The United States Pharmacopeia

“好好陪孩子吧，这病没药，活不过3岁。”医生宣判，昆明电器商人徐伟的儿子得了罕见Menkes病。所有人都以为命运已定，这个只有高中学历的父亲，却在自家杂物间里，用瓶瓶罐罐和医学论文，硬生生给儿子“炼”出了一条生路。更让人震惊的是，他先扎自己、再扎妻子，确认安全后才颤抖着将针扎进儿子皮肤。如今，孩子奇迹般活到了近6岁。 绝境求生：当医生判了“死刑”，父亲怎么办？ 那是一个寻常的六月天，昆明阳光明媚，徐伟却如坠冰窟。他抱着仅仅六个月大的儿子小灏洋，听医生宣判了冰冷的词语：Menkes综合征。这是一种基因缺陷导致身体无法吸收铜的罕见病，全球范围内十有八九活不过3岁，没有药物，甚至没有希望。医生除了摇头，只有一句“回去好好陪孩子”的劝慰。 徐伟挣扎着加入了几个病友群，每天看到的却是接连不断的噩耗。今天这家孩子走了，明天那家也没了。有个母亲发布的视频里，孩子手里被放了一块糖，说是这辈子太苦，下辈子能甜一点。徐伟看得手直抖，握不住手机。但他抬头，看到儿子冲他笑，那双弯弯的眼睛，让他做出了一个旁人无法理解的决定：买不到的药，就自己做。 杂物间里的“炼金术”：高中学历挑战医学巅峰 徐伟家的杂物间，原是堆放破自行车、旧纸箱和落灰家电的地方，很快被清空了。取而代之的是堆积如山的烧杯试管、瓶瓶罐罐、一台二手冰箱，以及一本本被翻得卷边的医学书。他高中毕业后就没碰过英语，却硬是啃下了上世纪60年代几百篇医学论文，抄满了十几个笔记本，每个单词都靠字典查阅。那些论文中被故意隐去的关键步骤，他反复推演，拿兔子做实验，兔子死了，再推，再试。 为了购买实验所需的原料，他一天打几十个电话，无数次被当成骗子挂断。为了给自制药物做检测，他每月飞一趟上海的共享实验室，很快花光了家里所有积蓄。2021年7月，当所有准备就绪，他将第一针扎向自己胳膊时，闭着眼等待着未知的结局。三天后确认无碍，又给妻子打了一针。直到确认安全，他才颤抖着手，将那凝聚着全部希望的针头，扎进了儿子皮肤。一周后的检查结果显示，儿子的铜指标开始恢复正常。 “爱，是绝境中唯一的解药，也是突破所有不可能的燃料。” 奇迹照进现实？当年的“土法”竟与世界新药不谋而合 儿子病情稳定后，徐伟并未止步。他又开始研究更深层的基因编辑技术，希望彻底根除儿子的病根。他写下的那些关于基因突变、Prime editor工具的专业文字，让人难以相信这是一个高中学历的父亲所为。 然而，就在几千公里之外的美国，2026年1月12日，美国药监局（FDA）批准了一款名为Zycubo的新药，专门用于治疗Menkes综合征。这款药的主要成分，正是组氨酸铜，它成了全世界第一款官方批准的Menkes病药物。 临床数据显示，出生4周内使用Zycubo的患儿，死亡风险能降低78%。近一半早治疗的孩子活过了6岁，有的甚至活过12岁，而未经治疗的孩子，无一能活过6岁。尽管其生产过程曾因合规问题被FDA搁置，但最终还是获批上市。这不禁让人唏嘘：如果这款药在2020年就能面世，徐伟还需要在杂物间里，冒着巨大风险，用“土法”自制救命药吗？ “当个体拼尽全力点亮微光，世界的‘光明’却总姗姗来迟。” 记者后来探访了徐伟家中的杂物间，那里至今堆满了数百本医学书、厚厚的笔记和各种试剂。这个逼仄的空间，见证了一个父亲最深沉的绝望，也铭刻了最坚韧的骨气。面对网上关于FDA新药的评论和询问，徐伟选择沉默。他儿子现在已近6岁，健康地活着，这便是最好的回答。而未来，美国这款高价新药能否进入中国，医保能否覆盖，普通家庭能否承担，都还是未知数。 这个父亲的伟大，在于他用最原始的求生本能，对抗了医学的空白和制度的滞后。这既是父爱奇迹，也暴露了罕见病药物研发的困境。面对孩子生命垂危，医生又无能为力，你敢不敢像徐伟一样，自己走上这条九死一生的路？ 大家怎么看？欢迎评论区聊聊。 信息来源 央视新闻：昆明一位父亲为救患罕见病儿子自制药 新京报：昆明男子为患罕见病儿子自制药 已获初步成功 FDA官网：FDA approves first drug for Menkes disease 声明：本文整理自公开信息，仅供讨论参考；具体以权威发布为准。

摘要 配体结合试验（LBA）和流式细胞术作为临床样本分析核心技术，在生物标志物检测、免疫表型分析等领域作用关键。本文系统梳理2024—2025年两者最新进展，对比应用特点，阐述实验设计、验证标准等技术细节，分析肿瘤、免疫疾病等领域应用案例，并提供商业化产品选择指南。研究表明，LBA在超高灵敏度检测（如SimoA技术实现飞摩尔级检测）、流式细胞术在高通量多参数检测（实时通量超每秒100万个细胞）领域各有突破；LBA擅长可溶性生物标志物定量，流式细胞术优势在单细胞免疫表型分析；监管机构对两者验证要求日趋严格，临床应用价值显著；商业化产品需结合需求与预算选择。本文为临床研究人员提供全面技术参考（图一）。 一、引言 在精准医疗体系中，临床样本分析技术直接影响疾病诊断准确性、治疗方案个体化及疗效监测实时性。配体结合试验（LBA）与流式细胞术作为临床研究支持核心技术，在非临床与临床评价体系中占据重要地位。 LBA基于抗原－抗体特异性结合原理，检测生物样本中目标分子浓度，用于药物动力学、药效学及免疫原性评估，是大分子生物药生物分析的首选平台。流式细胞术通过单细胞多参数高通量分析，检测细胞物理特性与荧光标记参数，在免疫表型分析、细胞分选等方面优势独特，已发展为可检测数十种参数的复杂分析平台。 近年来，人工智能、微流控等技术与两者融合，推动其在检测灵敏度、通量等方面显著突破。同时，肿瘤免疫治疗等临床需求拓展了应用范围，完善了技术标准。但临床研究人员面临技术选择、结果可靠性保障、监管合规等挑战。因此，系统梳理技术进展、对比应用特点、规范操作流程，对推动临床研究高质量发展意义重大。本文旨在为专业人员提供全面技术参考，助力技术选择与科学应用。二、LBA和流式细胞术的最新技术进展2.1 LBA技术的突破性进展 2024—2025年，LBA技术核心突破集中于超高灵敏度、多重检测及自动化领域。单分子阵列（SimoA）技术作为数字ELISA代表，实现单分子水平检测，检测限达飞摩尔（fM）级，较传统ELISA灵敏1000倍以上，变异系数低于10%，动态范围超过4个数量级。该技术在阿尔茨海默病诊断中，血液Aβ42/Aβ40比值预测灵敏度92%、特异性87%；前列腺癌术后PSA检测灵敏度低至0.008 pg/mL，可提前预警复发。 电化学发光（ECL）技术创新显著，新型ECLIPSE技术通过独立腔室设计分离生物分析与ECL产生过程，提升检测稳定性；准固态ECL免疫传感器采用凝胶铸型纤维素膜平台，降低成本同时提高灵敏度。多重检测方面，SimoA通过磁珠染料编码实现10重检测，每小时处理575个结果；邻近延伸试验（PEA）结合抗体-寡核苷酸与实时PCR，实现96重检测，单块检测板可测92种蛋白质。自动化与智能化水平同步提升，全流程自动化平台减少人工误差，AI技术优化信号处理与结果判读。2.2 流式细胞术的革命性创新 流式细胞术迎来技术融合爆发期，实时成像与光谱分析技术突破显著。BD FACSDiscover™ A8集成SpectralFX™与CellView™图像技术，成为首个实时成像光谱细胞分析仪。SpectralFX™技术支持50种以上荧光试剂面板分析，通过完整荧光光谱识别实现高分辨率检测；CellView™技术实现单细胞高速荧光与无标记成像，获取细胞形态、抗原共定位等新参数。 高通量技术持续升级，2024年流式细胞术临床应用拓展至心血管、神经系统等领域，最新成像流式细胞仪实时通量超每秒100万个细胞，空间分辨率达780纳米。AI技术深度应用，聚类知情降采样技术可在保留低比例MRD群体的同时茎尖细胞数，DeepFlow™软件实现全自动化分析，将单病历分析时间缩短至5分钟内，与手动分析相关性r>0.9。光谱流式技术方面，Beckman Coulter CytoFLEX Mosaic模块提升弱荧光检测灵敏度，可检测80纳米颗粒，模块化设计增强设备灵活性。2.3 技术融合与平台整合 技术融合成为核心发展趋势，LBA-LC-MS/MS混合技术结合免疫捕获与LC-MS/MS检测，通过抗独特型抗体、酶消化等组合，同步分析ADC药物的抗体、连接子及药物载荷，解决传统LBA基质干扰、LC-MS大分子检测局限等问题，已成功应用于ADC生物分析。 微流控与流式细胞术融合形成微流式细胞术，结合微制造技术与传统流式设计，降低样本试剂消耗，提升分析精度与速度。AI与机器学习广泛应用于数据分析，流式细胞术领域的SOM算法、随机森林分类器提升淋巴瘤诊断效率；LBA领域AI技术优化信号处理与结果预测，提高检测可靠性（图二）。 2.4 技术发展趋势展望 未来，两者将向超高灵敏度（LBA有望实现阿摩尔级检测）、高多重检测（流式细胞术向100色以上突破，LBA超越96重）、深度智能化自动化（全流程无人值守）、即时检测（POCT设备小型化便携化）及多组学整合（与基因组学等数据融合）方向发展，为精准医疗提供更全面支撑。三、LBA与流式细胞术的应用对比分析3.1 生物标志物检测能力对比 LBA在可溶性生物标志物定量检测中优势显著，适用于PK、PD及免疫原性评估，SimoA等技术的超高灵敏度可检测低丰度标志物，覆盖细胞因子、肿瘤标志物等类型。流式细胞术擅长单细胞水平多参数分析，通过荧光标记同步检测细胞表面与细胞内标志物，反映细胞异质性与功能状态。 多重检测方面，LBA的PEA技术实现96重蛋白质定量，流式细胞术光谱技术支持50种以上参数检测，但前者聚焦群体水平可溶性标志物，后者针对单细胞多参数分析，信息维度存在本质差异。通量方面，SimoA每小时处理575个10重检测结果，自动化ELISA平台实现高通量批量检测；流式细胞术速度取决于细胞数量与参数复杂度，高速设备每秒可检测数万个细胞。3.2 免疫表型分析应用对比 流式细胞术是免疫表型分析核心技术，在血液系统疾病诊断中，通过解析癌细胞“分子指纹”区分白血病谱系与亚型，检测灵敏度达10^-4到10^-5，可发现微量残留病变。在自身免疫性疾病中，可分析免疫细胞活化状态、检测自身抗体，辅助诊断并监测疾病活动度。 LBA在免疫表型分析中应用有限，主要检测血清中细胞因子、免疫球蛋白等可溶性免疫分子，反映机体免疫激活状态，但无法提供细胞水平信息及亚群贡献差异。两者在自身免疫病诊断中形成互补，LBA定量检测自身抗体滴度、补体水平，为治疗评估提供补充信息。3.3 检测性能指标对比 灵敏度上，LBA的SimoA技术达fM级，流式细胞术可检测细胞表面数千至数十万个抗原分子。特异性方面，LBA依赖双抗体夹心的表位识别，流式细胞术依托抗体特异性与多参数综合判断。动态范围上，LBA为3—6个数量级，流式细胞术受荧光检测器限制为3—4个数量级，可通过染料优化扩展。 样本需求方面，LBA需5-100微升样本，流式细胞术需10^5到10^6个细胞对应的数十至数百微升样本。检测速度上，流式细胞术单细胞分析更快，LBA自动化平台擅长批量样本处理。成本方面，流式细胞仪初始投资更高，LBA运行成本集中于试剂，需结合应用场景评估成本效益。3.4 技术局限性分析 LBA局限性包括：高度依赖抗体质量，易受基质干扰与药物干扰，多重检测增加交叉反应风险，难以检测细胞内标志物。流式细胞术局限性：依赖细胞活性与样本质量，多参数补偿复杂，绝对定量能力弱于LBA，设备操作维护需专业培训。 实际应用中，可通过严格抗体验证、标准化样本处理、优化检测程序等措施改善LBA可靠性；通过改进样本制备、采用先进补偿算法、建立标准化分析流程提升流式细胞术准确性，或联合两种技术互补短板。四、技术操作规范与质量控制体系4.1 实验设计的关键要素 LBA实验设计核心要素：选择经验证的高质量抗体，建立覆盖LLOQ至ULOQ的6-8点校准曲线，设置低中高3个水平质控品，制定标准化样本处理流程（控制冻融次数、保存条件），合理设计检测批次并包含校准品与质控品。 流式细胞术实验设计要点：根据目的设计抗体组合并优化浓度，准备单染色对照设置荧光补偿，设置同型、阳性、阴性等对照类型，确定10^4到10^6个细胞的样本量，制定标准化样本处理流程，检测前完成仪器校准与质量检查。 通用原则包括：制定全流程SOP文件，采用盲法设计减少人为干扰，关键指标设置2—3次重复，建立完善数据记录系统，明确异常值判断与处理标准。4.2 方法验证标准与要求 LBA验证遵循ICH M10指导原则，核心指标包括：特异性（通过交叉反应、基质干扰研究验证）、准确性（80%—120%范围内）、精密度（批内CV<15%，关键浓度<20%）、LLOQ（准确度80%—120%，CV<20%）、ULOQ（准确度80%—120%）、线性范围（r²>0.98）动态范围（覆盖预期样本浓度）及稳健性（耐受实验条件微小变化）。 流式细胞术验证参考美国药学会白皮书与CLSI H62指南，包括准确性（参考样本验证）、精密度（批内/批间变异）、检测能力（最低细胞/抗原检测水平）、选择性（细胞亚群区分能力）、参考范围建立及样本试剂稳定性评估。特殊验证要素包括抗体特异性、补偿设置、门控策略及仪器校准验证。4.3 质量控制体系建设 LBA质量控制涵盖：设备定期校准、维护与性能验证，环境条件控制；试剂验收、规范储存、批次验证与标准品管理；每批次检测包含校准曲线与质控品，设置平行样，建立异常结果处理与数据审核机制。 流式细胞术质量控制包括：每日用标准荧光微球质控，定期全面校准仪器，维护液流系统与激光器；检测过程使用质控品，设置完整对照，验证补偿与门控策略；规范数据分析软件设置，建立数据审核、报告规范与记录保存系统。 持续改进机制需包含内部审核、外部比对（室间质评）、偏差处理流程、CAPA系统及人员定期培训考核。4.4 数据分析与结果解释 LBA数据分析：采用四参数或五参数逻辑回归拟合校准曲线，通过相关系数与残差评估拟合质量；内插法计算样本浓度并校正稀释因子，验证浓度在定量范围内；分析质控品结果，绘制趋势图监测系统漂移，失控时及时排查纠正。 流式细胞术数据分析：转换数据格式并清洗干扰数据，应用补偿矩阵校正，标准化不同批次数据；基于细胞物理与荧光特性制定设门策略，识别定量细胞亚群并验证门控合理性；计算细胞亚群数量/比例，分析抗原表达水平与细胞功能，应用统计方法比较组间差异。 结果解释需结合临床背景与参考范围，区分生物学异常与检测误差；药物临床试验中考虑药物对标志物的影响，系列检测关注时间趋势。报告需采用标准化格式，包含检测方法、分析范围、质控结果等信息，必要时提供临床解释，确保数据可追溯。五、临床应用案例分析5.1 肿瘤领域的创新应用 免疫检查点抑制剂疗效预测中，流式细胞术与多重免疫荧光联合检测显示，尿路上皮癌患者瘤内CD3+LAG-3+细胞频率与nivolumab治疗应答显著相关（p=0.0001），LAG-3+细胞聚集体可作为疗效预测标志物。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）分析中，流式细胞术检测的TIL特征与多种癌症预后相关，联合TMB可构建免疫治疗应答预测评分系统。 ADC药物药代动力学监测中，LBA-LC-MS/MS混合技术实现抗体、连接子与药物载荷的同步定量，解决传统方法局限。CAR-T细胞治疗监测中，流式细胞术追踪CAR-T细胞数量、表型与功能，评估治疗效果并预测不良反应。5.2 免疫疾病诊断与监测 原发性免疫缺陷病诊断中，AI辅助流式细胞术工作流程（3管10色检测板、21种抗体）实现全自动化分析，单病历分析时间<5分钟，与金标准淋巴细胞亚群分析相关性r>0.9。自身免疫病中，LBA检测ANA、抗双链DNA抗体等自身抗体辅助诊断，流式细胞术分析Treg、Th17等亚群数量功能，揭示发病机制。 LBA检测IL-6、TNF-α等细胞因子评估炎症程度，监测治疗效果；检测补体C3、C4水平辅助判断系统性红斑狼疮等疾病活动性与预后。5.3 传染病诊断与防控 COVID-19防控中，LBA的侧流免疫分析（LFA）技术快速检测SARS-CoV-2特异性IgG/IgM抗体，适用于全血、血浆样本即时检测。HIV感染管理中，流式细胞术检测CD4+ T细胞计数是评估免疫功能的金标准，结合病毒载量检测指导抗病毒治疗。 利比里亚HIV感染者隐球菌病筛查中，LFA序贯检测CD4+ T细胞计数（≤200 cells/μl）与隐球菌抗原，40.2%受试者CD4+ T细胞计数达标，其中40.7%隐球菌抗原阳性，实现精准诊断。疫苗效果评估中，LBA检测特异性抗体水平评估免疫原性，流式细胞术分析免疫细胞功能评估保护效果。5.4 其他疾病领域的应用 神经系统疾病中，SimoA技术检测血液Aβ42/Aβ40比值、P-tau181，阿尔茨海默病预测准确性媲美脑脊液检测。心血管疾病中，流式细胞术检测心肌损伤标志物微粒评估病情进展。间质性肺病诊断中，流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液白细胞亚群，判断炎症类型与活动性。 过敏性疾病中，流式细胞术检测嗜碱性粒细胞、Th2细胞因子评估过敏程度，监测脱敏治疗中Treg变化。糖尿病等代谢性疾病中，LBA检测胰岛素、炎症因子，流式细胞术分析免疫细胞功能异常，揭示疾病与免疫系统关联。罕见病诊断中，两者检测特定蛋白质缺陷或免疫异常，提供关键诊断依据。六、商业化产品选择指南6.1 流式细胞仪产品对比分析 BD Biosciences产品线：临床型FACSCalibur（双激光器、4荧光参数）、FACSCanto II（三激光器、6-8荧光参数）适用于常规免疫分型；科研型LSRFortessa™（5激光器、18+荧光参数）、FACSymphony（5激光器、30检测通道）支持复杂多参数分析；分选型FACSAria Ⅲ（纯度>99%）、FACSDiscover™ S8（光谱+成像技术）代表行业前沿。 Beckman Coulter产品线：CytoFLEX S（4激光器、12荧光通道）、CytoFLEX LX（6激发波长）性价比突出；AQUIOS CL专为临床批量检测设计；CytoFLEX Mosaic模块化光谱模块可升级检测能力，检测80纳米颗粒。 Cytek Biosciences产品线：AURORA（40+荧光参数）、Northern Lights（紧凑型）依托全光谱技术简化多色实验，适合复杂分析。索尼SH800基于微流控技术保护细胞活性，适用于干细胞研究；iCELLigence集成实时细胞分析技术。6.2 LBA检测平台产品对比 SimoA平台（Quanterix HD-X）：fM级灵敏度，CV<10%，10重检测通量575结果/小时，适合低丰度标志物检测。MSD平台（MESO QuickPlex SQ 120）：电化学发光技术，6数量级动态范围，10重检测，抗基质干扰素力强。 Luminex 200：微球阵列技术支持80重检测，适合大规模筛选，灵敏度相对较低。ELLA自动化免疫分析系统：全流程自动化，96孔板通量，适用于中小型实验室。LUMIPULSE G1200（Fujirebio）：全自动化学发光，适合临床大批量检测，精密度优异。6.3 产品选择决策框架 需求分析：细胞分析选分析型仪器（如BD FACSCalibur、Beckman CytoFLEX S）；细胞分选需分选型仪器（如BD FACSAria），成本为分析型2-5倍。微量样本选低流速/微量上样模块（如Cytek Northern Lights）；高通量样本需自动进样器。 技术参数：流式细胞仪入门级1-2激光器（3-5色），科研级3-5激光器（6-15色）；检测速度常规1万—5万Events/s，高速>10万Events/s；分选纯度需>99%。LBA平台根据标志物浓度选择灵敏度，按检测目标数量选单重/多重平台，结合样本量选通量。 预算规划：含设备采购、运行（试剂/耗材）、维护、培训成本，预留设备总价10%—20%为年度运维预算。品牌服务评估：优先选择装机培训完善、48小时内维修响应、免费软件更新、支持LIMS兼容的品牌。 合规性要求：临床检测需NMPA/FDA认证机型（如BD FACSCanto II）；感染性样本分选需封闭系统；软件需符合GLP/GMP的电子数据记录与审计追踪功能。6.4 采购实施建议 需求评估阶段：组建跨部门团队，制定需求清单，调研厂商资料，安排技术交流。产品评估阶段：现场演示测试实际样本，评估核心性能，进行成本效益分析，考察售后服务。 决策阶段：综合评分筛选产品，预留升级空间，谈判价格与服务条款，签订详细合同。实施阶段：优化实验室环境，完成安装调试，开展操作培训，建立SOP与质控体系，完成设备与方法验证。 长期管理：建立设备档案，制定预防性维护计划，完善质控体系，持续人员培训，定期评估使用效率并优化流程。七、结论 本研究系统分析LBA与流式细胞术的技术进展、应用特点、操作规范、临床应用及产品选择，得出核心结论：2024—2025年两者技术突破显著，LBA聚焦超高灵敏度与多重检测，流式细胞术侧重多参数与实时成像；两者应用互补，LBA擅长可溶性标志物定量，流式细胞术优势在单细胞免疫表型分析；方法验证与质控体系日趋完善，监管要求严格；在肿瘤、免疫疾病等领域临床价值突出；商业化产品各有特色，需结合需求选择。 未来，两者将向更高灵敏度、多重性、智能化方向发展，POCT设备与多模态融合成为趋势。实际应用中，需结合具体需求选择技术平台，建立完善质控体系，确保结果可靠，为临床决策提供科学依据。本研究为专业人员提供全面技术参考，助力技术规范化应用与高质量发展。

宿主细胞蛋白 (HCP) 是工艺相关的杂质，可能与治疗性蛋白共纯化。某些 HCP 杂质可能对患者安全（免疫原性或毒性）、疗效和/或产品质量产生影响。因此，通过严格控制的生产工艺降低 HCP 杂质的含量，并利用合适的分析方法监测其水平至关重要。生物制药公司目前普遍采用质谱法来鉴定工艺中间体以及原料药中可能存在的 HCP，并利用这些数据来持续改进工艺，降低患者的潜在风险。一些公司从非临床开发阶段就开始进行 HCP 鉴定，而另一些公司则在后期阶段或作为针对已鉴定 HCP ELISA 相关问题、工艺和产品质量或安全问题的根本原因分析的一部分来进行 HCP 鉴定。无论采用何种方法，都需要针对已鉴定的 HCP 建立全面的风险评估框架，以支持开发过程中的决策，监管机构也期望通过此类框架来确保药物产品的安全性和有效性。本文中，BioPhorum的HCP工作组汇集了一批行业专家，在现有风险评估框架的基础上，针对识别出的HCP制定了临床安全风险评估建议。这些建议融合了监管考量和行业经验，并通过一个真实案例研究来阐释更新后的框架的应用。主要建议包括：在识别和量化HCP后，开展临床风险评估以及产品质量风险评估；重点关注所有相关HCP的生物活性和免疫原性；以及加强跨职能部门的沟通与协作，以实现全面的风险评估。 简介 宿主细胞蛋白（HCP）是生物治疗药物生产过程中产生的一类重要的工艺相关杂质。生物制药中的总残留HCP水平被认为是一项关键质量属性（CQA），通常在药物放行过程中控制在规格限度内，以确保产品的安全性和有效性，并能稳定生产。 药物产品中残留宿主细胞蛋白（HCP）清除不彻底的主要临床风险包括免疫原性（即患者对异源HCP产生不良免疫反应，或因佐剂效应导致抗药抗体（ADA）生成增加，进而影响药物的药代动力学（PK）和疗效和生物活性（即可能导致不良反应的活性）。除临床风险外，残留HCP还可能影响产品和制剂在储存和转移过程中的稳定性，如果其他关键质量属性（CQA）（例如聚集体、碎片或可见颗粒）未得到有效控制，则可能导致产品质量问题和潜在的安全隐患。因此，HCP 控制和风险评估在整个生物制药行业至关重要；然而，由于宿主蛋白质组中存在大量 HCP，且 HCP 在免疫原性、生物活性和生化特性方面具有异质性，这些都可能影响与生物治疗产品的共纯化，因此这些任务可能极具挑战性。 自2014年5月成立以来，BPDG HCP工作组一直积极应对HCP管控和风险评估方面的挑战，汇聚该领域的行业领袖和专家，分享理念、回顾案例研究，并探讨有效策略和最佳实践。BPDG HCP工作组由来自39家领先生物制药和生物技术公司的155名成员组成，旨在通过基准调查和差距分析，促进业界在HCP管控策略的最佳实践和监管要求方面达成共识。 BPDG HCP 工作组已取得多项重要成果，包括对 HCP 控制策略的综合行业审查（BioPhorum_Development_Group  2016）、对 HCP 风险管理和控制的综合生物技术行业审查（BioPhorum_Development_Group  2017）以及对工艺开发风险进行分类/评分并促进 HCP 管理决策的详细策略，以补充现有风险评估框架，该框架主要关注个体 HCP 对患者安全的影响。 利用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 技术进行正交 HCP 表征，可以将 HCP ELISA 测得的 ng/mg (ppm) 值转化为已鉴定 HCP 及其各自含量的列表。随着 LC-MS/MS 在 HCP 鉴定中的应用日益广泛，以及人们对 HCP 对产品质量、安全性和有效性潜在影响的理解不断加深，BPDG 的一个小组于 2018 年成立，旨在通过查阅期刊文章和开展基准调查来拓展该领域的知识。通过文献回顾和小组成员的集体经验，该小组根据 HCP 对患者（HCP 可能导致患者发生不良事件的风险）、工艺（工艺无法有效清除 HCP 的风险）或产品质量（HCP 可能影响产品和/或制剂的风险）的影响，对潜在的问题 HCP 进行了分类。随后，Jones等人发表了一篇关于潜在“高风险”宿主细胞蛋白（HCP）的多公司合作研究报告 。该报告中包含的“高风险”HCP名单也可在BioPhorum网站上查阅。这些讨论主要集中在使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产，并经Protein A亲和层析柱纯化以及其他精制步骤的生物制药产品上。 然而，有必要将常见的、可能“高风险”的宿主细胞蛋白（HCP）名单扩展到其他宿主细胞种类。例如，这包括近期从新冠病毒活病毒疫苗研发中获得的经验，即源自T-Rex-293细胞的高水平人类热休克蛋白（HSP）与疫苗诱导血栓形成的可能性之间可能存在关联。因此，HCP风险评估不应局限于已被认为可能“高风险”的CHO细胞HCP名单。正如Jones等人所用，“高风险”旨在强调需要关注特定的HCP；由于“高风险”一词可能引起恐慌，因此为了更广泛地使用，也可以将其称为“观察名单”。随着对 HCP 及其影响因素的内部（公司特定）和外部（公开）知识的不断增加，“观察名单”将不断增长。 生物制药行业普遍认为，宿主细胞蛋白（HCP）的潜在安全风险是生物治疗药物面临的一大挑战。然而，目前宿主细胞蛋白相关信息的生成和管理策略，以及风险评估和补救措施的具体方法，仍然主要依赖于各公司及其过往的独特经验，已发表的宿主细胞蛋白风险评估和管理案例数量相对较少。例如，目前对于触发评估的宿主细胞蛋白级别、是否应进行宿主细胞蛋白概况分析及相关风险评估，以及如果进行评估，应在哪个阶段开展这些活动，均未达成共识。此外，如果宿主细胞蛋白未能得到充分清除或控制，则需要采取不同的补救策略。 BPDG临床风险评估小组成立于2020年，专注于宿主细胞蛋白（HCP）对患者安全的影响。该小组对BPDG成员公司进行了基准调查并讨论了调查结果，回顾了先前报告的构成患者安全风险的问题HCP，并评估了现有的临床风险评估框架。基于这些活动的经验，该小组致力于推进更新的风险评估框架，该框架建立在de Zafra等人提出的风险评估框架之上。 本文旨在回顾当前针对HCP（宿主细胞蛋白）临床安全风险评估的最佳实践框架，并为开发一种通用方法提供指导，以便在药物活性成分中识别出单个残留HCP后评估其临床安全风险。讨论将重点关注可能通过免疫原性或生物活性影响患者安全的HCP。需要注意的是，全面的HCP风险评估还应考虑可能通过降解药物活性成分和/或辅料（例如PS20）而影响产品质量的HCP，但此类风险评估不在本文讨论范围之内。本文将以CHO细胞表达的生物制品为例，阐述如何根据临床适应症评估临床安全风险，并描述遵循ICH Q9原则（ICH  2021）进行定期风险审查的最佳实践。虽然本文重点关注重组蛋白中残留HCP的临床安全风险评估，但所讨论的一般原则也适用于CHO以外的表达系统或其他类型的生物制品，例如重组肽、疫苗以及细胞和基因治疗产品。 监管方面的考虑 作为一类可能影响生物治疗药物安全性、有效性和质量的主要工艺相关杂质，应通过严格控制的生产工艺最大限度地减少最终产品中的残留宿主细胞蛋白 (HCP)。需要一种经过验证且灵敏度高的检测方法，能够检测多种蛋白质杂质，以测量整个生产过程中 HCP 杂质的清除情况 (ICH  1999；USP)。美国食品药品监督管理局 (FDA) 要求“尽可能使回收和纯化过程中引入的污染物低于使用高灵敏度分析方法可检测的水平”(FDA  1997 )。欧洲药品管理局 (EMA) 指出：“总之，对于 HCP，无论产品和生产系统如何，都必须对残留 HCP 进行常规检测。因此，目前要求在下游纯化步骤或纯化原料层面，使用合适的分析方法对 HCP 进行常规监测。批次间的结果应保持一致，并符合规格限度”(EMA  1997 )。 来自不同地区和发展中市场的监管机构可能对HCP控制有独特的规定。然而，人们普遍认为，需要一种灵敏的方法来检测生物制品中多种HCP，这符合ICH（ICH  1999 ,  2023）制定的方法要求指南，并在《欧洲药典》2.6.34 (2017)（Ph.Eur  2017）中进行了讨论。 业界致力于持续改进工艺相关杂质（包括宿主细胞蛋白，HCP）的控制。酶联免疫吸附试验（ELISA）是监测从细胞收获到原料药生产过程中各阶段HCP含量和清除率的传统工具。合适的HCP ELISA应满足以下条件：“抗HCP抗体必须能够识别各种电荷和分子大小的HCP ”（欧洲药典 2017），并具有足够的灵敏度来评估工艺清除HCP的性能。ELISA的适用性通常通过比较空载细胞（模拟）材料的HCP群体与预期生产工艺的HCP群体来评估，以证明空载生产产生的HCP包含预期生产工艺中大部分代表性HCP种类。该评估通常包括二维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D SDS-PAGE）和蛋白质印迹分析或正交方法。 虽然酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种灵敏、快速且有效的工具，可用于了解宿主细胞蛋白（HCP）的总水平，并且仍然是HCP监测的金标准方法，但它也存在一些重要的局限性。事实上，任何HCP ELISA只能检测到在用于抗HCP抗体生产的动物体内引发免疫原性反应的HCP；在这种情况下，HCP ELISA被定义为一种多分析物（总）检测。HCP ELISA仅提供HCP总水平的相对信息，而无法指出单个蛋白质的种类和相对含量。全球卫生机构认识到，建立一个利用多种检测方法的综合控制系统至关重要，尤其是在HCP检测方面（EMA  1997；Ph.Eur  2017；USP  2016）。 “生物制药生产商需要一个综合控制系统，以确保产品的整体纯度和生产一致性。通常，产品纯度是通过多种方法的组合来验证的，宿主细胞蛋白（HCP）的纯度检测尤其如此”（美国药典）。具体而言，多分析物HCP ELISA通常用作产品放行检测，但其他方法也有助于全面了解HCP和产品纯度；一些常用方法包括一维和二维SDS-PAGE（结合Western Blot）、CE-SDS和LC-MS/MS，以及根据需要进行的单分析物HCP ELISA。LC-MS/MS的优势在于，它可以用于鉴定单个HCP，并提供生产过程中每个阶段这些单个HCP杂质的相对丰度，从而指导工艺开发。具体而言，LC-MS/MS 可以识别与药物活性成分中的治疗产品结合并与其共纯化的蛋白质，从而有助于风险评估和后续实施工艺改进，以去除这些 HCP，并最大限度地降低对患者安全和产品质量的风险。 正如Champion等人所述，2005年之前FDA审查的大多数生物治疗药物中，基于ELISA的宿主细胞蛋白（HCP）含量为1–100 ng/mg（ppm）；然而，这些作者也承认，HCP ELISA检测出的含量取决于所有免疫反应性HCP的总和，该值可能代表一种、几种或多种不同蛋白质的信号。此外，ELISA数据取决于抗体来源，这限制了不同ELISA结果之间的可比性。由于这些方法学上的限制以及该关键检测方法在行业内缺乏统一性，监管机构尚未设定正式的HCP限量标准。然而，目前已知的大多数获批产品的HCP含量都较低，通常低于100 ng/mg（ppm）。作者认为，虽然该目标值并非基于科学依据，但通常被接受为一条实用的经验法则，历史上曾用于在项目早期阶段对生产能力进行基准测试。随着生产和临床经验的积累，任何特定产品的 HCP 规格都应根据工艺能力和临床经验进行重新评估和设定（USP，  2016）。事实上，HCP 水平低于 100 ng/mg (ppm) 可能对患者构成安全风险，具体取决于药物中存在的 HCP 类型及其临床应用背景（例如，目标人群、疾病适应症、免疫状态、给药方案、给药途径等）；反之，HCP 水平高于 100 ng/mg (ppm) 也可能出于同样的原因而安全。液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 能够识别 HCP，代表着一项技术进步，它极大地改进了风险评估方法，从而有助于评估与产品相关的安全风险。了解宿主细胞蛋白 (HCP) 的身份有助于指导工艺开发（例如，工艺步骤选择、定义操作范围）、生产（例如，偏差管理）或工艺生命周期管理（例如，获批后的工艺变更）中的关键决策。因此，可以通过精心设计工艺，持续交付高质量产品。 在过去的二十年中，质谱（MS）领域发展迅猛，分辨率、灵敏度、速度和动态范围均取得了显著提升。尽管仪器成本高昂，但它已成为识别和定量宿主细胞蛋白（HCP）的重要工具，检测限可低至ng/mg（ppm）级别。随着质谱技术的广泛应用，美国药典（USP）于2020年召集专家组起草了新的子章节<1132.1>，题为“利用质谱法测定生物制药中的残留宿主细胞蛋白”，该章节是对之前专门针对HCP测定的<1132>章节（USP  2025）的补充。虽然新的USP章节概述了质谱方法在HCP识别和定量方面的能力，并给出了实施的技术建议，但并未就何时以及如何使用质谱进行HCP临床风险评估提供指导。为了有效利用临床开发过程中可用的质谱数据，建议在临床开发的每个阶段都采用系统化的风险评估方法。 支持临床风险评估的信息/数据 在生物制药行业，对于是否以及何时在项目生命周期中采用质谱分析进行宿主细胞蛋白（HCP）鉴定，各公司采取的策略不尽相同。BioPhorum 于 2023 年对 HCP 工作组成员进行了一项调查，共收到 23 家公司的回复。调查发现，各公司采取的方法各不相同：仅有 1% 的公司在新药临床试验申请（IND）前常规进行 HCP 鉴定，30% 的公司仅出于根本原因分析的目的而使用质谱进行 HCP 鉴定，18% 的公司在 IND 后常规使用质谱进行 HCP 鉴定，而 48% 的公司则将质谱鉴定作为常规分析和根本原因分析的结合（图 1）。对于受访公司而言，启动根本原因分析调查的原因多种多样，例如 HCP 水平过高、工艺一致性不足、产品稳定性问题、稀释非线性问题，或上述所有原因的组合（图 1）。 图 1质谱 (MS) 分析可用于鉴定单个宿主细胞蛋白 (HCP) 物种，并可贯穿整个项目生命周期，从早期开发阶段（启动临床前研究之前）到商业化阶段。此外，也可根据需要进行 MS 分析，以支持根本原因分析。BioPhorum 于 2023 年对 HCP 工作组成员进行的一项调查发现，各公司采取的方法各不相同。 根据项目所处的阶段，不同类型的数据/信息可以纳入已识别的HCP的风险评估中。在研发初期，风险评估可能主要基于理论，包括HCP的识别以及对HCP与人类同源蛋白的生物学特性和同源性的了解，并可能使用计算机模拟工具以及HCP的内部和外部先验知识（源自CHO细胞系和其他细胞系）。随着研发的推进，基于产品特定数据（例如非临床和临床安全性以及抗药抗体（ADA）谱）的项目特定风险理解可以纳入风险评估。如图 2所示，与风险评估相关的数据通常会随着时间的推移而积累，并可以支持不断完善的风险评估。重要的是，随着研发的进行和生产流程进入商业化阶段，可能接触HCP的患者数量会急剧增加，因此，低频事件也可能被检测到。下文将进一步讨论可以纳入风险评估框架的数据类型。 图 2 根据数据的可用性，不同类型的数据可以在项目生命周期的不同阶段纳入风险评估。随着新数据的出现或数据的成熟，风险评估可以不断更新。随着产品特定信息的积累，对风险的理解也会不断加深。 先验知识 根据已发表的信息和当前的行业知识，HCP（宿主细胞蛋白）可根据其潜在影响分为四大类中的一类或多类：产品质量、制剂、在人体内的直接生物学功能以及免疫原性。现有信息可能足以指导HCP风险评估的决策。 通过文献检索可以获得有关宿主细胞蛋白 (HCP) 的信息。可能已有关于该蛋白的基础生物学、药理学和/或毒性的数据，并且可能找到描述在其他生物治疗产品中使用相同或类似 HCP 的既往经验的文献。可以解答的问题包括：该蛋白的细胞定位和组织表达、不同物种间基础生物学的可比性和/或差异性、相互作用的后果（即药理作用或对 HCP 和/或人源同源物产生抗 HCP 抗体的担忧），以及对产品质量的潜在影响（例如，降解风险）。此外，还可以根据 BioPhorum 小组之前的评估，确定 HCP 是否属于潜在的“高风险”蛋白。这些信息可以综合起来，用于指导人们了解该蛋白质及其在候选治疗药物中存在的潜在人类安全风险。 也可以通过评估公司内部数据来了解HCP。如果该HCP此前已在其他产品中出现，则可以收集并利用有关其浓度水平、工艺开发决策、对人体安全的风险和影响以及/或监管反馈的信息，以了解当前项目中出现类似风险的可能性。 许多宿主细胞蛋白（HCP）已被证实可能直接影响产品质量和制剂，例如能够降解药物/辅料的酶，或可能导致药物聚集的蛋白质。在这种情况下，其他用于监测产品质量和关键质量属性（CQA）的产品放行方法应能检测到这些变化，以确保在产品放行至临床之前解决潜在的HCP问题。如果观察到药物或辅料的降解或聚集，则应评估是否存在HCP导致此效应的可能性。除了定量检测方法外，还可以使用高灵敏度的酶活性检测方法来监测HCP的丰度（例如，脂肪酶和组织蛋白酶），作为控制策略的一部分。如前所述，HCP 的这些方面不是本文的重点，也不会进一步详细讨论。 正如 de Zafra 等人所述，可能在人体内具有直接生物学功能或具有诱导免疫原性的宿主细胞蛋白 (HCP) 难以通过非临床手段进行检测和监测。如果宿主细胞蛋白与人源蛋白高度同源，则该 HCP 可能具有生物活性，并且其给药可能破坏体内平衡。例如，细胞因子是一类参与细胞间信号传导以调节细胞活性和功能的蛋白质，它们可能在人体内具有生物学功能，尤其是在与人源蛋白同源性较高的情况下。细胞因子与其受体结合可诱导细胞活化、增殖、分化和/或细胞死亡信号，并常常导致可能对患者有害的级联反应。因此，应特别关注属于该蛋白家族的 HCP。 在人类中，两种被广泛引用的、具有已知生物学功能的CHO细胞来源的宿主细胞蛋白（HCP）是转化生长因子-β1（TGF-β1）和单核细胞趋化蛋白1/趋化因子（CC基序）配体2（MCP-1/CCL2）。Beatson等人首次证实CHO细胞可以分泌细胞因子，并与生物治疗药物共纯化。他们鉴定了TGF-β1，并证实了即使在pg/mL浓度下，TGF-β1在临床产品中也存在风险。尽管CHO细胞分泌的TGF-β1处于潜伏状态，但在经热处理激活后，它在人细胞中具有功能活性，并能诱导人CD4+ T细胞产生类似调节性T细胞的表型。MCP-1，又称CC基序趋化因子配体2 (CCL2)，可诱导嗜碱性粒细胞释放组胺，并在阿巴西普（Orencia）的IIa期临床试验中被发现，其浓度约为500 ng/mg时会导致严重不良事件。在全血体外试验中，检测到了释放的组胺，并将其与药物产品中MCP-1的存在联系起来。 大多数蛋白质疗法是在非人宿主细胞中生产的；因此，残留宿主细胞蛋白（HCP）存在的主要问题之一是，其中一种或多种HCP可能引发免疫反应。影响免疫反应发生的因素包括：蛋白质的一级序列和/或翻译后修饰与其人类对应物不同。没有人类对应物的宿主细胞蛋白也可能被视为外来物，从而触发免疫反应。这种反应的严重程度不一，从产生针对HCP的抗体而无不良反应，到更严重的反应，包括超敏反应和自身蛋白耐受性的丧失。 此外，对宿主细胞蛋白（HCP）免疫原性的担忧之一是，可能产生与内源性人类同源蛋白发生交叉反应并使其失活的抗HCP抗体；如果该人类蛋白执行重要的生物学功能和/或生物学冗余度较低，则可能导致严重的临床后果，尽管迄今为止，尚未有数据证实存在这种风险。理论上，即使HCP不具有免疫原性，它也可能作为佐剂诱导和/或增强抗药抗体（ADA）反应。在生长激素（Omnitrope）的临床开发过程中观察到了这种现象的一个例子；观察到ADA发生率异常高，使用工艺特异性检测方法进行的HCP检测显示HCP水平很高（约1400 ppm [ng/mg]），这表明HCP可能以佐剂的方式提高了ADA发生率。 在玻璃体内注射生物制剂雷珠单抗（Lucentis）的非临床开发过程中，也观察到了这种现象，即眼部炎症。为了确定宿主细胞蛋白（HCP）的免疫原性影响，研究人员进行了体外和体内试验。体外试验表明，当细胞受到雷珠单抗和不同浓度HCP的刺激时，会分泌炎症细胞因子（IL-1β、IL-8和MIP-1β）并上调细胞表面标志物（CD80和CD54）。在兔体内研究中，研究人员观察到单核细胞浸润出现在眼部不同部位，并且在接受HCP联合雷珠单抗治疗的动物的玻璃体液中检测到了抗药抗体（ADA），而在单独接受HCP或雷珠单抗治疗的动物中则未检测到。这些结果表明，HCP发挥了佐剂的作用，促进了眼部炎症和ADA的形成。 在单克隆抗体lebrikizumab的后期临床试验中，高水平的磷脂酶B样蛋白2 (PLBL2) (242–328 ng/mg) 被证实是宿主细胞蛋白(HCP)免疫原性的一个典型例子。约76%–90%接受lebrikizumab治疗的患者意外产生了抗PLBL2抗体。研究表明，这种反应与剂量呈正相关，当PLBL2水平降低至0.2–0.4 ng/mg时，抗HCP抗体的发生率有所下降，但并未完全消除。抗HCP抗体的存在并未导致任何不良事件的发生，包括注射部位反应、超敏反应或免疫学效应。与临床观察结果一致，回顾性计算机模拟评估表明PLBL2具有较高的免疫原性。同样，在一项CHO细胞生产的因子IX蛋白（trenonacog alfa）的临床试验中，29%的受试者检测到了抗HCP抗体，ELISA检测显示CHO细胞中HCP含量约为58,500 ng/mg；未报告与抗HCP抗体产生相关的不良事件，也未观察到抗HCP抗体的存在与抗药抗体（ADA）产生之间的关联。重要的是，临床数据证实，HCP 的存在不会影响 lebrikizumab 或 trenonacog alfa 的疗效。 其他在计算机模拟评估中具有高免疫原性评分的HCP包括CXC基序趋化因子3、核糖体蛋白L30（大肠杆菌）、蛋白S100-A6和谷胱甘肽-S-转移酶P1（小鼠）。尽管在已发表的案例中，HCP的存在以及在某些情况下抗HCP抗体的产生可能并未导致观察到不良临床反应，但它们可能带来的风险提示需要进行积极主动的评估；当可用数据有限时，可以利用这种评估在项目生命周期的早期阶段启动风险评估。 原文：L.Coye, M.A.Jones, G.Gaza-Bulseco, et al., Host Cell Protein Clinical Safety Risk Assessment—An Updated Industry Review. Biotechnology and Bioengineering,2025.