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点击蓝字关注我们 G蛋白偶联受体(GPCR)作为最大的膜蛋白家族，是细胞感知胞外信号并启动下游级联反应的关键门户，也是现代药物研发的核心靶点。然而，目前仍有约100种GPCR属于“孤儿受体”——其内源性配体未知，这限制对其生物学功能的深入探索和相关药物的开发。传统的GPCR去孤儿化方法存在诸多局限，比如基于文库的筛选难以高效识别内源性配体；生物提取物的生化分离方法需大量样品且易造成成分损失；虚拟筛选和生物信息学的预测仍需复杂的体内验证。总体而言，迫切需要一个有效和可推广的平台来实现GPCR去孤儿化。 2026年1月，中国联合研究团队在NATURE CHEMICAL BIOLOGY发表题为“Photo-cross-linking-assisted deorphanization deciphers GPR50–L-LEN pairing in metabolism”的研究。该研究建立了一种通用的光交联剂辅助的GPCR去孤儿化平台，并利用该平台成功鉴定孤儿受体GPR50的配体为神经肽LITTLE-LEN(L-LEN)，系统地研究了它们在蛋白质、细胞、组织和动物水平上的相互作用，揭示了一条新的代谢调控通路。 文章中的蛋白质组学数据分析使用PEAKS Online软件完成。 01 研究方法 作者先搭建并验证通用平台，锁定GPR50为目标受体。由于配体性质未知，故以蛋白质组学和交联肽组学的方法寻找内源配体，随后进行系统功能研究。蛋白质组学与交联肽组学的互补分析，极大地提升了从复杂样本中鉴定各类潜在配体的能力。其中，蛋白质组学针对具有胰酶切位点的长肽游离片段；交联肽组学直接鉴定短肽与GPR50形成的交联肽，通过质谱峰面积积分，定量候选肽在交联样本中的富集程度，为后续功能验证提供优先级依据。这些设计确保即使在复杂生物体系中也能完成GPCR去孤儿化。 02 平台建立 研究者将光敏氨基酸DiZPK(3-(3-methyl-3H-diazirine-3-yl)-propaminocarbonyl-Nε-l-lysine)通过基因工程手段定点引入GPCR的配体结合口袋附近。紫外照射后，DiZPK生成高活性卡宾中间体，与邻近配体形成共价键，从而稳定并捕获配体-受体复合物。以已知受体-配体对为模型，作者证明该交联系统能够在生理相关的条件下从内源样本中有效、特异性地捕获配体-受体复合物。此外，该技术适用于肽类、单胺类、脂质类及萜类(如阿片受体激动剂 salvinorin A)等多种配体，显示出良好的通用性。 图1 光交联辅助GPCR去孤儿化平台的研制与表征 03 内源配体的识别 利用上述平台，研究聚焦于代谢相关的孤儿受体GPR50。首先，作者借助AlphaFold预测GPR50结构，并在其潜在配体结合口袋附近设计多位点引入光交联探针DiZPK。随后，采用互补的蛋白质组学与交联肽组学策略分析交联复合物。通过对富集产物的筛选与比对，最终选择一个十氨基酸神经肽L-LEN为候选配体。 结合后续的功能实验，研究人员确认L-LEN能以纳摩尔级亲和力特异性激活GPR50，进一步使用可裂解交联剂进行的质谱分析则直接检测到二者的共价交联肽段，从物理相互作用层面验证了二者结合。结构-功能分析显示，L-LEN C末端暴露对其受体激活至关重要，而GPR50的胞外环及跨膜区特定残基构成主要结合界面。这些实验结果与AlphaFold的预测模型高度吻合，共同阐明了L-LEN与GPR50相互作用的分子基础。 图2 脑提取液中潜在GPR50配体的富集化和注释 图3 L-LEN作为GPR50内源性配体的鉴定 04 功能解析 在明确配对关系后，作者进一步解析L-LEN-GPR50信号轴的功能。在细胞层面，L-LEN抑制表达GPR50神经元的自发钙活动，该效应可被内向整流钾通道抑制剂阻断。组织层面，GPR50高表达于下丘脑背内侧部（DMH）的GABA能神经元和脑室周细胞，定量质谱测得该区域L-LEN的内源性浓度足以激活这些细胞的活性。体内功能实验证实，脑室注射L-LEN可选择性激活下丘脑中GPR50阳性细胞的早期基因表达，该效应在GPR50敲除小鼠中完全消失。脑片电生理记录证实，L-LEN能特异性抑制这些GPR50阳性神经元的电活动。这些从体外到体内、从分子到细胞的多层次证据共同表明，L-LEN作为GPR50的内源性配体，在生理环境下对该受体表达细胞起到抑制性调控作用。 图4 L-LEN和GPR50在调节细胞活动和动物生理中的体内协同作用 05 代谢调控机制 在生理与病理层面，禁食或瘦素缺乏状态下小鼠下丘脑L-LEN水平与能量代谢状态呈正相关。缺失L-LEN或GPR50均会导致下丘脑-垂体-甲状腺轴活性下降，并显著提高禁食诱导的低温蛰伏发生率。外源补充L-LEN可特异性逆转野生型小鼠的代谢抑制与体温下降，但对Gpr50敲除小鼠无效，证明L-LEN–GPR50信号轴是中枢调控能量消耗与体温适应的关键通路。机制上，该信号通过下丘脑-垂体-甲状腺轴调节激素分泌，并经由交感神经激活棕色脂肪产热，实现脑-外周协同调控。 图5 L-LEN-GPR50信号对能量消耗和体温的代谢状态调节 总结 此研究设计并验证了一个高效、通用的光交联剂辅助的GPCR去孤儿化平台，实现了在近生理环境下对GPCR的高效、特异性去孤儿化，并深入解析了GPR50–L-LEN信号轴在能量代谢平衡中的作用。该工作不仅拓展了哺乳动物代谢调控网络，其建立的光交联辅助平台也为系统性地攻克剩余孤儿GPCR提供了通用的研究范式，有望推动相关基础生物学发现及未来代谢性疾病治疗新靶点的开发。 参考文献 Wu R, Li N, Wen Z, et al. Photo-cross-linking-assisted deorphanization deciphers GPR50-L-LEN pairing in metabolism. Nat Chem Biol. Published online January 6, 2026. doi:10.1038/s41589-025-02098-6 若您想预先了解 PEAKS Online 的功能和应用，可点击文末“阅读原文”提交您的咨询信息，我们将为您提供详细的产品介绍。 产品推荐 PEAKS® Studio--兼容DDA和DIA，发现与靶向蛋白质组学质谱数据一站式软件平台 PEAKS® Online--基于服务器的高通量蛋白质质谱数据全流程自动化解决方案 PEAKS® AB--全球第一个抗体全自动化测序软件解决方案 PEAKS® GlycanFinder--结构分辨的糖蛋白组深度分析软件 ProteoformX™--通过Intact和Top-down Mass进行Proteoform表征分析软件 -扫码关注- www.bioinfor.com (EN)               www.deepproteomics.cn（CN） 作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformX™，DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。 联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com 欢迎戳“阅读原文”提交报名信息！！！

抗体-药物偶联物（ADC）是通过化学连接子将效应分子与单克隆抗体（mAbs）结合而形成的。对ADC的关键质量属性（CQA），如药物抗体比（DAR）、药物负荷分布和药物结合位点进行全面评估对药物开发至关重要。其中，药物结合位点由于影响ADC的稳定性和药代动力学受到广泛关注，然而，由于技术挑战，很少有研究关注这一领域的方法开发。2023年2月，来自中国科学院上海药物所的团队在Analytica Chimica Acta（IF=6.911）发表了题为“Conjugation site characterization of antibody–drug conjugates using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD)”的文章。EThcD碎裂模式（将电子转移裂解（ETD）和高能碰撞解离（HCD）相结合）产生的碎片离子比传统的HCD碎片更多，这有助于识别和定位翻译后修饰。在EThcD碎裂模式下，作者使用分析软件表征ADC药物的结合位点，包括随机偶联和位点特异性偶联，此研究可能有助于各种临床前和临床ADC的质量控制。ADC药物结合位点分析难点：1、效应分子通常具有高度疏水性，导致效应分子偶联的肽段在液相色谱分离过程中洗脱时间更晚。2、与其他类型的PTM相比，效应分子相对较大且结构复杂（约1000-2000 Da）。3、效应分子容易受到碰撞诱导的碎片化的影响，会显著削弱偶联肽段的电离效率。这对质谱分析结果的重现性造成影响。肽图分析方法优化：采用T-DM1样品作为ADC模型，包含92个潜在的结合位点，包括88个赖氨酸残基和4个N-末端氨基。由于结合位点多，小分子偶联的随机性强，增加了分析难度。作者优化了关键的LC–MS/MS参数以满足分析需求，包括液相色谱梯度、动态排除、AGC和IT。1、在调整液相色谱梯度时，作者考虑了总的二级肽段谱图数（PSMs）和效应分子偶联PSMs之间的平衡。对比了两种不同梯度条件下的DM1偶联肽段的PSMs的数量，发现梯度2条件下的效应分子偶联PSMs被更有效地分离（图1B）。这样可以减少共溶并改善了偶联肽段的质谱检测质量。2、设置动态排除过滤已经碎片化的母体离子，提高低丰度偶联肽段的检测。因此，在HCD条件的基础上，AGC和IT增加20%时，偶联肽段MS/MS谱图的比例有所增加（图1C）。图1 | 肽图分析工作流程和分析T-DM1的LC–MS/MS参数优化。通过EThcD表征ADC随机偶联位点使用EThcd碎裂方式分析T-DM1偶联位点，在62个软件鉴定的结合位点中，58个（16个在轻链，42个在重链）具有DM1相关的特征离子。在手动检查MS/MS谱图的过程中，发现一些有趣的肽段。如图2A中，由于MS/MS谱图中缺乏DM1特征离子，该肽段的验证受到影响；图2B中，肽段“SCDK（DM1）THTCPCPPELLGGPSVFLFPPKPK”具有特征离子和3个可能偶联DM1的赖氨酸位点，但是MS/MS谱图中没有赖氨酸位点完全断开的片段离子，就无法确认K4处的DM1偶联；图2C中，肽段“FTISATSK（DM1）NTAYLQMN”没有观察到特征离子，但是K9偶联位点的片段离子有助于正确识别位点。如图2D所示，EThcD可以准确定位K4偶联的DM1效应分子，而HCD不能准确定位。图2 | 利用片段离子验证可靠的ADC偶联位点尽管PTM搜索可能存在很高的错误发现率，这项研究首次报道了使用偶联位点的片段离子来评估软件搜索结果。HCD和EThcD分别鉴定了近56个和46个可靠的结合位点（图3A），不过经过手动检查特征离子和片段离子后，EThcD鉴定到的MS/MS图谱的可信度高于HCD。T-DM1的赖氨酸残基的DM1修饰可能由于空间或静电阻碍影响了蛋白酶的水解。因此，胰蛋白酶的酶解肽段具有更多的不完全酶解和更长的肽段，这适合于使用ETD裂解。总体而言，EThcD可能更适合ADC结合位点的表征。另外还发现，在EThcD下，所有手动验证的偶联位点的MS/MS图谱得分略低于HCD数据（图3D）。理论上，偶联肽段对EThcD表现出更好的裂解。一种可能的解释是，尽管已经调整了一些软件工具来处理ETD数据，但EThcD数据分析中存在一些不足。首先，b/y和c/z离子序列在合并后具有更高的指定错误率；其次，ETD产生的非c/z碎片离子数量越高（例如带电的还原母离子和无法解释的峰），错误分配的几率就越大。因此开发用于优化现有程序的新算法可以最大限度地发挥EThcD碎片化的优势。图3 | 用于T-DM1偶联位点表征的EThcD和HCD的比较通过EThcD表征ADC特异性偶联位点ADC-134-4是K251位点偶联的ADC药物，携带MMAE作为效应分子。其特征碎片离子为m/z 718.5，HCD碎裂倾向于裂解MMAE分子产生m/z 506.36的碎片离子。尽管图4A中的MS/MS光谱观察到与MMAE相关的特征离子506.36，但HCD碎裂在可能的偶联位点K249和K251附近不存在片段离子，而EThcD 碎裂下MS/MS图谱中的片段离子有很好的碎裂，有助于验证偶联位点（图4B）。同样，应用HCD和EThcD表征ADC-10-2药物偶联位点，结果发现，与HCD相比，EThcD可以更准确地识别K252为主要结合位点（图4C和图4D）。图4 | EThcD碎裂精确定位位点特异性ADC的正确偶联位点结论ADC偶联位点的表征是一个复杂但有前途的研究领域。作者结合PEAKS AB分析软件，评估了EThcD表征ADC偶联位点的可能性。EThcD碎裂产生了更多的主链断裂，提高了修饰位点定位的精确度。与HCD相比，EThcD在随机偶联和特异性偶联位点的鉴定中均观察到更高比例的可信MS/MS图谱。总体来说，将胰蛋白酶消化、60分钟液相色谱分离、EThcD碎裂和PEAKS AB软件搜索相结合来进行ADC药物偶联位点的表征，是ADC药物质量控制的一种很有潜力的方法。（CN）作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：，，, ，及抗体综合表征服务等。联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com其他平台：，，公众号与知乎同名

------------------------------------ 在蛋白质组学研究中，准确鉴定蛋白质的序列和结构至关重要。从头测序与数据库搜索分析是两种常用的蛋白质鉴定方法，它们在原理、流程、优势和局限性等方面存在差异，各自适用于不同的研究场景。 从头测序 从头测序是一种不依赖于参考序列数据库的蛋白质/多肽测序方法，其主要基于质谱技术。在质谱分析中，肽段母离子在碰撞诱导解离（CID）等碎裂方式下，产生一系列具有特定质量差的碎片离子，这些质量差对应着不同氨基酸的质量（关于碎片离子类型的介绍，可参考本篇推送（）。通过精确测量碎片离子的质荷比（m/z），并根据氨基酸的质量特征，逐步确定肽段的氨基酸序列（图1）。例如，当检测到两个碎片离子的质荷比相差129.04 Da 时，可能表示这两个离子之间相差一个谷氨酸（E）。 图1 从头测序原理示意 优势 1.适用于未知蛋白质鉴定 对于新的蛋白质、物种特异性蛋白质或变异蛋白质，由于数据库中没有相关参考序列，从头测序能够发挥独特作用，直接获取其氨基酸序列信息。 2.发现新的蛋白质特征 可以识别蛋白质中的未知翻译后修饰位点、氨基酸突变以及新的肽段序列，有助于揭示蛋白质的功能多样性和生物过程的复杂性。 局限性 1.准确性挑战 质谱数据的复杂性和噪声干扰，均会影响从头测序的准确性，尤其是在长肽段和复杂蛋白质的测序中，因此对算法要求较高。 2.计算资源需求大 从头测序需要对大量的质谱数据进行复杂的计算和分析，以推断可能的氨基酸序列组合，这对计算资源和时间要求较高。 部分应用场景 新物种蛋白质组研究 在探索新发现的物种或未被充分研究的生物类群时，从头测序是必不可少的工具。例如，对于一些深海微生物、极地特殊生物等，由于缺乏已知的蛋白质序列数据库，从头测序可以帮助研究人员鉴定这些生物所特有的蛋白质，了解它们适应特殊环境的分子机制。通过对这些新物种蛋白质组的分析，有可能发现具有特殊功能的酶、蛋白质转运体等，为生物技术和药物研发提供新的靶点和资源。 癌症蛋白质组学研究 癌症细胞中存在大量的蛋白质变异，包括基因突变导致的氨基酸序列改变以及各种翻译后修饰。从头测序可以帮助研究人员发现这些新的变异蛋白质，研究它们在癌症发生发展过程中的作用。例如，通过对肿瘤组织和正常组织的蛋白质组进行从头测序对比分析，可能发现一些肿瘤特异性的蛋白质标记物，用于癌症的早期诊断和预后评估。同时，对癌症相关蛋白质的翻译后修饰进行鉴定，有助于深入了解癌症细胞的信号传导通路和调控机制，为开发针对性的治疗药物提供理论基础。 生物进化研究 从头测序可以用于比较不同物种之间的蛋白质序列差异，研究生物进化的历程。通过对亲缘关系较近或较远的物种进行蛋白质组从头测序，可以分析蛋白质序列的保守性和变异情况，推断物种之间的进化关系。例如，比较不同哺乳动物的蛋白质序列，可以了解它们在进化过程中为了适应不同的生存环境而发生的蛋白质变化，揭示生物进化的分子基础。 数据库搜索分析 数据库搜索是将实验测得的质谱数据与已知的蛋白质序列数据库进行比对（图2）。首先，将质谱数据中的肽段质量信息（母离子和碎片离子）提取出来，然后在数据库中搜索与之匹配的理论肽段。数据库中的蛋白质序列经过虚拟酶切，生成一系列理论肽段，并计算其理论质谱数据。然后通过比较与实际质谱谱图中的肽段母离子和碎片离子信息的匹配程度，如质量偏差、碎片离子匹配数量等，来确定最可能的序列。 图2 数据库搜索基本原理示意(Picture Ref.: Jimmy K. Eng,et.al.,2011,MCP) 优势 1.准确性和效率高 在数据库覆盖度足够的情况下，能够快速准确地鉴定出已知蛋白质，匹配成功率高，大大节省了分析时间。 2.数据解读相对简单 基于已有的序列信息，结果的解读和验证相对容易，因为可以参考数据库中已有的蛋白质注释信息。 局限性 1.依赖数据库完整性 如果数据库中没有包含目标蛋白质的序列，或者序列信息存在错误、缺失，将无法准确鉴定蛋白质，对于新物种或新发现的蛋白质可能存在局限性。 2.难以检测新的变异和修饰 对于超出数据库中已知范围的蛋白质变异和翻译后修饰，可能会被忽略或错误鉴定。 部分应用场景 常规蛋白质组学分析 在对常见物种（如人类、小鼠、大肠杆菌等）的蛋白质组研究中，数据库搜索分析是最常用的方法。由于这些物种的蛋白质序列数据库相对完善，使用数据库搜索分析可以快速鉴定出大量的蛋白质，并且能够准确地对蛋白质进行注释，了解它们的功能和参与的生物过程。例如，在研究细胞的生理状态变化时，通过对不同处理组的细胞蛋白质组进行数据库搜索分析，可以快速发现蛋白质表达水平的差异，筛选出与特定生理过程或疾病相关的关键蛋白质。 药物研发与质量控制 在药物研发过程中，数据库搜索分析可用于鉴定药物的作用靶点和药物代谢产物。通过对药物作用后的细胞或组织蛋白质组进行分析，可以确定药物与哪些蛋白质相互作用，从而深入了解药物的作用机制。同时，在药物质量控制方面，数据库搜索分析可以用于鉴定药物中的杂质蛋白质，确保药物的纯度和安全性。例如，在生物制药中，通过对重组蛋白药物的生产过程进行监控，利用数据库搜索分析鉴定可能存在的宿主细胞杂质蛋白，保证药物的质量符合标准。 生物标志物筛选 在临床研究中，数据库搜索分析可用于筛选疾病相关的生物标志物。通过对患者和健康对照的生物样本（如血液、尿液等）进行蛋白质组分析，利用数据库搜索分析鉴定出差异表达的蛋白质，这些蛋白质有可能成为潜在的生物标志物。例如，在心血管疾病的研究中，通过对患者和健康人的血浆蛋白质组进行数据库搜索分析，发现了一些与心血管疾病发生发展相关的蛋白质标志物，为疾病的早期诊断和治疗提供了新的依据。 综合对比与方法选择 从头测序和数据库搜索分析各有优劣，在实际研究中，往往根据具体情况选择合适的方法或结合使用。对于已知物种且数据库丰富的研究对象，数据库搜索分析通常是首选方法，能够高效准确地鉴定大量蛋白质。而在探索新物种、研究蛋白质的新变异或修饰时，从头测序则提供了重要的手段。 近年来，随着技术的发展，将从头测序与数据库搜索分析相结合的策略逐渐受到关注。先利用从头测序获取部分肽段序列信息，再将这些信息与数据库搜索相结合，可以提高蛋白质鉴定的准确性和覆盖度，拓展了蛋白质组学研究的深度和广度。 (EN) （CN） 作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：，，, ， 及抗体综合表征服务等。 联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com