100 项与 Ciba Holding AG 相关的临床结果
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企業からの新技術と製品開発 重合法トナーの開発と工業化
作者: Hasegawa, Jun ; Kishimoto, Takuji
A review on microsuspension polymerized electrophotog. toners.
作者: Kohara, Teiji
A review on the properties and optical applications of cycloolefin polymers.
2003-01-01·Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan
作者: Kuniaki Goto ; Kiyoshi Watanabe
A review.This review describes the synthesis, properties, and the uses of the title compound
1. 为什么我们需要分子胶?分子胶有望成为细胞生物学和药物发现中不可成药靶标的突破性策略。传统上,小分子药物已成功用于调节酶的活性,由于它们的具有功能明确的结合口袋,能够结合细胞中的代谢物、配体和其他小分子。最适合药物化的蛋白质家族实际上是激酶和蛋白质受体,例如 GPCR 或核受体。然而,据估计,只有 10% 的编码基因组可通过传统小分子抑制剂进行药物化。其余 90% 包括参与蛋白质复合物或 DNA/RNA 结合的蛋白质,由于其功能,这些蛋白质往往具有平坦或突出的表面,并且已适应与其他蛋白质或核酸相互作用,但不与小分子相互作用。此外,转录因子和其他支架蛋白本质上往往是无序的,仅在蛋白质辅助因子存在的情况下折叠,因此通常无法与小分子结合。从概念上讲,PROTAC 通过结合并降解蛋白质作为治疗策略,增加了可药物靶点的数量,将非酶蛋白质包括在内。然而,PROTAC 却需要两个小分子配体,一个识别 E3 连接酶上的口袋,另一个结合感兴趣的靶标,因此,它们仍然需要靶标包含药物结合口袋。相反,分子胶很好地利用了不可成药的空间,通过创建或填充仅当两种蛋白质在胶水分子存在下结合时才出现的口袋。这为传统上不可成药的靶标的不同类型的调节提供了机会,例如,通过将靶标粘合到不同类型的效应蛋白上。分子胶的合理设计主要采用两种方法:即筛选以招募非天然效应物或增加对已知相互作用物的亲和力。IMiD 专注于蛋白质降解,通过招募转录因子作为 CRBN E3 连接酶的新底物,使药物转录因子成为可能;indisulam通过招募RNA 结合蛋白RBM39 降解为 DCAF15 E3 连接酶复合物,使药物成为可能。为了增加与天然 E3 连接酶的亲和力,Nurix 分子胶经过合理设计,可将 β-TrCP 募集到其天然底物 β-catenin(一种转录因子)上,且β-catenin的降解决定因子不存在磷酸化,正常情况下磷酸化后 E3 亲和力更高。在这种情况下,分子胶位于因β-catenin上缺乏磷酸基团而释放的口袋中,并且它重建了与β-TrCP的高亲和力表面。CypA 作为环孢菌素与钙调神经磷酸酶粘合以抑制其活性的效应蛋白而闻名 30 多年;然而,直到最近,CypA 才作为一种效应蛋白出现,可以更广泛地用于设计分子胶抑制剂,用于传统上难以药物治疗的靶点,例如 KRAS,作者应用结构引导设计来开发一种针对活性药物的分子胶。KRAS 的状态;这种分子胶将CYPA招募到 KRAS 上,阻断其他致癌相互作用,从而抑制 KRAS 驱动的细胞增殖。同样,分子胶被开发出来将 CRAF 粘合到其天然抑制蛋白14-3-3上。分子胶会锁定 CRAF/14-3-3 复合物,即使没有 CRAF 磷酸化(使复合物与 14-3-3 稳定在抑制性构象中所必需的)。下面,我们描述了一系列检测方法,这些检测方法将促进利用这些功能相互作用的分子胶的开发。分子胶可以彻底改变我们调节疾病相关蛋白质的能力,但它们的合理开发需要一个新颖的平台,其中的筛选方法和化学设计是重点,就像经典药物开发的情况一样。主要包括几种无细胞和细胞筛选方法,这些方法侧重于检测作为分子胶的小分子。2. 基于生化技术的分子胶筛选分子胶可使用一系列生化方法进行了鉴定,这些方法用于直接或间接监测蛋白质的接近或结合。通常,这些方法需要事先了解靶标和潜在效应蛋白。2.1 DEL胶筛选DNA 编码库 (DEL) 筛选是一种亲和力选择过程,可以筛选潜在的数万亿种化合物。每种化合物都单独标记有独特的 DNA 序列,然后可以对其进行扩增并用作化合物识别条形码。通常,使用拆分和库合成方法对库进行编码。简而言之,起始结构单元被标记有DNA序列,并且在添加第二个结构单元之后,DNA标签被延伸。通常,最多可以组装三个或四个结构单元的化合物,每一步都会产生数千个不同标记结构单元的混合物,从而形成巨大的 DNA 编码文库。DEL 筛选使用高蛋白质浓度(通常在 μM 范围内)来驱动配体结合复合物形成的平衡,读数与目标配体复合物的丰度相关。DEL 筛选(图1 A)已用于鉴定目标 BRD9 与 E3 连接酶 VHL 的分子胶。在这种方法中,BRD9 蛋白被固定,并使用 2 种不同的实验方法来鉴定潜在的小分子胶。将文库与固定化 BRD9 预孵育(允许形成二元复合物),或者将文库首先添加到 VHL,然后添加到固定化 BRD9(允许形成三元复合物)。为了控制非特异性结合,在不存在BRD9 的情况下将文库添加到固定基质中。洗涤 3 次后,蛋白质变性以释放结合物,并且 DNA 条形码经过 PCR 扩增和测序以鉴定结合化合物。为了计算富集,将二元结合的计数除以对照,将三元结合的计数除以二元结合,得到三元富集与二元富集的比率。较高的呈递物比率表明化合物与 BRD9 的结合更依赖于 VHL 的存在,这意味着更高程度的协同作用。该呈递物比率用于选择在与 BRD9 和 VHL 结合的三元复合物中具有不同程度协同性的小分子。筛选结果产生了一系列不同的结合行为,这取决于 VHL 配体和三嗪、BRD9 靶向核心之间的连接体的性质。然而,所有已识别的富集连接子本质上都相对较短且可循环。图1 .生化筛选技术被用来筛选分子胶。(A) DNA 编码文库涉及筛选带有独特 DNA 识别条形码标记的化合物,以找到促进相互作用的化合物。(B) 在束缚片段筛选中,将具有暴露的半胱氨酸残基的效应蛋白与目标肽和含有二硫键的片段文库一起孵育。对蛋白质具有固有亲和力的片段将与半胱氨酸紧密结合,并在检测中(通常通过 MS 或 FA)进行富集。(C) 在 TR-FRET 中,靶蛋白用供体荧光团标记,效应蛋白用受体荧光团标记。相互作用伙伴的紧密接近导致从供体荧光团到受体荧光团的 FRET。(D) AlphaScreen 是一种基于珠子的方法,依赖于两种感兴趣的蛋白质与特定珠子的结合。相互作用伙伴的紧密接近导致能量从一个珠子转移到另一个珠子并产生化学发光信号。(E) 在 E3 驱动的微阵列中,靶蛋白被固定到表面,并在存在和不存在假定的胶分子的情况下引入一系列效应器结合配偶体以测试任何相互作用。2.2 束缚片段筛选(tethered fragment screen)束缚依赖于片段和目标蛋白质之间可逆共价键的形成。如果靶蛋白在靶位点附近含有半胱氨酸残基,则可以直接使用,或者可以使用定点诱变在方便的位置引入半胱氨酸残基。然后在部分还原条件下将蛋白质与含有二硫键的片段文库一起孵育。对蛋白质具有固有亲和力的片段将靠近半胱氨酸结合,并且相对于非结合片段,硫醇-二硫化物平衡将有利于这些片段。因此,结合片段被蛋白质有效地选择并在检测中被富集。2.3 质谱检测先前已经表明,靠近可配体口袋的天然或工程半胱氨酸残基可用于促进稳定蛋白质-蛋白质相互作用的化合物的发现。这种二硫化物束缚方法已用于识别稳定 14−3−3 和 ERα 之间相互作用的化合物。此处,在存在或不存在ERα磷酸肽的情况下,将含有半胱氨酸的同种型 14−3−3 与含有二硫键的片段文库一起孵育。然后通过完整蛋白质质谱 (MS) 对蛋白质片段缀合物进行表征。2.4 荧光各向异性(Fluorescence anisotropy,FA) 检测在束缚方法的一种形式,使用雌激素相关受体 γ 的 DNA 结合域 (ERRγ DBD) 的 14−3−3 结合基序中发现的天然半胱氨酸残基来构建可用于 FA 筛选的磷酸肽探针方法。ERRγ-磷酸肽用荧光探针标记,通过 FA 的增加来监测片段诱导的磷酸肽与 14−3−3 的结合,图1 B。在该筛选方法中,荧光标记的含半胱氨酸的肽是最初与 14−3−3 的结合较弱,由低 FA 出发(低各向异性)证明。观察到的各向异性的增加证明了在还原条件下与二硫化物文库孵育后通过化合物结合来稳定蛋白质-肽复合物(14-3-3 与标记肽的结合增加)。使用 FA(或荧光偏振)筛选包含 350, 000 个小分子的库。鉴定到了 NRX-1532,它们能够增加 β-TrCP 和突变 β-连环蛋白肽之间的结合亲和力。证明双磷酸化肽 (pSer33/pSer37) 与 β -TrCP 的结合亲和力为 2 nM,而非磷酸化肽 (Ser33/Ser37) 与 β -TrCP的结合亲和力明显较低 (>100 μM)。2.5 时间分辨率荧光共振能量转移 (TR-FRET)基于 FRET 的方法的基本原理是供体和受体荧光团之间的能量转移。当这些部分彼此靠近时,入射光对供体的激发导致能量转移到受体。然后受体发射特定波长的荧光信号。因此,可以通过在每个伙伴上附加荧光标记并测量能量转移程度来监测分子之间的分子相互作用。Wang等人使用免疫调节药物 (IMiD) 衍生物 ALV-02–146–03 。在建立基于 TR-FRET 的 CRBN:Helios 二聚化测定之前,证明了与 CRBN 的参与。他们使用这种方法筛选了一个小型、集中的化合物库。经过几轮优化后的筛选导致了 ALV1 的设计,它已被证明可以诱导 Helios 的 CRBN 依赖性降解,图1 C。2.6 AlphaScreenAlphaScreen(ALPHA,放大发光邻近均质测定)是一种基于微珠的方法,用于研究微孔板形式中分子之间的相互作用。其原理依赖于将两种感兴趣的蛋白质结合到特定的珠子上。当两个分子之间发生相互作用时,这会导致两个珠子非常接近,在激光激发供体珠子时,使周围的氧气转化为更激发的单线态,然后扩散以与受体发生反应产生化学发光信号的珠子。该方法已用于测量 CDK12KD/CCNKΔC 和 DDB1 之间的相互作用。这里将生物素化的 FLAG-Avi-DDB1 构建体与 6HisCDK12KD/6HisCCNKDC(WT 或 G731 突变体)一起使用,从而可以证明存在改进的 AlphaScreen 信号/相互作用HQ461,表观 EC 50为 1.9 µM。AlphaScreen 测定还用于显示 THZ531 抑制 CDK12KD/CCNKΔC/DDB1 复合物的 HQ461 依赖性形成的竞争效应,图1 D。2.7 E3驱动的微阵列在诺华公司在未发表的通讯中描述的另一种方法中,1 个蛋白质微阵列用于筛选 VHL 和数千种蛋白质之间化合物诱导的相互作用,展示了一种 E3 连接酶驱动的目标不可知的分子胶发现方法。蛋白质微阵列是一种高通量方法,可用于并行监测许多蛋白质的相互作用。该方法由结合有捕获蛋白阵列的支持表面组成。随后,这允许在存在和不存在假定的胶分子的情况下引入结合配偶体,并监测相互作用,图1 E。发现几个小分子可以稳定 VHL 和 CDO1 之间的相互作用,CDO1 是一种参与调节的蛋白质。半胱氨酸代谢。这些化合物随后被证明可以促进 CDO1 的多泛素化和蛋白酶体降解。在使用微阵列的另一个例子中,人类蛋白质组微阵列被用来识别天然产物衍生的分子胶,用于靶向 E2F2 降解。3 基于细胞的分子胶筛选方法从历史上看,分子胶的发现基本是是偶然发生的,而不是通过应用设计的策略。主要是通过基于活力/毒性的细胞筛选或基于报告分析的其他表型筛选来鉴定分子胶,并且它们作为分子胶的作用模式只是随后发现的。在过去几年中,为了寻找分子胶,出现了几种细胞方法。在下面描述总结这些方法(图 2)。图2 .基于细胞的筛选技术。已使用一系列方法来筛选分子胶引起的接近和降解。(A) 在 TR-FRET 中,裂解细胞并添加针对每个相互作用伙伴的特异性标记抗体。相互作用伙伴的紧密接近导致从供体荧光团到受体荧光团的 FRET。(B) 在 Nano-BRET 中,相互作用的伴侣被表达为与生物发光蛋白供体(例如荧光素酶)或荧光蛋白受体的融合蛋白。相互作用伙伴的接近导致从供体到受体的 BRET。(C) 在免疫共沉淀中,将结合伴侣和化合物添加到固定靶标中,然后对复合物进行免疫沉淀并通过 SDS-PAGE 进行分析。(D)在邻近连接测定中,POI表达为与混杂的生物素连接酶(例如BioID)的融合蛋白。添加生物素后,POI 附近的蛋白质被生物素化,随后在 MS 分析之前用链霉亲和素珠捕获。 (E) 酶片段互补依赖于用小标签(例如 HiBiT)标记 POI,该小标签可以与其互补亚基相互作用以形成纳米荧光素酶。POI 降解后,不会产生荧光素酶信号。(F) 在信号降解增益测定中,在 GFP 表达细胞中,POI 表达为与脱氧胞苷激酶(dCK) 的融合蛋白,将非天然核苷2-溴乙烯基脱氧尿苷 (BVdU) 转化为毒物。POI 降解后,细胞活力得以保留,并且可以测量GFP 。应当指出的是,免疫共沉淀和邻近连接是较低通量的筛选方法。3.1 活力/毒性测定活力测定测量细胞的代谢活动。例如,MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)−2,5-二苯基溴化四唑)测定基于代谢活跃的细胞将黄色四唑盐MTT 还原为紫色甲臜。甲臜的吸光度可以在酶标仪中测量。相反,细胞毒性测定测量由于细胞死亡而发生的膜完整性的变化。这种名为 Cell tox green 的检测方法使用一种染料,该染料被排除在活细胞之外,但优先对死细胞的 DNA 进行染色。当染料与 DNA 结合时,其荧光特性显着增强。活细胞的荧光没有明显增加。因此,染料与死细胞 DNA 结合产生的荧光信号与细胞毒性成正比。Indisulam最初是通过 MTT 活力测定发现的一种抗肿瘤药物。其作为 DCAF15 和 RBM39 胶合剂的作用机制于 2017 年才被确立。他们生成了具有Indisulam耐受性的 HCT116 克隆,并通过外显子组测序鉴定了错义突变。RBM39基因在3个克隆中发生突变。用 WT 或突变 RBM39 瞬时转染 HCT-116 细胞,然后用 indisulam 处理,结果表明 RBM39 突变赋予对 indisulam 抗性。蛋白质印迹分析显示,胰岛素中毒需要 RBM39 降解。从用 indisulam 处理的 CRISPR 工程 RBM39–3xFLAG HCT116 细胞裂解物中纯化抗 FLAG,然后进行胰蛋白酶消化和 MS 分析,结果显示 DCAF15 是招募伙伴。Stabicki等人使用了一种不同的方法。发现另一种Cyclin K 分子胶 CR8 。他们挖掘数据库,将临床和临床前小分子的细胞毒性与数百种人类癌细胞系中 E3 连接酶成分的 mRNA 表达水平关联起来。然后,通过对已识别的 E3 连接酶成分进行 CRISPR 介导的失活来验证这种依赖性,并检查这是否可以挽救相应的药物引起的毒性。他们确定了 CR8 毒性与 DDB1 mRNA 水平之间的相关性。运用定量蛋白质组 MS 来检查用 CR8 处理细胞后的蛋白质丰度,发现 Cyclin K 是唯一受影响的蛋白质。Cyclin K 的降解可以通过抑制蛋白酶体、 neddylation 或 E1 泛素激活酶来挽救。然后,他们进行了以 E3 泛素连接酶为重点的 CRISPR-Cas9 抗性筛选,并确定了 DDB1、CUL4B、RBX1、NEDD8、NAE1 和 UBA3 为涉及的关键蛋白。GSPT1/2 降解剂是通过使用细胞活力测定 CellTiter-Glo在五种患者来源的细胞系中筛选沙利度胺衍生物的重点文库来鉴定的。他们鉴定了几种有效的靶标(EC50 < 1 µM),其中一些在所有五种细胞系中均具有活性,而另一些则表现出选择性,暗示了不同的作用机制。他们通过在高浓度来那度胺存在下进行配体竞争实验以及在 CRBN 敲除细胞中进行细胞活力测定,证实了 CRBN 依赖性作用机制。他们通过对一些命中的免疫印迹显示新底物 GSPT1 的降解,但在与抗增殖效力相关的 Caspase-Glo 测定中诱导细胞凋亡,而不是 IKZF1。基于多重 MS 的蛋白质组学分析表明,化合物 6 (SJ6986) 在对 MV4-11 细胞(一种急性白血病细胞系)进行处理后,选择性降低了约 9000 种蛋白质中 GSPT1 和 GSPT2 的丰度。这是第一个报道具有生物利用度的 GSPT1 降解剂。3.2 报告基因检测报告基因测定通过将报告基因与感兴趣的转录因子的调控序列连接来测量基因表达,该报告基因的产物可以很容易地检测和定量。然后报告基因充当转录因子活性的替代物。常见的报告基因包括β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶和GFP(绿色荧光蛋白)。吸光度、荧光或发光检测方法通常用于测量表达的报告基因蛋白图2 E。在 A549 细胞中使用报告基因测定,HQ461 被鉴定为来自 NRF2 高通量筛选的命中结果。对 A549-HQ461 抗性细胞进行的全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选表明,HQ461 毒性需要 DDB1、RBX1 和泛素蛋白酶体降解系统的其他调节因子。按照之前针对 indisulam 发表的相同策略,他们生成了 HQ461 抗性 HCT116 克隆,并通过全外显子组测序鉴定了 CDK12 中的错义突变。用WT或突变CDK12瞬时转染HCT-116细胞,然后用HQ461处理表明CDK12突变赋予对HQ461的抗性。Western Blot 研究表明,HQ461 会诱导 Cyclin K 降解,并且在存在蛋白酶体或 neddylation 抑制剂的情况下可以抑制这种降解。3.3 TR-FRET 检测虽然 TR-FRET 测定主要用于筛选 PPI 抑制剂,但它们已成功用于分子胶的发现,图2 A.Tang等人发表了一种细胞裂解物 TR-FRET 测定法来筛选 SMAD4-SMAD3 相互作用的调节剂。通过使用细胞裂解物,他们避免了对纯化蛋白质成分的需要。2022 年,开发了一种内源性细胞 TR-FRET 测定法,测量靶标参与和降解,以分析 BRD4 的 PROTAC。它依赖于使用 BRD4 抗体、标记的抗物种纳米抗体作为供体,荧光标记的 BRD4 抑制剂 JQ1 示踪剂作为受体。该测定使用未修饰的细胞系,并且可以部署到其他感兴趣的蛋白质,这些蛋白质具有特定的抗体,并且可以识别示踪剂,甚至非特异性的示踪剂。3.4 NanoBRET 检测NanoBRET(纳米荧光素酶生物发光共振能量转移)是一种用于测量活细胞中的结合事件、信号传导途径或受体运输的检测技术。在 BRET 中,能量转移发生在荧光素酶供体和荧光团受体之间,图2 B。2023 年,研究人员使用 NanoBRET CRBN 占用测定来研究基于 CRBN 的降解剂的药理学。该测定测量活细胞中荧光 CRBN 示踪剂从 NanoLuc 标记的 CRBN 中置换后 BRET 信号的剂量依赖性减少。他们筛选了 14 种沙利度胺衍生物来建立构效关系。他们特别关注两种新底物:IKZF1(一种转录因子)和 GSPT1(一种翻译终止因子)。他们还对两种蛋白质进行了降解测定,以量化每种化合物所实现的降解。他们的数据为设计没有 GSPT1 活性的降解剂提供了方向,从而避免了广泛的细胞毒性。3.5 蛋白质降解:酶片段互补 (EFC) 测定EFC 基于两种重组 β-半乳糖苷酶 (β-gal) 酶片段,它们充当酶受体 (EA) 和酶供体 (ED)。单独地,这些片段是无活性的,但当组合时,它们形成一种活性β-半乳糖酶,水解其底物以产生化学发光信号。这些检测方法是 DiscoverX 几年前开发的,具有多种应用,其中之一是 PathHunter 降解检测方法,图2 E。在这种情况下,目标蛋白用小肽片段标记,而大 β-gal 片段则用小肽片段标记。包含在孵育时间结束时添加到裂解缓冲液中的检测试剂中。Bonazzi等人使用PathHunter发现了一种促进锌指转录因子 IKZF2降解的分子胶。锌指转录因子是具有挑战性的靶标,因为它们基本上是非结构化的并且没有配体结合位点。然而,密切相关的 TF(IKZF1 和 IKZF3)已成为 IMiD 的目标,IMiD 与 CRBN E3 连接酶结合,然后招募 IKZF1/3,诱导降解。基于这些理论,使用 IKZF1 分子胶降解剂泊马度胺作为 SAR 的起点。泊马度胺结合的 CRBN 与 IKZF1 锌指 2 中的甘氨酸 β-发夹结合。IKZF1 和 IKZF2 的锌指 β-发夹有一个氨基酸不同,这介导了泊马度胺对 IKZF1 的选择性。因此,作者旨在找到一种可以容纳IKZF2 锌指 2 中组氨酸的化合物。他们使用 PathHunter 细胞降解测定法对 ProLabel 标记的 IKZF2 或 IKZF1 进行 SAR,以鉴定促进 IKZF2 而不是 IKZF1 降解的化合物。使用 CRBN 敲除细胞系证实降解依赖于 CRBN,并报告化合物 DKY709 作为 IKZF2 的选择性分子胶降解剂。NanoBiT 和 HiBiT 系统是酶片段互补技术的其他示例,该技术依赖于用酶的小亚基标记感兴趣的蛋白质 (POI),该酶的小亚基可以与其互补亚基相互作用形成发光复合物,图2 E与 PathHunter 类似,NanoBiT 和 HiBiT 系统的区别在于用于创建 POI 融合的小肽标签,通常只有 11 个氨基酸。较小尺寸的肽标签很有吸引力,因为它适合内源蛋白的 CRISPR-Cas9 基因组编辑,而且因为它不太可能干扰细胞内 POI 的正常生物功能。该方法首先是使用工程荧光素酶 NanoLuc 开发的,这是一种源自深海发光虾的 19 kDa 酶。NanoBiT 报告系统使用 11 个氨基酸肽 (SmBiT) 和 18 kDa多肽(LgBiT),每个都与目标蛋白融合。两个亚基弱关联(Kd > 100 µM),因此它们的互补由靶蛋白的相互作用决定。该小组后来开发了 HiBiT 报告系统,该系统利用高亲和力(LgBiT Kd = 700 pM)11 氨基酸肽标签实现发光定量。在此系统中,HiBiT 标记的 POI 可以在细胞裂解并添加 LgBiT 和 NanoLuc 底物 Furimazine 后进行定量。研究小组表明,发光信号与细胞中的蛋白质水平呈线性相关,并且可以在低至 1 amol 的浓度下检测到该信号,相当于每个细胞约 10 个分子。HiBiT 技术已用于分子胶发现。例如 ,使用 HiBiT-BRD4 降解剂测定来鉴定在用分子胶化合物“1a”处理后参与 BRD4 降解的连接酶。他们使用泛素蛋白酶体系统中包含 1158 个基因的 CRISPR/Cas9 敲除文库,发现沉默 DCAF-16(Cul4 连接酶复合物的底物识别成分),在用 1a 处理后可以挽救 BRD4-HiBiT 信号。3.6 蛋白质降解:信号分析增益通过信号减少来测量活性的降解测定的一个局限性是筛选输出被诱导细胞毒性的化合物污染。2021 年,Koduri等人设计了信号增益测定来寻找 IKZF1 的降解剂。他们在 293 细胞中将脱氧胞苷激酶(dCK)的修饰(一种将非天然核苷2-溴乙烯基脱氧尿苷 (BVdU) 转化为毒物的酶)与 IKZF1 融合(图2 F)。因此,蛋白质降解可防止形成毒素并给出抗性的正选择读数。在 BvdU 存在的情况下,对文献中先前未表征的 IMiD 类分子进行化学筛选,结果将 MI-2-61 和 MI-2-197 鉴定为分子胶降解剂。3 MAPPIT哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱捕获(MAPPIT,mammalian protein-protein interaction trap)是一种基于 JAK-STAT 信号转导途径的用于研究 PPI 的二杂交系统。诱饵蛋白和靶蛋白(感兴趣的靶标和选择的效应蛋白)与缺陷的细胞因子受体嵌合体相关。当特定诱饵和靶蛋白嵌合体之间发生 PPI 时,活性会恢复,JAK-STAT 信号传导导致报告基因表达受 STAT3 响应启动子控制。该系统已扩展到包括各种适应,例如用于识别 PPI 调节剂的反向 MAPPIT、用于分析化合物和蛋白质之间相互作用的 MASPIT(哺乳动物小分子-蛋白质相互作用陷阱) 、用于高通量的阵列 MAPPIT阵列蛋白质的筛选。Petschnigg等人开发了一种类似的方法,称为 MaMTH,用于哺乳动物膜双杂交测定。在此测定中,膜诱饵蛋白标记有泛素的 C 端一半 (Cub) 和嵌合转录因子 (TF),而胞质或膜结合的靶蛋白则标记有泛素的 N 端一半 (Nub) 。诱饵和猎物相互作用后,形成假泛素,该假泛素被胞质去泛素化酶识别,导致 TF 裂解并表达荧光素酶报告基因。4. Tango 和 split TEV 检测另一种有前途的方法是使用分离 TEV 或 Tango 检测。2006 年,有人开发了 Split-TEV 技术来监测哺乳动物细胞中的 PPI。该方法基于功能性 TEV 蛋白酶片段互补和随后的报告蛋白水解激活,因此结合了裂解酶和报告基因介导的检测的优点。他们证明这种方法可用于研究受体二聚化、受体信号传导、诱导型胞质 PPI 或受体酪氨酸激酶(RTK) 激活。他们还表明,当分子胶雷帕霉素诱导时,split-TEV 技术可用于测量细胞质中 FKBP 和 FRB 的相互作用。他们使用了“仅蛋白水解”分裂 TEV 报告基因测定,其中 FKBP 和 FRB 的相互作用导致 TEV 活性,导致荧光素酶的释放,该酶可以翻转荧光素以产生光。在该测定中,雷帕霉素浓度的增加导致发光单位的增加。2008年修改了Split-TEV方法,研究了三类受体,即G蛋白偶联受体、RTK和类固醇激素受体,并将其称为Tango。他们发现细胞内受调节的定位足以区分游离的和相关的 TEV 和转录因子融合伴侣,因此不需要裂解 TEV蛋白酶。因此,在他们的检测中,转录因子通过含有特定病毒蛋白酶 TEV 切割位点的接头与膜受体结合。受体的激活会招募与蛋白酶融合的信号蛋白,两个伙伴之间的相互作用导致转录因子的裂解和释放,该转录因子易位到细胞核,在那里激活荧光素酶报告基因。5. 分子胶表征的较低通量测定下面我们描述两种方法,更传统的 IP 和最近的邻近标记技术,可用于细胞中分子胶相互作用的低通量表征。5.1 IP 或亲和纯化分析在免疫共沉淀 (co-IP) 测定中,目标蛋白与固定在支持物上的特异性抗体结合。添加感兴趣的小分子后,对目标蛋白进行免疫沉淀,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和蛋白质印迹分析检测免疫沉淀蛋白及其结合配偶体的存在,图2 C如果小分子促进两种蛋白质之间的相互作用,则会检测到 co-IP 信号的增加,并表明该化合物作为潜在的分子胶成功稳定了蛋白质-蛋白质相互作用。沙利度胺是第一种分子胶,最初由 CIBA 于 1952 年发现,随后由格伦泰化学公司于 1957 年作为镇静剂开发,现在因其抗炎和抗肿瘤特性而被使用,直到 2010 年才被验证为分子胶。研究人员使用沙利度胺磁珠对细胞裂解物进行亲和纯化,并鉴定出与沙利度胺相互作用的 CRBN 和 DDB1as 蛋白。使用纯化的蛋白质,他们表明沙利度胺与 CRBN 结合,并由于其与 CRBN 的相互作用而与 DDB1 间接相互作用。2014 年,多个研究小组表明,沙利度胺类似物来那度胺可增加 CRBN 泛素化和降解 IKAROS 蛋白家族成员的活性。沙利度胺与 CRBN-DDB1 复合物的晶体结构确定了其作为分子胶的作用。5.2 .邻近连接分析BioID(邻近依赖性生物素识别)是一种依赖于大肠杆菌生物素连接酶 BirA的邻近标记方法,该酶在 R118G 处发生突变。POI在细胞中以BioID融合蛋白的形式表达,添加生物素后,会释放生物素酰-5'AMP,导致10 nm距离内蛋白质赖氨酸残基的混杂生物素化。然后用链霉亲和素包被的珠子沉淀蛋白质,并使用 MS 进行分析,图2 D。然而,BioID 的标记动力学很慢,因此需要足够的时间进行生物素标记(18-24 小时)。这限制了其在研究瞬态、短期 PPI 方面的应用。由此,设计了两种高效、混杂的 BirA 突变体,称为 TurboID 和较小的 miniTurbo,只需 10 分钟即可实现邻近标记。然而,TurboID 和 miniTurbo 都在哺乳动物细胞中表现出毒性。AirID(用于邻近依赖性生物素识别的前体 BirA)是另一种用于邻近标记的酶,由于其毒性降低,因此比 TurboID 有优势,但它需要更长的标记孵育时间。UltraID 是邻近连接酶库的最新成员;它的分子量为 19.7 kDa,是迄今为止设计的最小的酶,并且表现出高效的生物素化,而没有使用 TurboID 观察到的高水平背景标记。邻近连接测定已用于分子胶的研究。使用 AirID-CRBN 融合物,并检测到在用已知的分子胶泊马度胺处理后,SALL4 和 IKZF1 的生物素化有所增加。5. 结论和未来展望生化方法可能非常适合邻近诱导分子胶的识别和表征,并且预计它们在分子胶的合理筛选中的使用会增加。然而,由于其不同的作用机制和细胞系统内潜在复杂的相互作用,下游优化和验证仍然具有挑战性,这将需要结合下面将简要提到的方法。我们这里描述了一系列可用于创建先进的生化和细胞测定的技术,以系统筛选和验证潜在的分子胶。然而,需要仔细考虑这些测定的构建,以确保在测定中可以充分测量和控制蛋白质-蛋白质复合物浓度变化的检测(图3)。图3. 筛选考虑因素和未来机会。总结了筛选分子胶时的一些注意事项,以及未来可用于分子胶筛选的一些筛选技术的示例。(A) 在 MAPPIT 中,诱饵和猎物蛋白与缺陷的细胞因子受体嵌合体相关。当分子胶诱导诱饵和猎物接近时,嵌合体活性恢复,JAK-STAT 通路被激活,导致报告基因表达。(B) 在天然 MS 中,靶蛋白可以与各种效应蛋白和推定的胶一起孵育,并且可以使用 MS 直接测量未结合的蛋白质和/或所得复合物。(C) 在 Split-TEV 报告系统中,每个相互作用伙伴都用 N 端 TEV 或 C 端 TEV 标记,在分子胶诱导相互作用伙伴接近时,TEV 活性导致荧光素酶释放,在底物的存在。(D) 二聚化考虑因素。在旨在识别诱导二聚化的分子胶的 FRET 测定中,需要考虑可能有助于信号的复合物。在此示例中,不同批次的蛋白质分别用供体和受体标记,只有 50% 的胶诱导复合物会产生信号。(E) 信号窗口(背景信号和最大信号之间的差异)取决于相互作用蛋白的浓度、靶标和效应器之间的亲和力 (KTE)、胶水和效应器之间的亲和力 (KEG) 以及协同因子 α 。高通量筛选平台随后提供了一种从大型化合物库中识别潜在分子胶的有效方法。无论选择哪种方法,都应设计测定方法来测量测试化合物对感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作用的影响。在初步筛选中鉴定活性物质后,应采用正交方法,例如表面等离子共振(SPR),以定量评估化合物引起的 PPI 变化。当然,增强 HTS 活性物质和那些正交验证的命中的相关性需要基于细胞的测定来评估细胞环境中的分子胶活性。与传统药物发现一样,结构信息对于理解分子胶调节 PPI 的分子机制至关重要。在可以表达和纯化蛋白质的地方,应利用 X 射线晶体学或冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 来探索如何填充口袋以提高亲和性或协同性和选择性。此外,核磁共振(NMR)光谱可用于阐明潜在分子胶与其结合伴侣的结合模式。除了考虑筛选方法和要粘合的蛋白质试剂之外,决定在生化测定中筛选哪些文库也同样重要。这应该与分子胶通常的运作机制有着复杂的联系。总之,与 PROTAC 相比具有更多药物特性的小分子可以有效诱导蛋白质接近并调节靶蛋白功能和浓度,这一发现为集中精力合理设计和发现提供了动力。我们正处于进入分子胶药物发现领域的激动人心的阶段,幸运的是,现在可以将分析方法、生物物理和结构研究以及人工智能驱动的机器学习方法方面的技术进步结合起来,以帮助更好地理解促进新的和增强的蛋白质-蛋白质相互作用的小分子的分子特性。我们可能正在见证药物发现的一场革命,这可能会带来广泛的新的靶向治疗机会。声明:发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要,并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断,后果自负。若有侵权,告知必删!长按关注本公众号 粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看,请点这里↓
过去一年,多肽类药物备受市场关注。一方面,GLP-1 多肽药物点燃肥胖和代谢性疾病治疗市场,另一方面,多家长期致力于开发多肽偶联核素的核药企业相继被国际制药巨头收购 (例如,礼来:布局新一代放射性配体疗法,收购POINT 生物制药公司)。核药赛道火爆,备受国内外药企追捧。本文解读一篇发表于2021年《自然综述-药物发现》杂志的综述文章,解读过去100年多肽类药物发展历史和趋势。自1922年胰岛素的首次医疗应用以来,肽类药物在治疗糖尿病、癌症、骨质疏松症、多发性硬化症、HIV感染和慢性疼痛等多种疾病中发挥了重要作用,目前全球市场上已有大约80种肽类药物,并且有超过150种正在临床开发阶段,另外还有400至600种正在进行临床前研究。本文不仅回顾了早期研究方法,例如通过对天然激素如胰岛素进行化学修饰以提高其稳定性和药效活性的方法,对于今天仍然具有重要意义的教训。同时,也探讨了正在崭露头角的新策略,比如毒液组学(venomics)和肽展示库技术,为肽类药物的发现开辟了全新的途径。此外,还分析了在当前制药环境中,肽类药物可能发挥独特价值的领域,特别是在传统小分子药物或生物制剂无法有效干预的治疗领域。然而,为了使肽类药物充分发挥其潜力,尚需解决一系列挑战,包括改善口服生物利用度、增加血浆稳定性、延长体内循环半衰期以及降低生产成本等关键问题。肽类药物疗法领域的发展简史肽类药物的起点可以追溯到肽激素时代,其中胰岛素作为首个来源于内源性激素的疗法,它最初是从牛和猪的胰腺中提取获得,也开启了肽类药物研发的大门。1954年,维克多·杜·维尼奥领导的研究团队完成了催产素和加压素的全合成工作,并因此获得了1955年的诺贝尔化学奖。这是肽类化合物化学合成的重大突破。在1950年代,人工合成的肽激素如催产素和加压素进入临床应用,瑞士Ciba和Sandoz等工业集团的参与进一步推动了肽类药物产业的兴趣与商业化进程。然而,早期的溶液相化学合成方法效率低下,直到1963年固相多肽合成技术的发明及其与高效液相色谱纯化方法的结合,才使得肽类药物的研发引起了制药行业的广泛关注。布鲁斯·默里菲尔德提出了在固相上组装氨基酸以自动化合成多肽的概念,从而发明了固相多肽合成技术,这项革命性的方法极大地提高了多肽合成的效率和精确度,并最终为他赢得了1984年的诺贝尔化学奖。随着对肽类生物介质关键作用的认识加深,人们认识到其卓越的活性、选择性和低毒性特征,但也注意到肽类药物的局限性,包括口服生物利用度低、血浆稳定性差和体内半衰期短等问题。尽管如此,在20世纪70-80年代小分子药物盛行的黄金时期,肽类药物的研究并未停滞不前,而是通过不断改进药物递送技术、制剂和合成工艺,克服了这些挑战。进入1980年代,随着重组技术的到来,科学家们能够更洁净地生产更大分子量的多肽。1980年代后期,伴随着风险投资和生物科技公司的支持,肽类药物发展迎来了第二波高潮,重组人胰岛素的成功商业化及促性腺激素释放激素类似物如亮丙瑞林和戈舍瑞林的批准上市,验证了肽类药物市场的可行性并激发了更多的投资和研究活动。90年代后期,研究者采取了一系列策略来增加肽的分子量,如将肽与脂质、较大蛋白质或聚乙二醇进行偶联,这些策略有效地解决了肽类药物快速肾清除的问题,延长了它们在血浆中的循环时间。此外,展示技术的进步也发挥了重要作用,比如噬菌体展示技术使得研究人员能够从大规模文库中定向发现具有更好药理特性和更高药物相似性的肽序列。随着时间推移,肽类药物市场不断壮大,批准上市的药物种类涵盖了糖尿病、癌症、骨质疏松症等多种疾病的治疗,并且通过持续的技术革新和生物学认识的深化,肽类药物的研发正继续朝着更加高效、安全和适应性更强的方向发展。从2000年至2010年间,进入临床试验的肽类药物数量几乎翻倍于上世纪90年代。多肽药物市场肽类药物市场占据了一个介于小分子药物和生物制剂之间的独特药理学领域。在全球医药市场中,肽类药物占比达到5%,2019年全球销售额超过500亿美元。在过去的六十年间,肽类药物的批准数量稳步增长,全球肽类治疗市场的平均增长率约为7.7%。在肽类药物的销售收入中,胰岛素及其类似物占据了大约一半的份额(约250亿美元),显示出其在该领域的主导地位。紧随其后的是一系列重要的肽类药物产品:例如用于糖尿病治疗的GLP-1受体激动剂杜拉鲁肽(商品名Trulicity),其2019年的销售额达到44亿美元;另一款GLP-1受体激动剂利拉鲁肽,分别以Victoza和Saxenda品牌应用于糖尿病和肥胖症治疗,销售额达41亿美元;合成促性腺激素释放激素类似物亮丙瑞林(商品名Lupron和Eligard),主要用于癌症治疗,销售额为20亿美元。根据目前获批的肽类药物,大部分属于激动剂类别,并且最常被针对的适应症与内分泌学、新陈代谢以及肿瘤学有关。2019年多肽类药物销量排行榜基于合成人体激素的多肽药物基于重组人体激素的多肽药物基于激素提取物的多肽药物多肽类诊断产品从动物、植物和细菌中提取的多肽药物基于偶然发现和合理设计的多肽药物基于可注射的聚乳酸-乙醇酸或聚乳酸的肽类药物缓释制剂类药物(这种技术利用了PLGA和PLA这类生物可降解聚合物,通过将肽类药物与这些聚合物结合,形成微粒或微球形式的长效给药载体。由于PLGA和PLA在体内可以逐步分解为无毒产物并被代谢排出体外,因此它们作为药物输送材料具有良好的生物相容性和安全性。)代表性的多肽药物降钙素 (Calcitonin) 和甲状旁腺激素 (PTH)降钙素是一种由32个氨基酸残基组成的肽类激素,1961年发现其能有效降低狗血液中的钙离子水平。随后的研究证明,降钙素能够强有力地抑制骨吸收过程。鲑鱼降钙素与人体降钙素相比,在序列上有16个氨基酸残基的不同,但效力却高出40至50倍。1978年,鲑鱼降钙素获得了用于治疗高钙血症和绝经后骨质疏松症的批准。起初,鲑鱼降钙素是从鲑鱼类似甲状腺的腺体中提取得到的天然物质,但在1978年合成版本被批准使用,并且在2005年进一步发展出了基于重组技术生产的鲑鱼降钙素。甲状旁腺激素(PTH)是一个含有84个氨基酸残基的激素,于1925年被发现。它的作用与降钙素的效果相反,主要通过激活 PTH1 受体和 PTH2受体,促进骨骼中钙库释放钙离子,从而显著提高血液中的钙含量。然而,长时间持续升高的 PTH 水平会导致骨骼中钙储备的耗竭,不利于维持骨骼健康。多款靶向 PTH1R 的药物获批上市2023-12-13 甲状旁腺功能减退症:靶向PTH1R 的小分子激动剂开发进展2023-08-08 Ascendis Pharma: 甲状旁腺功能减退症临床进展2023-11-29 由于PTH及其类似物的体内半衰期极短,不适用于临床治疗。随着化学修饰技术的发展,研究人员采用多种策略延长了PTH类似物的活性及稳定性,例如引入非天然氨基酸、N端或C端的延伸以及二硫键模拟物等方法。这些改进使得PTH类药物能够在人体内更有效地发挥生物学效应并降低清除率。首个基于PTH的疗法是 Teriparatide,这是一种重组的人PTH前34个氨基酸残基片段,即生物活性部分,于2002年获得批准,用于治疗骨质疏松症。Teriparatide 不仅抑制骨吸收,而且是首个能够促进新骨形成而非仅抑制旧骨流失的药物,从而显著提高了骨密度和骨折风险的管理效果。随后,在克服PTH不稳定性的基础上,研发出了全长度的PTH疗法,以控制低血钙症患者体内的血钙浓度,并在2015年获得了批准。此外,还出现了类似于PTH相关蛋白(PTHrP)的合成类似物 abaloparatide,该药物与PTH有41%的序列同源性,并在2017年获批用于骨质疏松症的治疗。生长抑素(Somatostatin)生长抑素是一种14个氨基酸残基组成的内源性激素,具有抑制多种内分泌腺分泌的作用,包括对生长激素、胰岛素、胃泌酸、胆囊收缩素等的抑制效应。由于其体内半衰期极短,不适合直接用于临床治疗,因此研究人员通过一系列化学修饰技术对其进行了改进。肢端肥大症:最新临床研究进展2023-11-14礼来:布局新一代放射性配体疗法,收购POINT 生物制药公司2023-10-21靶向 GPCR 药物开发的全球十大药企之诺华 (3)2023-10-06J.P. Morgan 2024 系列: 被受关注的GPCR靶点和管线(3)2024-01-17首先,通过对生长抑素进行截短、替换特定氨基酸残基以及N-到C-末端的环化改造,科学家们成功提高了该激素及其类似物的稳定性和生物活性。例如,采用d-氨基酸、非天然氨基酸替换,N端或C端保护以及二硫键模拟等方法,最终开发出了一系列在临床上广泛应用的药物,如奥曲肽,它能有效治疗肢端肥大症、某些类型的肿瘤以及其他相关疾病,并且拥有显著延长的体内作用时间。此外,针对生长抑素受体的研究发现,许多肿瘤细胞会过表达这些受体的不同亚型,这不仅推动了亚型选择性生长抑素类似物如 lanreotide、vapreotide 和 pasireotide 的研发,还催生了肽放射核素疗法这一新的治疗领域。通过将放射性同位素与生长抑素类似物结合,形成可用于诊断和治疗神经内分泌肿瘤等疾病的放射性药物,例如In 111 pentetreotide、Ga 68 DOTA-TATE等。胰岛素(insulin)胰岛素是首个用于治疗疾病的肽类药物,于1922年首次从动物(牛和猪)的胰腺中提取并应用于临床,成功地改变了1型糖尿病患者的治疗方式,并且至今仍然是商业上最成功的肽类药物之一,市场需求随着肥胖症发病率的上升而保持了每年约10%的复合增长率。针对胰岛素本身的局限性,例如其短的代谢半衰期,研究人员运用各种药物化学策略进行了优化,包括引入非天然氨基酸、进行N端或C端的保护与延伸、模拟二硫键结构等手段,以增强胰岛素的稳定性和生物活性。这些改良不仅提升了胰岛素类似物的效力和选择性,还改善了其药代动力学特性,从而发展出一系列疗效更好、使用更方便的胰岛素制剂,如长效胰岛素及其类似物。此外,随着基因重组技术在1980年代的发展,胰岛素生产进入了一个崭新的阶段,能够高效、清洁地制造更大规模的多肽,克服了早期提取法的不足。通过与脂质、大分子蛋白质及聚乙二醇等结合,进一步增加了胰岛素分子的分子量,有效解决了肾清除过快的问题,延长了药物在血浆中的循环时间,从而确保了药物具有更持久的降糖效果。催产素 (Oxytocin) 和血管加压素类似物 催产素是一个含有9个氨基酸残基的内源性激素,在1954年由 Vincent du Vigneaud 团队首次实现全合成,并因其在分娩、哺乳以及社交行为中的关键作用而闻名。早产:获批上市的临床治疗性药物催产素因其在体内的半衰期较短(仅几分钟),限制了其作为治疗药物的应用潜力。为克服这一局限,研究人员采用了一系列创新的药物化学方法对其进行结构改造。包括但不限于:使用d-氨基酸以增加稳定性;引入非天然氨基酸来改变药理特性;进行N-端或C-端的保护与延伸以延缓降解;以及探索二硫键模拟物以增强其构象稳定性和代谢稳定性。通过这些化学修饰手段,开发出了具有更长作用时间、更高活性及选择性的催产素类似物。例如,desmopressin是经过修饰的加压素类似物,在治疗尿崩症方面显示了优于天然激素的效果。此外,催产素类似物在临床上被用于诱导宫缩以促进分娩,并在减少产后出血、治疗某些妇科疾病等方面也发挥了重要作用。血管加压素和利普西秦(Lys8-vasopressin)曾被用于治疗中枢性尿崩症,但后来被去氨加压素(desmopressin)替代,后者具有更高的蛋白水解稳定性。去氨加压素是最早能够口服和鼻腔给药的肽类药物之一,其半衰期约为1.5至2.5小时。Gonadotropin 释放激素类似物Gonadotropin 释放激素(GnRH)类似物是通过改造自然存在的 GnRH 而合成的药物,该激素在调控性腺分泌性激素方面起着关键作用。GnRH 超级激动剂的制作过程中,在第6位点用不同的D-氨基酸替代了甘氨酸(Gly),这增强了与受体的结合亲和力,并赋予其对蛋白酶的抵抗能力。而在C端甘氨酰胺位置替换为乙胺或仿生的肼基甘氨酸衍生物,不仅像天然酰胺一样可以防止羧肽酶降解,还使得分子更具有疏水性,从而增加了药效强度和作用时间。早期尝试制备拮抗剂时,在第6位点引入了D-氨基酸;然而,由于在大鼠皮下注射后出现组胺性皮肤反应,阻碍了进一步的临床应用开发。为了避免水肿这一不良风险,研究人员将D-精氨酸替换为中性的D-脲基烷基氨基酸。相比于激动剂,拮抗剂使用了更多非天然氨基酸成分,除了4、7和9号位点之外,其他所有残基在至少一种拮抗剂中都被进行了修饰。Amylin 类似物Amylin是一种由37个氨基酸组成的内分泌激素,主要由胰岛β细胞分泌,在体内参与血糖调节,特别是在餐后抑制胰高血糖素释放和减慢胃排空速度方面起着关键作用。肥胖症治疗药物的最新临床研发进展2024-02-19 读懂百年诺和诺德之创新、增长与影响非凡的第100年2024-02-01 J.P. Morgan 2024 系列: 被受关注的GPCR靶点和管线(2)2024-01-13 劝君慎重:全球 GLP-1R 研发管线有多卷?2023-07-28Pramlintide 由31个氨基酸组成,是一种合成的人胰淀素类似物,这是一种在餐后与胰岛素共同从胰腺β细胞分泌的肽激素。Ⅰ型糖尿病患者体内的胰淀素水平异常低下,而在Ⅱ型糖尿病患者体内则高于正常水平。由于内源性人类胰淀素高度淀粉样变性,研究人员借鉴了高度同源但非淀粉样变性的大鼠胰淀素中的脯氨酸残基(已知能够干扰二级结构),将其植入到人胰淀素序列中,从而研制出了普兰林肽。GLP-1 多肽GLP-1是一种由31个氨基酸残基组成的内源性肠促胰岛素激素,具有显著的葡萄糖依赖性胰岛素分泌促进作用,并能够抑制餐后胰高血糖素释放、减慢胃排空速度以及影响食欲,因此在糖尿病治疗中扮演了重要角色。GLP-1R:肥胖及代谢疾病治疗靶点2024-02-13 安进减肥管线 AMG 133 进化史2024-02-09 GLP-1 小分子激动剂领域风起云涌!紧随辉瑞,硕迪 GSBR-1290 临床 2a 数据遇险2023-12-19 Novo Nordisk 的2023半年报:关于糖尿病和GLP-12023-08-15 节节败退!辉瑞终止 GLP-1R 小分子激动剂 Danuglipron 临床3期开发2023-12-03 礼来:替尔泊肽正式登陆减肥市场,“减肥药王”之争打响第一枪2023-11-29 GLP-1R 火爆全球,它的姐妹受体 GLP-2R呢?2023-11-21 辉瑞的一波三折: 三款 GLP-1R 小分子激动剂的不同命运2023-11-12 Tirzepatide 获批用于治疗肥胖后,礼来公司的 GLP-1R 小分子激动剂还有多久?2023-11-09早期的研究发现,静脉输注 GLP1(7–37) 对2型糖尿病患者的胰岛素分泌和血糖有显著影响之后,人们投入大量努力将其开发为药物。然而,GLP1(7–37) 会被二肽基肽酶4迅速分解,并在1至2分钟内通过肾脏清除。尽管用其他短侧链氨基酸替代位置2的丙氨酸可以保护该分子免受酶解降解,但快速的肾清除率仍使其不适合用于治疗。在20世纪90年代初,从吉拉怪兽毒液中分离出一种与 GLP1(7–37) 具有53%同源性的39个残基组成的肽,名为“exendin 4”。研究发现 exendin 4是GLP1受体的完全激动剂,它对DPP4降解稳定,在人体内的肾清除率较低(5至7小时),这个多肽后来被开发成为一种药物(商品名为exenatide,采用皮下注射,每日两次给药)以用于治疗2型糖尿病。自此以后,包括liraglutide, albiglutide, dulaglutide, lixisenatide 和 semaglutide 等多种其他 GLP1 受体激动剂,以及 exenatide 的一种长效制剂,相继被批准用于2型糖尿病或肥胖的治疗。本文中还提到肽类药物发现策略,包括毒液组学与展示技术,前者利用生物信息学分析毒蛇等有毒动物基因组及转录组数据结合蛋白质组学从粗毒样本中获得的数据,识别大量潜在的治疗用毒素肽;后者则通过构建大规模肽库并筛选针对特定靶标的高亲和力配体。例如,Ra Pharmaceuticals mRNA 展示平台衍生出的环状肽zilucoplan 已进入三期临床试验,用于治疗全身型重症肌无力。在药物化学策略方面,研究人员致力于改进肽类药物的代谢稳定性和血浆半衰期,采用诸如N端乙酰化、N-甲基化、使用d-氨基酸或非天然氨基酸以及酰胺键类似物(如硫代酰胺、肽类似物和β-氨基酸)等手段。此外,N到C末端的环化和二硫键模拟物(特别是硫醚键)越来越多地应用于肽类药物设计中,以调整它们的代谢稳定性和生物利用度。同时,一些高度稳定的环状构象骨架,比如环状缩氨酸和向日葵胰蛋白酶抑制剂,可作为载体将具有治疗意义的药效团嵌入其环内,进而研发出更稳定且具有靶向特异性的口服肽类药物,如已上市的 linaclotide 和 plecanatide 用于治疗便秘型肠易激综合征。未来展望未来展望部分,作者提到肽类药物的发展趋势预计会加速,因为生物制品的成功打破了必须口服给药的传统观念。肽类药物领域已经成熟,能够可靠快速地规模化生产结构复杂的多达约100个氨基酸的肽,并进行有效的构效关系(SAR)研究和先导化合物优化。新兴的肽类药物发现技术能在短时间内高效生成有潜力的高选择性和高活性候选化合物。随着新型递送技术和创新化学策略的整合,肽类药物领域将继续蓬勃发展。最后,作者提及,尤其是抗菌、抗病毒和抗衰老肽类药物在未来具有广阔的增长空间。肽类在化妆品行业也越来越受到关注,如市场上销售的六肽 Argireline 作为肉毒杆菌神经毒素类似物用于减少皱纹,五肽 Palmitoyl Pentapeptide-4(Matrixyl)通过刺激成纤维细胞中的细胞外基质更新而有助于减轻皱纹,铜肽 GHK-Cu 作为一种天然三肽,具有较高的铜离子亲和力,具备抗炎功能并能促进皮肤成纤维细胞中胶原蛋白和糖胺聚糖的合成。总体而言,过去60年间肽类药物的稳步批准见证了该领域的发展,随着新药发现和递送技术的进步,肽类药物有望继续占据药品市场的独特地位,成为介于小分子药物与大分子生物制剂之间的有力竞争者。以上文章来源于GPCR drug discovery,作者段思研本文仅作信息交流之目的,文中观点不代表相关疾病治疗立场,也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导,请前往正规医院就诊。
关注并星标CPHI制药在线 2024年2月5日,诺华拟27亿欧元收购MorphoSys,进一步扩展和补充其在肿瘤学优势治疗领域的产品线。2024年刚过去的一个月,诺华动作不断,1月2日,诺华与Voyager Therapeutics达成合作协议,授权使用衣壳技术平台和开发治疗亨廷顿病和SMA的基因疗法,交易总额达13亿美元;1月5日,诺华宣布收购信瑞诺医药,将获得两款在研肾病治疗药物;1月7日,诺华与舶望制药达成合作协议,重点布局小核酸药物领域,获得一款I期临床项目的全球权益以及心血管疾病的另外两个靶点项目,合作总金额近42亿美元。诺华不断加速优化管线布局,也许从去年11月的研发日能够窥探一二。 一、发展历程 诺华起步于1758年的化学品销售公司(Geigy)、1840年CIBA公司以及1886年的山德士(Sandoz),三家公司主营为染料销售和生产,赶上了染料化工的快速发展机遇,逐步成为全球有影响力的化工企业。然而,1970年前后,石油危机爆发,化工原材料价格暴涨,多数化工企业纷纷倒闭,一些化工巨头开始转型制药领域。1884年,Sandoz和CIBA逐步涉足仿制药领域,推出了葡糖糖酸钙等划时代药物,Geigy进入医药领域时间相对较晚,1949年推出第一个重磅药物--保泰松。1996年,三家公司合并成诺华制药,诺华制药正式诞生,当时员工总数超10万人,业务领域广泛,但也面临化工等传统主营业务快速下滑、制药基础薄弱等问题,逐步开始改革之路,加速聚焦创新药业务,2023年剥离山德士仿制药业务后,诺华成功"瘦身"为专注创新药的巨头,2023年财报显示营收同比增长10%,净利润同比增长62%,初步显示出转型的成功。 2023年11月的研发日活动,诺华详细阐述最新的发展规划及进展,未来将持续聚焦心脑血管、免疫系统、神经系统、肿瘤等四大疾病领域,巩固化学、生物等两大技术领域优势,在核酸药物、靶向放射性配体疗法、基因和细胞治疗等三大新兴领域加大投入。从其重点关注领域来看,诺华似乎在创新药领域始终"特立独行",2023年全球医药巨头纷纷扫货、布局ADC领域,没有诺华身影;GLP-1靶点药物如火如荼,也没有诺华身影;曾经卷出天际的PD-1,依然没有诺华身影;诺华似乎始终保持着"众人皆醉我独醒"的状态,持续深耕化学药、生物药等优势方向,加大投入核酸药物、靶向放射性配体疗法、基因和细胞治疗等新技术领域,三大新技术逐步成为营收增长的重要力量,放射性配体疗法Pluvicto销售额9.8亿美元,同比增长261% ;小核酸药物Leqvio销售额3.55亿美元,同比增长217%,差异化竞争优势已经显现。 二、三大新技术领域 1.核酸药物 诺华在核酸药物领域布局的重要里程碑始于2019年以97亿美元收购The Medicines Company,获得了上文提到的重要产品Leqvio,次年,该产品即获得FDA批准上市,预计年销售峰值将达30亿美元。该产品的成功,加快了诺华核酸药物布局,2023年以来,陆续完成多笔大额收购、合作,包括10亿美元收购DTx Pharma、与Ionis合作开发降血脂药物、与舶望制药达成重磅合作等。 2.靶向放射性配体疗法 2023年ADC领域热点不断,诺华却未涉足其中,其实早在十几年前,诺华就在ADC领域投入巨大资源,但始终未取得理想结果。于是,诺华"另辟蹊径"切换赛道,选择了疗效相对更好、副作用较低的放射性配体疗法领域。目前拥有Pluvicto 和Lutathera两款上市产品,2023年销售额分别为9.8亿美元和6.1亿美元。诺华发展该领域策略也类似于核酸药物,通过收购和合作加快布局,2023年先后与Bicycle Therapeut、3B Pharmaceuticals GmbH等达成重磅合作。 3.基因和细胞治疗 诺华较早进入细胞和基因治疗领域,开发了全球第一款CAR-T新药,生产技术成熟、产能充足。同时,诺华不断通过并购、合作,持续巩固领先优势,包括与Dyno Therapeutics、Sangamo Therapeutics、Voyager、传奇生物等展开合作,收购Avrobio等。 三、小结 诺华发展历史已超百年,从曾经的染料化工企业逐步发展成为业务领域大而全的制药巨头,然后又逐步"瘦身"成为专注于创新药的企业。其发展历程,对于国内新药研发企业虽说难以借鉴,但也具有一定的启示意义,尤其是如何保持定力,持续深耕企业擅长领域以及"不跟风"打造差异化竞争优势。【智药研习社课程预告】来源:CPHI制药在线声明:本文仅代表作者观点,并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载,请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱:Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯,请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文,进入智药研习社~
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