPS）分离纯化人凝血酶原复合物（human prothrombin complex concentrate， PCC）的可行性。 方法   采用凝胶吸附法从CRPS中连续制备3批次PCC制品，对该工艺中PCC原液、半成品和成品的人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ, FⅨ）效价回收率、杂蛋白含量、干热病毒灭活效果进行检测分析；对PCC成品进行检定分析和稳定性试验。 结果   以CRPS中FⅨ效价为100%，凝胶吸附工艺中PCC原液、半成品、成品的FⅨ效价回收率分别为（65.0±2.1）%、（56.3±4.2）%、（40.3±1.8）%；原液中杂蛋白含量较低；干热处理前后各项质量指标均合格。PCC成品检定显示，其物理、化学、效价与FⅨ比活性、活化凝血因子活性等质量指标均满足中国药典2020年版三部要求。加速和长期稳定性试验的各项质量指标检测结果与0个月相比虽有所浮动，但均合格。 结论   采用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法可成功从CRPS中分离纯化出PCC。 正文 人凝血酶原复合物（human prothrombin complex concentrate，PCC）是由维生素K介导、在肝脏内合成的糖蛋白。PCC制剂主要由人凝血因子（human coagulation factor ，F）Ⅱ、FⅦ、FⅨ和FⅩ 4种凝血因子组成，临床上常被用于乙型血友病、肝功能损伤等凝血功能障碍疾病的辅助治疗。 DEAE Sephadex A-50凝胶为弱碱性阴离子交换剂，在pH7.2~7.4的环境中能吸附大部分酸性蛋白，且该凝胶的蛋白结合能力强、稳定性好。本研究拟用该凝胶吸附方法分离纯化去冷沉淀血浆上清液（cryoprecipitate reduced plasma supernatant，CRPS）中的PCC，根据中国药典2020年版三部（药典三部）的要求检测相关质量指标，并对成品进行加速和长期稳定性试验，考察各项质量指标的变化情况，为PCC储存环境和有效期的研究提供依据。 1 材料与方法 1.1 样品 3批次CRPS（批号：1、2、3）均由国药集团上海血液制品有限公司制备并提供。 1.2 主要试剂与仪器 氯化钠购自江苏省勤奋药业有限公司；枸橼酸钠购自湖南尔康制药股份有限公司；吐温80购自德国Merck公司；磷酸三丁酯（tri-n-butyl phosphate，TNBP）、盐酸、醋酸和氢氧化钠均购自国药集团化学试剂有限公司；醋酸钠购自上海试四赫维化工有限公司；氨基酸购自上海味之素氨基酸有限公司；DEAE SephadexTM A-50型凝胶购自美国GE公司；GB150-1998型吸附罐A和吸附罐B均购自上海日泰医药设备工程有限公司；Pellicon-2型超滤系统购自美国Millipore公司；ACL TOP-300型全自动凝血仪购自美国沃芬公司。 1.3 PCC的制备 1.3.1　凝胶吸附　按照质量比1 000∶3将每批次CRPS和凝胶干粉加入吸附罐A中，搅拌吸附后排出滤液。然后用洗涤液（10 mmol/L枸橼酸钠溶液和100 mmol/L氯化钠溶液）反复洗涤吸附后的凝胶以去除杂蛋白，再使用解离液（10 mmol/L 枸橼酸钠和1 000 mmol/L氯化钠）将目标蛋白与凝胶分离。目标蛋白溶液经超滤脱盐得PCC，再加入有机溶剂/去污剂混合物灭活剂（质量分数50% 吐温80和15% TNBP），24~26 ℃灭活6 h。将灭活处理后的PCC转移至吸附罐B中，按照1 000 g CRPS 加入1 g凝胶干粉的比例，搅拌吸附后排出滤液，然后用洗涤液去除杂蛋白和残留的灭活剂，用解离液处理获取目标蛋白。 1.3.2　成品制备　对目标蛋白进行第2次超滤脱盐，得PCC原液。收集超滤滤液，加入氨基酸将pH调至7.0，即得PCC半成品。再将其除菌分装至模制瓶中，经冻干后置于80 ℃恒温箱中持续保温72 h进行干热病毒灭活，即得PCC成品。 1.4 凝胶吸附工艺检测 1.4.1　FⅨ效价回收率检测　采用药典三部通则3519的一期法测定凝胶吸附试验中CRPS、PCC原液、PCC半成品、PCC成品的FⅨ效价，以CRPS中FⅨ效价为100.0%，根据下列公式计算3批次中各级FⅨ效价回收率，并计算其均值。 1.4.2　杂蛋白含量检测　采用免疫散射浊度法对3批PCC原液中的IgG、IgA、IgM、人血白蛋白（human albumin，ALB）和纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）等杂蛋白含量进行检测。 1.4.3　干热病毒灭活效果　采用1.4.1的方法分别测定3批次干热灭活处理前的PCC冻干品和经80 ℃干热灭活处理72 h后的PCC成品的FⅨ效价，干热灭活处理后FⅨ效价应为8.0~14.0 国际单位（international unit，IU）/mL；采用药典三部通则0731的第一法检测二者中的蛋白质含量，并计算其对应的FⅨ比活性，即FⅨ效价与蛋白质含量的比值，FⅨ比活性应不低于0.5 IU/mg蛋白质；肉眼观察二者的外观，加入20~30 ℃灭菌注射用水，轻轻摇动复溶后再次进行观察，干热灭活处理前后制品的外观均应为白色或灰绿色疏松体，加入20~30 ℃灭菌注射用水复溶后，均应为无色、淡黄色、淡蓝色或黄绿色澄明液体，可带轻微乳光；检测二者加入20~30 ℃灭菌注射用水的复溶时间，应在15 min内完全溶解；采用灯检法检查二者的可见异物指标，不得检出金属屑、玻璃屑、长度＞2 mm的纤维、最大粒径＞2 mm的块状物以及静置一定时间后轻轻旋转时肉眼可见的烟雾状微粒沉积物、无法计数的微粒群或摇不散的沉淀，以及在规定时间内较难计数的蛋白质絮状物等明显可见异物。 1.5 PCC成品检定 1.5.1　物理检测　3批PCC成品的外观、复溶时间和可见异物指标检测及可接受标准参照1.4.3，渗透压摩尔浓度采用药典三部通则0632的冰点下降法检测，可接受标准：渗透压摩尔浓度为240～450 mOsmol/kg。 1.5.2　化学检测　按照药典三部的要求，采用通则0832库伦滴定法检测PCC成品的水分含量，应≤3.0%；采用通则0631电位法检测PCC成品pH值，应为6.5～7.5；采用通则3110火焰光度法检测PCC成品钠离子含量，应≤160 mmol/L；采用通则3108高效液相色谱法检测PCC成品枸橼酸离子含量，应≤25 mmol/L；采用通则3205气相色谱法检测PCC成品TNBP残留量，应≤10 μg/mL；采用通则3203比色法检测吐温80残留量，应≤100 μg/mL；采用通则3123高效液相色谱法检测氨基酸含量，应为0.10~0.30 mol/L。 1.5.3　效价和比活性检测　按1.4.1方法测定3批次PCC成品的FⅨ效价，并按照1.4.3的方法计算FⅨ比活性，要求FⅡ效价≥8.0 IU/mL，FⅦ效价≥5.3 IU/mL，FⅨ效价在8.0~14.0 IU/mL，FⅩ效价≥8.0 IU/mL。 1.5.4　其他项目检测　根据药典三部要求检测PCC成品的人凝血酶活性、凝血因子活性、无菌性、异常毒性、热原、HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen， HBsAg）。将3批PCC成品分别和人纤维蛋白原充分混合后，肉眼观察判断其人凝血酶活性， PCC成品应无凝块或纤维蛋白析出；向PCC成品加适量pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，至FⅨ效价为 20 IU/mL，并检定其活化的凝血因子活性，供试品稀释液凝固时间均应≥150 s；采用薄膜过滤法对PCC成品进行无菌检查，供试品管应澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长；采用小鼠试验法进行异常毒性检查，7 d观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，7 d后每只小鼠体重应增加；采用家兔法进行热原检查， 3只家兔注射供试品后的体温变化均＜0.6 ℃且升温总和＜1.3 ℃为合格；采用ELISA检测HBsAg，应为阴性。 1.5.5　稳定性试验 1.5.5.1　加速稳定性试验　将3批PCC成品于（25±2） ℃、相对湿度（60±10）%的条件下放置6个月，第0、3和6个月月末分别取样，采用药典三部通则3519的一期法检测样品FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价，检测方法及结果标准参照1.4.3和1.5.3。 1.5.5.2　长期稳定性试验　将3批PCC成品存放于（5±3） ℃、相对湿度（60±10）%条件下24个月，第0、12和24个月月末分别取样，按1.5.5.1方法检测样品FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价，检测方法及结果标准参照1.4.3和1.5.3。 1.6 统计学分析 使用Excel 2020软件对实验数据进行统计分析，数据用均值±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，P＞0.05表示差异无统计学意义。 2 结果 2.1 FⅨ效价回收率 各工艺阶段FⅨ效价回收率呈递减趋势，以CRPS的FⅨ效价为100%，PCC原液、PCC半成品和PCC成品回收率分别为（65.0±2.1）%、（56.3±4.2）%和（40.3±1.8）%，见图1。这表明凝胶吸附过程中超滤截留、凝胶吸附、干热处理等操作对FⅨ效价均会造成一定损失。 2.2 杂蛋白含量 对PCC原液样品进行杂蛋白检测分析，结果如表1所示，IgG、IgA、IgM、ALB和Fn含量分别为≤0.6 、≤0.5 、＜0.2 、＜0.4 和≤0.2 g/L。各种杂蛋白残留量均保持较低的水平，表明2次凝胶吸附和超滤操作能够去除PCC中的大部分杂蛋白，降低了蛋白质含量，从而获得较高比活性的制品。 2.3 干热病毒灭活效果 各指标的检测结果见表2。3批次干热处理后PCC成品的FⅨ效价均在8.0~14.0 IU/mL之间，FⅨ比活性均不低于0.5 IU/mg蛋白质，且二者干热处理前后的检测值间的差异不具有统计学意义，F值分别为6.63、1.80，P值均＞0.05。干热处理前后制品的外观均为白色疏松体，复溶时间均小于10 min，可见异物检查正常，均未出现金属屑、玻璃屑、长度超过2 mm的纤维、以及白色絮状物或颗粒等现象。表明干热处理对PCC制品的质量影响不显著。 2.4 PCC成品检定 2.4.1　物理检测结果　物理检测实验结果显示，3批PCC成品的外观成型均较好，为白色疏松体；复溶时间均在10 min以内，复溶后均为淡蓝色溶液且乳光较轻；可见异物检测中未发现絮状物或蛋白颗粒现象；渗透压摩尔浓度为（375.0±4.6） mOsmol/kg。 2.4.2　化学检测结果　对3批PCC成品进行化学检定，结果显示水分含量为（1.0±0.2）%、pH值为7.0±0.1、钠离子含量为（73.0±7.0） mmol/L、枸橼酸离子含量为（15.3±0.6） mmol/L、TNBP残留量为（0.3±0.4） μg/mL、吐温80残留量为（42.7±12.6） μg/mL、氨基酸含量为（0.2±0.0） mol/L。以上各指标的检定结果均符合药典三部标准，见表3。 2.4.3　效价与FⅨ比活性检测结果　对3批PCC成品的检测结果显示，FⅡ效价为（14.5±1.1） IU/mL，FⅦ效价为（10.8±1.2） IU/mL，FⅨ效价为（10.4±0.4） IU/mL，FⅩ效价为（13.9±0.4） IU/mL，FⅨ比活性计算结果为（0.7±0.1） IU/mg，见表4。各指标检测结果均符合药典三部的要求。 2.4.4　其他项目检测结果　3批PCC成品和人纤维蛋白原充分混合后均未观察到有凝块或纤维蛋白析出；活化凝血因子活性检查结果显示凝固时间为（394.9±18.6） s，均在150 s以上；无菌检查结果显示3批PCC成品的试管均澄清，无菌生长；异常毒性检查结果显示小鼠均无异常反应并健存，且体重增加；热原检查结果显示3只家兔升温值分别为（0.1±0.1） ℃、（0.2±0.1） ℃和（0.3±0.2） ℃，均＜0.6 ℃，且升温总和分别为（0.6±0.1） ℃、（0.6±0.2） ℃和（0.6±0.0） ℃，均＜1.3 ℃；ELISA显示，HBsAg结果均为阴性。 2.4.5　稳定性研究结果 2.4.5.1　加速稳定性试验结果   各指标检测结果均合格。FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价指标检测结果如表5所示，与0个月相比虽有所浮动，但均合格。FⅡ效价均≥8.0 IU/mL，FⅦ效价均≥5.3 IU/mL，FⅨ效价均在8.0~14.0 IU/mL之间，FⅩ效价均≥8.0 IU/mL。对效价进行单因素方差分析，比较批次间的差异性，结果显示差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。 2.4.5.2　长期稳定性试验结果   FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价指标检测结果如表6所示，与0个月相比虽有所浮动，但均合格。FⅡ效价均≥8.0 IU/mL，FⅦ效价均≥5.3 IU/mL，FⅨ效价均在8.0~14.0 IU/mL之间，FⅩ效价均≥8.0 IU/mL。对效价进行单因素方差分析，比较批次间的差异性，结果显示差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。 3 讨论 PCC的制备技术主要包括无机盐吸附法和离子交换吸附法，采用无机盐吸附法制备的PCC虽能满足临床需求，但原料血浆中的枸橼酸盐或柠檬酸盐会干扰PCC的吸附，且被无机盐处理过的血浆难以制备ALB、人免疫球蛋白等其他产品，不利于血浆的综合利用。目前由新乡华兰生物工程股份有限公司、上海莱士血液制品股份有限公司等生产的市售PCC产品主要通过凝胶吸附法获得，其具体制备工艺以及PCC成品的FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ含量各不相同。 本研究采用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法从CRPS中连续分离纯化并制备3批次PCC，在比较各阶段过程品的同时，根据药典三部要求对成品各项质量指标进行检测，并开展稳定性研究。首先分析了各工艺阶段的FⅨ效价回收率，结果表明，各级回收率均有损失，且逐级降低，可能原因为超滤过程存在的膜污染和浓差极化现象、除菌过滤过程中的高强度压差、以及冻干和干热处理等因素均会造成蛋白活性损失。然后对原液中的杂蛋白含量进行了检测与分析，发现凝胶吸附结合超滤工艺能实现较低的杂蛋白残留量。研究中还对干热处理前/后PCC制品的质量变化做了比较，结果发现FⅨ效价和比活性均有下降趋势。干热处理常用于凝血因子类产品的病毒灭活工艺，虽然已被证实可以灭活脂包膜和非脂包膜病毒，但对制品活性也会造成一定影响。对干热处理前/后FⅨ效价和比活性做单因素方差分析，结果表明差异不具有统计学意义。本研究还对PCC成品进行了检定分析，结果发现各项指标检测结果均满足药典三部规定，证明该工艺能去除绝大部分的化学物质残留，其中FⅨ的效价和比活性分别为（10.4±0.4） IU/mL和（0.7±0.1） IU/mg，与已有报道相仿。另外对各批次间FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价的差异性进行了统计学分析，结果表明均不具有统计学意义。 综上所述，本研究采用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法从CRPS中成功制备出安全、稳定的PCC制品，为未来PCC的商业规模化生产奠定了基础。 作者 刘环1  张良1  曹璟1  杨帆1  方明阳2  江砚芳1 1国药集团上海血液制品有限公司血液制剂室，上海 200051；2国药集团昆明血液制品有限公司血液制剂室，昆明 650212 通信作者：江砚芳， Email：jiangyanfang@sinopharm.com 引用本文：刘环, 张良, 曹璟, 等. 人凝血酶原复合物的分离纯化工艺 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 241-246.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241216-00088 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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中文摘要目的   考察经免疫亲和层析纯化的马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点分布与比活性的关系，为工艺优化建立更好的质量表征。方法   采用毛细管等电聚焦电泳测定免疫亲和层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点，并进行统计分析。结果   免疫亲和层析纯化前后样品的等电点分布范围均在4.97~9.88之间；纯化后样品等电点的分布更为集中；样品纯化后在等电点区间6.01—7.00和8.01—9.00的峰面积占比较纯化前的有所增加，平均增加幅度分别为70%、37%；在等电点区间7.01—8.00和9.01—10.00的峰面积占比降低，平均降低幅度分别为25%、26%。结论   根据研究结果推测，马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2中针对破伤风毒素的中和活性较强的抗体等电点可能主要分布在6.01—7.00和8.01—9.00。正文马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是由破伤风类毒素免疫马所得的血浆经系列纯化制得的液体免疫球蛋白制剂，可用于预防和治疗由破伤风梭菌引起的感染。马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是天然多克隆抗体，各组分对破伤风毒素的结合能力不同。文献报道，马免疫球蛋白的IgG按血清学可分为5个亚型，即IgGa、IgGb、IgGc、IgG（T）和IgG（B），其中IgG（T）是最主要的中和抗体，相对分子质量最大，约180 000，其他亚型的相对分子质量为160 000~170 000。比活性是反映该类产品质量优劣的最主要指标，中和抗体占总抗体的比例越高，其比活性就越好。本研究所用马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是采用免疫亲和层析工艺纯化制备的高比活性制剂，与采用传统硫酸铵盐析法制备的破伤风抗毒素相比，其比活性提高2~3倍，采用SDS-PAGE法或高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定亲和层析纯化前后样品的F（ab'）2含量及保留时间，二者均无明显差别，这说明中和抗体及各种亚型的IgG的分子大小非常接近，采用传统电泳法及HPLC法无法对其差异进行表征。理论上，抗体Fab片段氨基酸序列的差异是导致抗体亲和活性不同的最主要因素，不同的氨基酸序列可能会造成F（ab'）2表面电荷差异。基于此，本研究尝试探索马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2各种亚型抗体的表面电荷分布，进而分析其等电点分布与比活性的关联性。毛细管电泳自20世纪80年代后发展迅速，具有分析速度快、分离模式多、样品和试剂消耗少等优点，已在医学、化学和生物医药领域广泛应用。本研究采用毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）电泳对马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点分布进行对比测定，探寻具有较高中和活性F（ab'）2的等电点分布特点，从而为该品的工艺改进提供理论依据和技术支持。1材料与方法1.1马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品层析纯化前样品：采用经破伤风类毒素免疫后的混合马血浆作为原料，经胃蛋白酶消化、硫酸铵盐析、超滤后制得。层析纯化后样品：以破伤风类毒素作为亲和配基，对上述样品进行免疫亲和层析纯化后制得。2种样品的编号及关键质量指标见表1。1.2主要试剂和仪器中性毛细管、等电点聚合凝胶、Marker（CIEF peptide marker kit）均购自美国贝克曼库尔特公司，硫酸铵、磷酸、氢氧化钠、乙酸均购自国药集团化学试剂有限公司，胃蛋白酶购自重庆奥力生物制药有限公司，精氨酸购自美国Sigma公司，亚氨基二乙酸购自北京索莱宝科技有限公司，尿素购自美国Bio-Rad公司，两性电解质（Pharmalyte 3-10）购自美国GE Healthcare公司。PA800 plus毛细管电泳仪购自美国贝克曼库尔特公司。1.3马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2含量测定方法1.3.1　SDS-PAGE法测定F（ab'）2含量　参照中国药典2020年版三部（药典三部）通则0541电泳法中的第五法，采用质量分数7.5%丙烯酰胺分离胶分析样品纯度。1.3.2　HPLC法测定F（ab'）2含量　参照药典三部通则3128抗毒素/抗血清制品分子大小分布测定法测定。1.4等电点分布测定与分析1.4.1　等电点分布测定　采用毛细管电泳仪测定马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2免疫亲和层析纯化前后样品的等电点分布，详细测定方法如下。毛细管预处理：运行“CIEF conditioning method”，即在345 kPa压力下依次用去离子水冲洗5 min，乙酸冲洗2 min，等电点聚合凝胶冲洗5 min，程序运行结束后即可进样检测。样品要求及处理：将样品用纯化水稀释至工作浓度（5~10 mg/mL）。CIEF电泳样品缓冲系统配制方法： 3 mol/L尿素液体凝胶溶液200 μL、两性电解质12 μL、阴极稳定液20 μL、阳极稳定液2 μL、等电点 marker A（10.0）2 μL、等电点 marker B （7.0）2 μL、等电点marker C（4.1） 2 μL、稀释后的样品10 μL（盐离子浓度低于50 mmol/L），混合后加入分析池。电泳条件：检测器 UV、检测波长 280 nm、毛细管切割长度 30.2 cm、毛细管有效长度 20 cm、毛细管温度 20 ℃、样品室温度 20 ℃、聚焦电压 25 kV、聚焦时间 15 min、分离电压 30 kV、运行时间 30 min。结果分析：用等电聚焦marker理论值及相应的迁移时间建立标准曲线，其中拟合优度值＞0.99，表明marker拟合性好，可用作定量。按毛细管电泳仪操作说明测定等电点。1.4.2　等电点分布结果分析　对层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品的等电点分布结果进行分析：（1）统计纯化前后样品等电点峰的数量和等电点分布范围；（2）分别统计纯化前后样品不同等电点区间的峰面积占比并进行比较。2结果2.1马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2含量测定结果HPLC结果显示，层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的含量均在96%以上，二者无明显差异，见图1和图2。SDS-PAGE结果显示，层析纯化前后F（ab'）2含量均在90%~93%之间，无明显差异，见图3。2.2马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点分布范围和分布峰数量测定结果亲和层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品的毛细管电泳等电点分布范围和分布峰数量结果如下：第1批样品纯化前后等电点分布峰数分别为38和31，等电点分布范围均为4.97~9.88（图4）。第2、3批样品纯化前后结果类似：纯化前等电点分布峰的总数分别为41、37，纯化后的峰数分别为35、34，纯化后峰数量略少；峰的分布范围方面，纯化前后样品的等电点分布范围均在4.97~9.88之间，等电点分布峰呈现范围相同且分布较广的趋势。2.3马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2不同等电点区间峰面积占比分析将图4中的峰按照等电点分布不同分为6个区间：1—6区间分别对应等电点4.10—5.00、5.01—6.00、6.01—7.00、7.01—8.00、8.01—9.00和9.01—10.00。剔除marker峰后，层析纯化后样品峰面积占比增加的2个区间为6.01—7.00和8.01—9.00，对应峰面积占比平均值分别提高70%和37%。层析纯化后样品峰面积占比减小的2个区间是7.01—8.00和9.01—10.00，峰面积占比平均值分别降低25%和26%。而在等电点区间4.10—5.00和5.01—6.00，层析纯化前后样品峰面积占比虽然分别增加和减小，但总占比均较低。结果见表2。3讨论马免疫血清类制品的发展先后历经原制血清、浓制血清、精制抗毒素等阶段，每一次技术升级及改进均聚焦于如何提高产品的质量及比活性、降低产品杂蛋白含量和过敏反应发生率。马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是破伤风抗毒素的升级换代产品，从2020年版中国药典质量标准来看，其比活性明显高于破伤风抗毒素。在临床应用中，大量文献报道也印证了马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2具有更好的安全性，进一步说明马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2比活性越高安全性越好。本研究对免疫亲和层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品中F（ab'）2含量进行测定，采用SDS-PAGE法检测F（ab'）2含量均在90%以上，用HPLC法检测F（ab'）2含量均在96%以上，二者结果无明显差异。分析CIEF电泳结果发现，层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品的等电点分布既有一致性又存在差异：相同点是二者等电点分布范围均为4.97~9.88，分布峰的总数也无明显差异。这是由于马免疫血清类制品是天然的多克隆抗体，免疫亲和层析过程可富集中和活性较强的抗体从而提高比活性，但层析过程中的非特异性吸附又导致不具中和活性的抗体无法被完全去除；同时多克隆抗体本身成分复杂，从而在等电点分布中呈现范围分布较广、数量较多的趋势。不同点在于，层析纯化前后样品在不同等电点区间的峰面积占比不同。在等电点区间6.01—7.00和8.01—9.00，层析纯化后样品的峰面积占比有所增高，增高幅度分别为70%和37%。而在等电点区间7.01—8.00和9.01—10.00，层析纯化后样品的峰面积占比有所降低，平均降幅分别为25%和26%。因此推测，中和活性较强的抗体可能主要分布在等电点6.01—7.00和8.01—9.00区间内。本研究从F（ab'）2含量及等电点分布角度对马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2层析纯化前后样品的比活性差异进行探讨，发现免疫层析纯化前后样品中F（ab'）2含量无明显差异，说明F（ab'）2含量不是影响比活性的主要原因；纯化前后等电点分布峰总数和分布范围虽无明显差异，但不同区间峰面积占比差异较大，说明比活性差异可从等电点分布角度体现。尽管对等电点区间的划分是人为划分，具有一定局限性，但在其他检测方法无法解释样品比活性差异的情况下，保证层析纯化前后划分方法一致即可确保本研究分析的准确性和科学性。从本研究等电点分布研究结果来看，免疫层析纯化前后样品等电点分布差异较大区间对应的蛋白应该是影响产品比活性的中和活性最强的F（ab'）2。后续研究将探究提高6.01—7.00和8.01—9.00区间对应蛋白的含量，分别纯化后进行比活性检测，以明确比活性和等电点分布的关系，从而进一步提高产品的比活性。本研究为马血清制品生产工艺改进和质量提高提供了新的研究思路和方法。作者包正琦  梁凌宇  秦芝蕾  段丽娟  马江  张锐  高建军  兰州生物制品研究所有限责任公司血清室，甘肃省疫苗技术创新中心， 兰州 730046通信作者：高建军，Email：gao5369@163.com引用本文：包正琦, 梁凌宇, 秦芝蕾 , 等. 马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2比活性与等电点分布的关联性 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(3): 170-174.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241129-00083识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

中文摘要目的   评价自制磷酸铝佐剂在不同储存条件下的稳定性，为该佐剂的储存和有效期设置提供数据支持。方法   选取连续3批产业化规模的自制磷酸铝佐剂，分别置于（5±3） ℃和（25±2） ℃储存。定期取样考察磷酸铝佐剂的主要评价指标（外观、pH值、铝含量、吸附率、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌性、细菌内毒素、砷盐、铁盐、硫酸盐、铵盐、重金属、磷铝摩尔比、零电荷点、粒径大小与分布）。结果   3批磷酸铝佐剂在2种温度下储存15个月后，外观、无菌性均合格，pH值在5.4~6.2之间，吸附率在93%~100%之间，铝含量在2.77~3.36 mg/mL之间，氯化钠含量在7.90~8.60 g/L之间，沉降上清分析在12~15 mL之间，细菌内毒素在0.5~3.0 内毒素单位/mg铝之间，磷铝摩尔比在0.82~1.13之间，累积分布达到10%、50%、90%时对应的粒径大小分别为1.75~2.53、2.87~3.98和4.94~6.90 μm，零电荷点在5.11~5.47之间，残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005%、重金属≤0.002%，佐剂各项主要评价指标均稳定且符合质量标准。结论   3批自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃和（25±2） ℃条件下保存15个月后稳定性良好，为磷酸铝佐剂储存条件及效期的制定提供了依据。正文佐剂是疫苗产品组成的一部分，佐剂的加入不仅有助于增强疫苗稳定性，还能增强其有效性。铝佐剂是人用疫苗中使用最广泛的无机佐剂，在减少抗原用量和接种次数、提高疫苗免疫持久性等方面显示出独特的优势。疫苗中常用的铝佐剂主要为氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。目前，磷酸铝佐剂已在如吸附白喉/破伤风类毒素疫苗、脑膜炎双球菌B疫苗Trumenba®、13价肺炎球菌多糖结合疫苗Prevnar 13®、20价肺炎球菌多糖结合疫苗Prevnar 20®等疫苗中应用。然而，铝佐剂的稳定性和有效性很大程度上会限制疫苗制剂的稳定性和免疫功效，需要对铝佐剂进行稳定性研究，科学制定其保存温度和效期。本研究依据《新原料药和制剂的稳定性试验》Q1A（R2）、《预防用含铝佐剂疫苗技术指导原则》等，对兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）生产的3批产业化规模磷酸铝佐剂（自制磷酸铝佐剂）进行稳定性研究，动态观察其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌性、细菌内毒素、砷盐、铁盐、重金属、硫酸盐、铵盐、磷铝摩尔比（P/Al）、零电荷点、粒径大小与分布等主要质控指标，评估其稳定性，为磷酸铝佐剂的储存条件及效期的制定提供依据。1材料与方法1.1主要试剂与仪器3批自制磷酸铝佐剂〔批号：试AP-202201001（简写为1）、试AP-202202002（2）、试AP-202203003（3），铝含量分别为2.99、2.85、3.23 mg/mL〕和佐剂-抗原作用（吸附率）测定用破伤风类毒素均由兰州公司菌苗四室提供。氯化钠、硝酸银、硫氰酸铵、硫酸铁铵、高锰酸钾、硝酸、乙二胺四乙酸二钠、三氧化二砷均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司。Mastersizer 3000粒度仪、Zetasizer Nano ZEN2600电位仪和MPT-2自动电位滴定仪均购自英国Malvern公司；sevenExcellence型pH计、S20型pH计和METTLER XS4002S电子天平均购自瑞士梅特勒-托利多公司；UV-2600型紫外-可见分光光度计购自日本岛津公司。1.2稳定性研究方案依据中国药典2020年版四部（药典四部）9402生物制品稳定性试验指导原则等要求，将3批自制磷酸铝佐剂每批分2组分别置于（5±3） ℃、（25±2） ℃储存，每间隔3个月取样检测，持续储存15个月。对不同温度、不同时间的样品进行主要评价指标检测及趋势分析。1.3主要评价指标测定参照药典四部通则3650氢氧化铝佐剂检定方法对自制磷酸铝佐剂进行下列质控项目检测。1.3.1 外观　目视检查，其外观应为白色或乳白色，半透明、黏稠乳状液，静置可形成分层。1.3.2 pH值　取混匀的自制磷酸铝佐剂10 mL，置烧杯中，室温放置，测定pH值。1.3.3 佐剂-抗原相互作用　佐剂-抗原的相互作用以佐剂对抗原的吸附率表达。（1）佐剂稀释：用生理盐水稀释自制磷酸铝佐剂至铝浓度1 mg/mL，即得供试品溶液。（2）佐剂吸附破伤风类毒素：取适量破伤风类毒素，加入0.85%氯化钠水溶液制成3 mL溶液；再加入供试品溶液约1 mL，使体系终体积为4 mL、铝终浓度0.25 mg/mL、蛋白终浓度100 μg/mL。室温吸附（2.5±0.1） h，期间每隔10 min用涡旋振荡仪振摇1次。吸附液置 2~8 ℃过夜。（3）吸附上清检测：将吸附液转移至离心管，10 000×g离心10 min，收集上清液，以Lowry法检测上清游离蛋白质含量，记录各管吸光度值并计算蛋白质含量，以各管上清液游离的蛋白质含量对应其蛋白质总量计算吸附率，计算公式如下：1.3.4 铝含量　用过量的乙二胺四乙酸二钠与供试品中的铝离子反应，再用锌滴定液滴定剩余的乙二胺四乙酸二钠。根据锌滴定液的消耗量，用下式计算供试品中的铝含量：式中V0、V1分别为空白试验及供试品消耗锌滴定液的体积，mL；c为锌滴定液的浓度，mol/L；V2 为供试品体积，mL；26.98为铝的相对原子质量。1.3.5 P/Al计算　依据药典四部通则3103磷测定法测定佐剂中磷含量，根据磷铝含量计算P/Al。1.3.6 氯化钠含量　量取供试品1.0 mL，加入0.1 mol/L硝酸银水溶液5 mL，混匀，加入8.0 mol/L硝酸10 mL，加热消化至溶液澄清。冷却至室温，加纯化水50 mL、8%硫酸铁铵指示液1 mL，用硫氰酸铵滴定液（0.05 mol/L）滴定至溶液呈淡棕红色，振摇后仍不褪色，即为终点。将滴定的结果用空白试验（可不消化）校正。计算公式：式中V0、VX分别为空白试验及供试品消耗硫氰酸铵滴定液的体积，mL；c为硫氰酸铵滴定液浓度，为0.05 mol/L乘以滴定液F值，mol/L；58.45为氯化钠的分子量。1.3.7 沉降上清分析　将供试品用生理盐水稀释至1 mg/mL，用涡旋振荡仪振摇至少30 s，取25 mL溶液静置24 h，记录沉淀体积，从总体积中减去即得上清液体积，应≤20 mL。1.3.8 无菌检查　采用药典四部通则1101无菌检查法中薄膜过滤法进行检查。1.3.9 细菌内毒素检查　依据药典四部通则1143细菌内毒素检查法中的浊度法，使用鲎试剂进行检查，单位为内毒素单位（endotoxin unit，EU）/mg铝。1.3.10 砷盐、铁盐、重金属、硫酸盐、铵盐检测　采用药典四部通则3650氢氧化铝佐剂检测方法依次检测。1.3.11 零电荷点　采用Zetasizer Nano ZEN2600电位仪和MPT-2自动电位滴定仪联合法检测自制磷酸铝佐剂的零电荷点：取一定体积的样品置于离心管中，离心、复悬，稀释至浓度为80~200 μg/mL，将样品注入样品池，用盐酸和氢氧化钠水溶液进行滴定测定零电荷点。1.3.12 粒径大小与分布　采用激光衍射法，使用Mastersizer 3000粒度仪进行测定。于样品分散器中加入超纯水，搅拌，扣除背景，加入自制磷酸铝佐剂使遮光度控制在7%~15%范围内，检测粒径大小与分布。2结果2.1（5±3） ℃储存的自制磷酸铝佐剂稳定性3批自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃放置15个月，其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌检查、细菌内毒素、P/Al、零电荷点及粒径大小与分布等参数在储存期内均无明显变化，均符合质量标准且趋势稳定，见图1、表1；残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、重金属≤0.002%、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005%，符合质量标准。2.2（25±2） ℃储存的自制磷酸铝佐剂稳定性3批自制磷酸铝佐剂在（25±2） ℃条件下放置15个月，其外观、pH值、吸附率、铝含量、氯化钠含量、沉降上清分析、无菌检查、细菌内毒素、P/Al、零电荷点及粒径大小与分布在储存期内均无明显变化，均符合质量标准且趋势稳定，见图2、表2；残留杂质砷盐≤0.001‰、铁盐≤0.015‰、重金属≤0.002%、硫酸盐≤0.5%、铵盐≤0.005% ，符合质量标准。3讨论铝佐剂被广泛应用于疫苗中以增强抗原的免疫原性，其质量和稳定性直接关系到疫苗的质量及稳定性。磷酸铝为羟基磷酸铝化合物，其表面的羟基在不同pH条件下会失去或获得质子，从而改变表面电荷。由于表面羟基被磷酸基取代的程度取决于反应物、沉淀条件及其零电荷点，而P/Al的变化会导致零电荷点值的变化，因此溶液环境的变化可导致铝佐剂表面磷酸盐的解吸或吸附，并伴随着表面电荷和抗原-佐剂相互作用的改变。市售磷酸铝佐剂的P/Al在0.7~1.2之间，零电荷点在4.5~6.5之间。在较高pH下，增加羟基浓度可以使羟基更有效地竞争铝周围的配位位点；在较低pH值下，沉淀更有利于Al-PO4键而不是Al-OH键的形成。由此产生的组分差异进一步导致聚集变化，从而影响佐剂颗粒大小。此外，佐剂表面不同基团的暴露也会导致蛋白质吸附的类型和能力差异。同样重要的是，抗原与佐剂的结合可以是几种相互作用机制的组合。抗原与铝佐剂的结合在很大程度上是通过非共价相互作用，包括静电、疏水、氢键和范德华相互作用，其中以静电吸附最为常见。一般来说，离子强度低、磷酸基团少、杂质少，有利于抗原吸附到铝佐剂表面，同时抗原与铝佐剂的稳态结合作用也受到抗原的等电点、铝佐剂的零电荷点、配方的pH值和离子强度的共同作用。测定佐剂-抗原的吸附率，有助于了解铝佐剂对抗原的吸附能力，以及在不同条件下（如不同pH值或离子强度）和长期储存下的吸附能力。佐剂-抗原吸附后不能进行高温灭菌或除菌过滤等常规除菌工艺，即磷酸铝佐剂自制备完成后应严格保持无菌状态。本研究参照国内外药典及相关文献，对自制磷酸铝佐剂在（5±3） ℃和（25±2） ℃放置15个月的主要评价指标进行了稳定性考察。研究结果表明，自制磷酸铝佐剂在2种温度下保存15个月的各项指标均未发生明显变化，且批间一致性良好，同时也证实了既定的无菌处理工艺及其保存容器可达到预期的无菌保障，且在储存期内容器和产品均无明显相关杂质析出，相容性较好。值得注意的是，3批佐剂pH值变化趋势稍有不同，第2和第3批佐剂的pH随着保存时间的延长都有缓慢下降的趋势，这与文献报道一致；第1批佐剂pH趋势略有不同，可能是由0点检测结果偏低造成：3个月时检测pH为6.2，往后节点pH变化也符合缓慢下降的趋势。检测系统误差也会影响pH测定，造成测定值在一定范围内波动。3批佐剂pH值在储存期内虽稍有变化，但均在标准范围内。本研究通过对佐剂稳定性的分析和综合评估，证明了自制磷酸铝佐剂在储存期内的安全性和有效性，为产品稳定性考察提供了有利数据支持。作者杜娇  洪文浩  许哲  姚钰  刘倩  冯潇  杨英英  周海飞  兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗四室， 甘肃省疫苗技术创新中心， 兰州 730046通信作者：周海飞，Email：haifeichow@163.com引用本文：杜娇, 洪文浩, 许哲, 等.自制磷酸铝佐剂稳定性研究 [J].国际生物制品学杂志, 2025, 48(1): 10-15.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240717-00050识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。