The Faecalibaculum rodentium (Fr) CRISPR-Cas9 system exhibits enhanced gene-editing precision and efficiency compared to SpCas9, with distinctive advantages in targeting the TATA box in eukaryotic promoters. However, the underlying molecular mechanisms remained unexplored. Here, we present cryo-electron microscopy structures of the FrCas9-single guide RNA (sgRNA)-DNA complex in both the R-loop expansion and pre-catalytic states, shedding light on its specialized recognition of the 5'-NRTA-3' protospacer adjacent motif (PAM) and the unusual overwinding of the sgRNA-DNA heteroduplex. Our investigations into the structure and extensive mutational analyses reveal that the phosphate lock loop plays a pivotal role in finely adjusting FrCas9's off-target sensitivity and catalytic efficiency. Remarkably, targeted residue substitutions in the phosphate lock loop and the PAM-distal region were found to synergistically enhance both the editing precision and efficiency of FrCas9. These findings advance our understanding of Cas9's accuracy and potency mechanisms while providing a molecular foundation for the rational design and development of next-generation CRISPR technologies.

2025-07-01·Journal of Advanced Research

Glutathione hybrid poly (beta-amino ester)-plasmid nanoparticles for enhancing gene delivery and biosafety

Article

作者: Han, Zhiqiang ; Tian, Rui ; Li, Qianru ; Chang, Shuangyan ; Hu, Zheng ; Ding, Jiahui ; Gao, Xueqin ; Zhu, Yuhe ; Tan, Songwei ; Yuan, Caiyan

INTRODUCTION:

CRISPR/Cas9 gene editing technology has significantly advanced gene therapy, with gene vectors being one of the key factors for its success. Poly (beta-amino ester) (PBAE), a distinguished non-viral cationic gene vector, is known to elevate intracellular reactive oxygen species (ROS) levels, which may cause cytotoxicity and, consequently, impact gene transfection efficacy (T.E.).

OBJECTIVES:

To develop a simple but efficient strategy to improve the gene delivery ability and biosafety of PBAE both in vivo and in vitro.

METHODS:

We used glutathione (GSH), a clinically utilized drug with capability to modulating intracellular ROS level, to prepare a hybrid system with PBAE-plasmid nanoparticles (NPs). This system was characterized by flow cytometry, RNA-seq, Polymerase Chain Reaction (PCR) and Sanger sequencing in vitro, and its safety and efficacy in vivo was evaluated by imaging, PCR, Sanger sequencing and histology analysis.

RESULTS:

The particle size of GSH-PBAE-plasmid NPs were 168.31 nm with a ζ-potential of 15.21 mV. An enhancement in T.E. and gene editing efficiency, ranging from 10 % to 100 %, was observed compared to GSH-free PBAE-plasmid NPs in various cell lines. In vitro results proved that GSH-PBAE-plasmid NPs reduced intracellular ROS levels by 25 %-40 %, decreased the total number of upregulated/downregulated genes from 4,952 to 789, and significantly avoided the disturbance in gene expression related to cellular oxidative stress-response and cell growth regulation signaling pathway compared to PBAE-plasmid NPs. They also demonstrated lower impact on the cell cycle, slighter hemolysis, and higher cell viability after gene transfection. Furthermore, GSH hybrid PBAE-plasmid NPs exhibited superior safety and improved tumor suppression ability in an Epstein-Barr virus (EBV)-infected murine tumor model, via targeting cleavage the EBV related oncogene by delivering CRISPR/Cas9 gene editing system and down-regulating the expression levels. This simple but effective strategy is expected to promote clinical applications of non-viral vector gene delivery.

2023-07-01·Med (New York, N.Y.)

Massively parallel CRISPR off-target detection enables rapid off-target prediction model building

Article

作者: Chen, Ye ; Hu, Zheng ; Wang, Yuyan ; Huang, Zhaoyue ; Jin, Zhuang ; Cao, Chen ; Tian, Rui ; Xie, Hongxian ; Zhong, Chaoyue ; He, Dan ; Zhao, Tingting ; Hong, Yongfeng ; Liu, Jiashuo ; Li, Lifang ; Dong, Dirong ; Sun, Lili ; Huang, Zheying

BACKGROUND:

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) genome editing holds tremendous potential in clinical translation. However, the off-target effect has always been a major concern.

METHODS:

Here, we have developed a novel sensitive and specific off-target detection method, AID-seq (adaptor-mediated off-target identification by sequencing), that can comprehensively and faithfully detect the low-frequency off targets generated by different CRISPR nucleases (including Cas9 and Cas12a).

FINDINGS:

Based on AID-seq, we developed a pooled strategy to simultaneously identify the on/off targets of multiple gRNAs, as well as using mixed human and human papillomavirus (HPV) genomes to screen the most efficient and safe targets from 416 HPV gRNA candidates for antiviral therapy. Moreover, we used the pooled strategy with 2,069 single-guide RNAs (sgRNAs) at a pool size of about 500 to profile the properties of our newly discovered CRISPR, FrCas9. Importantly, we successfully built an off-target detection model using these off-target data via the CRISPR-Net deep learning method (area under the receiver operating characteristic curve [AUROC] = 0.97, area under the precision recall curve [AUPRC] = 0.29).

CONCLUSIONS:

To our knowledge, AID-seq is the most sensitive and specific in vitro off-target detection method to date. And the pooled AID-seq strategy can be used as a rapid and high-throughput platform to select the best sgRNAs and characterize the properties of new CRISPRs.

FUNDING:

This work was supported by The National Natural Science Foundation of China (grant nos. 32171465 and 82102392), the General Program of Natural Science Foundation of Guangdong Province of China (grant no. 2021A1515012438), Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (grant no. 2020A1515110170), and the National Ten Thousand Plan-Young Top Talents of China (grant no. 80000-41180002).

项与珠海舒桐医疗科技有限公司相关的新闻（医药）

2025-12-09

·舒桐科技

基因治疗的“安全守门人”：CDE如何审视rAAV药物从实验室到病床的每一步

点击蓝字关注我们 12.9 在生物医药创新浪潮中，重组腺相关病毒（rAAV）基因治疗犹如一颗明星，为遗传病和难治性疾病患者带来曙光。但如何确保这类“活药物”的安全有效？国家药监局药品审评中心（CDE）近期在《Human Gene Therapy》发表的监管视角文章，系统揭示了中国对rAAV生物制品许可申请（BLA）的科学考量。本文将以更立体的逻辑，带你逐层深入这场科学与监管的共舞。 01 rAAV基因治疗：颠覆性技术的机遇与挑战 rAAV载体本质上是一种基因递送系统，其核心优势在于能够将治疗性基因长期、稳定地表达于人体细胞中。截至2025年，全球已有9款rAAV产品上市（见表1），涵盖血友病、脊髓性肌萎缩症等疾病。表1.已获得监管部门批准可进行商业销售的重组腺相关病毒产品产品然而，rAAV的高度复杂性也带来独特挑战： · 高度异质性：生产过程中易产生空衣壳、部分填充衣壳等杂质，影响疗效与安全性。 · 生产工艺多样：不同平台（如HEK293三质粒系统、杆状病毒-昆虫细胞系统）的病毒污染风险和质量控制标准不一。 · 技术快速迭代：检测方法（如滴度测定、空衣壳率分析）持续演进，监管需动态适应。这些挑战使得化学、生产和控制（CMC）成为rAAV药物获批的关键环节。中国NMPA近年来发布了一系列先进治疗产品（ATMPs）指南（见表2），逐步构建了覆盖研发全周期的监管框架。表2.中国先进疗法药物产品化学、生产及控制指南 02 监管基石：CMC指南体系如何支撑rAAV药物高质量发展中国的ATMPs监管体系以风险为基础，强调全生命周期管理。自2017年《细胞治疗产品研究与评价指导原则》起步，至2025年《rAAV体内基因治疗产品上市申请技术要点的发布，监管路径日益清晰。这些指南不仅明确了外源病毒控制、质量属性研究等要求，还体现了以下特点： · 分类精准化：针对体内基因治疗、体外基因修饰、溶瘤病毒等细分领域制定专属指南。 · 注重可操作性：例如《rAAV载体体内基因治疗产品临床试验申请CMC研究与评价指导原则》（2024年）详细列出了病毒清除验证、效价检测的具体方法。 · 动态更新：随着技术发展，指南通过问答形式及时回应行业关切，如2024年《复制型慢病毒检测常见CMC问题与要求》。这一体系的核心逻辑是：通过标准化要求降低不确定性，同时为创新留出空间。例如，对于空衣壳率这一关键质量属性（CQA），监管未设定统一限度，而是要求企业基于产品特性、工艺验证和临床数据制定合理标准。 03 核心战场：三大生产平台的外源病毒控制策略对比 rAAV生产中的外源病毒风险是监管关注焦点。不同生产平台因其材料与工艺差异，需采取针对性控制策略（见图1）：图1.主要生产平台的外源病毒污染控制流程图 part 1 HEK293瞬时转染平台 o 优势：工艺开发周期短，无辅助病毒引入。 o 风险：贴壁细胞放大难，原材料可能携带病毒。 o 监管要求：建立细胞库系统，对未处理半成品（UPB）进行病毒检测，并需进行病毒清除验证。 part 2 杆状病毒-昆虫细胞系统 o 优势：易于规模化，产量高。 o 风险：昆虫细胞可能潜伏弹状病毒，杆状病毒残留需控制。 o 监管要求：使用抗体中和UPB中的杆状病毒后检测外源病毒，并对纯化半成品进行残留病毒检测。 part 3 辅助病毒平台（如腺病毒/rHSV） o 优势：产率高，适合大规模生产。 o 风险：辅助病毒残留可能引发安全性问题。 o 监管要求：必须设计病毒去除/灭活步骤（如热灭活、纳滤），并对辅助病毒库进行严格鉴定。三种平台的综合对比如表3所示：表3. 三种主要重组腺相关病毒生产平台的比较监管强调“正交性”原则：即通过不同原理的步骤（如过滤、灭活）叠加控制风险，而非依赖单一手段。 04 质量控制的“显微镜”：关键属性如何影响安全有效性 rAAV的质量控制如同一场精密测量，需聚焦多个维度： · 效价（滴度）：常用ddPCR或qPCR测定载体基因组（VG）数量。剂量的精确性直接关乎疗效与毒性平衡，方法变更需进行可比性研究。 · 空衣壳率：空衣壳不仅无效，还可能竞争细胞受体或触发免疫反应。检测方法如分析型超速离心（AUC）、离子交换色谱（IE-HPLC）各有优劣，监管鼓励使用精度更高的新技术。 · 杂质控制：包括残留宿主DNA（要求≤10ng/剂）和工艺相关杂质。例如，HEK293细胞的E1基因残留需通过qPCR/ddPCR监控。 · 生物学活性：除物理滴度外，还需评估功能活性（如转基因表达效率），方法需与临床终点关联。值得注意的是，监管对某些属性（如rcAAV）尚未设定统一限度，而是基于风险评估。例如，rcAAV检测需结合细胞培养与qPCR，标准限度需根据方法灵敏度、批次数据合理设定。 05 未来展望：监管科学如何与技术创新同步进化 rAAV领域仍处于快速成长期，监管科学面临三重趋势： · 个性化挑战：针对不同血清型（如AAV8、AAV9）和适应症（全身vs.局部给药），质量控制策略需“量体裁衣”。 · 新技术应用：新一代测序（NGS）、机器学习等工具有助于提升外源病毒检测、杂质分析的灵敏度。 · 全球协调：中国CDE正通过加入ICH等机制，推动外源病毒控制、空衣壳率标准等领域的国际共识。监管的终极目标并非限制创新，而是通过科学、风险为基础的方法，让安全有效的产品更快惠及患者。正如CDE专家在文中所言，监管机构是创新的“助推器”而非“路障”。 rAAV基因治疗的商业化是一场马拉松而非冲刺。从细胞培养到临床给药，每一步都需科学严谨性与监管灵活性的平衡。中国的监管体系正通过指南迭代、沟通机制优化，展现其对前沿技术的包容与审慎。对于行业而言，早期与监管沟通、深度理解CMC要求，将是加速药物上市的关键；对于公众，了解这些幕后科学，能更理性看待基因治疗的潜力与边界。 @ 关于舒桐科技专注rAAV病毒载体生产与质控为基因治疗研发赋能在rAAV基因治疗药物从实验室走向临床的漫长征程中，稳定、高质量的病毒载体生产是至关重要的基石。舒桐科技深耕病毒载体领域，专注于为客户提供专业、可靠的rAAV病毒生产服务与关键的质控数据分析支持，助力攻克从工艺开发到IND申报的核心CMC难题。我们深刻理解推文中强调的“生产工艺多样性”所带来的挑战。舒桐科技依托成熟的工艺平台，可根据客户项目需求，提供灵活、可放大的rAAV生产服务，覆盖从质粒准备、细胞培养到病毒包装与纯化的全流程。我们致力于将客户的创新构想，转化为高质量、可供后续研究的病毒载体实物。舒桐科技的目标是成为您值得信赖的研发伙伴，通过提供坚实的生产与质控数据支持，助您加速研发进程，共同推动创新基因治疗药物的开发。上周精选 GeneRulor 推文题目：如何高效完成细菌全基因组功能获得性筛选？Tn5转座酶系统给出答案 👉点击查看原推文关于舒桐珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。如需获得更多信息，请咨询我们：电话： 400-6309596 18437963580（同微信）企业官网： http://www.generulor.com.cn 产品订购/技术支持： service@generulor.com

2025-12-04

·舒桐科技

突破ASO研发瓶颈！靶点精准筛选与序列优化实战全解析（上）

点击蓝字关注我们反义寡核苷酸（ASO）作为精准调控基因表达的核酸药物，已在神经退行性疾病、遗传病治疗领域崭露头角。然而，ASO药物开发的成败关键在于靶点的精准筛选和序列的合理设计。如何从海量候选位点中找到最优靶点？如何避开RNA二级结构的陷阱？体外验证时如何提高成功率？本文将结合实战经验，系统解答这些问题。 01 ASO作用原理与设计策略 ASO通过Watson-Crick碱基配对与靶RNA结合，主要利用RNase H降解mRNA或通过空间位阻调控剪接实现基因沉默。图1. Gapmer ASO通过DNA缺口区招募RNase H1酶，在结合位点精准切割靶mRNA 有效ASO需要满足的关键条件: （1）高特异性：与靶标RNA精准配对（2）高亲和力：稳定的杂交结合（3）低脱靶风险：避免非特异性结合（4）良好成药性：核酸酶稳定性与细胞摄取 02 ASO靶点设计步骤 2.1 转录本信息收集与注释全面收集靶基因的转录本信息，为后续位点筛选提供基础。关键步骤: （1）从RefSeq、GENCODE数据库获取所有已知转录本变体（2）标注5'UTR、CDS、3'UTR、内含子、外显子等结构域（3）识别起始密码子、终止密码子、polyA信号、剪接位点等功能元件实战提示: 同一基因可能有多个转录本变体，需要确认在目标组织中的主要表达形式，避免设计的ASO无法覆盖实际表达的转录本。 2.2 RNA二级结构预测与可及性评估 RNA二级结构直接决定ASO能否“接近”靶点。使用RNAfold等工具基于最小自由能算法预测二级结构，计算每个候选位点的单链概率和局部解链自由能。实战经验提示: l 优先选择环（loop）、凸起（bulge）等单链区域 l 避开茎区（stem）——这些区域即使设计出ASO，结合效率也很低 l 关注位点周围±10 nt的结构稳定性 l 避免高度结构化区域(ΔG < -8 kcal/mol) 2.3 基于作用机制的位点选择 RNase H介导的mRNA降解是最常用的ASO机制。优先区域: l 编码区(CDS)中后段 l 3'UTR前半部分位点筛选要求: l 避开强二级结构区域,选择单链可及性高的位点 l 考虑位点在核内和胞质中的可及性差异 l 避开起始密码子附近100 nt（翻译起始复合物保护） l 远离剪接位点±20 nt(除非目标是剪接调控) 化学修饰推荐: 采用Gapmer设计(DNA缺口+2'-MOE或LNA翼区)，这是目前临床验证最成熟的设计模式 03 序列设计与优化要点 3.1 序列长度与GC含量推荐序列长度：16-25 nt（过短特异性不足，过长易聚集） GC含量控制：40-60%是黄金区间 GC过高（>60%）:非特异性结合↑,易形成G-四联体 GC过低（<40%）:结合亲和力↓,Tm值偏低 3.2 避免不良序列模式 (1) 连续G碱基（≥4个）:可能形成G-四联体结构，导致非特异性蛋白结合 (2) CpG基序：尤其是CpsG（C-PS-G键），可能激活免疫系统——这在体内实验中可能引发意外的免疫反应 (3) 长同聚物序列：如AAAA、TTTT，会降低特异性 (4) 强自互补区域：使用OligoEvaluator检测发夹结构、二聚体，避免ΔG < -3 kcal/mol的区域 3.3 热力学参数优化 Tm值：推荐50-70°C 结合自由能（ΔG）：确保ASO-mRNA杂交足够稳定，但也不能过强导致难以解离不同修饰对Tm的影响化学修饰对Tm的影响: l 2'-OMe修饰:每个修饰约提升Tm 0.5°C l 2'-MOE修饰:每个修饰约提升Tm 1.0°C l LNA修饰:每个修饰约提升Tm 3-8°C 图2. 常用化学修饰类型 3.4 脱靶风险初步评估评估方法: 在全基因组及全转录组范围内检索是否存在连续16个碱基匹配的序列，且该序列位于基因或转录本上。风险分级: l 0-5个基因:低风险 l 5-20个基因:中风险 (需进一步细胞验证) l 20个基因:高风险 (建议更换靶点) 工具推荐： NCBI BLAST或Ensembl BLAST，参数设置为高敏感度。 04 珠海舒桐ASO设计服务珠海舒桐采用自主开发的智能设计平台，整合多维度生物信息学算法，为您提供从靶点筛选到序列优化的一站式ASO设计服务。我们的设计策略基于FDA批准药物的成功经验，确保每条候选序列都具备高活性、高特异性、低毒性的特点。完整设计流程七大步骤： Step 1: 靶基因获取与转录本注释操作内容: l 自动获取目标基因的所有转录本变体(RefSeq/GENCODE/Ensembl) l 标注5'UTR、CDS、3'UTR、外显子/内含子边界 l 识别剪接位点、起始密码子、终止密码子等关键区域② 滑窗算法全覆盖扫描 Step 2: SNP位点规避 l 数据来源: UCSC dbSNP数据库 l 规避原则: ASO序列中的任何一个碱基如果位于已知SNP位点，都可能导致: 部分人群ASO与靶mRNA结合亲和力下降、药物疗效个体差异显著、临床开发失败风险增加等 Step 3: 滑窗算法生成候选ASO库算法原理：使用滑窗算法对靶基因的反向互补序列进行全覆盖扫描 l 使用滑窗算法生成所有候选ASO l 自动标注外显子/内含子/UTR区域 l 对于5 kb mRNA,可生成约5000条初始候选序列初步筛选: l 排除GC含量<35%或>65%的序列 l 排除连续4个以上相同碱基(AAAA/TTTT/GGGG/CCCC) l 排除CpG基序(避免免疫激活) Step 4: RNA二级结构评估 l 预测工具:：RNAfold（Vienna RNA Package） l 算法：最小自由能（MFE, Minimum Free Energy） l 参数：Turner热力学模型，37°C生理条件 l 评估指标: 使用RNAplfold计算每个碱基与其他碱基互补配对的可能性 Step 5: 脱靶风险评估评估方法: BLAST全基因组比对功能注释分析: 对所有脱靶基因进行GO/KEGG富集分析，特别关注: l 核糖体蛋白编码基因（提示潜在细胞毒性） l 细胞周期调控基因（可能影响细胞增殖） l 凋亡通路基因（可能导致非特异性细胞死亡） Step 6: RNase H切割偏好性评分 l 评分依据：RNase H1酶对RNA-DNA杂交体的序列偏好性 l 算法：Position Weight Matrix(PWM) 基于大规模实验数据，RNase H1酶在不同序列背景下的切割效率存在显著差异。 Step 7: 跨物种序列保守性分析 l 评估靶点在不同物种间的保守性 l 支持临床前动物模型的研究设计 l 降低药物开发阶段的物种转换风险珠海舒桐高通量测序实验室为您提供专业的ASO靶点设计与筛选服务，标准周期15-20个工作日，交付Top 10-15条优化序列及完整筛选报告。包括非人灵长类物种保守性分析、物种特异性ASO设计、化学修饰AI优化建议等，全方位满足您的研发需求。项目启动流程简单快捷，只需提供靶基因信息(Gene Symbol或序列)和研究目的，我们将完成初步可行性评估并提供详细报价方案。下期预告:《ASO靶点筛选 | 从设计到验证的完整实验方案(下)》将详细介绍体外活性验证的标准流程，包括细胞系选择、转染优化、RT-qPCR检测、Western Blot蛋白验证等内容，敬请期待！参考文献 [1] Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-694. [2] Crooke ST, Witztum JL, Bennett CF, Baker BF. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metab. 2018;27(4):714-739. [3] Dhuri K, et al. Antisense Oligonucleotides: An Emerging Area in Drug Discovery and Development. J Clin Med. 2020;9(6):2004. 上周精选 GeneRulor 推文题目：基因编辑进入“LvNP时代”：递送技术的全新突破 👉点击查看原推文关于舒桐珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。如需获得更多信息，请咨询我们：电话： 400-6309596 18437963580（同微信）企业官网： http://www.generulor.com.cn 产品订购/技术支持： service@generulor.com

信使RNA寡核苷酸核酸药物

2025-11-27

·舒桐科技

成功案例揭秘｜慢病毒介导的基因敲除多克隆细胞株全流程解析

点击蓝字关注我们 # 基因编辑技术在生命科学研究中发挥着越来越重要的作用。CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑技术,因其操作简便、效率高、成本低等优势,已成为构建基因敲除细胞模型的首选工具。本文分享一例靶细胞CHD2基因敲除多克隆细胞株的成功构建案例,为相关研究提供参考。技术原理 CRISPR/Cas9系统源自细菌和古菌的适应性免疫机制,通过优化crRNA和tracrRNA形成单链向导RNA(sgRNA)，引导Cas9核酸内切酶对目标基因进行精准识别和切割。Cas9酶在sgRNA的引导下于目标位点产生双链断裂(DSBs),细胞随后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组修复(HDR)途径进行修复。NHEJ修复过程中常引入插入或缺失突变(Indel),导致基因移码突变,从而实现基因功能敲除。使用CRISPR/Cas9进行靶向基因组编辑项目实施方案 1 细胞质控与预实验项目采用小鼠结肠癌细胞系作为研究对象。细胞接收后进行严格的质量控制,包括细胞形态观察、支原体检测及细胞保种。为确保后续实验顺利进行,开展了两项关键预实验: 1. 药物筛选浓度优化:设置0-2 μg/ml的嘌呤霉素(Puromycin)浓度梯度,通过7天药物筛选实验,确定最佳药物筛选浓度。 2. 慢病毒感染效率测试：通过荧光标记慢病毒载体进行MOI(感染复数)梯度实验,确定靶细胞的最佳感染条件,既保证感染效率又维持细胞活性。靶细胞感PCDH-CMV-MCS-COPGFP-T2A-PURO 4X 白光靶细胞感PCDH-CMV-MCS-COPGFP-T2A-PURO 4X 绿光 2 靶点序列验证在sgRNA设计前,对靶细胞基因组中CHD2基因区域进行PCR扩增和Sanger测序验证。测序结果显示,该细胞系CHD2基因序列与NCBI参考序列完全一致,无随机突变,为后续精准设计sgRNA奠定基础。 3 sgRNA设计与质粒构建利用CHOPCHOP和CRISPOR等专业生物信息学工具,在CHD2基因编码区筛选出3条高效低脱靶的sgRNA序列。这些sgRNA经过以下评估: · 靶向特异性分析 · 脱靶风险评估 · GC含量优化 · PAM序列(NGG)验证将筛选的3条sgRNA分别克隆至慢病毒表达载体pLentiCRISPR中,该载体同时携带Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因(Puro)。质粒构建完成后进行全质粒测序验证,确认序列正确性。 4 慢病毒包装与细胞感染采用HEK293T细胞进行慢病毒包装,将3个重组质粒分别与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染。转染48-72小时后收集病毒上清,经0.45 μm滤膜过滤除菌后,对病毒液进行浓缩处理。使用最佳感染条件感染靶细胞,感染72小时后加入嘌呤霉素进行药物筛选,持续筛选5-7天以富集成功转导的细胞群体。 5 多克隆细胞系鉴定药筛完成后,收取细胞群体提取基因组DNA,采用跨越编辑位点的引物进行PCR扩增,PCR产物直接送Sanger测序。测序色谱图在sgRNA靶向位点出现明显的双峰或多峰信号,表明该位置发生了多种不同的插入/缺失突变,证实成功获得CHD2基因敲除多克隆细胞系。靶细胞 CHD2基因敲除多克隆细胞 4X 项目交付与质量控制 # 最终交付内容包括: 1. CHD2基因敲除多克隆细胞冻存管2支 2. 完整的实验报告及原始数据 3. 所有细胞冻存前均通过支原体检测细胞冻存前进行全面的形态学观察,显微镜下细胞状态良好,贴壁生长正常,无明显形态学异常,证实基因编辑未对细胞基本生物学特性造成显著影响。本案例展示了CRISPR/Cas9技术在构建基因敲除细胞模型中的成熟应用。通过规范的实验流程、严格的质量控制和科学的验证手段,成功构建了CHD2基因敲除多克隆细胞株,为后续功能研究提供了可靠的细胞工具。敲除多克隆的优势基于CRISPR/Cas9技术构建基因敲除多克隆细胞株的项目，已成为生命科学研究中的重要工具。敲除多克隆项目在技术层面具备多重优势，使其优于传统的单克隆筛选方法： · 高效性与稳定性：采用慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统，可高效感染多种细胞类型（包括分裂和非分裂细胞），并将基因编辑元件整合至基因组，实现稳定、持久的表达。预实验中的感染条件优化和药物筛选浓度测定，进一步保障了编辑效率与细胞活性的平衡。 · 快速可筛选性：载体携带的抗生素抗性标记（如嘌呤霉素抗性基因）使得研究人员能够通过药物压力快速富集成功编辑的细胞群体，显著缩短项目周期，避免繁琐的单克隆筛选流程。 · 高通量可扩展性：多克隆细胞株直接提供混合突变群体，无需经历耗时的单克隆扩增与验证阶段，特别适用于需要快速获得基因敲除模型的高通量筛选、初步表型分析或大规模功能研究。应用领域：支持多学科研究的通用平台基因敲除多克隆细胞株作为功能研究的基石，可广泛应用于以下方向： · 疾病机制研究：通过敲除特定基因，模拟疾病状态下的功能缺失，深入探究基因在肿瘤发生、代谢紊乱或神经退行性疾病中的分子机制。 · 表观遗传学分析：针对染色质重塑相关基因的敲除模型，为研究组蛋白修饰、DNA可及性及转录调控提供理想工具。 · 药物靶点验证与筛选：作为体外模型，用于评估候选药物对特定基因缺失细胞的效应，验证靶点有效性，或开展合成致死筛选以发现新的治疗组合策略。 · 基础信号通路解析：帮助揭示基因在细胞周期、DNA损伤修复、凋亡等关键通路中的生物学功能。舒桐科技致力于为科研工作者提供专业、高效的基因编辑服务,涵盖基因敲除、敲入、点突变等多种类型的细胞株构建。如您有相关需求或技术咨询,欢迎随时与我们联系。上周精选 GeneRulor 推文题目：Scientific Reports | 基因敲入效率的颠覆性提升：分步递送策略实现临床级iPSC的高效、安全编辑 👉点击查看原推文关于舒桐珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。如需获得更多信息，请咨询我们：电话： 400-6309596 18437963580（同微信）企业官网： http://www.generulor.com.cn 产品订购/技术支持： service@generulor.com

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