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中文摘要目的   构建粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）Fc与小分子药物DXd偶联物（GM-DXd），并探究其靶向杀伤急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞的治疗效果。方法   制备靶向GM-CSF受体（GM-CSF receptor，GMR）的GM-DXd，并通过还原性SDS-PAGE鉴定GM-DXd。采用蛋白质印迹检测GM-DXd的生物活性，流式细胞术检测AML细胞MV4-11、THP-1对GM-DXd的内化情况，细胞增殖-毒性检测和流式细胞术分别评价GM-DXd对GMR阳性AML细胞的活性抑制和凋亡诱导能力，蛋白质印迹检测诱导凋亡蛋白的表达。结果   制备的GM-DXd生物活性稳定，能成功被AML细胞内吞；与未给药组相比，GM-DXd抑制了AML细胞活性（对MV4-11和THP-1细胞的抑制中浓度分别为15.91和37.64 nmol/L）并促进AML细胞凋亡（20 nmol/L GM-DXd分别诱导~90%、~60%的MV4-11、THP-1细胞凋亡），细胞杀伤能力比DXd更强。结论   小分子偶联药物GM-DXd通过靶向GMR能够有效杀伤AML细胞，可以作为治疗AML的潜在药物。正文急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是最常见的成年人急性白血病，其特征是造血干细胞和祖细胞不受控制地生长。AML的标准治疗方式是基于阿糖胞苷和蒽环类药物的化学治疗（化疗）诱导方案（7+3），虽然靶向治疗的出现为携带特定突变的AML患者提供了新的治疗方法，然而仍有60%~70%的患者在达到完全缓解后复发，需要更有效的疗法来实现更持久的缓解。生长因子及其受体的异常表达已被证明与几种恶性肿瘤有关，这些生长因子被认为是将细胞毒性有效载荷递送到肿瘤细胞的理想载体。其中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）是参与造血细胞生长和分化的细胞因子，也可作为免疫调节剂。高亲和力的GM-CSF受体（GM-CSF receptor，GMR）是由CD116（α亚基）和CD131（β亚基）组成的异源二聚体，在早期造血干细胞上低表达而在大多数AML患者的原始干细胞表面高表达，被认为是AML靶向治疗的有吸引力的靶标。小分子细胞毒性药物喜树碱类似物DXd作为DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，通过GM-CSF与GMR结合被AML细胞内吞，可造成DNA损伤、引起细胞凋亡，最终通过靶向AML细胞延缓疾病进展。本研究将重组人GM-CSF（recombinant human GM-CSF，rhGM-CSF）Fc融合蛋白与DXd通过蛋白酶可裂解连接子马来酰亚胺-己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酸酯（maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyl alcohol，MC-VC-PABC）连接，构建靶向GMR的小分子药物偶联物GM-DXd，以期为AML的治疗提供候选策略。1材料与方法1.1试剂和仪器AML细胞系MV4-11、THP-1由中山大学附属第七医院科研中心爱德蒙·菲舍尔转化医学研究实验室冻存并提供；RPMI-1640和IMDM培养基、胎牛血清均购自美国Hyclone公司；rhGM-CSF-Fc融合蛋白购自北京义翘神州科技股份有限公司；偶联MC-VC-PABC的DXd（MC-VC-PAB-DXd）购自美国Med Chem Express公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐〔tris（2-carboxyethyl）phosphine hydrochloride，TCEP〕购自生工（上海）生物工程股份有限公司；蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、化学发光试剂盒均购自上海雅酶生物医药科技有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、10 KD离心式过滤器购自德国Merck公司；别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）标记的小鼠抗人CD116流式抗体、纯化的小鼠抗人CD131抗体、Alexa Fluor® 647抗鼠IgG1抗体、APC标记的小鼠抗人膜联蛋白V抗体和碘化吡啶（propidium iodide，PI）染料均购自美国Biolegend公司；抗胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）（Thr202/Tyr204）、Akt激酶（Akt kinase，AKT）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）（Ser473）和β肌动蛋白的一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；细胞活性检测试剂盒（cell counting kit 8，CCK-8）、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。Beckman CytoFlex流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；BSC-1300A2生物安全柜购自广州科凯特净化设备科技有限公司；ChemiDoc MP成像系统购自美国BioRad公司；SynergyTMH1全自动多功能酶标仪购自美国BioTek公司。1.2小分子药物偶联物GM-DXd的制备参照Li等构建抗体偶联药物的方法，rhGM-CSF-Fc经TCEP和EDTA在37 ℃下还原打开4个链间二硫键以暴露半胱氨酸残基，随后在冰浴条件下与16eq的MC-VC-PAB-DXd偶联，后经10 KD过滤器纯化。纯化药物的具体步骤为：首先用蒸馏水冲洗，随后依次用PBS和含1 mol/L NaCl的PBS洗去未结合的MC-VC-PAB-DXd，最后将GM-DXd交换至PBS中。药物于-20 ℃保存。1.3药物偶联效果的考马斯亮蓝染色检测取rhGM-CSF-Fc、GM-DXd和经TCEP还原的rhGM-CSF-Fc，加入蛋白上样缓冲液，金属浴95 ℃加热样品5 min。各取1份蛋白样品按每孔蛋白总量5 μg进行SDS-PAGE，电泳结束后用考马斯亮蓝染液染色30 min。染色完成后，用洗脱液洗去多余染液后，用Bio-Rad凝胶成像分析系统采集图像。1.4GM-DXd生物活性的检测针对GMR下游信号通路激活的检测，取2×106 mL-1 MV4-11、THP-1细胞置于6孔细胞培养板中，分别加入rhGM-CSF-Fc、GM-DXd，浓度为5 nmol/L，以加等量体积PBS为空白对照，37 ℃培养箱孵育30 min，收集细胞提取总蛋白。将等量的总蛋白在10%凝胶中进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上进行蛋白质印迹分析，用抗p-ERK（Thr202/Tyr204）、ERK、p-AKT（Ser473）、AKT和β肌动蛋白抗体进行印迹分析。1.5GMR阳性AML细胞内吞GM-DXd的流式细胞术检测分别取1×105 mL-1 MV4-11、THP-1细胞置于24孔细胞培养板中，分别加入等量阴性对照PBS、10 nmol/L rhGM-CSF-Fc、GM-DXd，37 ℃培养45 min后，收集细胞，用预冷洗涤缓冲液洗涤2次，并在冰上用APC偶联的小鼠抗人CD116抗体或纯化的小鼠抗人CD131抗体孵育30 min。用预冷洗涤缓冲液洗涤后，对于CD131孵育组，用Alexa Fluor® 647抗鼠IgG1抗体进行染色30 min，随后用洗涤液进行充分洗涤。用流式细胞仪分析细胞表面GMR的表达量。1.6GM-DXd对AML细胞体外杀伤活性的细胞活力检测取3×104 mL-1 MV4-11、THP-1细胞置于96孔板中，用相应细胞完全培养基稀释GM-DXd至一定浓度，加至96孔板中，总体积为100 μL，随后置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养48 h。按照试剂说明书加入相应CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值。实验重复3次，取均值。按下列公式计算细胞增殖活性：1.7GM-DXd对AML细胞凋亡影响的检测将1×106 mL-1 MV4-11、THP-1细胞接种于12孔细胞培养板中，加入不同浓度的GM-DXd或DXd（10、20 nmol/L）处理48 h。弃去培养基，预冷PBS洗涤细胞2次，加入膜联蛋白V 4 μL混匀，避光孵育15 min；加入1.5 μL PI混匀，随后进行流式细胞仪检测并分析结果。采用蛋白质印迹法检测药物处理后细胞凋亡蛋白的表达。提取GM-DXd、DXd处理和未给药MV4-11、THP-1细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取25 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离后，湿转至PVDF膜上，用含5% BSA的吐温20-三羟甲基氨基甲烷缓冲液〔tris（hydroxymethyl）aminomethane buffered saline with Tween-20，TBST〕在室温下进行封闭后加入抗多腺苷二磷酸核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP〕、切割胱天蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease 3，Cas-3）、β肌动蛋白抗体，在4 ℃摇床孵育过夜。用TBST洗去未结合抗体，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗去未结合抗体，使用Bio-Rad化学发光成像仪采集信号，分析细胞凋亡蛋白表达水平。1.8统计学分析使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。实验均独立重复3次，数据以均值±标准差表示。采用独立样本t检验比较2个样本均值，采用方差分析比较多个样本均值。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1GM-DXd的制备和偶联检测用TCEP将rhGM-CSF-Fc还原，使半胱氨酸残基充分暴露，随后在冰浴条件下与16eq的MC-VC-PAB-DXd偶联。用还原性SDS-PAGE分离rhGM-CSF-Fc、TCEP还原的rhGM-CSF-Fc及GM-DXd后，用考马斯亮蓝染色验证偶联是否成功。由图1可见，TCEP将rhGM-CSF-Fc充分还原，电泳中为表观相对分子量48 000~55 000的单一条带；最终反应产物GM-DXd为混合物，分子量略高于还原的rhGM-CSF-Fc，且条带中未出现杂蛋白，说明该反应条件下rhGM-CSF-Fc未发生变性降解。结果表明，非特异性结合可导致结合不同量MC-VC-PAB-DXd的GM-DXd产生。2.2GM-DXd生物活性的检测蛋白质印迹检测rhGM-CSF-Fc或GM-DXd处理的AML细胞中GMR的下游信号通路传导蛋白AKT、ERK的磷酸化显示，rhGM-CSF-Fc、GM-DXd处理均增加了MV4-11和THP-1细胞中p-AKT、p-ERK的磷酸化水平（图2A），表明GM-DXd保留了GM-CSF的生物活性。由于细胞表面GMR的表达量与药物的快速内化有关，因此采用流式细胞术分别检测rhGM-CSF-Fc、GM-DXd处理后MV4-11、THP-1细胞表面的GMR，以判断GM-DXd是否被细胞内化。结果显示，与未处理组相比，rhGM-CSF-Fc、GM-DXd处理组的MV4-11和THP-1细胞表面的GMR荧光信号均减弱，且平均荧光强度值降低差异均无统计学意义（MV4-11：t=0.50，P=0.500；THP-1：t=0.21，P=1.000），表明GM-DXd能被MV4-11及THP-1细胞内化，MC-VC-PAB-DXd未影响rhGM-CSF-Fc的内化能力（图2B）。2.3GM-DXd对AML细胞的体外特异性杀伤分别用0.1、1.0、10.0、100.0、200.0 nmol/L的GM-DXd或DXd处理MV4-11和THP-1细胞系48 h，随后用CCK-8检测细胞活力。结果显示，与未处理组相比，GM-DXd处理组的细胞活性均降低；与DXd（图3A）相比较，GM-DXd（图3B）在相等剂量下对MV4-11、THP-1细胞活性抑制能力更强并呈浓度依赖性。通过量效曲线计算，GM-DXd对MV-4-11和THP-1细胞的抑制中浓度分别为15.91和37.64 nmol/L。2.4GM-DXd体外诱导的AML细胞凋亡使用流式细胞术检测药物诱导AML细胞凋亡能力，检测结果（图4A）表明，与对照组相比，20 nmol/L GM-DXd处理组中MV4-11细胞约90%被诱导凋亡，THP-1细胞约60%凋亡。提取药物处理后的MV4-11、THP-1细胞总蛋白，用蛋白质印迹分析细胞凋亡蛋白切割Cas-3和PARP的表达水平，结果显示，经GM-DXd处理后，2种细胞内切割Cas-3和PARP的表达量均升高（图4B）。3讨论AML是1种异质性恶性肿瘤，其特征为造血干细胞过度增殖及其分化停滞，导致骨髓和血液中成髓细胞不受控制地积蓄。虽然诱导和巩固化疗可使大多数AML患者得到完全缓解，但超过50%的患者最终死于复发，5年总生存率下降到30%~40%。近年来，靶向药物的应用开启了AML靶向治疗的大门，为AML的治疗带来巨大的进步。特别是西妥珠单抗和受体酪氨酸激酶抑制剂的出现极大地改善了难治性AML患者的生存率及预后。但是，靶向治疗药物耐药、联合化疗毒性的叠加、缺乏有效靶点等问题的不断出现，为AML的治疗选择提出了新的挑战。提高AML患者生存率及预后的方法之一是通过效应分子与AML细胞表面特异性过表达的分子结合，将不具有选择性的高效细胞毒药物带至AML细胞以达到特异性杀伤肿瘤细胞的作用。此类药物治疗AML的重要考虑因素是靶标的选择。目前被FDA批准的可用于治疗AML的此类药物均靶向CD33。尽管CD33在AML细胞中广泛表达，但研究表明它在正常造血干细胞中同样表达，这就意味着多种造血谱系细胞可能因这类药物的使用同时减少而导致靶向CD33药物的临床效益受到限制。CD123是目前处于AML治疗临床试验的另1个靶点，它在正常造血干细胞上的表达可引起与CD33类似的靶向非肿瘤细胞问题。本研究选择了GMR作为目标。既往研究已经证明该靶点在人早期造血干细胞中低表达，而在AML的原始造血干细胞中则是高表达。靶向GMR虽然仍会导致骨髓细胞耗竭，但不会损害患者正常造血功能或诱导持续的血小板减少。总而言之，靶向该分子具有一定的安全性。GMR在AML细胞中高表达这一特点保证了该药物开发的可能性。在过去的几十年中，已经有许多靶向GMR的融合蛋白的研究，如Perentesis等证明，与细菌毒素白喉毒素融合的GM-CSF配体可通过激活凋亡途径消除化疗耐药的AML细胞系和AML患者肿瘤细胞；Kreitman和Pastan证明，假单胞菌外毒素融合的GM-CSF配体作为效应分子，对化疗耐药的AML患者祖细胞具有细胞毒性，而对正常细胞则无细胞毒性。由于既往针对靶向这一靶标的细菌或植物毒素融合蛋白的开发均由于其不可避免的免疫原性而以失败告终，因此进一步开发用于靶向AML的非免疫原性和高度特异性的细胞毒素具有极大意义。细胞凋亡或程序性死亡在组织内环境稳定中发挥着重要作用。AML细胞已被证明存在失调的凋亡机制，这促进了AML耐药性的产生。本研究选取喜树碱类似物DXd作为GM-CSF偶联的小分子细胞毒药物。DXd已被证实可以诱导DNA损伤并导致肿瘤细胞凋亡，比喜树碱效力更强且骨髓毒性更低。与常用的微管抑制剂不同，DXd不仅针对分裂旺盛的细胞也对处于静止期的细胞具有杀伤作用，这意味着该药可能对AML中的静止期造血干细胞也具有一定的杀伤能力。使用DXd的强效靶向GMR的药物偶联物可以延缓或消除由于静止期造血干细胞再次激活而导致的AML复发。而对于GM-CSF与DXd之间的连接子，本研究选择了可被蛋白酶切割的MC-VC-PABC连接子。该连接子作为抗体偶联药物中最常用的可裂解连接子，具有很好的血浆稳定性。此外，该连接子还引入了1个自降解间隔子，使其更易暴露在蛋白酶环境下而不影响其稳定性。MC-VC-PAB-DXd的缀连会改变rhGM-CSF-Fc的构象结构，可能影响rhGM-CSF-Fc的生物活性，从而阻碍rhGM-CSF-Fc对GMR的内化诱导能力。本研究证明，小分子药物偶联物GM-DXd能够快速地被GMR阳性AML细胞内化，并发挥细胞毒性作用。用不同浓度的GM-DXd、DXd处理2种AML细胞系，并在48 h检测细胞活性，结果证实GM-DXd较单药DXd的细胞毒作用更强。流式细胞术检测GM-DXd处理后细胞的凋亡情况表明，GM-DXd诱导的DNA损伤足以引发AML细胞的凋亡。目前开发的针对GMR的与细菌或植物毒素嵌合的蛋白均显示出高效力，抑制中浓度在皮摩尔范围内。然而，这种融合结构的毒素部分会不可避免地引发免疫原性。本研究中描述的GM-DXd与既往的细菌或植物毒素嵌合的蛋白相比，虽然效力较低，但预计是非免疫原性的。DXd是相对分子质量为493.48的低分子量化合物，这类低分子量化合物被认为不足以诱导机体免疫应答。为了进一步验证这类药物在AML靶向治疗中的作用，未来在动物模型中进行体内研究是必不可少的。总之，本研究开发了新型的小分子药物偶联物GM-DXd，对AML细胞具有选择性细胞毒性。该药物通过激活细胞内凋亡内在通路诱导AML细胞凋亡。数据表明，它有可能成为治疗AML的有效方法，并解决当前治疗AML的一些局限性。作者肖艳  张登央  郭瑶  余柳婷  陈纯  薛红漫  陈韵中山大学附属第七医院（深圳）， 儿童血液肿瘤专科，儿童血液病实验室，深圳 518107通信作者：陈韵，Email：cheny653@mail.sysu.edu.cn引用本文：肖艳, 张登央, 郭瑶, 等. 新型小分子药物偶联物GM-DXd的制备及抗急性髓系白血病细胞活性 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(2): 75-81.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241224-00091识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

随着生物药行业发展，便捷高效，副作用小的皮下注射的给药方式越来越受到患者的青睐。同时对于药企而言，皮下注射也是突破同质化竞争和提高患者依从性的重要方法。为了减轻皮下注射的疼痛，药物会做成小剂量的高浓度蛋白制剂。通常，通过修饰注射部位、低粘度配方制剂、保护性复合微球/珠等方法可减轻高浓制剂皮下注射引起的疼痛，并提高药物的利用度1。在上述方法中，修饰注射部位的方法尤为引人瞩目，该方法一般使用重组人透明质酸酶与药物做成复方制剂，重组人透明质酸酶可以降解注射部位皮肤中的透明质酸，降低细胞间质的粘性，显著增加皮下给药的最大注射量（图1）。使得药物快速进入体内，大大缩短给药时间，同时还可降低给药频率。目前FDA已经批准8款含重组人透明质酸酶的皮下制剂抗体药上市，其中就有如利妥昔单抗，曲妥珠单抗和达雷妥尤单抗等药物。表1：皮下注射高浓制剂药物的配方/方法图1：透明质酸酶的作用机制Halozyme公司作为重组人透明质酸酶领头羊企业，其ENHANZE药物递送技术2已经在上述上市药物中有广泛应用。在Halozyme公开的专利中可以看到，重组人透明质酸酶使用CHO DG44细胞作为生产宿主细胞3。而选择CHO细胞作为表达系统的原因如下：人源和牛源的透明质酸酶有500多个氨基酸序列一致，而在470位点氨基酸极其残基上有较大差异。此外，人透明质酸酶含有额外8个半胱氨酸残基（共12个），且残基具有多个N-糖基化位点。但是，重组表达的可溶性牛透明质酸酶的酶活性极低（可能是大肠杆菌表达）。因此更复杂的人源透明质酸酶只能由可进行更高级蛋白翻译后修饰的哺乳动物细胞，如CHO细胞来进行表达。下面我们以Halozyme公司100 L CHO DG44细胞生产工艺为例3，浅探序列优化至上游细胞培养工艺路线。重组人透明质酸酶的分子改造一般而言，人源透明质酸酶主要以亲水性氨基酸锚定在细胞质膜，在磷脂酶C催化后细胞产生酸性环境中透明质酸酶才具有活性。先前研究中通过缺失突变可能的糖基磷脂酰肌醇位点（活性蛋白与细胞膜的结合方式）旁侧的羧基也并未获得理想的酶活性。本次研究中，研究者通过缺失突变477-483位点氨基酸的羧基（图2），使得重组人透明质酸酶在中性环境中即可发挥作用。图2：缺失突变477-483位点氨基酸的羧基CHO DG44细胞转染和培养将上述人透明质酸酶cDNA转染至CHO DG44细胞中，通过加压筛选出高表达的阳性克隆并将其接种至化学成分限定培养基中。经四步层析后，可获得比活超过100,000 USP Units/mg 蛋白的重组人透明质酸酶，且可完整表达6处N-glycan修饰。随后细胞扩种建立WCB进行100 L反应器生产，培养周期持续两周，经纯化浓缩后的重组人透明质酸酶的比活比商业的动物源透明质酸酶比活高出50至100倍（数据未展示）。通过测试浊度，粘度或者还原后糖量可以判断重组人透明质酸酶对糖胺聚糖的作用，本次研究中，将脐带透明质酸与1单位的重组人透明质酸酶孵育至特定时间，然后电泳分离透明质酸的消化产物，从图3中可以看出，即使是纳克级别的重组人透明质酸酶也具有很好的酶消化效果。图3：β 1–4内切糖苷酶介导的重组人透明质酸酶对高分子量透明质酸的解聚目前国内也在重组人透明质酸酶赛道快速赶超，使用的CHO细胞亚型更加丰富，培养工艺愈发先进。Cytiva HyClone细胞培养解决方案Cytiva作为生物制药供应商，拥有丰富的产品类型以支持客户工艺需求。HyClone作为Cytiva旗下培养基子品牌，在CHO培养基领域深耕多年，旗下有“王牌产品”ActiPro+7ab组合以及其他培养基，为细胞高表达保驾护航。此外，在重组人透明质酸酶纯化和过滤工艺中也有相应产品和技术支持。如您有任何关于CHO细胞生产重组人透明质酸酶或任意产物的培养基、填料、滤器需求或工艺问题，欢迎扫描下方二维码，我们将为您提供专业技术和样品支持！参考文献：1.Collins D ,Manuel Sánchez-Félix, Badkar A V ,et al.Accelerating the development of novel technologies and tools for the subcutaneous delivery of biotherapeutics[J].Journal of Controlled Release, 2020, 321.DOI:10.1016/j.jconrel.2020.02.036.2.Kenneth W ,Locke, Daniel C ,et al.ENHANZE® drug delivery technology: a novel approach to subcutaneous administration using recombinant human hyaluronidase PH20[J].Drug delivery, 2019.DOI:10.1080/10717544.2018.1551442.3.Frost G I .Recombinant human hyaluronidase (rHuPH20): An enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration[J].Expert Opinion on Drug Delivery, 2007, 4(4):427-440.DOI:10.1517/17425247.4.4.427.

慢病毒 (LV) 是一种RNA病毒，其特点是能够将病毒RNA整合到宿主细胞DNA中。因此，慢病毒载体 (LVV) 被用于细胞和基因治疗领域，在体外和体内将核酸递送到靶细胞中。我们开发了一种可放大的上游工艺，在Xcellerex XDR 10一次性生物反应器和ReadyToProcess WAVE 25波浪式生物反应器中，使用悬浮培养的HEK293T细胞进行LVV生产。本文叙述了HEK293T悬浮细胞从复苏到摇瓶培养，再扩增到生物反应器培养的工艺过程。整个培养及转染工艺过程使用的是HyClone的peak expression medium (PEM) 无血清培养基，最终在生物反应器中瞬时转染并获得了高滴度的LVV。在此，我们利用实验设计 (DoE) 方法来优化HEK293T悬浮细胞系统的LVV生产，并分阶段进行实验：首先，利用DoE方法在摇瓶培养规模，通过评估和优化多个对LVV产量增加起关键作用的因素，如质粒浓度、活细胞密度和收获时间等，建立转染方案。接下来，使用第一步建立的转染方案在Cytiva Xcellerex XDR 10或ReadyToProcess WAVE 25中进行LVV生产。在Xcellerex XDR 10和ReadyToProcess WAVE 25生物反应器系统上，我们进行了三次重复的LVV生产，验证了高效和稳健的可放大细胞培养工艺。具体流程见下图（图1）：图1图1所示，LVV生产过程的概述。我们将在本文中讨论细胞培养和转染工艺的建立过程。 本文所述工艺采用的是四质粒转染系统 (Cell Biolabs) ，包括两个包装载体，一个包膜载体和一个携带绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因的表达载体，及PEI MAX (Polysciences) 转染试剂。聚乙烯亚胺 (PEI) 与质粒DNA产生带正电的复合物，质粒DNA通过内吞作用进入细胞并将DNA传递到细胞核，使外源DNA的基因在293细胞体内表达（图2）。图2图2所示，使用四质粒转染方法瞬时转染HEK293T细胞。PEI与DNA形成复合物，然后将其引入宿主细胞。 •✦实验流程及结果✦•HEK293T细胞悬浮驯化并适应到无血清培养环境我们将在HyClone DMEM培养基和10%胎牛血清 (FBS) 中贴壁生长的HEK293T细胞，消化后直接转移到HyClone PEM培养基中进行传代培养，经10次传代后，通过观察悬浮细胞的生长和形态，确定细胞已完全适应无血清悬浮培养。 PEM培养基是即用型的无血清293培养基，含有稳定型L-谷氨酰胺和泊洛沙姆188。 利用HEK293T悬浮细胞优化LVV生产方案 DoE研究采用全因子设计，包括5个参数（活细胞密度、孵育时间、增强剂浓度、增强剂添加时间和DNA浓度），以评估转染的最佳条件。在我们的DoE开发过程中，设定的标准是达到1010个病毒颗粒 (VP/mL) 和107个转导单位 (TU/mL) 。 实验结果发现，每一个条件的优化都可以使病毒滴度超过DoE设定的标准。 为了摸索转染最适合的活细胞密度 (VCD) ，我们没有进行额外的DoE，而是进行了一个简单的实验。其中只测试了三个不同的VCD和孵育时间，并根据DoE的结果设置了所有其他参数。实验结果表明，活细胞密度为3×106个/mL，孵育时间为5 min，可以获得最大滴度（图3）。图3图3所示，评估VCD和孵育时间。所有测试VCD的DNA-PEI复合物孵育时间为10分钟。所有测试孵育时间的VCD为2×106个/mL。 优化转染方案 在进行了初始DoE研究后，根据结果设计了LVV生产方案（表1）。表1：用于转染方案的最终参数细胞系HEK293T，经过悬浮驯化培养基HyClone peak expression medium转染试剂PEI MAX 40k质粒比例1:1:1:3 (1 pRSV-Rev: 1 pCMV-VSV-G: 1 pCgpV: 3 pGFP)转染时细胞密度（活细胞数/mL）3×106DNA (µg/mL)1DNA:PEI 比例 (µg:µL)1:2转染试剂孵育时间 (min)5丁酸钠添加（转染后的小时数）5丁酸钠终浓度 (mM)10收获时间（转染后的小时数）72为了确认LVV生产的转染方案，使用HyClone PEM培养基在摇瓶中进行三次1 L的 LVV生产。病毒液的滴度在所有重复中都高于接受标准，并且重复之间的方差很小（图4）。图4图4所示，用1 L HyClone PEM培养基在摇瓶中生产LVV的病毒滴度。 在Xcellerex XDR 10一次性生物反应器生产LVV 首先，将HEK293T细胞在摇瓶中扩增，产生足够的细胞用于接种到Xcellerex XDR 10。在反应器中初始培养基体积为5 L，接种细胞密度为0.4×106个/mL。接着扩增细胞72 h到细胞密度约为3×106个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释培养体积至约9.2 L。 接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中，最终反应器体积为10 L，细胞浓度为3×106个/mL。转染5小时后，加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染72小时后收获。Xcellerex XDR 10中三个批次的结果如图5所示。所有三次生产结果的病毒滴度均高于接受标准。图5图5所示，在Xcellerex XDR 10中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染，转染72 h后收获。 为了确认Xcellerex XDR 10的转染效率，除了流式细胞术分析外，我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光的评估。图6为收获时LVV稀释样品中GFP阳性荧光细胞。图6图6所示。(A) Xcellerex XDR 10收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。所有三个生产批次的病毒滴度相似，约为1010 VP/mL和107 TU/mL（图7）。所有三个批次之间的一致性表明工艺设计是稳健的，适用于生产目的。 图7图7所示，使用Xcellerex XDR 10三次生产LVV的病毒滴度。实验的接受标准用红色虚线突出显示。所有生产批次均符合标准。在ReadyToProcess WAVE 25波浪式生物反应器生产 最后，我们使用ReadyToProcess WAVE 25生产5 L LVV。在摇瓶中扩增HEK293T细胞，然后在ReadyToProcess WAVE 25中接种HEK293T悬浮细胞，起始培养基体积2.5 L，接种密度0.3×106个/mL。培养72 h至细胞密度达到约3×106个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释体积至约4.8 L。在接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中，最终反应器中工作体积为5 L，此时细胞密度为3×106个/mL。转染后5小时，加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染后72小时进行收获。ReadyToProcess WAVE 25中三个生产批次的结果如图8所示。 图8图8所示，在ReadyToProcess WAVE 25中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染，转染72 h后收获。 为了确认ReadyToProcess WAVE 25的转染效率，除了流式细胞术分析外，我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光评估。图9为收获时LVV稀释样品中GPF阳性荧光细胞。图9图9所示，(A) ReadyToProcess WAVE 25收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。 所有三个生产批次的病毒滴度相似，约为1010 VP/mL和107 TU/mL（图10）。图10图10所示，在ReadyToProcess WAVE 25中三次生产LVV的病毒滴度。实验的接受标准用红色虚线突出显示。所有生产批次均符合标准。结论与讨论 我们建立了一种可放大且强大的LVV生产上游工艺，这套工艺使用培养于PEM培养基中的HEK293T悬浮细胞，首先在摇瓶进行转染条件的建立和优化，然后在ReadyToProcess WAVE 25和Xcellerex XDR 10进行了放大验证。实验结果表明：每次生产都符合我们对收获病毒滴度设定的接受标准（≥1010 VP/mL和≥107 TU/mL）。 该方案还展现出从小摇瓶到10 L生物反应器规模的可扩展性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。