100 项与 Sigma Systems, Inc. 相关的临床结果
0 项与 Sigma Systems, Inc. 相关的专利(医药)
中文摘要
目的 建立邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生化反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)并验证,以检测百日咳抗原中间产物中氨基酸的含量。
方法 采用OPA柱前衍生化RP-HPLC检测百日咳抗原中间产物百日咳毒素脱毒液中L-天冬氨酸钠盐、丝状血凝素脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸的含量,并对该方法的专属性、系统适用性、线性、准确度、耐用性、检测限和定量限进行验证。
结果 OPA柱前衍生化RP-HPLC检测配置溶液,对照品和供试品溶液可见对应的氨基酸色谱峰,供试品溶液的保留时间和峰面积相对标准偏差均小于2.0%。氨基酸浓度在5~100 μg/ml时,浓度与峰面积线性关系良好,检测氨基酸样品的加标回收率均在80%~120%之间。用磺基水杨酸和盐酸稀释剂处理供试品后,2种稀释剂检测值之间的相对误差在±5%范围内。定量限为5 μg/ml,检测限为2 μg/ml。
结论 成功建立了检测百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法,该方法的专属性、系统适用性、线性、准确度、耐用性良好。
正文
百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的急性呼吸道传染病,严重时可导致婴幼儿死亡,百日咳疫苗的大规模使用能够显著减少该疾病的发生。根据工艺的不同,百日咳疫苗分为全细胞和无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine, aP),aP由百日咳抗原,包括丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)、百日咳毒素、黏附素及菌毛蛋白等组分组成。在生产过程中,百日咳毒素纯化液经PBS和甘油稀释后,使用L-天冬氨酸钠盐和戊二醛脱毒,得到百日咳毒素脱毒液;FHA纯化液用PBS稀释后,使用甘氨酸和甲醛脱毒,得到FHA脱毒液;黏附素纯化液用碳酸盐缓冲溶液稀释后,使用L-赖氨酸和戊二醛脱毒,得到黏附素脱毒液。目前,关于组分百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的衍生化分析方法主要包括异硫氰酸苯酯法、2,4-二硝基氟苯法、邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生化反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)等。
OPA柱前衍生化RP-HPLC检测技术制备简单、反应迅速、灵敏度高,但需要及时进样。OPA在室温下巯基乙醇环境中,与一级氨基酸反应生成具有强荧光性的异吲哚衍生物。OPA本身不散发荧光,在色谱分离时不会形成干扰峰。OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法使用自动进样器进行在线衍生,可以精确控制衍生反应的时间,有效避免衍生反应时间变化对测定结果的影响。本研究拟对OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法的流速和洗脱程序进行优化,并对百日咳抗原中间产物中的L-天冬氨酸钠盐、FHA脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸共3种氨基酸的含量进行检测,旨在为类似产品中氨基酸含量的检测提供依据。
1
材料与方法
1.1
主要仪器与试剂
LC-20AD型高效液相色谱仪、AJS-02色谱柱(规格:150 mm×4.6 mm,3 μm)均购自日本岛津公司;5430R型离心机购自美国Eppendorf公司。
赖氨酸和L-天冬氨酸钠盐均购自美国Sigma公司,甲醇、乙腈均购自德国默克公司,磺基水杨酸和盐酸均购自北京益利精细化学品有限公司,OPA衍生试剂购自日本岛津公司,甘氨酸、磷酸、十二水合磷酸氢二钠和十水合四硼酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司。0.22 μm聚偏氟乙烯〔poly(vinylidene fluoride),PVDF〕滤膜购自天津津腾实验设备有限公司。
1.2
供试品
百日咳毒素脱毒液(批号:20211213)、FHA脱毒液(批号:20211214)、黏附素脱毒液(批号:20211216)均由北京民海生物科技有限公司制备。
1.3
OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法的建立
1.3.1 溶液配制 流动相A:分别称取9.0 g十二水合磷酸氢二钠和9.5 g十水合四硼酸钠,加超纯水溶解,加入0.1 mol/L 盐酸调pH至8.0,加超纯水至2 L,混匀。流动相B:分别量取900 ml甲醇和900 ml乙腈,加超纯水至2 L,混匀。OPA衍生试剂:取OPA衍生试剂A液1支,加入OPA衍生试剂B液60 μl,混匀。稀释剂:取超纯水100 ml,加磷酸500 μl,混匀。对照品溶液:分别吸取不同体积的1 mg/ml L-赖氨酸储备液、1 mg/ml甘氨酸储备液、1 mg/ml L-天冬氨酸钠盐储备液及纯化水,混匀,配制各氨基酸终浓度分别为5、20、40、60、80和100 μg/ml的对照品溶液。系统适用性溶液:分别吸取1 mg/ml L-赖氨酸储备液、1 mg/ml甘氨酸储备液、1 mg/ml L-天冬氨酸钠盐储备液各40 μl及880 μl纯化水,混匀。
1.3.2 供试品溶液处理 使用1.5%磺基水杨酸溶液稀释供试品百日咳毒素脱毒液,稀释15倍;使用1.5%磺基水杨酸溶液分别稀释FHA脱毒液、黏附素脱毒液,均稀释2倍。室温条件下静置2 h,取溶液1 ml,14 000×g离心10 min,取上清液并用0.2 μm PVDF滤膜过滤后注入玻璃样品瓶。平行进样2次。同时将1 ml纯化水注入HPLC玻璃样品瓶作为空白溶剂。
1.3.3 色谱条件 采用OPA柱前衍生化检测法检测供试品溶液,先采用在线衍生法将空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液或供试品溶液进行衍生后进入色谱柱进行分离,具体步骤为:分别取15 μl硼酸盐缓冲液、2 μl供试品或对照品、2 μl OPA衍生试剂和12 μl水、20 μl稀释剂混匀,静置0.5 min后上样。HPLC检测的具体参数设定如下:色谱柱为AJS-02(规格:150 mm×4.6 mm,3 μm),流速1.0 ml/min,检测波长为338 nm,进样量2 μl,柱温40 ℃,流动相包括流动相A和流动相B,具体洗脱程序见表1。
1.4
方法验证
1.4.1 专属性 取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液按照1.3.3方法上样,记录色谱图。可接受标准:空白溶剂中的3种氨基酸不出峰,阳性对照(系统适用性)溶液出现3种氨基酸对应的色谱峰,供试品黏附素脱毒液的色谱图中出现L-赖氨酸对应色谱峰,供试品FHA脱毒液溶液中出现甘氨酸对应色谱峰,供试品百日咳毒素脱毒液中出现L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰。
1.4.2 系统适用性 取1.3.1制备好的系统适用性溶液,按照1.3.3的方法连续上样5次,记录L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐溶液的色谱图、峰面积及保留时间。可接受标准:各氨基酸保留时间和峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均不高于2.0%。
1.4.3 线性与范围 分别取5、20、40、60、80和100 μg/ml的L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐对照品溶液,按照1.3.3的方法上样,进行3次试验。以标准溶液浓度为x轴,氨基酸的峰面积为y轴,建立回归曲线,计算决定系数(R2)。可接受标准:R2≥0.99。
1.4.4 准确度 取FHA脱毒液0.5 ml,分别加入浓度为10、40和70 μg/ml的甘氨酸储备液进行混合;将百日咳毒素脱毒液用1.5%磺基水杨酸稀释15倍后,取0.5 ml分别加入浓度为10、40和70 μg/ml 的L-天冬氨酸钠盐储备液混合;将黏附素脱毒液用1.5%磺基水杨酸稀释2倍后,取0.5 ml分别加入浓度为10、40和70 μg/ml 的L-赖氨酸储备液混合。将以上混合液按照1.3.3的方法进行上样,并按下列公式计算回收率。可接受标准:回收率在80%~120%之间。
1.4.5 检测限和定量限 分别配置2、3、5、10 μg/ml的L-赖氨酸、甘氨酸和L-天冬氨酸钠盐对照品溶液,按照1.3.3的方法进样,确定氨基酸含量检测方法的检测限和定量限。可接受标准:以上检测限检测值的信噪比均大于3,以上定量限检测值的信噪比均大于10,且定量限对应浓度的氨基酸溶液的回收率在80%~120%之间。
1.4.6 耐用性 将供试品百日咳毒素脱毒液、FHA脱毒液和黏附素脱毒液分别用1.5%磺基水杨酸和0.1 mol/L盐酸稀释5倍,按照1.3.3的方法进样后,分析2种稀释剂稀释供试品后检测值之间的相对误差,计算公式如下。可接受标准:2种稀释剂稀释供试品后检测值之间的相对误差在±5%之内。
2
结果
2.1
专属性
如图1所示,空白溶剂中无氨基酸对应色谱峰,阳性对照溶液可见3种氨基酸色谱峰:L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰在约2.0 min时出现,甘氨酸对应色谱峰在约9.3 min时出现,L-赖氨酸对应色谱峰在约22.1 min时出现。黏附素脱毒液的色谱图中可见L-赖氨酸对应色谱峰,FHA脱毒液的色谱图中可见甘氨酸对应色谱峰,百日咳毒素脱毒液的色谱图中可见L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰,以上结果均符合要求,表明该方法具有良好的专属性。
2.2
系统适用性
结果见表2,系统适用性溶液连续上样5次的L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐溶液保留时长的RSD均在0.1%~0.4%之间,峰面积的RSD均在0.2~0.5%之间,均小于2.0%,均符合要求,表明该方法具有良好的系统适用性。
2.3
线性与范围
试验结果发现,L-赖氨酸、甘氨酸、 L-天冬氨酸钠盐3种氨基酸溶液的浓度在5~100 μg/ml时,3次试验标准曲线的R2均大于0.99,符合要求,表明该方法在5~100 μg/ml范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系。
2.4
准确度
通过分析上样结果,发现对百日咳毒素脱毒液进行L-天冬氨酸钠盐加标试验时,3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为101.6%、98.2%和99.0%;对FHA脱毒液进行甘氨酸加标试验时,3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为109.9%、101.0%和99.6%;对黏附素脱毒液进行L-赖氨酸加标试验时,3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为99.8%、98.9%和101.2%。以上回收率均在可接受标准范围内,表明该检测方法的准确度良好。
2.5
检测限和定量限
不同浓度氨基酸溶液检测结果的信噪比见表3。检测结果显示,L-天冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸的浓度为2 μg/ml时,所对应的信噪比均大于3,可作为检测限;L-天冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸的浓度为5 μg/ml时,所对应的信噪比均大于10,且该浓度3种氨基酸溶液的回收率均在96.8%~104.9%之间,符合要求,将该浓度作为定量限。
2.6
耐用性
结果见表4,2种稀释剂处理供试品后相对误差在﹣2.1%~3.3%之间,在可接受范围内,说明这2种稀释剂稀释供试品后对其中氨基酸含量检测基本无影响,此检测方法的耐用性良好,考虑对高效液相色谱仪及色谱柱的维护,选择使用1.5%磺基水杨酸处理样品更为合适。
3
讨论
氨基酸的检测方法有分光光度法、化学法、色谱法等。其中,氨基酸的高效液相色谱分析方法主要分为直接分析和间接分析2种。直接分析法包括蒸发光散射检测法和高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法;间接分析法有柱前衍生法和柱后衍生法。柱前衍生法分析氨基酸,使用的衍生试剂主要有OPA、异硫氰酸苯酯、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯和丹磺酰氯等。本法采用OPA对样品进行柱前衍生后,进行氨基酸检测。
田志伟等的研究中采用OPA柱前衍生法检测人免疫球蛋白中甘氨酸含量,张亿等同样采用OPA柱前衍生法检测复方制剂中盐酸赖氨酸含量。盛凤仙和张幼捷采用OPA柱前衍生法检测人凝血酶制品中甘氨酸的含量,采用手动衍生法;目前尚无疫苗相关产品中多种氨基酸同时检测的方法报道。
本研究结果显示,OPA柱前衍生法检测3种氨基酸(L-天门冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸)系统适用性良好;检测限为2 μg/ml,定量限为5 μg/ml;在5~100 μg/ml范围内线性关系良好,R2大于0.99,准确度良好,可应用于百日咳抗原中间产品百日咳毒素脱毒液中L-天冬氨酸钠盐、FHA脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸含量的同时检测。该法减少了流动相的使用量,降低了系统压力并且提高了工作效率,也为其他生物制品中氨基酸的检测提供了参考。
作者
聂晓齐1,2 杜闪2 朱留强2 王艺霞2 王斌2 张钰东2 邓海清2 尹珊珊2 韩飞1
1沈阳药科大学药学院, 沈阳 110016;2北京民海生物科技有限公司研发四室, 北京 102629
聂晓齐和杜闪对本文有同等贡献
通信作者:
尹珊珊, Email: yinshanshan@biominhai.com;
韩飞, Email: hanfei_spu@163.com
引用本文:聂晓齐, 杜闪, 朱留强, 等. 组分百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的邻苯二甲醛柱前衍生化RP-HPLC检测 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(3): 145-150.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230824-00007
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文章要点
02
抗肿瘤靶向药物一直以来以酪氨酸激酶为主要靶点,约占总数的80%。其中,赫赛汀(曲妥珠单抗)作为首个单克隆抗体癌症靶向药物,堪称癌症治疗的里程碑。赫赛汀以HER2酪氨酸激酶为靶点,不仅是HER2阳性乳腺癌患者的标准治疗药物,还被广泛应用于其他多种HER2阳性肿瘤,如卵巢癌、胃癌、肺癌等。
然而,随着治疗的推进,肿瘤往往会产生耐药性,使得治疗效果大打折扣。以赫赛汀为例,乳腺癌患者中继发性耐药的发生率高达88%,这意味着大多数患者在接受治疗一段时间后,癌细胞“学会”了如何抵抗药物,肿瘤耐药后不断激活新的靶点,导致病情复发转移并危机病人生命。这种情形就像“打地鼠”游戏,让治疗处于被肿瘤牵着鼻子走的被动窘境。
张灏教授的团队在应对这一挑战时,采取了一种全新的策略。他们研究发现,酪氨酸磷酸酶PTPRO在赫赛汀耐药中扮演了关键角色,可能是耐药性的“幕后黑手”,并进一步证明了一个由酪氨酸磷酸酶PTPRO为中心操控多个耐药基因的新机制。其中肿瘤新靶点HER3被证明是PTPRO的一个直接底物。与常规的治疗策略不同,张灏团队没有选择对抗每个新出现的激酶,而是靶向酪氨酸磷酸酶,以避免被肿瘤“牵着鼻子走”。
传统上,作为“抑癌基因”的磷酸酶被认为是不能成药,这主要是因为它们的活性位点非常保守,三维结构复杂,小分子药物难以有效结合并发挥作用。为了解决这一难题,张灏团队采用了 “RNA激活”技术,并在此基础上建立了抗体偶联导向的RNA激活递送系统。这一系统有效地克服了磷酸酶成药过程中“口袋缺乏”和特异性差的两大难点,解决了磷酸酶难以成药的关键问题。
在一系列体外实验和小鼠模型的体内研究中,该团队证明了这种新策略的有效性。研究显示,RNA激活术能够成功激活PTPRO酪氨酸磷酸酶,抑制包括HER2、HER3、SRC等在内的多个耐药基因,从而逆转赫赛汀的耐药性。更令人振奋的是,动物实验未发现明显的毒副作用,这意味着这种方法有望成为一种安全有效的抗肿瘤耐药新策略。
这一研究的第一作者包括暨南大学基础与公共卫生学院的王露副教授,以及暨南大学附属第一医院的林宇晟博士和姚志猛博士。这一研究获得国家自然科学基金(基金号82273183、82072683) 和广东省自然科学基金(基金号2022A1515010925)的资助。
文章链接:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1368-7646(24)00076-1
李龙承博士点评
03
肿瘤发展往往由致癌基因的过度激活和抑癌基因的失活推动。在传统药物开发中,大部分策略聚焦于抑制致癌基因,而抑癌基因通常被视为难以利用的靶点。在这方面,酪氨酸激酶的抑制剂已广泛用于临床,然而,通过激活酪氨酸磷酸酶的治疗策略尚未实现。
面对这一挑战,张灏教授团队通过抗体导向的RNA激活技术,创新性地解决了酪氨酸磷酸酶难以成药的问题。他们设计的针对PTPRO启动子的小激活RNA(saRNA)在实验中显示出很强的活性,能有效激活乳腺癌细胞中PTPRO的表达,并恢复对赫赛汀的敏感性,展示了其在乳腺癌治疗中的应用潜力。
递送这些saRNA到肿瘤细胞中一直是一大挑战。张教授团队创造性地使用了赫赛汀偶联的介孔二氧化硅纳米颗粒来递送saRNA,有效提高了在HER2阳性肿瘤细胞中的富集。他们的研究不仅证明了saRNA单独使用在抑制肿瘤生长上的有效性,而且联合使用赫赛汀能进一步增强治疗效果,为将来的临床应用提供了强有力的数据支持。
耐药性是癌症治疗中的一大难题,常规策略难以应对不断变化的靶点。张灏团队的这项研究提供了一种全新的方法,通过激活酪氨酸磷酸酶PTPRO,有效逆转了赫赛汀的耐药性,显示了RNA激活技术在解决肿瘤耐药问题中的巨大潜力。未来的工作有必要进一步优化PTPRO saRNA及其递送系统的效率和安全性,以期将这些实验室成果转化为临床疗法。
RNA激活是一种利用双链小RNA实现靶向基因开启的技术,这种双链小RNA被称为saRNA。全球已有两款saRNA药物进入临床试验,分别是英国MiNA Therapeutics公司开发的MTL-CEBPA和中美瑞康公司开发的RAG-01,前者已经进入临床II期开发,用于治疗肝癌;后者刚进入临床I期,用于膀胱癌的治疗。
我相信,这项研究将激发更多研发人员在此领域的深入研究,并最终为癌症患者带来更有效的治疗方案。
点评专家简介
04
李龙承博士,中美瑞康创始人、董事长兼总经理。李博士有30多年临床、基础研究及小核酸药物开发的综合经历。曾任美国加州大学旧金山分校(UCSF)终身制副教授、独立研究员,北京协和医院特聘教授、中心实验室主任。李博士在小RNA介导的基因激活方面的破土性工作开创了一个全新的RNA激活研究领域。曾获得多项政府及机构研究资金资助,包括极具竞争性的美国NIH Transformative R01基金,总资助额度达500多万美元。在国际学术期刊发表论文80余篇,总引用次数达13000余次。获得多项RNA激活的美国专利授权。曾应邀到各种国际学术会议、大学及工业界如Alnylam Pharmaceuticals、Sigma、Genentech、Sirna Therapeutics做专题演讲。(转化医学网360zhyx.com)
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当全球生物3D打印市场狂飙突进之时,一个隐秘的赛道被带火了!
这个赛道是生物3D打印材料(又称“生物墨水”)——通过选用合适的生物墨水,3D打印技术可以制造人体组织和器官的代替物,并在人体内发挥作用。
也就是说,基于生物墨水的创新,3D生物打印可以在再生医学、药物测试、医学研究等领域创造出巨大的应用空间。
目前,生物墨水在科研端正引起极大研究兴趣。自2016年以来,相关科研院所对生物墨水的科研工作正在快速增加,期刊发文数和专利出版物持续上升,这将助力行业的大发展。
2003—2023年期间,生物墨水领域每年期刊发文数量和专利出版物数量
图源:《2024年未来健康:新兴生物材料》报告
同时,生物墨水赛道已经涌进众多创新企业,它们的加入正为行业的大规模产业化铺路。以美国为例,在当地,生物3D打印领域共有130多家实体服务商,其中41家是生物墨水研发企业。而在中国,已有博恩生物、华夏司印、捷诺飞、蓝光英诺、迈普医学、上普生物、苏州永沁泉智能设备(按企业简称首字母排序)等创新企业发力生物墨水赛道,且多家企业拿到融资。同时,来自瑞典的生物墨水研发企业BICO(原Cellink)已成功在纳斯达克IPO。
更重要的是,在市场需求端,尽管目前市面上尚无权威的生物墨水市场规模统计报告,但从全球生物3D打印市场保持21.91%(《中国生物3D打印行业报告》数据)的年增长率来看,生物墨水的需求量势必水涨船高。
从科研到产业的供给激增,再到市场端的巨大需求,生物墨水赛道已然走到爆发前夜。
生物墨水,
正在崛起的蓝海赛道
生物墨水的进展与生物3D打印行业的发展密切相关。
你可以想象一下,若要打印出一个人体器官,至少需要3D打印机、活细胞和生物材料三样东西,这个材料就是生物墨水。
从成分上看,生物墨水主要材料是聚合物(包括天然聚合物、合成聚合物等),有时还会在生物3D打印时负载活细胞,以及加入细胞因子或其他生物分子。
需要注意的是,在动脉网的访谈中,当下关于生物墨水的定义业界尚无统一共识,特别是生物材料是否需要负载细胞这一点。一部分观点认为,生物墨水一定要负载细胞,没有细胞就不能再生;另一部分观点则表示,只要是用了生物材料(天然或合成聚合物),就可以认定为是生物墨水。
但不管怎样,作为最后能被打印成人体器官的生物墨水,核心要具备三大要素,分别是可打印性、生物相容性、力学性能。
● 可打印性主要是指生物墨水的成形性能,即材料黏度可调可控、可打印工艺参数窗口宽等;
● 生物相容性是看生物墨水模拟细胞外基质的能力,要求生物墨水尽可能地接近所打印细胞在体内的微环境,促进细胞的增殖和分化并最终实现彼此间通信;同时,好的生物相容性也反映了该生物墨水的低免疫原性;
● 力学性能则要求生物墨水有足够的强度来支持后续的培养及体内植入过程。
只有满足上述条件,生物墨水才能真正用于科研或临床端。
接下来看组成生物墨水的重要材料——合成聚合物、天然聚合物。合成聚合物包括聚乙二醇(PEG)及其衍生物聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和聚己内酯(PCL)等。其中,聚乙二醇是合成聚合物中最主要的物质之一,其具有良好的生物相容性,并且能在可编程生物材料中以多种不同方式使用,例如用作可编程水凝胶的基础。
天然聚合物则是生物墨水中最大的一类材料,该材料可细分为多糖材料和蛋白质材料:多糖材料又可细分为海藻酸盐、纤维素、透明质酸、壳聚糖和琼脂糖等;蛋白质材料则包括明胶、胶原蛋白、肽、蚕丝蛋白、纤维蛋白和纤维蛋白原等。此外,许多天然聚合物可以形成水凝胶,其可使细胞自由迁移,创造一个类似于细胞外基质的微环境。所以,由天然聚合物配方组成的水凝胶已成为生物3D打印不可或缺的组成部分。
“天然的生物材料能模拟体内的微环境,特别有利于细胞的增殖、分化和再生。”华夏司印创始人兼CEO陈慧敏博士告诉动脉网,“同时,天然生物3D打印,可以精密呈现体内空间结构,且通过调控天然生物材料的相关特性,还能更好地模拟体内的力学性能。”
天然聚合物与合成聚合物的分类情况 动脉网制图
在聚合物之上负载活细胞也成为行业尝试的方向。根据CAS西湖大学近期发布的《2024年未来健康:新兴生物材料报告》显示,活细胞能够增殖、分化,并与周围环境相互作用,且可以模仿自然组织的行为。因此,将活细胞融入生物墨水中可以构造功能性组织。
从活细胞的来源看,当下主要有干细胞、内皮细胞和组织特异性细胞。其中,由于干细胞具有多种分化能力和再生组织与器官的潜能,所以在行业使用最为广泛,这里面囊括了间充质干细胞、诱导多能干细胞、神经干细胞和造血干细胞等。
但光有活细胞远远不够,还需要添加生长因子来刺激特定的细胞行为。举个例子,当用生物打印的方式打印出一块皮肤,并把它贴在患者创口表面后,生长因子就会发挥出其化学诱导的作用,让更多的自体细胞向缺损部分聚集,最终让生物打印的皮肤与自身皮肤组织融为一体。从这个维度,就可以看出生长因子的重要性。
在业内,常用的生长因子有转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。
正是得益于在材料上的持续深耕,生物墨水现取得不小突破,且实现商业化。据了解,市面上已有基于明胶的水凝胶生物墨水,如Gel4Cell®(Amerigo Scientific)、BioInk®(RegenHU);基于甲基丙烯酰的生物墨水,如GelMA(SBP)、BioGel(Biobot)、Tissue Fab(Aldrich);基于海藻酸盐的CELLINK(CELLINK101)、基于钙磷酸盐的OsteoInk™(RegenHu)等等。
不过,当下销售的生物墨水和基于生物墨水的产品,绝大多数仍用于研究目的或设计中试实验,临床端的市场尚处于蓝海阶段。
面对巨大的窗口,生物墨水研发企业开始冲刺,意欲抢得行业先机。
创新势力持续涌入,
生物墨水赛道“大角逐”
在生物墨水赛道,各个国家的科研机构都在加码冲刺,意欲抢占先机。
以一定程度上代表了各国在生物墨水研究领域进展的期刊发文和专利申请为例,据《2024年未来健康:新兴生物材料》报告显示,在商业实体和非商业实体专利权人的地理分布上,美国(USA)和韩国(KOR)在商业和非商业领域都占主导地位。中国(CHN)目前在非商业领域中排名全球前三。
2003—2023年期间生物墨水专利权人的地理分布
图源:《2024年未来健康:新兴生物材料》报告
比如在2021年,清华大学团队就宣布研发出一款具有异质组织微环境的载细胞微凝胶双相生物墨水,其能更好地模拟天然组织和器官的结构复杂性和异质性;2022年,北大运动医学研究所余家阔教授团队与华夏司印合作发表有关《脱模法制备精细3D打印互穿水凝胶支架促进软骨分化》的文章;等等。
此外,在2023年国家儿童医学中心(上海)、上海儿童医学中心联合东华大学团队共同研发了一款新型生物墨水,该生物墨水具有抑菌性、形状保真、适合 3D 生物打印和细胞冻存保护等一系列特性,生物医学应用前景广阔。
除科研机构外,各地相关企业的进展也是重中之重。比如在实体专利权人商业领域中排名全球前三的瑞典,就诞生了BICO这一业内第一家上市的生物墨水研发企业。
BICO成立于2016年,前身为Cellink,其在2016年发布了首个即用型生物墨水,一举成名。该款即用型生物墨水是由纳米纤维素为基础的水凝胶,其提供了与细胞外基质相似的结构性质,细胞与墨水混合打印,这样打印机只要一个喷嘴,打印完的结构再进行交联,就变得易处理且耐冲击。由于该款生物墨水改变了科研人员使用生物墨水的方式,同时降低了成本,因此在3D生物打印领域发挥了重要作用。
随后在发展中,BICO不断推陈出新。据公司官网,BICO的生物墨水已有装在即用型墨水囊中的标准生物墨水、医疗级生物墨水,以及优化特定细胞增殖和分化的组织特异性配方生物墨水、用于光基生物打印的生物墨水四种。同时,针对不同的生物打印方式,BICO在每一类生物墨水中也划分了多样的产品。
Cellink旗下各类即用型生物墨水 图片来源:企业官网
值得一提的是,BICO在2023年推出了旗下首款医疗级生物墨水CELLINK Vivoink,该款生物墨水主要基于天然聚合物,如透明质酸纳米纤维素和藻酸盐。据官网介绍,CELLINK Vivoink中藻酸盐与 CaCl2 交联剂结合使用,可确保离子交联,从而在整个生物3D打印过程中保持打印结构的机械稳定性。
由于上市之后不断扩张,BICO现已并购多家企业,业务范围继生物打印(生物墨水属于该业务板块)后,增加了生命科学工具和生物自动化两大板块。从财报可以看到,生物打印的收入在2023年达到了6.6亿瑞典克朗(约4.4亿元人民币),处于持续增长中。
再看来自美国的生物墨水研发企业Humabiologics,该企业于2021年推出了世界上第一个天然人造胶原蛋白生物墨水和明胶生物墨水。Humabiologics创始人兼CEOMohammad Albanna博士接受媒体访谈时表示,天然人造胶原蛋白和明胶生物墨水能够解决行业当前使用动物源生物墨水的缺点。
国内生物墨水研发企业也逐渐涌现,大致与全球处于同一起步阶段。例如成立于2018年的创新企业华夏司印就自主研发生产了GMP级生物墨水,目前已开发出十多种,包括甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化I型胶原(Col1MA)、甲基丙烯酰化角质蛋白(KerMA)等。
华夏司印旗下生物墨水(部分) 图片来源:企业官网
“我们聚焦光敏天然生物3D打印材料,现研发生产的生物墨水已经覆盖90%人体组织器官,且全部采用cGMP生产线进行标准化、规模化生产,并进行了国内首个医用级生物墨水的主文档申报。”华夏司印创始人兼CEO陈慧敏博士表示,该企业参与了中检院生物墨水行业标准的制定。此外,华夏司印已与默克旗下知名生命科学品牌Sigma签约进行科研级生物墨水的OEM(代工生产),开启了全球化之旅。
又比如位于杭州的捷诺飞,该企业研发的系列生物墨水具有良好的可打印性和生物相容性,打印的支架有利于细胞存活、增殖、迁移和分化,可广泛应用于组织工程、干细胞、肿瘤、药物筛选等生物医学领域的研究。
捷诺飞旗下生物墨水的应用领域 图片来源:企业官网
不难发现,创新企业们持续深耕,现已取得重要突破。后续,得益于更多企业的进入与新的可能性产生,生物墨水赛道势必取得更大进展。
挑战与机遇并存,生物墨水赛道的故事才刚刚起步
在生物墨水赛道创新不断的当下,行业仍面临一些挑战。
《2024年未来健康:新兴生物材料报告》就提到了材料的机械强度不足、细胞活力和相互作用的影响、打印过程的控制以及成本等问题。
例如,一些用于制备生物墨水的合成聚合物和添加剂不具有生物相容性/细胞相容性,因此,在考虑到其生物学性能的基础上,要设计出独特的生物墨水面临着难题。像使用不含细胞外基质成分的合成高分子聚合物制成的水凝胶虽然能够支持细胞,但不能促进细胞生长,并且会限制细胞间的相互作用,从而形成非天然的微环境。
要解决这些挑战,需要跨学科的合作和创新,以实现生物墨水在临床应用中的更大突破。
“随着前期近十年的快速积累,生物墨水正从科研端的应用走向临床端的应用,所以我认为后面3到5年会是生物墨水行业爆发的一个阶段。”在华夏司印创始人兼CEO陈慧敏博士看来,作为生物3D打印技术的核心材料,生物墨水的重要性正日益凸显。
同时,陈慧敏博士也认为,众人拾柴火焰高,很多的技术突破需要基于全球市场的发展。因此,加强国际合作,大规模的临床应用才能展开,亦能真正促进生物3D打印行业的跃升。
毫无疑问,材料的持续突破、科研院所与创新企业的加速研发、国际合作的不断加强,生物墨水市场正积蓄巨大的势能。
在这个过程中,那些勇于探索、持续精进的开拓者们,也将享受到丰厚的回报。
(本文在撰写的过程中,得到了华夏司印创始人兼CEO陈慧敏博士的大力支持,在此表示感谢)
*封面图片来源:123rf
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