Yaohai Biological Pharmaceutical Co., Ltd.

从6000万美元的首轮融资到如今9000万美元的C轮融资，Attovia Therapeutics（以下简称Attovia）一直在打破自己的融资上限。作为一家临床阶段的生物治疗公司，Attovia专注于搭建免疫介导疾病和肿瘤学领域的生物治疗管线。在C轮融资中，Deep Track Capital、Vida Ventures、Sanofi Ventures等一众明星机构纷纷入局，押注Attovia的未来发展。目前，Attovia已经完成了3轮融资，累计融资2.55亿美元。更值得关注的是，短短两年时间，Attovia便实现了从获得技术授权到推进多个项目进入临床阶段的跨越。这样的发展速度，在竞争激烈的医药研发领域并不多见。这家年轻的Biotech公司究竟凭借什么，一次次吸引资本的目光？01再鼎医药团队领衔，通过授权获得纳米抗体平台1989年，比利时科学家在骆驼的血液中发现一种特殊的单域抗体片段，它由天然缺失轻链的重链抗体（HcAb）衍生而来，仅含重链抗体的可变区（VHH），分子质量约15kDa，仅为传统抗体的1/10，是目前已知可结合抗原的最小单位，因而被命名为纳米抗体。其三维结构紧凑，CDR3区域长且柔韧，可深入抗原裂隙，实现高亲和力与特异性结合。随着生物技术的发展，纳米抗体的优势愈发凸显，成为医药研发热点。它体积小，在动物体内和组织中穿透力强，甚至能穿透血脑屏障抵达肿瘤内部；抗原结合能力广泛，便于通过基因改造针对不同病原；仅含一个结构域，稳定性更高，在体内留存时间长，对温度、pH等环境变化适应性强，药效持久。因此，作为更具优势的新型抗体药物形式，纳米抗体的潜力备受关注。目前，纳米抗体行业的研发与商业化整体处于早期状态。自2018年全球首个纳米抗体Caplacizumab在欧盟获批上市，纳米抗体正在探索应用于治疗从病毒感染到癌症等多种疾病，为创新药研发企业的发展布局不断蓄能。在此契机下，Alamar Biosciences和Frazier Life Sciences联合成立Attovia，通过全球独家授权的方式获得了纳米抗体ATTOBODY技术平台的知识产权。Attovia正基于该平台专注开发免疫介导疾病与肿瘤的管线。Attovia管理团队与中国药企颇有渊源，实力雄厚。首席执行官傅涛、首席科学官Petter Veiby、早期发现和转化医学部门副总裁David Bellovin均来自创新型生物制药公司再鼎医药。团队长期深耕生物研发领域，曾深度参与再鼎医药关于肿瘤、自免及神经系统疾病等多个领域创新药物的全球研发与商业化进程，具备丰富的行业经验与专业技术积累。自2023年成立，Attovia就锚定免疫介导疾病和肿瘤领域，首轮6000万美元融资用于ATTOBODY平台技术优化与早期项目规划。2024年，1.05亿美元B轮融资推动重点管线ATTO-1310和ATTO-002进入临床筹备阶段，同时公司扩充研发团队。2025年，9000万美元C轮融资助力下，ATTO-1310进入临床Ⅰ期，ATTO-3712也计划于下半年启动Ⅰ期临床研究。02双表位结合模式赋能，专有纳米抗体的五大优势Attovia的核心技术是ATTOBODY平台，利用纳米抗体相对分子质量小、稳定性高、组织穿透性好、易于基因工程改造等特性，将两个针对同一抗原不同表位的纳米抗体进行连接，形成双表位的结构。其设计是通过专有空间定位技术连接两个结合臂，形成独特的分子结构。这种技术的核心目标是通过优化两个结合臂的空间排列，使其以最佳构象与抗原、受体等目标分子结合，从而增强药物的靶向性和生物活性。具体来看，ATTOBODY的结合臂采用VHH结构域，通过专有连接技术将两个VHH纳米抗体按特定方向排列，实现对目标分子上两个不同表位的同时结合，形成双表位结合模式。这一设计使其可针对难成药靶点，具有可调节的半衰期：ATTOBODY技术概述   来自：Attovia官网超高亲和力：传统抗体往往是单表位结合，亲和力相对较弱。ATTOBODY利用双表位结合模式，产生picomole（pmol）级别的亲和力，极大地增强了与靶点结合的紧密程度，且解离速率慢，能长时间与靶点结合，增强药物疗效。精准特异性：通过与目标分子上的两个表位相互作用，能精准识别目标，可区分传统方法难以区分的相似分子，如G蛋白偶联受体、离子通道或肿瘤特异性变体等，减少对非目标组织的影响，提高治疗的精准性和安全性。高效内化：相较于传统抗体或纳米抗体，其双表位结合模式可促进目标分子更高效地被细胞内化，使它成为抗体偶联药物（ADC）或放射核素偶联药物（RDC）的理想递送选择，能更有效地将治疗物质递送至细胞内部，发挥更强的治疗作用。快速组织渗透：分子体积小，单个纳米抗体约15kDa，双表位纳米抗体约30kDa，比传统抗体（150kDa）更小，可快速穿透组织，在疾病部位迅速发挥作用，实现更快、更深入的治疗效果，尤其适用于治疗一些需要药物快速到达病变部位的疾病，如炎症性皮肤病等。模块化结构：ATTOBODY具有模块化结构优势，可通过灵活组合不同模块构建多特异性生物制品。例如，通过多种形式组合，该结构能够实现对多个不同靶点或同一靶点不同区域的同时靶向，达成更精准、高效的治疗效果。此外，通过与不同半衰期延长片段融合，可将药物的给药间隔延长至两到三个月，显著减少患者给药次数，提高用药依从性。基于此，ATTOBODY平台通过双表位结合模式，显著加速药物开发过程，不仅能提供丰富多样的候选药物，扩大可靶向的疾病范围，还能降低研发风险，助力推出具有领先潜力的治疗药物。03双核心管线即将进入临床阶段，瞄准“明星靶点”IL-31目前，依托ATTOBODY技术平台，Attovia已成功开发5条管线，部分项目已进入临床阶段。其中，IL-31是公司研发的核心靶点。Attovia围绕该靶点布局了ATTO-1310和ATTO-3712两条重点管线，这两款产品均有望成为治疗各种免疫介导疾病的潜在BIC（best-in-class）药物。其主打在研产品ATTO-1310为一款长半衰期抗IL-31单抗，主要用于治疗慢性瘙痒。在慢性瘙痒患者体内，IL-31往往处于异常高表达状态，持续刺激神经末梢产生瘙痒感。该药物的作用机制正在于精准靶向IL-31细胞因子，通过与IL-31特异性结合，阻断IL-31与其受体的相互作用，进而抑制下游瘙痒相关信号通路的激活。目前Attovia已宣布首位患者在ATTO-1310治疗慢性瘙痒的人体首次临床Ⅰ期试验中完成给药。另一款在研产品ATTO-3712是长半衰期IL-13/IL-31双抗，它同时作用于IL-13和IL-31两个关键细胞因子。在特应性皮炎和慢性自发性荨麻疹等疾病中，IL-13和IL-31都参与了炎症反应和免疫失衡的过程。IL-13可促进炎症细胞浸润、诱导上皮细胞产生炎症介质，IL-31则与瘙痒症状密切相关。ATTO-3712通过同时阻断这两个细胞因子的信号传导，更全面地调节免疫反应，减轻炎症、缓解瘙痒症状。目前该药物处于IND申请阶段，计划于2025年下半年开展Ⅰ期临床研究。Attovia现有管线布局   来自：Attovia官网值得关注的是，IL-31靶点竞争日趋激烈。其中，由Galderma研发的Nemluvio（nemolizumab-ilto，奈莫利珠单抗）已获批上市，为第1款获批用以抑制IL-31信号的单抗。Nemluvio在美获批适应症包括成人结节性痒疹、中重度特应性皮炎等。除此之外，多款靶向药物正处于研发阶段：强生的双特异性抗体NM26靶向IL-31和IL-4Rα，即将进入临床II期；再鼎医药的IL-13/IL-31双抗ZL-1503同时靶向炎症和致痒信号通路，预计于2025年递交IND申请。04国内纳米抗体形成初步产业链纳米抗体市场已成为生命科学相关领域的主要市场之一。从市场规模来看，根据贝哲斯咨询数据，2024—2029年全球纳米抗体的市场将以24.2%的复合年均增长率高速增长，预计到2029年规模将增至12.3亿美元。这一蓬勃发展的市场态势，也为Attovia这类专注于纳米抗体技术的企业提供了广阔的发展空间。全球纳米抗体市场规模   数据来源：贝哲斯咨询由于纳米技术的不断进步，全球纳米抗体市场行业的需求正在激增。在诊断领域，纳米抗体被广泛应用于免疫测定、生物传感器及分子成像技术，可精准识别肿瘤特异性抗原或感染性疾病标志物，实现癌症、艾滋病等复杂疾病的早期精准诊断；在治疗领域，纳米抗体有效穿透组织和细胞的能力使它们成为将治疗有效载荷直接输送到患病部位、最大限度地减少全身副作用并提高治疗效果的理想选择。据美国市场研究机构Wise Guy Reports数据，2024年，全球纳米抗体市场在区域市场北美、欧洲、亚太地区、南美、中东和非洲的收入预计为22亿美元，预计到2032年将达到92亿美元，复合年增长率为19.58%。海外市场方面，赛诺菲旗下原Ablynx公司，作为纳米抗体先驱，2018年推出全球首款纳米抗体药物Caplacizumab，用于治疗获得性血小板减少紫癜，此后基于其NANOBODY技术平台，多款纳米抗体药物处于临床Ⅰ期。LAVA Therapeutics则专注γ-δT细胞募集双抗开发，其Gammabody平台独具特色，基于此研发的靶向EGFR实体瘤的LAVA-1223虽处临床前，但已吸引Seagen达成合作授权。国内纳米抗体领域同样发展迅猛。康宁杰瑞、信达生物、博生吉、友芝友、爱思迈生物、普米斯、科望医药、普瑞金、晶准生物、洛启生物、班科生物等企业积极投身纳米抗体药物研发；金斯瑞生物、义翘神州、泰克生物、卡梅德生物、百英生物、南京传奇生物、耀海生物等企业则更多聚焦于纳米抗体的研发服务、生产工艺开发或试剂供应。像康宁杰瑞自主研发的恩沃利单抗（商品名：恩维达），是一种由纳米抗体和Fc段组成的单特异性抗体，为全球首个获批上市的皮下注射PD-(L)1抗体。根据康宁杰瑞财报，2023年—2024年，恩沃利单抗分别给康宁杰瑞带来1.96亿、1.59亿人民币的收入，彰显出纳米抗体药物的市场潜力。总体而言，国内纳米抗体产业已形成从研发到应用的初步产业链，作为一股抗生领域的新生力量，纳米抗体无论从成本还是本身的开发价值上都值得期待。如果您想对接文章中提到的项目，或您的项目想被动脉网报道，或者发布融资新闻，请与我们联系；也可加入动脉网行业社群，结交更多志同道合的好友。近期推荐声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。文中如果涉及企业信息和数据，均由受访者向分析师提供并确认。动脉网，未来医疗服务平台

导读：mRNA序列设计是mRNA疫苗/药物开发的第一难关，序列骨架直接影响mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性等，是mRNA成功开发的关键决策之一。mRNA由编码区域（CDS）和非编码区域（5' cap、5' UTR、3' UTR和3' poly A尾）构成。其中编码区决定了经mRNA递送的功能性蛋白的成药潜力。本期文章菌菌将聚焦于CDS编码序列，结合mRNA巨头公司Moderna、BioNTech/辉瑞、Arcturus等实际应用案例解析其设计与优化策略。 01 mRNA序列全解析  5’ Cap的作用是保护mRNA不被外切酶降解、维持其结构稳定性，并与3’端的poly A尾、poly A结合蛋白（PAPB）和翻译起始因子蛋白协同作用，起始蛋白质的翻译。出于真核生物体内表达的考虑，mRNA常用的帽结构为Cap1。IVT mRNA常用的加帽方式包括酶法加帽和共转录加帽。 5’ UTR和3’ UTR的功能为调控mRNA的翻译，影响mRNA的稳定性。在mRNA疫苗/药物的研发过程，UTR的设计原则为：直接选取人高表达基因的mRNA、使用病毒来源UTR、或基于算法全新设计UTR序列。 如前所述，poly A尾与Cap结构、poly A尾结合蛋白（PAPB）协同起始mRNA的翻译程序。已被证明有效的polyA序列包括长度在100~120 nt的纯A序列、或分段式polyA序列（例如辉瑞/BioNTech的30A + 10(GCAUAUGACU) + 70A）。 除以上非编码的元件外，编码区域（CDS）的可翻译率无疑是至关重要的。CDS的设计和优化策略为：首先确定目标蛋白的氨基酸序列（天然蛋白序列或具有增强功能的突变体），其次是针对目标物种进行密码子优化。 下文中菌菌将结合典型案例分析mRNA CDS的设计与优化，主要包括两个步骤：首先是设计目标蛋白氨基酸序列，再基于密码子设计并优化mRNA CDS序列。 图示 mRNA序列设计原则 02 编码蛋白的氨基酸序列设计与优化 mRNA CDS序列的设计基础是确定目标蛋白的氨基酸序列。氨基酸排列顺序是蛋白质一级结构和高级结构的基础，直接决定蛋白质的生物学功能。天然活性蛋白的氨基酸序列是CDS序列设计的可选方案之一。 然而，随着蛋白质工程的成熟发展，筛选或定向改造具有增强功能的突变体能够进一步改善蛋白或多肽分子的成药特性。这一工程化设计思维也逐渐应用于mRNA CDS序列的设计，相关典型案例如下： 案例1：报告基因eGFP 绿色荧光蛋白（GFP, green fluorescent protein）来源于水母Aequorea victoria，能够在原核和真核生物体内表达荧光蛋白。2008年，发现和发展GFP蛋白的三位科学家Osamu Shimomura、Martin Chalfie 和Roger Tsien（钱永健）被授予了诺贝尔化学奖。 然而GFP发光信号较弱，科学家发现了一种GFP突变体，得到了增强型绿色荧光蛋白（eGFP, enhanced green fluorescent protein）。相比天然版本的GFP，eGFP的荧光强度提高了35倍。 目前，eGFP mRNA已成为mRNA研究领域必不可缺的工具，用于细胞转染对照、mRNA序列优化、目标蛋白示踪以及递送系统开发。 图示 耀海RNASci平台eGFP mRNA的细胞转染评估 报告基因mRNA的使用对于LNP递送系统的开发至关重要，例如：绿色荧光蛋白mRNA、红色荧光蛋白mCherry mRNA、荧光素酶mRNA（Luciferase mRNA）等。耀海生物RNASci平台提供多种报告基因mRNA（转染级和高纯度级），在体内外均具备高表达水平，高质量满足mRNA的细胞转染和动物试验需求。欢迎垂询：13380332910。 案例2：Moderna mRNA-3705（hMMUT多态性） 基因/蛋白的多态性也是目标蛋白氨基酸序列选择的考量之一。 mRNA-3704和mRNA-3705是Moderna开发的针对甲基丙二酸血症/酸尿症（MMA）的管线，MMA最常见的致病因素是甲基丙二酰辅酶A变位酶（MMUT）缺陷或缺失。 mRNA-3704和mRNA-3705均编码人MMUT，二者的区别在于，mRNA-3704的第671位氨基酸是缬氨酸（V671），而mRNA-3705的671位氨基酸替换为异亮氨酸（I671）。mRNA-3705的编码序列的来源为健康人群MMUT在671位点的多态性。 图示 Moderna mRNA-3704/3705的序列示意图 案例3：Arcturus ARCT-810（OTC突变体） 参考蛋白/多肽药物的开发，设计一种蛋白突变体以改善其半衰期等性能，也是mRNA上游设计中的重要步骤。 ARCT-810是Arcturus的在研管线，靶点为鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC），针对鸟胺酸氨甲酰基转移酶缺乏症（OTCD）。ARCT-810通过专有脂质纳米颗粒（LNP）将mRNA递送到细胞中，mRNA被翻译成功能性的OTC，使患者自身肝细胞产生具有生物学功能的OCT酶。相比野生型OCT酶，ARCT-810存在3个氨基酸位点的改变，从而提高了OTC的半衰期，且增加了与线粒体的结合。 图示 Arcturus ARCT-810序列示意图 案例4：ReCode RCT2100（CFTR突变体） 囊性纤维化（CF）是由囊性纤维化跨膜传导调节器（CFTR）基因突变引起的疾病，会导致患者进行性气道损伤和呼吸衰竭。ReCode正在开发一款基于mRNA蛋白替代疗法的管线——RCT2100。RCT2100编码CFTR mRNA，利用选择性器官靶向（SORT）LNP通过雾化器吸入给药，将mRNA特异性递送至与疾病有关的器官、组织和细胞。 RCT2100的mRNA编码区经过了优化。野生型CFTR蛋白存在一个特定的水解热点，而ReCode优化后的CFTR mRNA相比野生型的水解热点明显减少，有效维持mRNA的稳定性和翻译效率。  图示 ReCode RCT2100序列示意图 03 mRNA CDS序列的设计与优化 基于以上策略确定了目标蛋白的氨基酸序列，下一步是针对氨基酸序列设计优化mRNA序列，常用的策略为密码子优化。据报道，两种密码子优化策略（复合密码子家族优化和家族内密码子优化）已成功用于商业化mRNA疫苗CDS区的优化，包括Moderna新冠疫苗mRNA-1273和BioNTech/辉瑞疫苗BNT-162b2。 当前主要以CAI（密码子适应指数）作为密码子优化的参数。经密码子优化后，mRNA-1273的CAI约为0.98，BNT-162b2的CAI约为0.95，二者均相比天然新冠病毒S蛋白编码基因（CAI＜0.7）大幅提高。 3.1 复合密码子家族优化 对于精氨酸（Arg）编码基因来说，人体内使用CGN的频率高于AGR。然而，在病毒基因组内却恰恰相反。例如，新冠病毒的刺突蛋白包含42个Arg残基，其中30个由 AGR 密码子编码，仅12个由 CGN 密码子编码。 在mRNA疫苗的CDS序列优化方面，辉瑞/BioNTech采用了典型的复合密码子优化策略，在BNT162b2的CDS区域减少了8个AGR密码子，对应增加了CGN密码子的频率。Moderna开发的mRNA-1273也使用了这一策略，将其中28个AGR密码子替换成了CGN。 类似地，高表达的人核糖体蛋白中，81%的亮氨酸通过CUN密码子编码。因此，在mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273中，多数的UUR被替换为CUN。 3.2 家族内密码子优化 家族内密码子优化的原则是替换为高表达基因优选且被最丰富的tRNA解码的最佳同义密码子。在编码Arg的密码子中，CGG被认为是CGN家族中的最优解。基于这一原则，BNT162b2和mRNA-1273对Arg密码子进行了优化。 同样地，在谷氨酸（Glu）密码子优化方面，mRNA-1273中的GAN家族密码子全部替换成了GAG。 图示 2款商业化mRNA疫苗的密码子优化策略 04 结语 众所周知，mRNA通过表达目标蛋白发挥预防或治疗效应，因此在mRNA CDS序列设计中，目标蛋白分子的设计是重中之重。编码蛋白的一级结构（氨基酸序列）直接影响功能性蛋白在体内的稳定性、半衰期和活性等成药关键特性。这一偏上游的分子设计在公共文章中反而鲜少提及，菌菌在本文通过典型案例进行了详细阐述。 其次，密码子优化能够改善mRNA在目标宿主的翻译效率，对于mRNA-蛋白剂量水平也必不可少。密码子优化是基因合成、分子生物学领域的重要部分，可借助的工具包括多家生物技术公司推出的线上工具、以及百度推出的LinearDesign。 参考文献  [1] Coughlan KA, Eybye M, Henderson N, DeAntonis CM, et al. Improved therapeutic efficacy in two mouse models of methylmalonic acidemia (MMA) using a second-generation mRNA therapy. Mol Genet Metab. 2024 Sep-Oct;143(1-2):108560. [2] Markey McNutt, MD, PhD, FACMG. It Translates: An Update on the ARCT-810 mRNA for OTC Deficiency. SIMD Annual Meeting 2024. [3] Daniella I，Dmitri B， Ella A M， et al. Functional Rescue of CFTR by Aerosolized Delivery of Optimized CFTR mRNA Using ReCode LNPs in Primary Human Bronchial Epithelial Cells Derived From Patients With Cystic Fibrosis. American Thoracic Society (ATS) 2022 International Conference.2022. [4] Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3;9(7):734. doi: 10.3390/vaccines9070734. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观，不代表本站立。

导读：埃博拉病毒（Orthoebolavirus）是一种危险的病原体，已造成30多起疫情爆发。然而，目前获批的疗法范围有限，且它们仅对埃博拉病毒有效，对其他正变形病毒缺乏交叉保护。2024年11月25号，中国人民解放军军事医学科学院陈薇和于长明团队共同在Emerging Microbes & Infections（影响因子：8.4）发表文章：A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection。他们发现先前分离的人类来源抗体 2G1 可以识别埃博拉病毒每个亚种的糖蛋白（GP），2G1可识别丝状病毒中高度保守的表位，并通过阻断 GP 蛋白水解实现中和。此外，研究人员利用mRNA技术制备了编码2G1抗体的mRNA-2G1-LNP制剂，发现其在细胞水平上表现出交叉中和能力，是蛋白形式IgG的十倍以上，并且它以低剂量阻断了 EBOV 和 SUDV 假病毒对小鼠的侵袭，无明显的肝毒性。这项研究表明，mRNA-2G1-LNP 制剂是抵抗埃博拉病毒的非常有潜力的候选干预措施。 应用技术: mRNA序列设计、mRNA序列优化、UTR筛选、poly(A)筛选、密码子优化、体外转录、mRNA磁珠纯化、mRNA-LNP包封、细胞转染、流式细胞术、表面等离子共振、ELISA、假病毒中和试验、冷冻电镜、受体结合抑制试验等。 01 研究背景 埃博拉病毒属于丝状病毒科，病毒呈长丝状体，直径大约为80-100纳米。埃博拉病毒粒子由包膜、基质和核衣壳组成，脂质双层结构的病毒包膜表面有许多由GP糖蛋白形成的7-10纳米长的三聚体刺突。埃博拉病毒属主要分为6个种，包括EBOV，SUDV，RESTV，BDBV，TAFV和BOMV。其中四种病毒（EBOV、SUDV、BDBV和TAFV）对人类致病，在过去四十年中引发了40多次疫情，病死率高达25%-90%。 膜蛋白GP是一种I型跨膜蛋白，全长676个氨基酸(amino acid, AA)，形成了病毒颗粒表面的刺突结构。在翻译过程中，它首先形成一个前体GP蛋白(preGP)，之后在第501aa位点被弗林蛋白酶或类弗林内切蛋白酶切割成一个由二硫键连接的GP1-GP2片段。三个GP1-GP2片段聚集形成的三聚体复合物是埃博拉病毒与宿主细胞受体结合与融合的位点，也是中和性抗体研究的主要靶点。GP蛋白的粘蛋白类似区(Mucin-like domain)处于GP1外侧，结构类似一个帽子。 埃博拉病毒不同亚种GP氨基酸序列差异高达59% ，这对广谱药物的开发构成了极大挑战。最近的一项研究表明，对EBOV的既往免疫力对SUDV的保护作用有限。两种获批的抗体药物仅靶向EBOV，不能交叉中和其他亚种。博拉病毒的多变种和逃逸变异、在未来疫情中变异的不确定性、疫苗不适用于特定人群以及抗体药物的长开发周期都说明探索广泛或快速起效对策的重要性。广谱型抗体是应对埃博拉病毒的有效手段，通常靶向未遮挡、高度保守的GP2亚基和GP1亚基的碱基区域，通过阻断受体结合后发生的GP切割和构象重排来实现中和效应。 02 免疫广谱中和抗体2G1的验证研究人员采用流式细胞仪分析2G1抗体结合广度，发现2G1可以同展示在239T细胞表面的六种埃博拉病毒亚种（EBOV，SUDV，RESTV，BDBV，TAFV和BOMV）的GP糖蛋白结合。他们还表征了2G1抗体在粘蛋白结构域存在（GPΔTM）或不存在（GPΔMuc）的情况下对EBOV GP的重组细胞外形式的亲和力，发现 GPΔTM和GPΔMuc的可比动力学常数分别为5.25nM和5.44nM。 埃博拉病毒的进入是由GP糖蛋白介导的，GP将病毒颗粒附着在细胞表面，将其递送到内体，并催化病毒膜和内体膜之间的融合，因此，抗体中和效应主要发生在晚期胞内体中的酸性环境。研究人员观察PH改变对2G1与GPΔTM、 GPΔMuc和裂解GP（GPcl）结合活性的影响。结果发现低pH值对2G1与GPΔTM和GPΔMuc的结合影响最小，同时，还发现2G1对GPcl结合力非常弱。 接下来，研究人员使用携带GP糖蛋白的重组HIV假病毒来检测2G1抗体的广谱性，结果发现，2G1对所有测试的埃博拉病毒亚种均表现出有效的广泛中和作用，半数最大抑制浓度（IC50）值范围为0.02至0.44μg/mL，优于对照抗体mAb114和FVM04。 为了剖析重链和轻链对结合的贡献，研究人员准备了2G1的野生型和推断种系交叉配对形式（IGL）。分析轻链（VL）和重链（VH）的可变区，比较显示 VL-IGL和VL-WT之间的氨基酸分歧（9/106）比VH-IGL和VH-WT之间的氨基酸差异更大（6/124）。与2G1-WT相比，2G1-HIGL/KWT和2G1-IGL与GP的结合活性显著降低（分别降低91.4倍和55.4倍）。相比之下，2G1-HWT/KIGL的结合能力仅比 2G1-WT 低 4.4 倍，强调了重链在结合中的关键作用。通过重链互补决定区（CDR）的丙氨酸扫描诱变进一步分析，在CDR2中发现了一个关键残基Y56，在 CDR3 中发现了三个关键残基C99、G100B和C100D，这些位置的突变导致2G1的结合能力大幅降低，EC50值比野生型高59.9至133.9倍。 03 光谱中和抗体2G1的中和机制  GP三聚体（由GP1-GP2异二聚体组成）上的表位，包括聚糖帽（GC）、头部、Mucin、GP1核心、GP1/2、碱基、IFL和HR2。在这些表位中，远离病毒膜的GC、Head和Mucin在空间上更容易接近，已被证明在疫苗接种过程中具有更高的免疫优势。然而，这些区域是种间序列分歧和自然进化突变的热点。靶向IFL、GP1核心和头部的抗体表现出高交叉反应频率，其中IFL与埃博拉病毒广谱型活性的相关性最强。ADI-15878等中和抗体的表位（完全或部分）位于IFL结构域中，已知它们可以中和至少四种直肠病毒。值得注意的是，来自疫苗接种者的2G1以及来自幸存者的 ADI-15878 识别出位于GP2 N端下方的疏水口袋，表明该区域作为广谱性埃博拉病毒药物或疫苗开发靶点的重要性。 为阐明2G1结合和中和机制的结构基础，研究者使用冷冻电子显微镜以2.98 Å的分辨率确定了2G1-Fab与EBOV GPΔMuc复合物的结构。2G1轻链和重链的中央连接几乎与GP1亚基的主体平行排列，三个 Fab 与每个GP三聚体接合。尽管2G1与ADI-15878具有相同的结合模式，但两种抗体之间存在明显的区别。2G1识别由IFLtip、HR1、GP1核心和GP2 N端组成的四级表位，该表位结合了针对埃博拉病毒病最有前途的广谱混合物成分的表位：ADI-15878（IFL+HR1）和ADI-23774（310口袋+IFL碱基+ GP2N端）。除了表位的差异外，ADI-15878还表现出与GPcl的强结合，并且据推测会阻碍受体结合后的融合触发过程。相反，2G1与GPcl的结合较弱，并通过阻断GP的上游切割来中和病毒。 04 编码抗体的2G1 mRNA的设计与优化 研究人员采用mRNA技术来表达2G1抗体的重链和轻链，初始mRNA序列包含Cap1结构、5'UTR（TEV）、2G1重链或轻链的编码序列、3'UTR（F-I）、100个核苷酸的poly(A)尾和元件之间的Linker。将mRNA转染HEK293T细胞，并在多个时间点收获培养上清液。结果发现，转染后48小时，2G1 抗体浓度达到最高限值为74.4ng/mL。 研究者优化了mRNA的组成元件以提高2G1抗体翻译效率： Cap1和Cap0两种不同类型的帽结构对抗体表达的影响没有统计学上的显著差异。 为了简化组件替换和优化，研究人员在初始mRNA序列设计时在不同的元件之间引入了Linker，然而，这些Linker可能会干扰mRNA二级结构。去除Linker后，抗体表达显著增加。 在HBA1、HBB及4种候选UTR组合序列中，天然HBA1和HBB UTR表现出最高的翻译效率。将HBA1和HBB的UTR序列交换组合，并且引入非洲爪蟾β珠蛋白（XBB）的5’UTR序列，结果发现，利用 HBA1-5' UTR的mRNA（HBA1-HBB和HBA1）显示出最佳的翻译效果，表达的抗体浓度超过1500 ng/mL。 用三磷酸尿苷（UTP）代替N1-甲基假尿苷酸（ψ）在细胞水平上对mRNA翻译的效率没有显著影响。 两种不同形式的poly(A)尾，即A30-linker-A70和A70C30的mRNA-2G1抗体表达水平没有显著差异。 编码序列的优化在数值上增强了抗体生产，尽管与未优化的队列没有显著差异。 使用两种针对亨尼帕病毒的抗体1E5和1B6验证优化后的mRNA元件的翻译效率，发现该mRNA骨架序列具有普适性，两种抗体表达水平可分别达到1835和5533 ng/mL。 将mRNA抗体的重链和轻链以五种不同的比例混合到细胞中，确定了其最佳摩尔比为1：1.1。配制LNP包封的mRNA-2G1（mRNA-2G1-LNP）。mRNA-2G1-LNP的包封效率约为89.7%，平均粒径约为 84.6 nm，在电子显微镜下呈现球形形态。在293 T细胞中，mRNA-2G1-LNP 的抗体表达水平要比用lipofectamine转染的高36.6%。在细胞上清液中，mRNA-2G1-LNP 表达完整 IgG和少量游离的轻链。为确定LNP制剂的稳定性，将mRNA-2G1-LNP在4℃下储存8周，监测包封效率、有效浓度和细胞水平表达的变化。第36天，包封率和有效浓度均未发生显着变化。储存终点mRNA-2G1-LNP的细胞水平表达水平是保持在第二周时观察到的52.4%。 05 mRNA-2G1-LNP的免疫保护效果研究人员评估mRNA-2G1-LNP在体外对rHIV-EBOV 的中和效果。在细胞感染前6小时，添加浓度为0.1 μg/mL的mRNA-2G1-LNP，能够中和90% 的假病毒。mRNA-2G1-LNP抗体对rHIV-EBOV的IC50值为16.4ng/mL，中和能力是 IgG 的19.8倍。在基于生物发光成像的BALB/c小鼠感染模型中评估 mRNA-2G1-LNP的体内保护活性。小鼠在攻击前12小时通过尾静脉注射不同剂量的mRNA-2G1-LNP，所有注射组均表现出良好的保护效果。最低剂量组0.125 mg/kg小鼠体内的总发光值仅为PBS组的11.9%，高剂量组小鼠未未检测到发光信号。 同样，mRNA-2G1-LNP体外可有效中和rHIV-SUDV，IC50 为 32.6 ng/mL，是IgG中和活性的12.5倍。在SUDV假病毒的小鼠攻击模型中，预防性注射mRNA-2G1-LNP可提供足够的保护，0.125mg/kg的最小剂量组小鼠体内总发光强度仅为对照组的6.72%，而高剂量组则完全阻断了小鼠感染rHIV-SUDV 。 通过尾静脉注射给予mRNA-2G1-LNP、 2G1抗体或空壳LNP，研究小鼠mRNA-2G1-LNP的表达动力学和代谢特征。注射mRNA-2G1-LNP 后，血清抗体浓度迅速升高。6h时，1和0.5 mg/kg mRNA-2G1-LNP剂量组的平均血清抗体水平分别为25.80和8.45μg/mL。24小时，血清抗体达到峰值：分别为31.73和11.36μg/mL。第7天，血清抗体浓度分别降至14.19和6.67μg/mL。值得注意的是，这些血清抗体浓度高于2G1在体外对真实EBOV的IC90值（3.2μg/mL）。在小鼠中观察到的人类2G1半衰期较短，估计约为三天，这可能限制了mRNA编码的抗体水平进一步增强和延长的可能性。 为评估mRNA-2G1-LNP在小鼠体内的肝毒性，研究者监测了给药后小鼠体重和肝功能的血清生化标准，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酐（CR）。所有注射组中小鼠的体重都表现出最初的下降，然后恢复，然后在第14天达到同等体重。mRNA-2G1-LNP和IgG组之间的体重没有显着差异。体重增加的早期波动可能与该阶段的密集采血工作有关。1mg/kg mRNA-2G1-LNP 的剂量对小鼠的肝功能没有显着影响，与PBS组相比，四种肝功能的生化标准没有统计学差异。 06 总结 据称，2G1抗体是第一个已报道的能够与所有六种埃博拉病毒亚种的天然 G结构结合的抗体。本研究证实了2G1抗体是一种广谱型的埃博拉病毒中和抗体，并阐明了其中和活性的结构基础和中和机制，从而为开发针对埃博拉病毒的广谱型药物提供了候选成分和设计原理。通过优化表达2G1抗体的mRNA元件，找到了一种普适性的、表达中和抗体的mRNA元件组合，为其他基于mRNA-LNP的治疗方法提供了重要的参考信息。 基于在mRNA序列设计和纯化方面的卓越经验，耀海生物重磅推出mRNA定制化合成服务，全流程涵盖质粒模板序列设计、IVT RNA制备、RNA纯化、RNA-LNP包封、mRNA和LNP质量检测。详细请联系菌菌：133 8033 2910。 参考文献  [1] Fan P, Sun B, Liu Z, Fang T, Ren Y, Zhao X, Song Z, Yang Y, Li J, Yu C, Chen W. A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection. Emerg Microbes Infect. 2024 Dec;13(1):2432366. doi: 10.1080/22221751. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。