Pieris AG

概况 Palvella成立于2015年，公司主要专注于皮肤疾病领域的药物研究与开发，公司在2024年底通过同Pieris Pharma反向合并完成上市； 公司有一个独特的QTORIN药物递送平台，这个平台是一种无水凝胶系统。通过QTORIN平台制备的透皮制剂可以达到更高载的药量，也可以递送更复杂的分子（如高分子量），同时由于配方中不含有传统的渗透增强剂（会导致局部刺激或者更多药物进入全身），渗透的深度只到病灶的真皮层，起效的同时全身暴露少，保证了安全性； 公司的主要产品是3.9%的雷帕霉素无水凝胶（QTORIN Rapamiycin）用于一些血管畸形疾病的治疗。雷帕霉素是经典的mTOR抑制剂，而很多血管畸形疾病的病因也是最后收敛于mTOR通路的过度激活，但是因为雷帕霉素本身毒性很大，长期口服对患者并不友好（尤其是对于一些并不致命的疾病）。同时雷帕霉素稳定性差，分子量又很大（914，远大于正常透皮给药药物的分子量上限500），不容易制备成高浓度透皮制剂，但通过QTORIN技术平台可以制备成高浓度（3.9%）的无水凝胶，直达患病部位，全身暴露引起的毒性大幅降低； 目前3.9%的雷帕霉素无水凝胶（QTORIN Rapamiycin）的第一个适应症是微囊型淋巴管畸形（mLM）。 mLM主要由于胚胎发育早期的PIK3CA基因体细胞突变，导致PAM（PI3K/AKT/mTOR）通路持续过表达引起的淋巴内皮细胞异常增殖和肥大，从而皮下组织形成微小囊肿，临床上会表现出皮肤表面的水泡或者斑块，颜色非常明显（不美观），还会经常漏液（需要经常换衣服）。目前美国约有30000名左右的确诊患者，主要治疗方式还是激光，硬化或者off-lable使用雷帕霉素等药物（口服有毒，低浓度皮肤制剂效果不好），但是对于mLM效果并不好（巨囊型的还好治疗一些），复发率也很高； 在QTORIN Rapamiycin针对mLM的三期临床中，主要终点相对于基线改善达到2.13点（满分3），远超预期，86%的患者改善达到2个点以上，同时次要终点全部达标，安全性良好，预计2026年下半年递交上市申请； QTORIN Rapamiycin也在开发针对皮肤静脉畸形（cVM）的适应症，cVM是TEK基因或者PIK3CA基因的体细胞突变驱动，最终都是收敛于mTOR通路的激活，导致静脉内皮细胞的增生。cVM主要表现为皮肤上的蓝色或者紫色斑块（淤青），也会有持续的疼痛和溃疡出现。目前美国有约7万名cVM患者，但是目前的疗法（硬化疗法等）效果甚微。在QTOTRIN Rapamiycin针对cVM患者的二期临床试验中，主要观察指标cVM-IGA改善了1.5点（P<0.001）,效果稳定并且显著，公司预计2026年下半年开始启动三期临床； 公司目前还在开发QTORIN Rapamiycin针对血管角质瘤（Angiokeratomas）的治疗，预计2026年二季度开启启动二期临床试验，同时也在利用QTORIN平台开发透皮匹伐他汀（Pitavastatin）用于浅表性光化角化病（Superficial Actinic Porokeratosis）的治疗，预计2026年下半年进入二期临床； 从估值层面讲，公司目前针对的mLM和cVM都没有FDA批准的药物，尽管有很多处方外用药和手术疗法，但是依然是一个缺乏竞争的市场，而且这两个适应证都是罕见病，定价上也有一定优势，尤其是在疗效如此显著的基础上，以及从目前看到的医生调研结果看，还是有很大机会快速放量。如果认为mLM极大概率成功获批，同时考虑到其孤儿药定位，价格在10-15万美金每年，能渗透到一半的美国本土患者（不考虑全球），mLM适应证2027年获批，cVM适应证2029年获批的情况下，未来7-8年后销售达峰，峰值销售30-40亿美元应该是个可以期待的数字； 个人认为公司的主要风险并非来自于疗效，而是商业化能否快速上量和竞争对手的情况。商业化层面，虽然理想状态下公司存在着未满足的需求，但是商业化本身的不确定性很多，包括团队，策略等，因为现在的市场给小型企业团队独自做商业化的窗口非常小，如果前半年做的不好，就基本不给机会了，所以团队的压力也是巨大的，但优势在于美国有一半病人来自于美国本土的400家血管异常中心Vascular Anomaly Centers (VACs)，而且这些中心几乎都处方外使用雷帕霉素治疗血管畸形，无需教育，如果公司可以快速有效覆盖这些中心，很容易达到事半功倍效果。第二个，就是竞争对手，现在看起来最大的竞争方就来自于pan-PI3Ka抑制剂，Relay，诺华，礼来，Onkure都有类似资产，也在做类似适应证，QTORIN Rapamiycin的优势就是安全性，PI3K抑制剂的缺陷也是安全性，但目前来看，PI3K抑制剂还是有很大概率克服安全性风险的，这就对Palvella团队提出了更高要求，看是否可以利用好先发优势，教育并占据市场； 总体来看，Palvella拥有着独特的技术平台，有已经验证的资产，未来也有多种扩展证的可能性。个人认为，这类皮肤病虽然并不致命，但是对人的精神损耗是非常严重的，面部或者身体的丑陋带来的心态影响是促使大家使用这类药品的核心动力，非常有可能超出预期。同时这类疾病病人集中，也非常有利于快速放量（再次强调良好的开头非常重要）。而且这类疾病的发病原因是基因体细胞突变，所以大概率需要长期用药，因此从销售角度，是一个完美市场模型。从目前预测能达到的30-40亿美元的峰值销售来看，目前Palvella不到20亿市值的估值，还存在着很大的上涨空间。 不知道大家是否相信命运，有时候命运齿轮的转动确实会让神奇的事情出现。我猜想2023年对于Palvella也应该是喜忧参半吧。开心的是2022年底，公司核心产品QTORIN 3.9% 雷帕霉素无水凝胶针对mLM的二期临床获得成功，但令人担忧的是公司并没有足够的钱开始三期临床，甚至不得不在23年通过进一步出让部分的产品权益，向Ligand融资了500万续命（这个交易回头看是一个比较差的决定）。在2023年，地球的另外一个地方，有一个叫Pieris的公司同样陷入了黑暗之中，曾经是资本市场的宠儿的Pieris，凭借着Anticalin蛋白技术同多家公司达成合作，但是最终因为其主导的elarekibep项目失败，导致合作伙伴阿斯利康终止协议，从而让公司走入绝境，决定终止所有的临床项目，变成了一个持有一些现金和未来权益的壳公司。在纳斯达克，这类的壳公司相对还是抢手的，只要有好的资产，可以装进去实现快速上市。笔者投资的多家公司就是通过这样的交易结构实现上市的。当时的Palvella也在参加Pieris的评估筛选，但其实排名并不靠前，也没太多机会。结果后来排名靠前的Company A因为找不到足够的基石投资人（借壳的公司上市的以后通常需要做一轮PIPE，因此需要找到足够的投资人出资），被迫出局，而此时Palvella递交了方案同时也带了几个实力雄厚的投资人，在2024年下半年就同Pieris签署了协议，完成了反向合并。一年多以后，Palvella 的雷帕霉素无水凝胶针对mLM的三期临床获得成功，市值较当初涨了10倍有余，再回头审视这个案例，原来太阳底下并没有新鲜事，缺乏的是相信自己的勇气。 公司概述 QTORIN 技术平台 QTORIN 是 Palvella 专有的、受专利保护的局部药物输送平台。在透皮给药领域，药物分子的分子量通常需低于 500 道尔顿（Daltons）才能穿透角质层到达真皮层。然而，许多强效的治疗药剂，如雷帕霉素（分子量 914 ），因其巨大的体积、极差的溶解度和化学不稳定性，极难通过常规凝胶或乳膏剂型实现有效渗透。 QTORIN 技术平台的研发团队通过对多种辅料组合进行测试，开发出了一种独特的无水凝胶系统。该平台具有以下几大核心优势：第一，高载药量。QTORIN 能够容纳高浓度的活性药物成分（API），例如 QTORIN 雷帕霉素的浓度高达 3.9%，这远超市场上其他实验性局部制剂。第二，深度皮肤渗透与定位。该制剂被设计为可将有效治疗浓度的药物直接输送到疾病发生的源头——真皮层，同时不依赖传统的渗透增强剂（传统增强剂往往会导致严重的局部刺激或药物进入全身循环）。第三，极低的全身吸收。临床数据显示，QTORIN 雷帕霉素给药后的血药浓度仅为皮克级别，远低于产生免疫抑制副作用的阈值。第四，环境稳定性。QTORIN 凝胶在室温下可保持物理和化学稳定性超过 24 个月（雷帕霉素不太稳定）。 QTORIN 雷帕霉素产品介绍 雷帕霉素本身是一种强效的 mTORC1 抑制剂，最初用于肾移植后的免疫抑制。Palvella 的创新之处在于，它通过 QTORIN 平台将这种具有明确疗效但全身毒性大的分子转化为一种可以安全长期使用的局部靶向药物。 Palvella已经针对其核心产品QTORIN 雷帕霉素申请了多个专利，从专利中分析，其处方大概率是代号NA22的处方，在专利中其处方组成如下表所示： QTORIN 雷帕霉素第一个适应证— 微囊型淋巴管畸形 (mLM) 微囊型淋巴管畸形（mLM）是一种严重的、慢性的、终生性的遗传性淋巴系统疾病。其根本发病机制是由于胚胎发育早期发生的 PIK3CA基因体细胞激活性突变。这种突变导致 PI3K/AKT/mTOR 通路持续过表达，引发淋巴内皮细胞异常增殖和肥大，最终在真皮和皮下组织形成直径小于 2 厘米的无数微小囊肿。mLM 患者通常在出生时发病，且由于基因突变的原因，这种疾病一般不会自发缓解。临床上，mLM 表现为皮肤表面的颗粒状水泡和斑块（非常丑陋），伴随严重的淋巴溢（淋巴液持续外渗，尤其是夏天，需要经常更换衣服，给患者造成很大负担）和急性蜂窝织炎。淋巴液的长期渗漏不仅破坏皮肤屏障，还会引发反复的深部感染，导致患者频繁住院，甚至面临败血症等生命危险。 据估计，美国境内约有超过 30,000 名确诊的 mLM 患者。现有的手术切除往往难以彻底清除病灶，术后复发率极高。激光和硬化疗法虽然能缓解部分症状，但过程痛苦且效果有限。口服雷帕霉素虽然有一定疗效，但由于全身性的免疫抑制、高血脂和对生长发育的潜在影响，尤其是对于占很大比例的青少年患者而言，并非长久之计。 QTORIN 雷帕霉素的 2期 PALV-06 临床试验结果 2 期 PALV-06 研究是一项多中心、开放标签、基线对照试验，旨在评估 QTORIN 雷帕霉素每日涂抹一次（QD）治疗 12 周的安全性和有效性。该研究入组了 12 名 6 岁及以上的 mLM 患者，这些患者均为治疗顽固型，或曾经历多次手术且病灶稳定。由于 mLM 不会自发缓解，因此采用基线对照（即患者在治疗期间的表现与其治疗前的状态进行对比）。 在该试验中，主要疗效评估工具包括：医生全球评定改善量表（CGI-C）： 一个 7 分制的临床评价量表，范围从“极显著恶化”（-3）到“极显著改善”（+3）。医生全球严重程度评分（CGI-S）： 一个 5 分制的严重程度量表，1 代表“无病灶”，5 代表“极重度”，涵盖病灶高度、渗漏、出血、红斑和过度角化五个维度。患者全球评定改善量表（PGI-C）： 同样的 7 分制量表，由患者从自身感知角度进行评价。 试验结果展示100% 的受试者在第 12 周达到了 CGI-C 的“显著改善”（+2）或“极显著改善”（+3）。CGI-C 平均改善值为 +2.42 点（p < 0.0001），而 PGI-C 为 +2.08 点（p < 0.0001）。医生评估的整体 CGI-S 评分平均下降了 1.33 点（p < 0.0001）。其中，病灶高度、渗漏和出血天数等关键指标均表现出统计学意义的改善。特别是淋巴溢出天数减少了 58.9%（p = 0.0255），生活质量指标 DLQI 改善了 4.17 分。给药后的平均血药浓度仅为 120.98pg/mL，远低于 5 ng/mL的免疫抑制阈值。所有治疗相关不良事件（TRAE）均为轻度或中度，最常见的是应用部位疼痛（25%）和瘙痒（25%），无严重不良事件（SAE）或因 AE 导致的停药。 基于 2 期的成功，Palvella 启动了关键的 3 期 SELVA (PALV-09) 试验。这是一项为期 24 周的单臂、基线对照研究，入组了 51 名 3 岁及以上的患者（主要分析人群为 49 名 6 岁及以上患者，ITT 人群）。之所以将主要终点设在 24 周而非 12 周，是因为 2 期数据显示部分患者在 12 周后仍有持续改善空间 。主要终点 mLM-IGA（和前面CGI-C类似）： 这是专门为该疾病开发的“微囊型淋巴管畸形研究者全球评估”量表。它同样是一个 7 分制的动态变化量表（-3 到 +3），但要求医生必须参考基线照片进行评分，以增加评估的客观性 。关键次要终点 mLM-MCSS（独立盲审评分）： 这是一个 13 点规模的综合静态严重程度量表（总分 3-15），由远程独立观察者对随机混排的基线与 24 周照片进行盲法评估，涵盖囊肿外观、高度和渗漏/出血三个维度（每个维度 1-5 分）。 3 期数据显示mLM-IGA 相比基线平均改善了 2.13 点（p < 0.001），远超投资者预期的 1.5 点。95% 的患者表现出积极响应（改善>1点），86% 的患者达到了“Much”或“Very Much”改善的高度。独立的盲审 mLM-MCSS 评分显示了 3.36 点的平均下降（p < 0.001），这个也消除了单臂试验的主观偏差质疑。此外，患者自评的 PGI-C 改善了 1.9 点（p < 0.001），展现了高度的一致性。 安全性特征与 2 期高度一致，全身暴露极低（< 2ng/mL）。最常见的 TRAE 包括应用部位痤疮（6%）、变色（6%）和瘙痒（6%）。仅 1 名患者因可能相关的 AE（淋巴溢）停药 。98% 的完成者选择转入长期扩展研究，安全性表现相当良好。公司计划2026年下半年递交NDA。 QTORIN 雷帕霉素的第二个适应证— 皮肤静脉畸形 (cVM)QTORIN 技术平台 皮肤静脉畸形（cVM）是皮肤科最常见的血管畸形类型，主要由 TEK基因（编码 TIE2 受体，约占 70%）或 PIK3CA基因（约占 30%）的体细胞突变驱动。这些突变最终都收敛于 mTOR 通路的过度激活，导致静脉内皮细胞不成熟增殖和扩张。与淋巴管畸形不同，cVM 表现为皮肤上的蓝色或紫色斑块，类似永久性的“淤青”。其另外一部分痛苦在于缓慢血流导致的微血栓形成，这引发了持续的剧烈疼痛、溃疡以及具有破坏性的钙化沉积物（静脉石）。美国约有超过 75,000 名 cVM 患者，其患病率高于 mLM，代表了更大的未满足市场。目前 cVM 的临床治疗通常仅依靠压缩衣或局部硬化治疗，这些手段无法触及疾病的病因，且对大面积病灶效果甚微。 QTORIN 雷帕霉素的 2 期 TOIVA 试验数据 在 2025 年 12 月公布的 2 期 TOIVA 研究顶线数据中，QTORIN 雷帕霉素依然表现优异。该研究入组了 16 名患者，评估 12 周的疗效。 主要观察指标 cVM-IGA 平均改善了 1.5 点（p < 0.001），中位改善值为 2.0 点。其中 73% 的患者表现出 1 点以上的改善，67% 被评为“显著或极显著改善” 。值得注意的是，无论患者携带的是TEK还是PIK3CA突变，或者是基因型未确定的患者，均表现出了类似的临床获益。这种“对因治疗”的特性使得 QTORIN 雷帕霉素能够作为静脉畸形的广谱调节剂。公司计划在 2026 年下半年启动 cVM 的 3 期关键研究。 QTORIN 雷帕霉素扩展适应证— 血管角质瘤 (Angiokeratomas) Palvella也在最大化QTORIN 雷帕霉素的价值，目前他们计划开发的下一个适应证是血管角质瘤 (Angiokeratomas)。 该疾病的发病机制由VEGF信号传导激活与mTOR通路过度活跃形成的反馈回路驱动，导致角质形成细胞过度增殖与表皮下真皮乳头层血管的严重扩张。美国受该病影响的确诊患者超过50000人。临床症状表现为伴有过度角化的深红色至蓝黑色丘疹或斑块，极易发生自发性出血并伴随剧痛、感染风险和日间功能障碍，且该病变无自发消退倾向。针对该适应证目前没有任何FDA批准的靶向药物。FDA已于2025年12月授予该适应证快速通道资格（Fast Track Designation），公司计划于2026年第二季度启动Phase 2临床试验。 QTORIN 技术平台新项目— QTORIN 匹伐他汀 Palvella也在利用QTORIN平台开发新的项目，他们下一个项目是QTORIN匹伐他汀针对播散性浅表光线性汗孔角化症（DSAP）。DSAP 是一种慢性、癌前病变的遗传性皮肤病，在美国影响超过50,000名患者，主要表现为日晒部位出现的无数扩张性病损，不仅影响美观，且存在 6.4% 至 11.6% 的恶性转化风险（主要是鳞状细胞癌）。 DSAP 的根源是甲羟戊酸（Mevalonate）通路的基因突变，导致有毒中间代谢产物的堆积和胆固醇缺乏。虽然学术研究已证明局部使用他汀类药物（如洛伐他汀）有效，但目前缺乏规范化的处方药。而且由于口服他汀类药物的皮肤分布极低无法起效，而院内手工配制的局部他汀药物存在极大的浓度不稳定性与获取限制。而Palvella开发的 QTORIN 匹伐他汀，凭借匹伐他汀远高于洛伐他汀的抑制效力，而且可以皮肤靶向递送，有望成为全球首个针对 DSAP 的发病机理驱动疗法。公司计划于 2026 年下半年启动 2 期研究。 未来Palvella有多个里程碑，整体来看最重要的里程碑大部分都在27年，中间应该不会有很大变化： 血管畸形领域的竞争态势 笔者在写这部分的时候，内心是有一些纠结的，因为其中有一家企业，是笔者投资的公司，从心底里期望公司变得更好，从而给投资人带来更好的收益。但是本文还是客观分析，期待更多的产品一起将这个市场做大。血管畸形的病理根源（如PIK3CA突变）往往深达肌肉、软组织甚至内脏，局部凝胶仅能控制表皮水疱与漏液，无法逆转深层异常血管增生。因此针对病因的口服用药是存在明确市场的。从目前来看，虽然诺华的alpelisib已经获批PROS，而且在做血管畸形，但是高血糖和皮疹毒性还是很大程度限制了应用，所以诺华最近收购了Synnovation Therapeutics也是这个原因。未来在PI3Kα泛突变选择性抑制剂会成为主要方向，因为可以保证活性，降低副作用，但是距离其上市还有相当长时间。另外就是这类血管畸形疾病并不致命，因此对于安全性要求非常高，相对于其他产品的口服给药，皮肤局部给药的雷帕霉素凝胶依然有一定优势。 Palvella 的估值 Palvella (PVLA) 的估值的基础是针对mLM适应证的三期临床成功。针对首个适应证微囊型淋巴管畸形 (mLM)，美国确诊患者约 3 万人，很多券商也做了调研，一些血管畸形专家将 mLM-IGA 量表 +1.5 点的改善设定为 100% 采纳的“甜点位”，而 SELVA 的改善是+2.13 点。 这种结果意味着 QTORIN 雷帕霉素已跨越医生的心理阈值。个人预计mLM获批的概率超过90%，如果商业化做的出色，预计美国峰值渗透率可以接近一半。如果可以将QTORIN 雷帕霉素定价到10-15万美元的孤儿药价格，预估 mLM 单一适应证在美国的峰值销售额将超过20亿美元。皮肤静脉畸形 (cVM) 确诊患者超 7.5 万人，其二期试验已初步验证疗效，并且作用机理类似，风险溢价随平台验证而显著降低，预计 2026 年下半年启动三期临床。未来皮肤静脉畸形 (cVM)的适应证预计峰值销售可以超过15亿美元。同时考虑到血管角质瘤 (Angiokeratomas)适应证的开发，以及QTORIN匹伐他汀的推进。即使非常保守估计，目前不到20亿市值的Palvella还是有很大上涨空间。 Palvella 核心风险 院内配方药（Compounding Pharmacies）的廉价替代风险：雷帕霉素（Rapamycin）作为上市数十年的非专利药物，API（原料药）获取成本极低 。一线调研显示，高达68%的医生已在大量处方由院内配药药房（Compounding Pharmacies）调配的外用雷帕霉素（虽然浓度不够）。目前患者使用院内调配制剂的平均自付成本（OOP）仅为每月约220美元（最高不过600美元）。相比之下，我们做的估值是按照孤儿药价格做的预测。面对高价差，支付方（Payers）可能强制要求患者在院内廉价制剂疗法失败后方可报销。此外，美国FDCA 503A条款明确允许，当医生认定患者存在特定临床需求时，药房可合法调配仿制配方（某公司已经深受其苦）。血管畸形的病理根源（如PIK3CA突变）往往深达肌肉、软组织甚至内脏，局部凝胶仅能控制表皮水疱与漏液，无法逆转深层异常血管增生。Lilly的STX-478、Relay的Zovegalisib以及OnKure的OKI-355等新一代突变选择性PI3Kα抑制剂，正通过精准规避野生型靶点消除高血糖等代谢毒性。一旦这些口服药物在后续临床中证实具备支持慢性给药的安全性，可能临床医生将倾向于使用系统性疗法从根本上缩小整体病灶体积。同时，Quoin正在推进载药量高达4%-5%的雷帕霉素贴剂和洗剂 ，直接在局部给药赛道对PVLA构成同质化威胁（虽然还早）。 另外一个核心威胁就是公司的商业化能力，现在的整体市场，如果不走卖掉公司（即使想卖掉，也要做出自主商业化的样子）的路，小型公司一定要在前两个季度（最多三个）能做出超出市场预期的商业化成果，只有这样，公司的价值才会得到释放。对于Palvella这样的公司，商业化能力到底如何，还要让我们拭目以待，如果开始做不起来，那么大概率会一蹶不振。 总结 作为一家专注于治疗严重、罕见遗传性皮肤病的生物制药公司，Palvella 凭借其受专利保护的 QTORIN 技术平台，成功解决了高分子量药物透皮吸收的难题。其首个产品 QTORIN 3.9% 雷帕霉素无水凝胶（QTORIN Rapamycin）在针对微囊型淋巴管畸形（mLM）的 3 期 SELVA 临床试验中取得了压倒性的胜利。此外，公司在皮肤静脉畸形（cVM）的 2 期研究中也展示了卓越的疗效。随着 2026 年下半年 NDA 的计划提交以及 2027 年上半年的预期获批，Palvella 有望填补 mLM领域的市场空白。个人对雷帕霉素无水凝胶真正看好的原因不仅仅是低风险，而是患者对于美的追求，血管畸形并不致命，但是会导致频繁漏液（夏天需要频繁换衣服），和皮肤上丑陋的色斑带来的自卑感，这种心灵的折磨对于任何一个患者有着不亚于真正的疼痛。另外本人对于公司商业化有信心的地方在于美国有一半的病人来自于美国本土的血管异常中心Vascular Anomaly Centers (VACs)，大概有400家，并且这些中心几乎都off-lable使用雷帕霉素治疗血管畸形。也就是说，如果Palvellak可以很好的覆盖这些中心，那么利用先发优势就是有可能实现商业化的快速放量。因此还是觉得有着30-40亿美元以上的销售潜力，同时考虑到适应证的扩着和平台新分子的开发，目前的估值依然有上升空间。 个人观点，仅供参考 注：本公众号专注于美国生物医药公司深度分析，欢迎交流。

欢迎加入“艺药荟”知识星球，领取优惠券并免费享有全部资源! 经典阅读： 摘要 过程强化和培养基优化作为提高生产力和商品生产成本(COG)的关键步骤，为商业化准备奠定了基础，并重新定义了患者可及性的格局。本研究描述了一种逐步方法，用于探索不同的强化补料分批培养过程以及优化的细胞培养基，以生产Mabcalin™双特异性抗体。最初，通过利用灌注扩增，开发了接种密度为10.3×10⁶个细胞/mL的强化补料分批培养(IFB)，以生产6.1g/L的产品，相比之下，原始传统补料分批培养(TFB)的产量为3.9 g/L。在IFB转换之后，选择了一种高性能生产培养基MagniCHO™来替代原来的培养基，这进一步将滴度提高到了9.1g/L。结果强调了开发优化的细胞培养基用于强化培养的重要性。此外，采用了超强化间歇灌注补料分批培养方法，将接种密度提高到73.6×10⁶个细胞/mL。记录的最终收获滴度为24.5g/L。此外，计算了制造COG以评估过程强化如何导致提高生产成本效益，采用UI-IPFB工艺可将COG降低多达71%。本研究表明，即使对于难以表达的模式，应用包括过程强化和培养基优化的战略开发方法也可以有效地提高制造效率和COG竞争力。 【NO.1】引言 本研究利用现有知识和过程策略实现高生产力和具有成本效益的制造过程，概述了Pieris Pharmaceutical,Inc.的Cinre-bafusp Alfa(PRS-343)的开发路径，PRS-343是一种双特异性融合蛋白，结合了靶向4-1BB的Anticalin®蛋白和靶向HER2的抗体(图1)。这种具有单链设计的新型双特异性蛋白此后被称为Mabcalin™蛋白。该研究应用了多种过程策略，包括TFB、IFB和UI-IPFB(图2)，并采用了不同的培养基选项。为确保强化上游过程中的最佳细胞生长、活力和滴度，药明生物公司开发了一种专有的生产培养基MagniCHO™，专为强化培养量身定制。该开发基于对不同代谢阶段各种CHO细胞类型关键营养需求的全面理解和模拟。从原始商业培养基切换到Magni CHO™展示了过程强化和培养基优化的综合效果。我们使用UI-IPFB过程(一种分批补料和灌注培养的混合方式)的策略从根本上改变了过程性能，使滴度从原来的3.9g/L提高到了前所未有的24.5g/L。这个滴度比原来的TFB过程高出五倍多，同时保持了相当的产品质量。此外，该研究提供了不同制造过程条件下的详细COG分解分析，阐明了过程强化对成本分布和COG降低的影响。结果，通过IFB和UI-IPFB过程开发，分别可实现高达46%和71%的COG降低。总体而言，本研究展示了一种系统且有效的方法来开发复杂双特异性蛋白的高生产力过程，突出了过程强化和培养基优化在改变生物治疗制造效率和成本效益方面的决定性作用。 【NO.2】材料和方法 2.1.细胞系、培养基和种子扩增 本研究中使用的亲本细胞系是SelexisSURECHO-M细胞系™，其稳定表达Pieris制药公司的cinrebafuspalfa(PRS-343)，这是一种双特异性融合蛋白，它将与HER2靶向抗体基因连接的4-1BB靶向抗钙素®蛋白结合在一起。本研究评估了四种市售且化学成分明确的细胞培养基，包括培养基A(富士胶片欧文科学公司的BalanCD CHO GrowthA)、培养基B(Cytiva公司的Actipro)、培养基C(默克SAFC公司的Ex-CELL®Advanced CHO)、培养基D(赛默飞世尔科技公司的Dynamis)。药明生物公司开发了一种专有生产培养基Magn iCHO™，作为多种CHO细胞培养过程中使用的平台培养基之一。在所有条件下均使用了同一组市售补料培养基HyClone™CellBoost™7a和7b(Cytiva)。 图1展示了Pieris公司专有的Mabcalin™双特异性蛋白的结构，这是一种将Anticalin®蛋白与抗体融合的新型单链设计 图2则通过示意图对比了超强化间歇灌注补料分批培养(UI-IPFB)过程与传统补料分批培养(TFB)和强化补料分批培养(IFB)过程，直观地展示了不同培养模式的差异 在细胞扩增阶段，细胞在摇瓶中于36.5°C,125rpm旋转、6%CO₂的条件下在振荡培养箱中培养。摇瓶以0.3×10⁶个细胞/mL接种，当活细胞密度(VCD)达到3.0-6.0×10⁶个细胞/mL时，每3-4天进行传代培养。 2.2.N-1种子培养 N-1种子培养在摇瓶或3L台式生物反应器中以分批或灌注模式进行。与细胞扩增阶段类似，培养温度保持在36.5°C。对于轨道直径为50mm的振荡培养箱，参数为6%二氧化碳、80%湿度和125rpm旋转。在3L生物反应器的灌注培养中，通过空气或氧气鼓泡将溶解氧(DO)百分比维持在40%，并使用纯CO₂鼓泡或1M碳酸钠溶液滴定将pH控制在6.90±0.25。根据需要添加消泡剂以控制生物反应器中的泡沫。 对于N-1批次扩增，将培养物以0.3×10⁶个细胞/毫升的接种密度接种，持续3天，直到活细胞密度(VCD)达到3.0-6.0×10⁶个细胞/毫升。对于N-1灌注扩增，将培养物以1.0×10⁶个细胞/毫升的接种密度接种。从第2天到第5天，将一个ATF-2中空纤维过滤器(Repligen公司)连接到生物反应器进行连续灌注。灌注速度每天递增，作为灌注培养基的A培养基的三天灌注速率分别为1.0、2.0和3.0体积/天/罐(VVD)，当使用Magni CHO™时，灌注速率分别为0.5、1.0和3.0VVD。在UI-IPFB研究中的N-1灌注过程中，培养物接种密度和灌注速率保持不变。在进行UI-IPFB生产接种之前，使用在用的ATF-2细胞截留装置在4h内将N-1种子浓缩至初始培养体积的50%、33%、25%、20%。在细胞培养浓缩阶段，生物反应器参数，如温度、pH值、溶解氧(DO)、搅拌和通气，保持在相似的设置下。浓缩过程中应用相同的3.0VVD灌注速率，同时将ATF收获流速增加到9.0VVD以快速浓缩培养体积。 2.3.生产培养 使用250mL摇瓶在TFB和IFB模式下评估了四种市售培养基(A-D)。用于培养基筛选的补料分批生产进行14天，或者如果活力下降到60%以下则终止。除非个别设计另有规定，TFB和IFB生产的目标接种密度分别为1.0×10⁶个细胞/mL和10.0×10⁶个细胞/mL。初始培养温度为36.5°C，然后在达到VCD峰值的前一天转移到33.0°C。 使用A培养基和Magni CHO™在3升生物反应器中进行生产。每天以10:1的比例加入相同的市售补料培养基Cell Boost7a和7b。由于不同工艺条件下接种密度和代谢消耗的变化，根据离线测量的渗透压所指示的每日消耗量补充补料。由于每日补料，渗透压维持在350至450mOsm/kg之间。总体而言，TFB和IFB生产的总补料比例均为33-36%，而UI-IPFB生产需要的总补料量为初始工作体积的~80%。通过空气或氧气鼓泡将溶解氧维持在40%，使用纯CO₂鼓泡或1M碳酸钠溶液滴定将pH控制在6.9至7.0之间。根据需要补充消泡剂以控制生物反应器中的泡沫。温度最初设定为36.5°C，然后在达到VCD峰值的前一天转移到33.0°C或32.0°C。TFB和CFB生产的初始接种密度为0.3×10⁶个细胞/mL，而IFB的接种密度为10.0×10⁶个细胞/mL。对于UI-IPFB生产，目标接种密度为25.0、40.0、55.0和80.0×10⁶个细胞/mL。 根据具体研究设计实施间歇或连续灌注策略。对于UI-IPFB过程，在第4、7和10天进行三个独立的间歇灌注循环，每个循环的灌注速率为1.5VVD，持续24小时。对于CFB过程，从第2天开始以0.5VVD的灌注速率进行连续灌注，然后从第3天起将灌注速率提高到1.0VVD。在所有生产生物反应器中，如先前研究所述，通过使用内径为50kD的中空纤维，在灌注过程中将蛋白质保留在生物反应器容器中。 2.4.过程中测试和质量属性分析 通过每日取样监测活细胞密度(VCD)、细胞活力、葡萄糖和乳酸。使用Vi-CELLXR细胞计数仪(贝克曼库尔特公司)测量VCD和细胞活力。使用Cedex BioHT分析仪(罗氏公司)检测葡萄糖和乳酸。使用渗透压计(Advanced Instruments)进行渗透压的离线测试。对于滴度测量，将细胞培养液在14000g下离心5分钟，然后使用配备Thermo Fisher Scientific公司POROS®A柱的安捷伦1260高效液相色谱仪(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)分析上清液。 在进行产品质量分析之前，首先通过蛋白A层析(Mab Select SuRe™LX树脂，Cytiva公司，瑞典乌普萨拉)对上清液样品进行纯化。使用安捷伦1260高效液相色谱系统，采用Tosoh TSK gel G3000SWxl柱进行高分子量和低分子量物种的尺寸排阻色谱分析，流动相为0.5mL/min磷酸钠、300mM氯化钠，pH7.4，流速为(20mM，柱温为20°C，紫外检测波长为280nm。使用配备光电二极管阵列检测器且设置在220nm的贝克曼库尔特PA800Plus仪器进行还原型和非还原型毛细管等电聚焦十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(CE-SDS)分析。 使用配备FC涂层iCIEF柱盒的Protein Simple CIEF分析仪，通过成像毛细管等电聚焦分析电荷变体种类。将样品与适当的pI标记物(5.85/9.50)、两性电解质(5-8、8-10.5)、0.35%甲基纤维素、1M尿素以及10mM精氨酸和亚氨基二乙酸混合，然后注入氟碳涂层毛细管柱盒。检测波长设置为280nm以评估电荷变体分布。 通过聚糖释放、纯化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记以及超高效液相色谱-荧光检测(UPLC-FLD)分析的步骤来表征N-聚糖谱。使用WatersA CQUITYUPLC®BEH酰胺柱(1.7μm,2.1×100mm)分离标记的聚糖，并在配备荧光检测器的WatersBio-Core系统H-class超高效液相色谱系统上通过亲水相互作用液相色谱-荧光检测(HILIC-FLD)进行检测。使用FLR检测器通过其相对峰面积对每个单独的N-聚糖进行定量。 2.5.培养基成本和生产成本分析 对于制造COG比较，所有生产成本均在2000L一次性生物反应器规模的条件下计算。COG分析是根据先前描述的方法进行的。简而言之，运营成本主要考虑公用事业和劳动力相关的使用情况。对于公用事业部分，汇总了设施占用、设备使用及其相关维护和折旧，以及水、气和电消耗产生的公用事业费用。关于劳动力使用，计算主要取决于每个单元操作中操作的复杂性，并根据制造经验估计所需的操作时间和操作人员。M&C包括上游(一次性生物反应器、培养基、一次性混合和储存袋、培养基过滤器、管道、探头和ATF柱)和下游(缓冲液、混合和储存袋以及过滤膜)材料，其消耗根据物料清单中的实际使用情况进行模拟。COG计算中未考虑树脂成本。这是因为在连续的商业制造活动中，树脂可以重复使用至预定义的生命周期限制，无论上游工艺条件如何，这都会导致对总体COG的等效最小增加。至于培养基成本比较，Magni CHO™的相对单价是培养基A的60%，并且在所有工艺条件下使用相同的进料培养基价格。 【NO.3】结果 3.1.使用商业培养基通过强化补料分批工艺提高生产力 在最初尝试提高Mabcalin™产量的生产力时，在摇瓶中以TFB和IFB模式评估了三种市售培养基(培养基B-D)，以培养基A作为原始TFB工艺的对照。 图3. 候选商业培养基在摇瓶中的培养性能；(a) TFB和(b) IFB中的VCD和细胞活力；(c) 滴度；(d) IVCD。 在如图3a所示的TFB工艺中，培养基C和D使细胞指数生长更快，并在第5天达到~30.0×10⁶细胞/mL的最高峰值VCD，比对照提前两天。培养基B在细胞生长方面表现最差，在第9天仅达到21.3×10⁶细胞/mL的峰值。此外，培养基B/C/D在培养后期的最终VCD下降到11.0至16.6×10⁶细胞/mL之间，活力降至50-73%。相比之下，培养基A中的TFB工艺显示出最高的最终VCD和活力，分别为22.1×10⁶细胞/mL和87.5%，这也导致了最高滴度3.9g/L。同样，在IFB培养物中(图3b)，培养基A显示出最佳的细胞生长潜力，峰值VCD攀升至~37.0×10⁶细胞/mL，与培养基C相当，但在第14天之前明显更好地维持了活力。相比之下，由于活力下降更快，除对照外的所有条件都提前收获(第10-11天)。因此，培养基A实现了最高的IFB滴度5.44g/L(图3c)，最高的IVCD为389×10⁶细胞-天/mL(图3d)，并且N-聚糖谱与参考标准相似(图S1)。基于该结果，尽管培养基A和C之间的TFB滴度相似，但在IFB生产的背景下，培养基A优于所有其他培养基。因此，培养基A在后续的IFB研究中仍作为主要生产培养基。 图4. 使用所选培养基A的3 L生物反应器中的培养性能，(a) N-1细胞密度（VCD）和细胞活力；(b) 生产细胞密度（VCD）和细胞活力；(c) 乳酸；(d) 累积细胞密度（IVCD）、产量（滴度）和单位时间产率（Qp）。 随后，在台式3L生物反应器中进一步验证了使用培养基A切换至IFB工艺的可行性。最初，评估了使用交替切向流(ATF)细胞截留装置在连续灌注模式下细胞增殖的潜力。该方法旨在根据N-1细胞生长潜力确定IFB生产的接种密度。如图4a所示，用于接种TFB生产的传统N-1批次培养从初始活细胞密度(VCD)为0.3×10⁶个细胞/mL开始，在第3天达到最终密度5.2×10⁶个细胞/mL。通过从第2天到第5天进行N-1连续培养基交换灌注，获得了终VCD为78.8×10⁶个细胞/mL。因此，初始接种密度目标能够达到10.0×10⁶个细胞/mL(图4b)。在生产过程中，进行了每日大剂量补料，在IFB工艺中总补料体积达到初始工作体积的36.3%，而TFB对照为33.5%。在第2天温度变化后，IFB培养物的VCD在第5天继续上升至42.4×10⁶个细胞/mL，而TFB生产在第8天为31.2×10⁶个细胞/mL。在活力方面，直到第6天IFB和TFB条件都有相似的趋势。第6天后，IFB培养物的活力下降更快，在第14天降至63.0%，而TFB在第14天为91.5%(图4b)。与活力下降同时，IFB培养物中的乳酸在培养结束时也呈上升趋势。IFB生产的终乳酸在第14天升至1.44g/L，而TFB为0.62g/L(图4c)。IFB中高58.2%的IVCD弥补了IFB生产中观察到的略低的细胞比生产率(Qp)(图4d)。最终，IFB培养物的滴度增加到6.1g/L，是TFB对照的156.4%。IFB结果表明，通过N-1灌注进行补料分批强化是提高生产率的可行方法，尽管同时开始出现一些不良表现，如细胞活力下降更快和乳酸重新积累。 3.2.通过应用专利的MagniCHO™培养基提高生产率 IFB培养的性能高度依赖于细胞培养基的营养能力和平衡以维持高细胞密度。同时，适用于强化工艺的培养基能够抑制或抵消副产物合成的不利影响。为了在Mabcalin™的强化补料分批生产中进一步提高培养基性能,培养基A用补料培养基或普朗尼克F68(一种保护细胞免受剪切应力的表面活性剂)进行了强化。然而，两者均未显示出显著性能改善(图S2)。基于这些结果，在这轮IFB优化中评估了一种专门为强化细胞培养工艺设计的专利生产培养基Magni CHO™。对Magni CHO™和培养基A进行了并行评估，以比较它们在N-1灌注和IFB生产中的性能。 图5. 使用培养基A (IFB-1) 和 Magni CHO™ (IFB-2) 的IFB生产。(a) N-1 VCD和细胞活力；(b) 生产期VCD和细胞活力；(c) 乳酸；(d) IVCD、滴度和Qp。 在图5a所示的N-1灌注培养中，使用两种不同培养基的细胞生长曲线从第4天开始出现分化：使用Magni CHO™培养基时，第5天的峰值活细胞密度(VCD)攀升至86.8×10⁶个细胞/mL，而使用培养基A时为78.8×10⁶个细胞/mL。同时，培养基A组的细胞活力缓慢下降至98.3%，而Magni CHO™组为99.2%，这意味着在培养基A条件下出现了细胞凋亡的迹象。此外，即使使用Magni CHO™培养基最终获得了更高的VCD，但N-1灌注的总体积仅为容器体积的4.5倍，远低于培养基A对照组(容器体积的6.0倍)。结果表明，使用Magni CHO™作为灌注培养基能够提高增殖性能，维持更好的细胞活力，同时减少培养基的总体消耗和成本。 在进行N-1灌注后，分别接种使用培养基A生产的IFB-1和使用MagniCHO™生产的IFB-2，保持相同的初始细胞密度目标为10.0×10⁶个细胞/mL。接种后，应用类似的每日推注补料方案来比较这两种不同的工艺。在生产早期，与使用培养基A培养出的42.4×10⁶个细胞/mL相比，MagniCHO™使峰值活细胞密度达到更高的51.7×10⁶个细胞/mL(图5b)。在生产末期，活力出现了显著差异：IFB-1的活力在第14天开始迅速下降，低至63.0%，而在IFB-2条件下，第14天观察到活力高于80%。同时，IFB-1的乳酸曲线从第7天也出现了再次积累的第二次变化，而使用Magni CHO™时，最终仅残留可忽略不计的乳酸量(图5c)。由于使用Magni CHO™提高了代谢状态，最终滴度从IFB-1中的6.1g/L提高到IFB-2中的9.1g/L(图5d)，这是由活细胞密度(IVCD)和细胞比生产率(Qp)分别提高23.9%和21.4%所驱动的。 3.3.通过超强化IPFB工艺(UI-IPFB)提高生产率 为了进一步探索提高生产率的替代强化策略，使用培养基A或MagniCHO™作为生产和间歇灌注培养基，应用了UI-IPFB细胞培养工艺。在使用MagniCHO™的UI-IPFB研究中，图S3初步评估了不同灌注速率下接种密度在20至80×10⁶个细胞/mL之间的情况。在这些条件中，选择来自五倍N-1种子浓度的73.6×10⁶个细胞/mL的最高接种密度作为后续比较的最佳条件。发现N-1灌注培养五倍浓缩后，UI-IPFB工艺的最终活细胞密度高达372.9×10⁶个细胞/mL(图6a)。在生产过程中，在第4、7和10天进行了三个24小时间歇灌注的独立周期。相比之下，由于在整个生产阶段乳酸异常积累，在使用培养基A的IPFB生产中仅检测到少量蛋白质产生(数据未显示)。因此，选择Magni-CHO™用于UI-IPFB工艺。 图6. 使用Media A或Magni CHO™培养基对TFB、IFB和UI-IPFB性能的比较。(a) N-1 VCD和细胞活力；(b) 生产VCD；(c) 细胞活力；(d) IVCD、滴度和Qp。 在UI-IPFB生产过程中，第2天的VCD峰值达到101.5×10⁶个细胞/毫升(图6b)。尽管接种密度高得多，但UI-IPFB培养物的活力曲线与IFB-2过程相当，在第14天活力缓慢下降至84.0%，延长至第16天后进一步降至79.4%(图6c)。鉴于第14天后滴度继续上升(趋势未显示)，生产持续时间延长至第16天。生产结束时，获得了24.5g/L的最终产品滴度，这相当于使用培养基A时TFB滴度的6.3倍，以及使用Magni CHO™时IFB-2滴度的2.7倍。滴度的显著增加部分是由于IVCD相对于TFB和IFB-2条件分别显著增加了508%和157%(图6d)。此外，从UI-IPFB培养物计算出的数据显示，Qp从TFB对照中的14.8pg/细胞/天适度提高到18.9pg/细胞/天。然而，IFB-2和UI-IPFB条件之间的差异很小(图6d)。 图7. 不同工艺下的产品质量比较 在产品质量方面，图7总结了以TFB条件为对照的不同工艺的结果。通过SEC-HPLC测定的高分子量和低分子量物质(HMW和LMW)的百分比高度可比，显示出聚集体比例相似(<5%)，截短物种的量可忽略不计。CE结果进一步揭示了产品聚集和截短方面的相似性。关于电荷分布，观察到一些细微差异，因为所有三种强化工艺的酸性物质都略有增加，范围从0.6%到4.0%。此外，N-聚糖分析表明，随着工艺强化，半乳糖基化和甘露糖水平均下降，导致IFB和UI-IPFB产品中的GOF群体均增加7.5-10.2%。 3.4.培养基成本和COG分析 为了全面概述生产成本分布和COG降低预测，基于所开发的不同工艺进行了系统的成本分析。最初，我们计算了使用商业培养基A或Magni CHO™的不同培养模式的培养基成本，以展示工艺模式的演变和最佳培养基的选择如何有利于每批最终药物物质(DS)的产量以及单位DS产品的培养基费用(表1和图8)。 图8. 不同条件下的工艺输出和经济分析。(a) 每批次的DS输出及归一化比率；(b) 归一化的COG及其细分比率。 假设在一个2000L的一次性生物反应器(SUB)中，使用培养基A的原始TFB工艺的DS产量可达5.1kg。通过选择更好的培养基选项，如Magni CHO™，由于采用Magni CHO™后TFB滴度提高了28%，每批DS产量增加到6.5kg。此外，随着优化的IFB工艺，生产效率的提高更加明显，其中IFB-2中每批DS产量攀升至11.8kg，比使用培养基A的TFB对照工艺高133%。大大超过IFB产量，使用Magni CHO™的UI-IPFB生产了31.9kg的DS，是TFB对照的6.3倍(表1和图8a)。 表1 不同工艺中的培养基成本比较 表1中的评估还表明，使用专利培养基Magni CHO™可显著节省培养基费用。首先，在TFB工艺中从培养基A转换为Magni CHO™不仅使滴度提高了28%，而且由于Magni CHO™单价额外降低了60%，最终每DS的培养基成本降至对照的53%。应用IFB工艺后，选择性能较差的培养基A在节省培养基成本方面仅带来了边际效益，特定培养基成本降至TFB的91%。换句话说，尽管IFB-1生产的滴度提高到了6.1g/L，但由于N-1灌注导致的培养基消耗大幅增加并未带来更具竞争力的培养基节省。相比之下，由于使用Magni CHO™培养基提高了生产率，IFB-2和UI-IPFB工艺的特定培养基成本均降低了70%。 在相同的TFB生产模式下，COG的降低很大程度上取决于培养基A和Magni CHO™之间的比较性能。假设在所研究的所有条件下下游加工收率相似，通过在TFB生产中简单地将培养基从商用培养基A替换为Magni CHO™，归一化COG可降至对照的76%(图8b)。此外，使用IFB工艺进行工艺强化也被证明是有效的，特别是在IFB-2工艺中使制造COG降低了46%，但在IFB-1工艺中仅降低了16%。这进一步强调了细胞培养基在最大化强化工艺策略对提高生产率和降低COG的潜力方面的重要作用。更重要的是，开发了一种超强化的UI-IPFB工艺，实现了滴度提高5.3倍和COG降低71%(图8b)。如图8b所示，通过我们逐步的工艺强化和优化策略，从TFB到更先进的IFB和UI-IPFB工艺的演变过程性能也转化为制造COG的显著节省。 为了对生产成本进行系统评估，将COG计算分为两个主要部分，以反映运营成本和材料与消耗品(M&C)费用的各自贡献(图8b)。在TFB对照工艺中，运营成本占总成本的很大一部分(73%)，M&C费用占其余的27%。这种分布突出了基线TFB工艺中与运营相关的公用事业和劳动力利用的重大贡献。然而，在TFB工艺中应用MagniCHO™后，观察到COG贡献发生了明显变化，大部分COG降低归因于运营相关的节省，从73%降至57%，主要是由于DS产量增加而运营复杂性变化不大。转向使用MagniCHO™培养基的IFB-2生产在运营和M&C要素方面均表现出更显著的COG降低，最终分别降至TFB对照的39%和15%。最终，UI-IPFB工艺在所研究的所有条件下展示了最显著的COG降低，运营成本降至18%，M&C降至对照的仅10%。详细的成本分布分析说明了逐步的工艺强化和优化如何能够实现越来越大的COG降低，主要是通过提高制造运营效率。 【NO.4】讨论 生产成本在决定患者可承受性方面起着关键作用，从而影响药物与其市场竞争对手相比的经济可行性。我们的COG分析指出运营成本和M&C费用是生物制药制造中的主要成本贡献因素。 一般来说，运营成本由与公用事业和劳动力相关的要素组成。本研究表明，在所有成本类别中，公用事业成本占比最大，先前的研究也证明了这一点。公用事业成本的突出地位尤为明显，部分原因是对专用和经过验证的设备、高档材料和先进设施有高标准的良好生产规范(GMP)要求。同时，公用事业费用还涉及大量的电力、水和天然气，特别是在那些为满足生产需求而全天候运行的设施中。细胞培养过程的强化被证明是降低每单位DS生产公用事业成本的关键，尽管可能不可避免地需要更复杂的设备，如ATF，以及可能更重的产品纯化负荷。然而，据报道，过程强化的进展导致了更高的上游产量、更短的生产时间或制造节奏。这些好处弥补了强化工艺中通常涉及的潜在更高的总体运营成本，从而提高了运营效率并降低了COG读数。 在本研究中，我们证明了过程强化在将相对运营成本从TFB的73%降至UI-IPFB条件下低至18%方面的有效性，尽管实施UI-IPFB过程可能涉及劳动力使用增加、设备和设施利用率提高，例如在N-1和生产阶段都使用ATF灌注设备、额外的培养基和缓冲液制备，以及为储存更高体积中间体和DS的储罐或袋子占用更大空间。此外，从TFB过程向更先进的细胞培养过程(如IFB和UI-IPFB)的转变通常也会导致总维护和消耗成本直接上升。这种增加可归因于采用灌注技术，这导致上游加工过程中培养基和ATF过滤器的使用增加。此外，上游生产力的提高需要更广泛的下游操作，进一步增加了成本。因此，在追求更高生产力与管理和减轻维护和消耗费用的必要性之间取得平衡可能是一个潜在的挑战。一种常见的对策是评估和采用更具成本效益的材料，包括替代培养基或消耗品，在这种情况下，用Magni-CHO™替代培养基A就是一个例子。因此，通过利用不同的成本效益材料——不仅是细胞培养基，还有低成本的过滤器、袋子、树脂或化学品——可以直接应对高维护和消耗成本的挑战。或者，许多技术创新，如酸化或絮凝强化收获、弱分配或过载模式的先进色谱精制、集成在线调节或稀释系统——据报道能够提高下游加工能力并减少维护和消耗使用。所有这些进展进一步符合提高生物制造运营的经济和环境可持续性这一更广泛的目标。 需要注意的是，根据我们的实际经验，使用不同生产工艺模式产生的总体上游培养基成本可能占总维护和消耗费用的20-60%。因此，培养基筛选和优化通常是工艺开发工作的一个组成部分。为了突出细胞培养基对整体制造经济性的重要性，在不同工艺场景之间进行了直接的培养基成本比较。在相同的TFB工艺模式下，用Magni CHO™替代可使培养基成本降低47%，这表明在细胞培养过程中应用优化的专有培养基相对于商业选择具有优势。当与强化工艺相结合时，培养基优化策略的效果更加显著。如在IFB和UI-IPFB条件下所示，使用Magni-CHO™将每单位DS的相对培养基成本降至原始TFB工艺成本的28-30%。 此外，我们的分析发现总培养基消耗与特定于DS的培养基成本之间存在间接关系。尽管连续培养，如浓缩补料分批培养(CFB)和强化灌注培养(IPC)，广为人知可支持细胞生物量积累增加和每日生产力提高，但我们的研究发现，连续方法并非生产这种分子的可行解决方案，CFB生产中低生产力和乳酸代谢调节不佳就证明了这一点(图S4)。事实上，在某些情况下，连续生产由于培养基使用量大、澄清率低和设施运行时间长，无法保证经济竞争力。UI-IPFB生产提供了一种替代强化策略，它规避了连续生产中的常见缺点，同时利用灌注培养的优势更好地维持细胞状态。在本研究中，尽管UI-IPFB工艺需要的培养基量最大，但鉴于其实现的更高滴度，其培养基成本效率优于所有其他条件。这表明，尽管工艺强化会引发更高的材料和消耗品费用预算，但在开发具有成本效益的制造工艺中，它被证明是一种高附加值的做法。 尽管UI-IPFB在实现高细胞密度和滴度方面具有优势，但开发可扩展的UI-IPFB工艺的挑战不应被低估。一方面，UI-IPFB的N-1步骤会产生高度浓缩的细胞密度，这可能在N-1阶段引发过多的pCO₂和泡沫积累。因此，可以设计一种增强的CO₂剥离策略并进行适当的泡沫控制。此外，根据相似的过滤通量和ATF与过滤的比例，选择合适数量和尺寸的ATF(例如，更大的XCellATF10系统)，以便在与小规模工艺相似的时间范围内实现相同的浓缩系数。根据我们的经验；由于N-1灌注阶段细胞活力高且细胞碎片最少，ATF中空纤维可以承受相对较高的通量比而不存在污染风险。此外，浓缩系数取决于生物反应器容器能够支持的最小工作体积。为此，市售一次性生物反应器已设计出高达20:1的调节比，以在大容器中实现低工作体积。另一方面，在UI-IPFB生产过程中维持高细胞密度培养是不可避免的，这导致对高氧传递速率(OTR)的要求。然而，据报道，在2000L SUB中，体积氧传质系数(kLa)可达40h⁻¹，使得超高细胞密度生产成为可能。此外，选择在生产中应用UI-IPFB的人可能会考虑修改生物反应器设备和设施布局，以便在N-1和生产阶段都纳入灌注功能，尽管其要求往往比完全连续灌注(如CFB或IPC)所需的要求简单得多。此外，需要对下游纯化的指征进行广泛评估，因为对产品质量的潜在不利影响可能需要特别关注，例如残留的HCP导致聚山梨酯降解和最终制剂中形成颗粒，以及由降解或聚集形成的与产品相关的杂质。因此，建议优化下游工艺以更好地适应强化生产。尽管存在挑战，但在药明生物的250L和2000L SUB中都已证明了UI-IPFB的放大，通过适当的下游纯化策略可生产出质量相当的产品。 同样值得注意的是，在强化工艺中不恰当地应用不太理想的培养基，可能会在试图提高工艺生产率和降低COG时适得其反，如本研究中在IFB-1和使用培养基A的UI-IPFB工艺中所观察到的那样。在使用培养基A的IFB-1条件下，滴度提高到6.1g/L，仅使COG降低了16%，甚至无法与使用Magni CHO™的TFB工艺中24%的COG降低相比较。同样，先前的一项研究发现，在保持相同原始补料分批培养基的情况下应用IFB生产，仅产生了相当的滴度，且COG降低有限，仅为7-9%。此外，在UI-IPFB工艺中使用培养基A直接导致整个生产期间乳酸消耗严重受抑制，因此最终仅检测到少量产物(数据未显示)。使用培养基A时观察到的乳酸峰值再次强调了培养基优化对于减轻此类代谢副产物积累的重要性，这种积累会对细胞活力和滴度产生不利影响。研究结果表明，尽管应用强化工艺(如UI-IPFB)已广泛用于提高滴度，但细胞培养基的优化对于实现持续良好的细胞生长和寿命、平衡和可控的细胞代谢以及因此改善产物合成以最大化工艺强化对制造效率的影响同样重要。 许多研究报告称，满足细胞系特定营养需求的定制培养基配方可带来更高的产量。具体而言，Magni CHO™的开发历程始于一系列DoE筛选研究。这种迭代的配方优化使得能够识别出对培养基性能有显著影响的关键因素，尤其是在强化工艺中。同时，废弃培养基分析可以提供关于如何在不同代谢阶段在细胞水平上实现相对营养平衡的进一步见解。基于该分析，仔细确定了氨基酸的浓度。同时，对各种因素进行了细致研究和调整，包括已知可抵消活性氧(ROS)损伤并支持基本细胞代谢的维生素、还原剂、金属和螯合剂、生长促进剂和核苷酸，以尽量减少后期不利的代谢结果。然后通过在不同培养模式下的严格测试对所得配方进行验证，以确保其能够满足细胞生长和生产力的期望性能。在本研究中，TFB工艺中从培养基A替换为Magni CHO™导致滴度从3.9g/L提高到5.0g/L。这种改进代表滴度提高了28%，COG降低了26%。同样，在IFB工艺的N-1灌注阶段，与培养基A相比，Magni CHO™能够以25%更少的培养基用量支持更高的最终活细胞密度(VCD)。此外，在实施Magni CHO™培养基后，IFB滴度从6.1g/L提高到9.1g/L。即使在UI-IPFB生产中以80×10⁶细胞/mL的超高接种量，Magni CHO™的竞争优势也变得更加显著，在本研究中实现了最高滴度24.5g/L，而在培养基A条件下产物检测可忽略不计。这一显著改进不仅通过补料分批或混合工艺提高了基于CHO的生物生产的滴度基准，还证实了工艺强化和培养基优化在催化向更具成本效益的生物制品制造范式转变中的重要作用。此外，逐步提高滴度和降低COG的工艺强化也与从临床到商业生产的药物开发轨迹一致。在早期阶段，更常见的TFB工艺可能足以证明临床安全性和有效性，而强化工艺可能会因额外的资源和设施投资而超出早期临床需求。但随着临床试验的推进，工艺强化可能会占据中心地位，因为工艺产量和经济性成为满足商业市场预测的核心。与此同时，了解不同工艺下的设施能力并选择最大化制造效率的最佳商业工艺需要逐案进行全面评估。 【NO.5】结论 采用细胞培养强化策略已被公认为是一种提高生产力同时降低生产成本的有效方法。该研究展示了一种经典且不断发展的过程强化和培养基优化实践，通过实施IFB和UI-IPFB过程策略以及优化的专有细胞培养基。该策略在16天的补料分批生产中将细胞培养滴度显著提高到24.5g/L，比原始TFB过程增加了6倍多。此外，采用UI-IPFB过程在2000L制造规模上使生产成本大幅降低了71%。将UI-IPFB策略与优化的培养基配方相结合，有可能推动传统生物制品补料分批生产，使其更具成本效益、可持续性和生产力。这种转变不仅通过提高效率和降低成本使生物制造行业受益，还通过使拯救生命的生物制品更易于全球患者获得，对全球医疗保健产生深远影响。 欢迎加入“艺药荟”知识星球，免费享有行业资源，联系星主享受9折优惠。 邀您加入“艺药荟社群”交流学习! 备注：姓名+单位+方向 版权说明：本文欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权或其他合作需求，请联系梓树ZiShu（微信：Z07302256）。 免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表“艺药荟”立场，亦不代表“艺药荟”支持或反对文中观点。本文不作为治疗方案推荐。如需治疗指导，请前往正规医院就诊。

近日，中国国家药品监督管理局（NMPA）受理了两款PD-L1与4-1BB双特异性抗体的临床试验申请，它们分别是基石药业的NM21-1480和普米斯生物的PM1003。这一进展标志着全球制药行业对4-1BB靶点的竞相布局已进入新阶段。除了这两款新药，辉瑞、BMS、华海、齐鲁等多家知名制药企业也已纷纷加入到4-1BB靶点的研发竞争中。同时，4-1BB靶点在CAR-T、CAR-NK等细胞疗法中的应用也日益广泛，为免疫治疗领域带来了新的希望与挑战。 ▲ 基础生物学特性 4-1BB（CD137）是激活型免疫检查点分子中的一员，隶属于肿瘤坏死因子受体家族（TNFR）。这种分子在抗原激活的T细胞上高表达，但在静止状态的T细胞上则不表达。不仅如此，4-1BB还在树突细胞（DC）、NK细胞等免疫细胞的表面有所呈现。 一旦4-1BB与其特异性配体4-1BBL结合，便会触发一系列的细胞内反应。这些反应包括激活NF-κB、JNK/SAPK、p38 MAPK等关键通路，从而产生共刺激信号，有效提升CD4+和CD8+T细胞的活性，并促进T细胞的增殖。同时，这种结合还会刺激巨噬细胞分泌出多种炎症细胞因子，例如IL-6和TNF-α，进一步强化抗肿瘤免疫反应。 ▲ 临床研究挑战 4-1BB，作为一种激动性受体，与PD-1等抑制性受体有所不同，它主要扮演着“踩油门”的角色，而非仅仅是“去刹车”。尽管PD-1和CTLA-4等靶点的研究如火如荼展开，4-1BB等激动剂抗体的临床进展却不尽如人意。 目前，全球已有数款4-1BB激动型抗体进入临床研究阶段。其中，Pfizer的utomilumab和BMS的urelumab的临床进展最为迅速。尽管这两款药物在早期的研发过程中遇到了不少困难，甚至一度陷入疗效平庸和肝毒性过大的困境，但近年来，随着联用方案的出现，它们似乎找到了翻盘的契机。 Urelumab，这款由BMS研发的全人源IgG4单克隆抗体，自2005年进入人体试验以来，就备受瞩目。然而，2008年因肝毒性导致两例受试者死亡，其试验被迫中止。研究人员在随后的试验中调整了药物剂量，但遗憾的是，剂量降低后药物的治疗效果并不显著。对于Urelumab单药治疗来说，如何在确保安全性的同时，实现肿瘤微环境中的适当药物暴露，成为了亟待解决的问题。 2016年，Urelumab的研究迎来了转机。在与O药的联用方案中，治疗PD-L1阳性黑色素瘤患者的ORR高达50%，而对于PD-L1阴性的患者，联用方案的ORR也达到了47%，显示出卓越的疗效。 ▲ 药物研发策略 尽管CD28、OX40等类似靶点面临挑战，但部分企业仍积极探索激动型抗体的开发策略。面对重重挑战，如何才能打破僵局，实现绝境翻盘呢？ ▲ 国内企业的布局 国内多家企业也在布局4-1BB单抗领域，如华海药业、天演药业等。其中，天演药业的ADG106是一款全人源阻断激动型抗CD137 IgG4单克隆抗体，其独特的作用机制使其在临床前研究中显示出较高的潜力。在2021年ASCO上公布的Ⅰ期爬坡试验数据中，ADG106未观察到剂量限制性毒性，且无3级及以上不良事件，显示出良好的安全性。 此外，PD-L1×4-1BB双抗作为一种新的治疗策略，通过同时激活T细胞并降低脱靶毒性，为肿瘤免疫治疗提供了新的可能。 ▲ 双特异性抗体的优势 基于双特异性抗体能够同时结合两种特异性抗原的优势，通过双抗分子对肿瘤细胞表面靶点如PD-L1、HER2与4-1BB的独特亲和力，企业期望双抗药物能优先结合肿瘤细胞，进而激活T细胞并降低脱靶毒性。 ▲ 具体药物研发实例 目前，Pieris Pharmaceuticals已着手研发4-1BB×HER2双抗，而天境生物则聚焦于4-1BB×Claudin18.2双抗。其中，PRS-343作为一款4-1BB×HER2双特异性抗体，通过精准锁定HER2阳性癌细胞，有望降低包括肝毒性在内的脱靶效应。在2019年SITC大会上，Pieris公布了其Ⅰ期临床数据，显示截至2019年10月23日，PRS-343治疗HER2阳性实体瘤患者的总缓解率（ORR）达到11.11%（2/18），疾病控制率（DCR）则高达100%。 此外，天境生物与ABL Bio公司联合研发的TJ-CD4B双抗药物，在临床前研究中展现出强大的抗肿瘤活性，且在外周组织中的毒性极低，显示出为更多患者带来治疗希望的潜力。