北京博奥森生物技术有限公司

编辑：丹青 糖尿病认知障碍（diabetes cognitive impairment，DCI）是糖尿病患者常见的并发症之一，其特点是认知功能的逐渐下降，尤其是记忆、注意力和执行功能的受损[1]。随着全球糖尿病患者数量的增加，DCI的患病率呈上升趋势。流行病学数据和临床研究表明，高达50%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者会在一定程度上出现认知功能障碍[2]。DCI的发病机制复杂，涉及胰岛素抵抗、慢性高血糖引起的氧化应激、炎症反应以及脑血管病变等多种机制[3]。而现有的治疗策略主要集中于血糖控制及改善认知，针对DCI的特异性治疗手段仍然匮乏，且疗效有限。因此，开发新的治疗策略，改善患者生活质量，缓解医疗负担，已成为迫切的医学需求。 铁死亡是一种与铁代谢紊乱相关的新型细胞死亡方式，近年来被广泛研究并发现与多种神经退行性疾病和代谢性疾病密切相关[4]。持续高糖状态可导致氧化还原稳态失衡、脂质过氧化增强及铁代谢异常，进而诱导神经元损伤并促进认知功能下降[5]。在铁死亡的调控中，核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）信号通路具有重要作用。Nrf2作为细胞抗氧化应激反应的核心转录因子，可通过调控多种抗氧化基因维持细胞氧化还原稳态，同时在铁等金属代谢、脂质代谢及谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成中也发挥关键作用。此外，GPX4作为铁死亡的关键调控因子，通过GSH依赖性清除脂质过氧化物、维持细胞膜的稳定性，在抑制铁死亡中发挥核心作用，并被认为是Nrf2相关抗氧化调控的潜在下游靶点[6-8]。研究表明，槲皮素通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻氧化应激和脂质过氧化损伤，有效抑制神经元铁死亡，显著改善db/db小鼠的认知功能障碍[9]。此外，西格列汀等也可通过抑制铁过载和调控Nrf2/GPX4信号通路来抑制铁死亡，改善DCI[10-11]。因此，调控Nrf2/GPX4信号通路以抑制铁死亡，可能成为治疗DCI的潜在策略。 补阳还五汤出自王清任的《医林改错》，是活血化瘀的经典名方。补阳还五汤及其有效成分具有增强机体抗氧化水平、抑制炎症、调节糖脂质代谢、减轻神经损伤等多种药理学作用[12-13]。临床研究显示，补阳还五汤可在一定程度上改善糖尿病伴轻度认知损害患者的认知功能[14]。此外，补阳还五汤可通过减轻氧化应激、调节铁死亡相关因子进而改善糖尿病肾损伤[15]；还可通过激活Nrf2/GPX4信号通路，改善脑卒中后认知功能障碍[16]。上述研究证实补阳还五汤在改善糖尿病及其并发症与认知功能障碍方面具有突出潜力，但在治疗DCI中的具体机制尚不明确。尤其是其能否通过调控Nrf2/GPX4抑制铁死亡进而发挥神经保护作用，仍缺乏系统研究。因此，本研究通过建立DCI大鼠模型及高糖诱导的人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞损伤模型，从体内外2个层面探讨补阳还五汤通过激活Nrf2/ GPX4信号通路，减轻神经损伤，改善认知功能障碍的作用机制，以期为补阳还五汤防治DCI提供实验依据和理论支持。 1  材料 1.1  动物 SPF级雄性SD大鼠86只，8周龄，体质量（200±10）g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物质量合格证号5120350006228。56只大鼠用于动物实验，30只大鼠用于细胞实验含药血清制备。所有动物饲养于陕西中医药大学中药药理实验动物房，室温20～25 ℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h明暗循环，自由进食饮水。动物实验经陕西中医药大学动物伦理委员会批准（批准号SUCMDL20240627001）。 1.2  药材 补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、茯苓4.5 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g组成，饮片均购自陕西中医药大学校医院，经陕西中医药大学药学院中药鉴定教研室颜永刚教授分别鉴定为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根、伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎、钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier)的干燥体、蔷薇科植物桃Prunus persica (L.) Batsch的干燥成熟种子、菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，均符合《中国药典》2025年版规定。 1.3  药品与试剂 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批号20240402）购自北京博奥拓达科技有限公司；二甲双胍（批号A0202A24710）、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（批号A137250724）购自碧云天生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、GSH、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（批号分别为20241113、20241115、20241114、20241113）购自南京建成生物工程研究所；亚铁离子（Fe2+）试剂盒（批号WE06P4463860）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体（批号00168571）、膜铁转运蛋白1（ferroportin 1，FPN1）抗体（批号00140462）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10028231）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）抗体（批号BD06244484）、Nrf2抗体（批号BE03075304）、GPX4抗体（批号BE09305893）购自北京博奥森生物技术有限公司；溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）抗体（批号4000000753）、铁蛋白重链（ferritin heavy chain，FTH）抗体（批号3600010955）、转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFR）抗体（批号3600010833）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；山羊抗兔IgG二抗（批号BST18K21C19E54）、超敏ECL化学发光液（批号20H11B71S）购自武汉博士德生物技术有限公司；DME/F12培养基（批号AL30836673）购自美国Gibco公司；胎牛血清（批号2422334）购自上海逍鹏生物科技有限公司；CCK-8试剂盒（批号20250913）购自苏州新赛美生物科技有限公司；Nrf2抑制剂‌ML385（批号281591）购自美国MCE公司。 1.4  仪器 JLBehv-MWMG型Morris水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）；EPOCH2NS型酶标仪（美国BIOTEK公司）；Accu-Chek卓越型罗氏血糖仪（瑞士罗氏公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；Donatello型脱水机（意大利迪佩斯公司）；RM2016型组织切片机（上海徕卡仪器有限公司）；GC204005型冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UPHW-Ⅱ-90T型纯水仪（成都超纯科技有限公司）；DYY-5D型电脑三恒多用电泳仪电源、DYCZ-TRANS2型转印电泳仪、DYCZ-24DH型双板垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Crx53型荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）。 2  方法 2.1  补阳还五汤的制备 取黄芪120 g、当归6 g、茯苓4.5 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g，加入10倍量蒸馏水浸泡1 h后，煮沸40 min，趁热滤过；再加入8倍量蒸馏水，煮沸30 min，趁热滤过；合并2次滤液，浓缩即得补阳还五汤药液2.85 g/mL（生药量），常温冷却后4 ℃保存备用。参照《中国药典》2025年版一部，通过高效液相色谱进行含量测定，补阳还五汤药液中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮的质量分数分别为0.33、0.65、0.79、0.15、0.69、0.09 mg/g。 2.2  动物实验 2.2.1  DCI大鼠模型的建立、分组与给药 大鼠适应性饲养7 d后，参考课题组前期造模方法[17-18]，随机选取8只为对照组，给予普通饲料喂养；其余48只大鼠给予自制高脂高糖饲料喂养4周，4周后单次ip STZ（35 mg/kg）建立糖尿病模型。注射3 d后尾静脉取血检测大鼠空腹血糖，大于16.7 mmol/L视为糖尿病模型造模成功。造模成功后继续给予高脂高糖饲料喂养8周，通过水迷宫实验筛选认知功能障碍大鼠。将对照组大鼠逃避潜伏期平均值设为参照值，计算模型组逃避潜伏期平均值的相对增加比例。若该比例不低于20%，则认为造模成功[19]。将符合标准的大鼠随机分为模型组及补阳还五汤低、高剂量（7.125、28.500 g/kg，分别相当于临床剂量的0.5、2.0倍）组和二甲双胍（0.2 g/kg）组，每组8只，常规饲养。各给药组ig相应药物（0.1 mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续给药4周，每周检测各组大鼠体质量和空腹血糖。 2.2.2  Morris水迷宫实验 给药结束后，采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。前5 d进行定位航行实验：将象限边缘设置标记点，第1象限里（目标象限）设置平台，为确保大鼠不能看见平台，水池中水面需没过平台。将大鼠分别从4个象限各放入水中1次，记录大鼠寻找平台时间（限时90 s），第6天进行空间探索实验：撤去平台，记录大鼠目标象限移动距离、停留时间及穿越平台区域次数。 2.2.3  取材及样本处理 水迷宫实验结束后，各组大鼠ip戊巴比妥钠麻醉，进行腹主动脉取血，4 ℃、3 500 r/min离心，分离血清，于−80 ℃冰箱保存。各组取3只大鼠全脑用4%多聚甲醛固定，其余大鼠取完整脑和海马组织，置于−80 ℃冰箱保存。 2.2.4  苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察大鼠海马组织病理变化 脑组织在4%组织固定液浸泡24 h后，石蜡包埋，切片脱蜡及水化，随后HE染色，洗涤切片，脱水透明，于显微镜下观察细胞损伤情况。 2.2.5 免疫组化法检测海马组织Nrf2、GPX4表达 取包埋后的大鼠脑组织样本制备切片，依次完成脱水与抗原修复处理。加入3%牛血清白蛋白在室温下封闭30 min，随后加入GPX4（1∶100）、Nrf2（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗，室温孵育50 min。PBS漂洗3次后进行DAB显色，复染返蓝，二甲苯透明，于显微镜下采集图像，使用Image J软件量化结果，统一调节图片阈值，定量检测目标蛋白阳性区域面积与总视野面积，计算阳性面积百分比。 2.2.6 大鼠血清中SOD、CAT活性及MDA、GSH水平的检测 取大鼠血清样品，置于冰上解冻。按照试剂盒说明书进行操作，检测大鼠血清中SOD、CAT活性及MDA、GSH水平。 2.2.7 脑组织Fe2+水平检测 取冻存脑组织，加入提取剂，冰上研磨，制备10%组织匀浆，离心取上清，按照试剂盒说明书操作，检测脑组织Fe2+水平。 2.2.8  Western blotting检测海马组织Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达 取冻存海马组织，按照裂解液∶组织＝100 μL∶10 mg的比例加入RIPA裂解液，用组织研磨仪研磨成匀浆，12 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法测定上清液蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗，4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜后，加入二抗，室温孵育1 h；洗膜后，通过ECL化学发光法显色，曝光后观察特定蛋白条带。以GAPDH作为内参，使用Image J软件测定目标蛋白的相对表达量。 2.3  细胞实验 2.3.1 细胞培养 SHSY-5Y细胞用含10%胎牛血清的DME/F12培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。 2.3.2 补阳还五汤含药血清的制备 将30只SD大鼠随机分为空白组和补阳还五汤低、高剂量（7.125、28.500 g/kg）组，每组10只。空白组ig蒸馏水，其余各组ig补阳还五汤药液，1次/d，连续给药7 d。末次给药2 h后，腹主动脉取血，于室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，收集同组血清，56 ℃水浴锅灭活30 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，−80 ℃保存备用。 2.3.3 葡糖糖造模浓度筛选 将SHSY-5Y细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，加入含不同浓度（40、80、120、260、200 mmol/L）葡萄糖的培养基处理细胞，对照组加入完全培养基，空白组不接种细胞不给药，每组3个复孔，37 ℃孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后，采用酶标仪检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白) 2.3.4 细胞分组与给药 设置对照组、模型组及补阳还五汤低、高剂量含药血清组和补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组。对照组和模型组加入10%空白大鼠血清，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组预先使用Nrf2抑制剂ML385（10 μmol/L）处理2 h[20]，随后补阳还五汤低、高剂量含药血清组和补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组加入相应剂量含药血清处理6 h。含药血清处理结束后，除对照组加入完全培养基，其余各组加入含160 mmol/L葡萄糖的培养基造模24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后，采用酶标仪检测A值，计算细胞存活率。 2.3.5 线粒体膜电位检测 SHSY-5Y细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，按照“2.3.4”项下方法进行分组和给药，PBS洗涤后每孔加入200 μL JC-1荧光探针染液（1 μmol/L），培养箱中避光孵育30 min，PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察并拍照。 2.3.6  SOD、CAT活性及MDA、GSH水平的检测 SHSY-5Y细胞以2×105个/孔接种于24孔板中，按照“2.3.4”项下方法进行分组和给药，按照试剂盒说明书进行操作，检测细胞内SOD、CAT活性及MDA、GSH水平。 2.3.7  Western blotting检测Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达 按照“2.3.4”项下方法进行分组和给药，收集细胞，按“2.2.8”项下方法检测相关蛋白表达。 2.4  统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，数据以表示。Morris水迷宫定位航行实验中逃避潜伏期采用重复测量方差分析，空间探索实验及其他指标各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐，则采用LSD检验；若方差不齐，则采用非参数检验。 3  结果 3.1 补阳还五汤对DCI大鼠体质量及空腹血糖的影响 如表1所示，对照组大鼠体质量整体呈缓慢上升趋势，而模型组大鼠体质量则呈现明显下降趋势（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤各剂量组及二甲双胍组大鼠体质量下降趋势均有所改善，其中给药第4周补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠体质量显著升高（P＜0.05），表明补阳还五汤能够延缓DCI大鼠体质量下降速度。 如表2所示，对照组大鼠空腹血糖水平整体保持相对稳定，模型组大鼠空腹血糖持续升高（P＜0.01），且在后期升高更为明显；与模型组比较，自给药第2周各组大鼠空腹血糖水平均有所下降，其中给药第2周二甲双胍组大鼠空腹血糖显著降低（P＜0.05），给药第3周补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖显著降低（P＜0.05、0.01），给药第4周补阳还五汤各剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖显著降低（P＜0.01），提示补阳还五汤具有一定降血糖作用。 3.2  补阳还五汤对DCI大鼠学习记忆的影响 采用Morris水迷宫评估大鼠的空间学习记忆能力，结果如表3所示，在定位航行实验中，各组大鼠逃避潜伏期均随训练时间延长而呈下降趋势。与对照组比较，模型组自第3天起逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），且至第5天仍维持较高水平（P＜0.01），提示模型组大鼠空间学习能力明显受损；与模型组比较，各给药组逃避潜伏期均有不同程度缩短，至训练后期已接近对照组水平，其中第3天补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05），第4、5天补阳还五汤各剂量组和二甲双胍组大鼠逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05、0.01）。 空间探索实验结果如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠目标象限移动距离、停留时间及穿越平台次数明显减少（P＜0.01），表明其空间记忆保持能力下降；与模型组比较，各给药组大鼠目标象限移动距离、停留时间及穿越平台次数均明显增加（P＜0.05、0.01），表明补阳还五汤可改善DCI大鼠的学习记忆能力。 3.3  补阳还五汤对DCI大鼠海马组织CA1区病理变化的影响 如图2所示，对照组大鼠海马CA1区神经细胞排列紧密，形态完整，轮廓清晰，细胞核清晰可见；模型组细胞排列分散，间隙增大，边界模糊，大量核固缩，细胞坏死增多；与模型组比较，补阳还五汤各剂量组和二甲双胍组神经细胞病理损伤有明显改善，细胞死亡减少，排列较为紧凑，形态较为圆润，其中补阳还五汤高剂量组改善作用更为明显。 3.4  补阳还五汤对DCI大鼠氧化应激、Fe2+水平及铁代谢相关蛋白表达的影响 如图3-A所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中SOD、CAT活性及GSH水平显著升高（P＜0.05、0.01），补阳还五汤低、高剂量组MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），提示补阳还五汤可减轻DCI大鼠氧化应激损伤。 如图3-B所示，与对照组比较，模型组大鼠脑组织中Fe2+水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中Fe2+水平显著下降（P＜0.05、0.01）。如图3-C所示，与对照组比较，模型组大鼠海马组织TFR蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），FPN1、FTH蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠海马组织TFR蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），FPN1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组FTH蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。上述结果提示补阳还五汤可改善DCI大鼠铁代谢紊乱。 3.5  补阳还五汤对DCI大鼠海马组织Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达的影响 免疫组化结果如图4-A、B所示，与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区Nrf2和GPX4蛋白阳性表达显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠海马CA1区Nrf2蛋白阳性表达显著升高（P＜0.05），各给药组大鼠海马CA1区GPX4蛋白阳性表达显著升高（P＜0.05、0.01）。 Western blotting结果如图4-C所示，与对照组比较，模型组大鼠海马组织Keap1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠海马组织Keap1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），Nrf2、GPX4蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；各给药组SLC7A11蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；补阳还五汤低、高剂量组HO-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 3.6  葡萄糖干预SHSY-5Y细胞浓度确定 如图5所示，随着葡萄糖浓度的增加，SHSY-5Y细胞存活率逐渐下降。当葡萄糖浓度为160 mmol/L时，显著抑制SHSY-5Y细胞增殖（P＜0.01），因此选用160 mmol/L作为葡萄糖造模浓度。 3.7  补阳还五汤对高糖诱导的SHSY-5Y细胞增殖的影响 如图6所示，与对照组比较，模型组细胞存活率显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤低、高剂量含药血清组细胞存活率显著升高（P＜0.01）；与补阳还五汤高剂量含药血清组比较，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组细胞存活率显著降低（P＜0.05）。 3.8  补阳还五汤对高糖诱导的SHSY-5Y细胞氧化应激水平及线粒体膜电位的影响 如图7-A所示，与对照组比较，模型组SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤低、高剂量含药血清组SOD、CAT活性及GSH水平显著升高（P＜0.05、0.01），补阳还五汤高剂量含药血清组MDA水平显著降低（P＜0.05）；与补阳还五汤高剂量含药血清组比较，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.05、0.01），MDA水平显著升高（P＜0.05）。 如图7-B所示，与对照组比较，模型组红色荧光减弱、绿色荧光增强，提示高糖诱导可导致SHSY-5Y细胞线粒体膜电位降低并引起线粒体功能异常；与模型组比较，给予补阳还五汤含药血清干预后细胞红色荧光增强，绿色荧光减弱，表明补阳还五汤能够在一定程度上改善高糖诱导的线粒体膜电位下降，减轻线粒体功能损伤。而加入ML385后，细胞红色荧光减弱、绿色荧光增强，较补阳还五汤高剂量含药血清组有所下降，提示ML385可部分削弱补阳还五汤对线粒体膜电位的改善作用。 3.9  补阳还五汤对高糖诱导的SHSY-5Y细胞Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达的影响 如图8所示，与对照组比较，模型组Keap1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，补阳还五汤各剂量含药血清组Keap1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），补阳还五汤高剂量含药血清组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与补阳还五汤高剂量含药血清组比较，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组Keap1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。 4  讨论 中医学上对于DCI无明确记载，认为DCI属于“消渴”合并“痴呆、健忘”等范畴。研究发现DCI的中医证型以瘀血阻络为多[21]。《医林改错》中记载，所谓“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”，即血瘀的产生是因为气虚，因此在治疗血瘀证时，侧重“补气活血”。《血证论》言：“瘀血发渴者，以津液升之……有瘀血，则气为血阻，水津因不能随气上布”。消渴日久，内热炽盛，伤津耗气，气为血之帅，气行则血行，气虚则导致气推动血液功能失常，久而血液运行不畅，瘀血困于脑，瘀血不去则新血不生，阻滞脑络，脑失所养，遂发为脑病，故导致DCI的发生[22]。可见瘀血作为主要病理产物贯穿DCI始终。长期高血糖状态可导致使血液黏稠度与聚集性升高、血液流变性下降，血液出现“黏、浓、凝、聚”的状态，血流缓慢导致瘀血内存，血液运行不畅并引发微循坏障碍，最终引起脑组织灌溉不足及缺血缺氧[23]。瘀血不去则新血难生，组织因而失于濡养。长期高血糖可使神经细胞处于持续代谢应激状态，线粒体电子传递链负荷增加，活性氧大量生成，从而损伤神经细胞膜、蛋白质及DNA，破坏神经元微环境稳态[24]。同时，脑部微循环障碍、慢性脑灌注不足、线粒体功能异常及氧化应激等改变也被认为与认知功能下降密切相关，这一过程与“久瘀令喜忘”所揭示的瘀滞于内、神失所居而致呆病的病理认识相契合[25]。在此基础上，持续氧化应激可进一步打破氧化-抗氧化平衡，使脂质过氧化产物大量积聚，同时铁代谢紊乱导致游离Fe2+增加，激活铁死亡相关信号通路，放大脂质过氧化损伤，并在GPX4等抗氧化防御功能不足时诱发神经元铁死亡[26-27]。 中医药在治疗疾病具有整体观念、辨证论治的优势，通过益气养阴、补肾填精、活血化瘀、化痰开窍等治法治疗DCI[28-30]。补阳还五汤中黄芪大补元气，气旺以促血行，则瘀去络通，为君药，当归活血通络而不伤血为臣药，赤芍、川芎、桃仁、红花使活血祛瘀之力大增，地龙力专善走，共为佐使，诸药合用，可有补气、活血、散瘀、通络之效[31]。羟基红花黄色素A为红花中代表性活性成分，已有研究表明其可在糖尿病相关血管损伤模型中调控SLC7A11、GPX4等抗铁死亡相关分子，减轻氧化应激和铁死亡[32]。芍药苷为赤芍中的主要单体成分，可通过激活相关信号通路抑制氧化应激，改善帕金森小鼠的运动功能障碍及神经元死亡[33]。阿魏酸为当归、川芎等药材中的重要酚酸类成分，具有清除自由基、抑制脂质过氧化的作用，研究显示其可上调Nrf2相关抗氧化反应并抑制铁死亡诱导剂erastin诱导的铁死亡[34]。此外，黄芪来源的异黄酮类成分如毛蕊异黄酮，亦被报道具有抗氧化、保护线粒体功能及调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路减轻神经元铁死亡的潜力[35-36]。因此，补阳还五汤并非单一成分发挥作用，而可能通过其中多类活性成分协同调控，共同发挥抗氧化和抗铁死亡作用。 本研究通过高脂高糖饮食联合小剂量STZ注射法构建DCI大鼠模型，大鼠造模后出现体质量下降、血糖升高及多饮、多食、多尿等典型T2DM特征，并且表现出认知记忆能力的下降[37]。海马是大脑参与认知和记忆的重要区域，对高血糖非常敏感，其损伤可引发认知障碍。HE结果显示，模型组大鼠海马CA1区神经细胞损伤明显，细胞皱缩，细胞核深染。上述结果提示，持续的高血糖可导致大鼠学习及记忆功能受损。而经补阳还五汤干预后，各组大鼠血糖下降，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数、目标象限移动距离及停留时间增加，海马CA1区神经细胞形态恢复，排列整齐，提示补阳还五汤能够改善DCI大鼠的认知功能及神经损伤。 已有研究表明，铁死亡参与DCI及多种中枢神经系统疾病发生[38-39]。铁死亡的本质特征包括铁离子依赖性的脂质过氧化积聚及细胞氧化还原稳态失衡，因此调控细胞氧化还原稳态的关键分子可能在铁死亡过程中发挥重要作用[40]。Nrf2是氧化应激反应中的重要因子，生理条件下，Nrf2与Keap1特异性结合并处于相对失活状态。当细胞受氧化应激刺激时，Nrf2从Keap1解离并转位入核，进而激活HO-1、SOD等抗氧化基因的表达，从而增强组织抗氧化能力[41]。Nrf2基因敲除小鼠表现出氧化应激标志物的增加并伴有空间学习和记忆的缺陷，也可通过激活Nrf2/HO-1信号通路有效抑制DCI大鼠体内氧化应激损伤[42-43]。上述研究均提示Nrf2在抑制氧化应激及改善认知功能发挥了重要作用。除调控氧化应激外，Nrf2还可调节多种铁死亡相关基因表达并参与铁死亡过程，其活性升高可降低细胞对铁死亡的敏感性，并减轻神经元损伤[44]。SLC7A11与GPX4被认为是Nrf2的潜在下游靶点，上调两者表达可增强细胞抗铁死亡能力[45]。其中，SLC7A11负责将胱氨酸转运入胞，为GSH合成提供底物。GSH作为重要的非酶性抗氧化物质，可清除活性氧并维持细胞氧化还原稳态。而GPX4为GSH依赖性抗氧化酶，能够将脂质过氧化物还原为无毒脂质醇，从而抑制脂质过氧化[46]。已有研究指出，通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路可减轻铁死亡并改善阿尔茨海默病动物模型的认知障碍[47]。本研究结果显示，补阳还五汤干预能够降低大鼠海马组织和SHSY-5Y细胞中MDA水平和Keap1蛋白表达，上调Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达，并且升高线粒体膜电位，改善线粒体功能异常。以上结果提示其可能通过激活Nrf2/GPX4信号通路，改善抗氧化系统失衡、降低脂质过氧化物产生并保护线粒体功能，从而减轻神经元损伤。加入Nrf2抑制剂ML385后，补阳还五汤的改善作用被明显削弱甚至部分抵消，提示该信号通路可能是其发挥神经保护效应的重要分子基础。 铁是维持脑功能活动的重要微量元素，现有的研究表明，铁代谢紊乱与认知损伤密切相关，而铁的摄取、储存与输出等过程都会影响铁沉积[48]。体内游离的Fe3+与转铁蛋白结合后，经TFR识别以复合物的形式进入到细胞内，并被还原成Fe2+随后被转运至细胞质。Fe2+可通过Fenton反应促进脂质过氧化物生成并放大氧化损伤。而FTH作为铁蛋白的组成部分，通过储存过量的Fe2+以维持铁池的平衡[49]。研究发现，敲除FTH后小鼠皮质铁代谢稳态被打破，并且能够加重创伤性脑损伤，促进神经元铁死亡[50]。FPN1作为输出蛋白，可将Fe2+转运至胞外。细胞通过吸收、转运、储存、排泄等环节共同维持铁稳态，从而降低铁过载相关损伤并增强对铁死亡的抵抗能力[51]。陈娟等[52]研究发现，补阳还五汤能够调控铁转运相关蛋白的表达，促进脑铁代谢平衡进而改善脑缺血再灌注所致的神经损伤。本研究结果显示，补阳还五汤可以降低DCI大鼠脑组织中Fe2+蓄积，下调海马组织中TFR的表达并上调FPN1、FTH的蛋白表达，提示其可能通过改善铁代谢紊乱来缓解DCI大鼠脑内铁过载，从而减轻神经损伤。 本研究通过体内外实验，初步验证了补阳还五汤通过调控Nrf2/GPX4信号通路改善DCI的作用机制，并结合铁代谢等相关指标提示其可能参与铁死亡调控。然而，铁死亡的发生涉及复杂分子网络，本研究仅在细胞水平采用Nrf2抑制剂ML385进行干预，尚未使用铁死亡的激动剂或抑制剂以及动物水平反向验证的证据进一步证实其因果关系。此外，本研究体外高糖诱导模型未设置甘露醇等渗对照组，不能完全排除渗透压变化对细胞活力的潜在影响。因此，未来将通过设置等渗对照、建立铁死亡相关模型并结合技术干预手段，进一步探究补阳还五汤在调控铁死亡过程中的具体作用。 综上，补阳还五汤可改善DCI大鼠学习记忆能力，减轻海马组织病理损伤，缓解氧化应激和铁代谢紊乱，其神经保护作用可能与激活Nrf2/GPX4信号通路并调控铁死亡相关过程有关。本研究为补阳还五汤防治DCI提供了实验依据，也为靶向铁死亡的DCI干预策略提供了新的研究思路。 利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来  源：赵博深，安宇宇，李樱楠，孙泽萱，史永恒，韩朝军，王  川，王  斌，米燕妮，刘继平．基于Nrf2/GPX4信号通路研究补阳还五汤对糖尿病认知障碍大鼠的改善作用及机制  [J]. 中草药, 2026, 57(17): 6793-6806. END 文章内容仅供思路参考，不代表本刊观点，非中医药专业人员请勿试药 文章来源:中草药杂志社，本草全球转载仅为传播行业信息，不做商业用途。若转载不当，请联系：28331285@163.com删除，感谢原作者的辛劳付出。文中插入广告与本公众号无关。 本草全球服务内容  包括但不限于:  中药新药、经典名方、配方颗粒、中药CMC、美国FDA IND、中药保护品种临床试验申报、中药上市再评价、药物经济学评价、新药研发及中药类注册备案全过程咨询与委托服务;可为有关单位疑难问题提供解决方案与技术支持、开展内训等服务。凡提交至本草全球的疑难问题,均可协助解决。  联系人:田先生 13801667235

摘   要：目的 观察祛寒逐风合剂对胶原诱导型关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠的影响,并探讨其作用机制。方法 SD大鼠随机分出12只作为正常组,其余65只采用尾根部皮下注射胶原乳剂制备CIA大鼠模型。将造模成功的60只大鼠随机分为模型组,甲氨蝶呤组,祛寒逐风合剂低、中、高剂量组,连续4周灌胃相应药物。实验期间测定足跖肿胀度和关节炎指数(AI)。给药4周后,HE染色观察踝关节组织病理学变化;ELISA检测血清C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1、IL-1β、IL-6水平;Western blot检测膝关节滑膜组织中Janus激酶2(JAK2)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、p-STAT3蛋白表达;RT-qPCR检测膝关节滑膜组织中JAK2、STAT3 mRNA水平;免疫组化检测基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13表达。结果 与模型组比较,祛寒逐风合剂中、高剂量均能降低大鼠足跖肿胀度,改善踝关节病理变化,减少血清中CRP、TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6等炎症因子的分泌(P<0.01),下调滑膜组织中JAK2、STAT3的蛋白与mRNA表达,以及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平(P<0.05),抑制踝关节中MMP-1、MMP-3、MMP-13的阳性表达(P<0.01)。结论 祛寒逐风合剂可有效改善类风湿关节炎模型大鼠足跖肿胀度、踝关节病理变化与炎症因子分泌,其作用机制可能与调控JAK2/STAT3信号通路有关。 关键词：祛寒逐风合剂;类风湿关节炎;CIA大鼠;JAK2/STAT3信号通路 引用格式： [1]苏小军,郭影,朱文菊,等.基于JAK2/STAT3信号通路探讨祛寒逐风合剂治疗类风湿关节炎的作用机制[J].中国中医基础医学杂志,2025,31(8):1373-1378. DOI:10.19945/j.cnki.issn.1006-3250.2025.08.011. 中 医  ZGZYJC 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节侵蚀破坏为主要特征的全身性自身免疫疾病,其临床病理特征为炎性细胞浸润,滑膜细胞异常增殖,血管翳生成,最终导致软骨破坏和骨损伤,甚至永久性残疾[1]。目前治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药、生物制剂等,但长期服用多会发生胃肠道不适、肝肾损害、感染、骨髓造血障碍等不良反应[2-3]。 祛寒逐风合剂(以下简称合剂)为甘肃省中医院院内制剂(备案号:甘药制字Z04000849),源自武威汉代医简中的“伤寒逐风方”,由附子、川乌、白术、细辛、花椒、泽泻、川芎、秦艽、威灵仙、龟甲、鳖甲11味中药组成,具有逐风除湿、温经活络、活血止痛、益肾强筋的功效,中医临床用其治疗风寒湿痹证具有较好疗效。目前,其抗RA的药理作用及机制尚不明确。本研究拟采用胶原诱导型关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠模型探究合剂抗RA的作用及可能机制,为临床用药以及该药的进一步开发提供实验基础。实验方案已通过兰州市食品药品检验检测研究院实验动物伦理审查委员会审批,编号:2023-003。1 材料1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠,体质量180～220 g,购于兰州大学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(甘)2018-0002。实验前大鼠在兰州市食品药品检验检测研究院SPF级实验动物区适应性饲养3天,室温(20±2)℃,相对湿度(55±10)%,自由饮食。1.2 主要药物与试剂 祛寒逐风合剂(甘肃省中医院院内制剂,甘药制字:Z04000849,批号:22092,规格:250 mL/瓶,含生药量:1.877 5 g/mL);甲氨蝶呤片(上海上药信谊药厂有限公司,批号:197220807,规格:2.5 mg/片)。 免疫级牛Ⅱ型胶原蛋白冻干粉(货号:20021),美国Chondrex公司;不完全弗氏佐剂(货号:7002),美国Chondrex公司;乙酸(货号:20210511),国药集团化学试剂有限公司;C-反应蛋白(CRP)ELISA试剂盒(货号:YX-E20998)、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(货号:YX-E21174)、白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒(货号:YX-E21185)、IL-1 ELISA试剂盒(货号:YX-E20957)、IL-1β ELISA试剂盒(货号:YX-E20958),上海优选生物科技有限公司;苏木素(货号:G1080)、伊红(货号:G1100),北京索莱宝科技有限公司;Janus激酶2(JAK2)抗体(货号:bs-0908R)、磷酸化JAK2(p-JAK2)抗体(货号:bs-3206R)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)抗体(货号:bsm-52235R)、p-STAT3抗体(货号:bs-1658R),北京博奥森生物技术有限公司;二抗(货号:ab6721),艾博抗(上海)贸易有限公司;RNA提取试剂盒(货号:10606ES60),翌圣生物科技(上海)股份有限公司;逆转录试剂盒(货号:R202-02),新贝(上海)生物科技有限公司;基质金属蛋白酶(MMP)-1抗体(货号:10371-2-AP)、MMP-3抗体(货号:17873-1-AP)、MMP-13抗体(货号:18165-1-AP),武汉三鹰生物技术有限公司。1.3 主要仪器 Infinite F50型酶标仪,瑞士帝肯贸易有限公司;Gentier 96R型实时定量PCR仪,西安天隆科技有限公司;JB-P5型包埋机,武汉俊杰电子有限公司;RM2016型病理切片机,上海徕卡仪器有限公司;UB102i型光学显微镜,重庆澳浦光电技术有限公司;NanoZoomer-SQ型扫描仪,日本滨松光子学商贸有限公司;JY-ZY5型转膜仪、JY-SCZ型电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司。2 方法2.1 胶原乳剂与药物制备 胶原乳剂制备:取0.05 mol/L的乙酸溶液5 mL,置于10 mg牛Ⅱ型胶原蛋白冻干粉中,混合均匀,配成浓度为2 mg/mL的胶原溶液,4 ℃冰箱过夜备用。将不完全弗氏佐剂与胶原溶液等体积混合,使用涡旋振荡器在冰浴条件下乳化。 合剂浓缩液制备:80 ℃水浴下,分别将107、214、429 mL合剂浓缩至100 mL,制得含生药2.01、4.02、8.05 g/mL的浓缩液,4 ℃保存备用。 甲氨蝶呤混悬液制备:将3.5 g甲氨蝶呤溶于50 mL的0.9%氯化钠溶液中,制成含原药浓度为0.07 mg/mL的混悬液,4 ℃保存备用。2.2 CIA大鼠模型的复制与鉴定 SD大鼠随机分出12只作为正常组。除正常组外,其余65只大鼠尾根部皮下注射0.1 mL胶原乳剂,1周后同样方法进行二次免疫[4-5]。2周后进行关节炎指数(AI)评分,4只足爪单独计分,每只鼠最高得分16分,AI≥2分则视为造模成功。评分标准如下。0分:无红肿;1分:小趾关节轻度红肿;2分:趾关节和足踝关节肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内的全部足爪均出现肿胀。2.3 分组与给药 取造模成功的大鼠,按照随机数字表法分为模型组、甲氨蝶呤组与合剂低、中、高剂量组。于造模结束后给药。按照70 kg成人临床剂量折算出大鼠等效剂量,祛寒逐风合剂成人用量为150 mL/d,即相当于生药量4.02 g/kg。甲氨蝶呤组大鼠每周灌胃2次,合计给药剂量为每周1.4 mg/kg(相当于成人等效剂量的1.6倍);合剂低、中、高剂量组大鼠每天分别灌胃20.1 g/kg、40.2 g/kg、80.5 g/kg(相当于成人等效剂量的0.8、1.6、3.2倍)剂量的中药浓缩液;正常组和模型组给予等容量0.9%氯化钠溶液。灌胃体积均为1 mL/100 g,连续给药4周。2.4 足跖肿胀度及AI评分测定 采用容积法测定大鼠足跖肿胀度,于造模前及造模后每周测量1次。同时,根据既定评分标准进行AI评分,量化炎症程度[6]。2.5 ELISA检测血清炎症因子 末次给药后所有大鼠禁食不禁水12 h,麻醉后腹主动脉取血,收集各组大鼠血清,按照ELISA试剂盒说明书步骤检测血清中CRP、TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6水平。2.6 HE染色观察踝关节组织病理 大鼠脱颈椎处死,剪取病变踝关节,4%多聚甲醛溶液固定,依次进行脱钙、固定、脱水、石蜡包埋、4 μm切片、HE染色等步骤,全片白光扫描后,经Slide Viewer软件观察并截图。2.7 RT-qPCR检测JAK2、STAT3 mRNA水平 大鼠脱颈椎处死后,仰面固定四肢,以膝关节为中心纵行切开皮肤,环绕韧带三面逐层打开关节腔,紧贴髌骨的一层呈淡黄色的组织即为滑膜组织,剥离膝关节滑膜组织,保存于-80 ℃冰箱。Trizol试剂提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA,以β-actin为内参基因,采用2-△△Ct法计算JAK2、STAT3 mRNA的相对表达。PCR 引物由上海优选生物科技有限公司设计合成,引物序列见表1。 表1 引物序列 2.8 Western blot检测JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达 取膝关节滑膜组织提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,制备12%的分离胶和5%的浓缩胶,进行电泳、转膜、封闭、洗涤后,加入JAK2抗体、p-JAK2抗体、STAT3抗体、p-STAT3抗体(1∶1000),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,山羊抗兔二抗(1∶4000)室温孵育1 h,洗膜,加入显影液。以GAPDH为内参,经Image J软件量化各条带灰度值。2.9 免疫组化检测MMP-1、MMP-3、MMP-13阳性表达 取踝关节组织石蜡切片,烤片、脱蜡复水、抗原修复、封闭、一抗孵育(1∶200)、二抗孵育、显色、复染、封片,显微镜下观察,每张图片随机选取3个高倍镜视野(×20)进行图像分析,用Image J检测阳性区域的平均光密度值,计算大鼠踝关节中MMP-1、MMP-3、MMP-13的阳性表达。2.10 统计学方法 采用SPSS 27.0软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析及多重比较,方差齐时采用LSD检验,方差不齐时采用塔姆黑尼检验,P<0.05代表差异具有统计学意义。3 结果3.1 足跖肿胀度比较 本次实验共有61只大鼠造模成功,随机取60只进行分组。与正常组比较,模型组大鼠足跖肿胀度显著升高(P<0.01),且在造模期间持续增长,第3周、4周、5周、6周时均显著高于正常组(P<0.01)。与模型组比较,甲氨蝶呤组与合剂低、中、高剂量组大鼠从第4周起足跖肿胀度均明显降低(P<0.05)。结果见表2。 表2 合剂对大鼠足跖肿胀度的影响 注:与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.05,cP<0.013.2 AI评分比较 与正常组比较,模型组大鼠AI评分在第2周、3周、4周、5周、6周明显升高(P<0.01)。与模型组比较,甲氨蝶呤组大鼠AI评分在第5周、6周明显降低(P<0.01),合剂低、高剂量组大鼠AI评分在第4周、5周、6周均明显降低(P<0.05),合剂中剂量组大鼠AI评分在第5周、6周均明显降低(P<0.05)。结果见表3。 表3 合剂对大鼠AI评分的影响 注:与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.05,cP<0.013.3 踝关节组织病理学比较 如图1所示,正常组大鼠踝关节滑膜细胞排列整齐,未见炎性细胞浸润和滑膜组织增生,未发生软骨破坏。模型组大鼠滑膜组织中有大量炎性细胞浸润,出现滑膜和纤维组织增生,关节表面层次紊乱,骨侵蚀严重。与模型组比较,甲氨蝶呤组,合剂低、中、高剂量组大鼠踝关节滑膜组织炎性细胞浸润、滑膜纤维增生和骨侵蚀情况均有不同程度改善,其中以甲氨蝶呤组和合剂高剂量组最为明显。 A.正常组;B.模型组;C.甲氨蝶呤组;D.合剂低剂量组;E.合剂中剂量组;F.合剂高剂量组 图1 合剂对大鼠踝关节组织病理学的影响(HE,×20)3.4 血清炎症因子表达比较 与正常组比较,模型组大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较,各用药组大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6含量显著降低(P<0.01)。结果见图2。 注:与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.01 图2 合剂对大鼠血清炎症因子水平的影响(n=12)3.5 踝关节JAK2/STAT3通路相关基因水平比较 与正常组比较,模型组大鼠踝关节组织中JAK2、STAT3 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较,合剂高、中、低剂量组和甲氨蝶呤组大鼠踝关节组织中JAK2、STAT3 mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)。结果见图3。 注:与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.01 图3 合剂对大鼠踝关节组织中JAK2、STAT3 mRNA水平的影响(n=6)3.6 踝关节JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较 与正常组比较,模型组大鼠踝关节组织中JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,合剂高、中剂量组和甲氨蝶呤组大鼠踝关节组织中JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平明显降低(P<0.05);合剂低剂量组JAK2蛋白表达水平也明显下降(P<0.01)。结果见图4。 注:与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.05,cP<0.01 图4 合剂对大鼠踝关节组织中JAK2/STAT3通路蛋白水平的影响(n=3)3.7 踝关节MMP-1、MMP-3、MMP-13表达水平比较 如图5所示,MMP-1、MMP-3、MMP-13阳性表达定位于胞膜,着色为棕黄色。与正常组比较,模型组大鼠踝关节MMP-1、MMP-3、MMP-13阳性表达明显增强(P<0.05)。与模型组比较,合剂低剂量组大鼠踝关节MMP-1、MMP-3阳性表达降低(P<0.01);甲氨蝶呤组与合剂中、高剂量组MMP-1、MMP-3、MMP-13阳性表达均显著降低(P<0.01)。表明合剂可下调踝关节中MMP-1、MMP-3、MMP-13的阳性表达。 注:图中黑框区域为阳性表达区;与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.05,cP<0.01 图5 合剂对大鼠踝关节组织中MMP-1、MMP-3、MMP-13表达的影响4 讨论 RA是常见的自身免疫性疾病,以滑膜病变和骨破坏为主要临床表现。RA病情缠绵难愈、易反复发作、致残率高,严重影响患者的生活质量,被视为“不死的癌症”。据流行病学调查,RA全球患病率约为1%,且女性患病率约为男性的3倍[7-8]。炎症因子异常增多是RA的病理生理特征性表现之一。其中,CRP作为评估RA全身炎症的重要指标,不仅与关节组织炎症评分及疾病活动度呈显著正相关,还具有促进破骨细胞分化的生物学效应[9]。IL-1作为免疫炎症反应的关键细胞因子,常与TNF-α协同表达,二者共同参与关节软骨的破坏过程[10]。其中IL-1β是IL-1的主要活性亚型,可通过促进环氧化酶(COX)-2和MMPs等因子的合成与释放,刺激滑膜细胞和淋巴细胞增殖,从而加剧炎症反应和关节骨损伤[11-12]。IL-6则主要介导破骨细胞及成纤维样滑膜细胞的活化,促进血管翳形成,并能正向调节TNF-α和IL-1的分泌,形成炎症级联反应,进一步加重关节和软骨组织的损伤[13]。本实验结果显示,模型组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1、IL-1β和IL-6水平均显著升高。经合剂干预后,各剂量均能有效抑制上述炎症因子的分泌,证实其可通过调控多重炎症通路发挥抗RA作用。 既往研究证明,JAK2/STAT3参与了多种疾病的发生与发展,在调节炎症反应与细胞增殖、分化、凋亡等生理病理过程中发挥重要作用[14]。在RA发病过程中,TNF-α、IL-6、IL-1、IL-1β等炎症因子均可激活JAK2激酶,使其发生磷酸化,磷酸化的JAK2进一步诱导STAT3磷酸化,最终,磷酸化STAT3二聚化并从细胞质转移到细胞核内,启动下游相关基因,引发级联反应[15-16]。本次实验结果显示,模型组大鼠JAK2/STAT3信号通路关键分子的mRNA和蛋白表达水平均显著上调;经合剂干预后,该通路相关mRNA及蛋白表达均被显著抑制,表明合剂可通过调控JAK2/STAT3信号通路活性发挥治疗作用,从而延缓疾病进展。JAK/STAT信号通路的持续激活可促进MMPs表达上调,进而导致软骨细胞凋亡增加及滑膜组织抗凋亡能力增强[17]。临床研究证实,RA患者滑膜液中存在MMPs的异常高表达[18]。其中,MMP-1、MMP-3和MMP-13作为MMPs家族的主要效应分子,不仅参与胶原降解过程[19-20],还在软骨破坏、关节炎症及血管翳形成等病理过程中发挥关键作用[21]。本研究发现,合剂各剂量均能显著下调MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达水平,这可能是其缓解RA骨破坏的重要机制。 综上,合剂可通过多靶点作用发挥治疗效应:①调控炎症因子网络;②抑制JAK2/STAT3信号通路活化;③降低MMPs表达水平。这些作用共同改善了RA大鼠的关节炎症和骨损伤,初步阐明了合剂的治疗机制,为后续深入研究提供了实验依据。 参考文献： [1] SMOLEN J S,ALETAHA D,MCLNNES I B.Rheumatoid arthritis[J].Lancet,2016,388(10055):2023-2038. [2] WATANABE T,FUJIWARA Y,CHAN F K.Current knowledge on non-steroidal anti-inflammatory drug induced small-bowel damage:a comprehensive review[J].Gastroenterol,2020,55(9):481-495. [3] SMOLEN J S,LANDEWE R,BIJLSMA J,et al.EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs:2016 update[J].Ann Rheum Dis,2017,76(6):960-977. [4] 张富渊,姜泉,夏聪敏,等.清热活血方对胶原诱导关节炎大鼠miR-140、TLR4、NF-κB的影响[J].中国中医基础医学杂志,2023,29(4):583-587.6 [5] 刘霞,张小琼,郭小红,等.基于转录组学探讨仙茅酚苷类提取物对胶原诱导性关节炎大鼠的作用及机制[J].中药药理与临床,2022,38(2):84-90. [6] 王永辉,张晓园,李艳彦,等.基于JAK2/STAT3信号通路探讨风湿宁胶囊对寒湿痹阻型类风湿关节炎的作用机制[J].中国中医基础医学杂志,2017,23(7):949-952. [7] PRASAD P,VERMA S,SURBHI,et al.Rheumatoid arthritis:advances in treatment strategies[J].Mol Cell Biochem,2023,478(1):69-88. [8] JIN S,LI M,FANG Y,et al.Chinese registry of rheumatoid arthritis(CREDIT):Ⅱ.prevalence and risk factors of major comorbidities in Chinese patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther,2017,19(1):1-8. [9] POPE J E,CHOY E H.C-reactive protein and implications in rheumatoid arthritis and associated comorbidities[J].Semin Arthritis Rheum,2021,51(1):219-229. [10] 曹云祥,刘健,陶艳红,等.新风胶囊通过调控巨噬细胞极化改善活动期类风湿关节炎患者炎症反应及生活质量的研究[J].中国中医基础医学杂志,2022,28(9):1466-1470. [11] 揭立士,时孝晴,刘子修,等.桃仁-红花通过抑制NF-κB信号通路改善IL-1β诱导的软骨炎症和降解[J].中药新药与临床药理,2023,34(7):936-947. [12] DAYER J M.The pivotal role of interleukin-1 in the clinical manifestations of rheumatoid arthritis[J].Rheumatology,2003,42(suppl 2):ii3-ii10. [13] FAVALLI E G.Understanding the role of interleukin-6 (IL-6) in the joint and beyond:a comprehensive review of IL-6 inhibition for the management of rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Ther,2020,7(3):473-516. [14] WU X,SHOU Q,CHEN C,et al.An herbal formula attenuates collagen-induced arthritis via inhibition of JAK2-STAT3 signaling and regulation of Th17 cells in mice[J].Oncotarget,2017,8(27):44242. [15] MALEMUD C J.The role of the JAK/STAT signal pathway in rheumatoid arthritis[J].Ther Adv Musculoskelet Dis,2018,10(5-6):117-127. [16] FRAGOULIS G E,MCINNES I B,SIEBERT S.JAK-inhibitors.New players in the field of immune-mediated diseases,beyond rheumatoid arthritis[J].Rheumatology,2019,58(Supplement 1):i43-i54. [17] O'SHEA J J,KONTZIAS A,YAMAOKA K,et al.Janus kinase inhibitors in autoimmune diseases[J].Ann Rheum Dis,2013,72(suppl 2):ii111-ii115. [18] ARAKI Y,MIMURA T.Matrix metalloproteinase gene activation resulting from disordred epigenetic mechanisms in rheumatoid arthritis[J].Int J Mol Sci,2017,18(5):905. [19] 彭程,高明利,于静,等.独活寄生汤对大鼠类风湿关节炎的治疗效果及对血清IL-1β、TNF-α和MMPs的影响[J].中华中医药学刊,2021,39(8):82-85. [20] PULIK ,EGOSZ P,MOTYL G.Matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis and osteoarthritis:a state of the art review[J].Reumatologia,2023,61(3):191. [21] HU Q,ECKER M.Overview of MMP-13 as a promising target for the treatment of osteoarthritis[J].Int J Mol Sci,2021,22(4):1742. 文章编号： 1006-3250(2025)08-1373-06 原文下载： 苏小军,郭影,朱文菊,等.基于JAK2/STAT3信号通路探讨祛寒逐风合剂治疗类风湿关节炎的作用机制 .发表于《中国中医基础医学杂志》2025年第31卷第8期 编  辑：黄晓华     审  核：于    峥

点击上方蓝字关注我们 做抗体药物研发，经常看到"参比制剂""参比品"两个名词，名称相近，用途、法规定位完全不一样。如果混淆，会带来项目上的重大风险。 什么是法规上的「参比制剂」 依据国家药监局的定义：参比制剂，是用于仿制药（含生物类似药）注册申报，作为质量和疗效对照的上市原研药品完整制剂。（《 国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》（国办发〔2016〕8号）） ✔属性：法定药品，完整上市制剂； ✔用途：药品注册申报，用于药学、非临床、临床试验全套比对研究； ✔获取渠道：按照药监局要求采购上市原研制剂，是申报阶段强制要求物料。 什么是「科研级抗体药参比品」 科研级参比品，是基于公开的原研抗体氨基酸序列，通过重组表达制备得到的蛋白科研工具。 ✔属性：重组蛋白科研试剂，不是上市药品，不属于法规参比制剂； ✔用途：仅限科研场景：体外细胞实验、功能预实验、小动物体内药效、动物造模、方法学摸索； ✔使用边界：不能用于药品注册申报，不能用于人体，不能用于临床诊断和治疗。 一张表快速对比 科研端的现实价值 原研参比制剂价格高昂、批次有限，大量用于前期条件摸索、预实验会造成巨大成本浪费。 博奥森科研参比品，帮助科研人员在项目早期完成大量预实验、方法摸索、动物模型探索，把珍贵的原研参比制剂留给后期正式申报阶段使用。 ⚠️博奥森抗体药参比品为科研工具物料，仅供研究使用(RUO)，不可用于临床诊断、治疗及人体给药。本产品不属于 NMPA 法规定义的参比制剂，不可用于药品注册申报。 扫码查看全部抗体药参比品产品列表 博奥森生物，自2001年诞生以来，始终坚守在生命科学前沿，为全球科研人员提供卓越品质的免疫学试剂产品与服务。我们拥有资深的科学家团队、先进的抗体发现、验证与生产平台，始终坚持“自主研发、原始创新”的理念，确保每一款产品都能达到国际标准，持续提供“4R” 品质科研工具【Repeatable（可重复）、Replicable（可复制）、Reproducible（可再现）和Reliable（可信赖）】。 博奥森，以创新为魂，以品质为根，与您携手共创生命科学的美好未来。 Inspiring Scientific Discovery 400-901-9800 www.bioss.com.cn www.biossusa.com 公众号 小红书 B站