VIRMA

N6-甲基腺苷(m6A)甲基化可通过RNA甲基转移酶复合物(MTC)沉积在染色质相关RNA (caRNAs)上，调控染色质状态和转录。然而，MTC被募集到不同基因组位点的机制仍然难以捉摸。2023年8月28日，芝加哥大学何川、陈梦洁及贝克曼研究中心陈建军共同通讯在Nature Cell Biology 在线发表题为“RBFOX2 recognizes N6-methyladenosine to suppress transcription and block myeloid  leukaemia differentiation”的研究论文，该研究发现RBFOX2识别N6-甲基腺苷抑制转录，阻断髓性白血病分化。RBFOX2可以募集MTC成分RBM15，促进启动子相关RNA的甲基化。RBM15也与YTHDC1物理相互作用，将多梳抑制复合体2 (PRC2)募集到RBFOX2结合的位点，从而实现染色质沉默和转录抑制。此外，作者发现RBFOX2/m6A/RBM15/YTHDC1/PRC2轴在髓性白血病中起关键作用。下调RBFOX2显著抑制急性髓系白血病细胞的存活/增殖，促进其髓系分化。RBFOX2也是白血病干细胞/起始细胞自我更新和急性髓性白血病维持所必需的。该研究提出了m6AMTC募集和m6A沉积在caRNAs上的途径，导致位点选择性染色质调节，这对白血病具有潜在的治疗意义。m6A是哺乳动物细胞中最常见的信使RNAs。由m6A甲基转移酶复合物(MTC)安装，由METTL3/14、WTAP7、RBM15/15B8、ZC3H13和VIRMA (KIAA1429)组成，并且可以被去甲基化酶FTO11和ALKBH5去除。m6A对mRNA代谢和翻译的功能影响是通过m6A阅读蛋白介导的，例如含有YTH结构域的蛋白(YTHDC1/2)、YTHDF1/2/3。可以通过直接或间接机制优先结合m6A修饰转录本的阅读器蛋白列表，包括IGF2BP1/2/3、HNRNPA2B1、HNRNPC和HuR，还在继续扩大。虽然m6A在转录后mRNA衰变和翻译调控中的关键作用已经得到了很好的证实，但最近的研究也表明，METTL3/METTL14复合体可以介导非编码染色质相关RNAs (caRNAs)的m6A甲基化，从而调节染色质状态并调控转录；然而，MTC如何被募集到不同的染色质位点以及它如何实现位点选择调控在很大程度上是未知的。此外，YTHDC1是唯一被鉴定的m6A与染色质调控相连接的阅读蛋白。然而，如何募集YTHDC1参与m6A依赖性的位点选择性调控尚不清楚。机理模式图（图源自Nature Cell Biology）该研究展示了一个涉及MTC、YTHDC1和RNA结合蛋白(RBP) RBFOX2的转录调控轴：RBFOX2募集MTC成分RBM15来甲基化启动子相关RNAs (paRNAs)。RBM15进一步与YTHDC1相互作用，将PRC2募集到RBFOX2结合的位点进行转录抑制。RBFOX2/ m6A/RBM15/YTHDC1/PRC2轴在髓性白血病中发挥重要作用，下调RBFOX2可显著抑制急性髓性白血病(AML)细胞的存活/增殖，促进AML细胞向髓性分化。因此，RBFOX2被认为是一种染色质因子，在位点特异性染色质调节过程中促进m6A沉积在caRNAs上，具有治疗白血病的意义。综上，该研究揭示了RBFOX2作为染色质上的m6A结合蛋白在促进caRNA甲基化以抑制转录方面的功能作用。这种调控模式填补了染色质和caRNAs的m6A甲基化之间的串扰中一个关键的缺失环节。文章来源“iNture”责编|文竞择校对|文竞择End往期精选围观历史性突破！不需卵子和精子就可以合成人类胚胎热文富豪用儿子血浆“回春”科学吗？Science：血液牛磺酸缺乏驱动衰老热文世界首例！35岁的她，通过机器人操刀移植的子宫，成功诞下宝宝热文为了避免心脏骤停，53岁的他成为“第一个”植入开创性除颤器的心脏病患者热文首次披露！175家生物制药公司的薪资数据：薪资中位数达20万美元点击“阅读原文”，了解更多~

这项研究成果发现了METTL3的一种全新的功能，定位在胞质中的METTL3通过与PABPC1结合促进一系列促癌基因的表达，从而以m6A非依赖的方式推动胃癌的进展。 METTL3是一种甲基转移酶，通常在细胞核中与一系列蛋白质（METTL14、WTAP、VIRMA等）一起介导mRNA上的m6A修饰，从而影响mRNA的加工、出核、翻译以及降解[1]。 然而有研究发现，METTL3也会定位于肿瘤细胞的细胞质中，促进肿瘤的发展，并且这个过程是不依赖于其甲基转移酶活性的[2,3]，这提示METTL3在肿瘤中发挥的作用或许与其细胞定位有一定的联系。然而我们目前对METTL3在肿瘤细胞细胞质中发挥作用的机制还不是十分了解。 近期，由中国医学科学院余佳、王芳和金晶，以及重庆大学附属肿瘤医院邹冬玲领衔的研究团队，在《自然·细胞生物学》上发表研究成果[4]。 他们发现在胃癌细胞中，METTL3定位至细胞质中，并以m6A非依赖的方式促进一系列促癌的表观遗传因子的翻译，进而促进胃癌的进展。 机制上，定位于胞质中的METTL3可以与PABPC1结合，稳定PABPC1与转录起始复合物eIF4F的结合，从而促进SETD1A、SETD1B、MKI67和GATA2等促癌基因mRNA的翻译，促进肿瘤。 论文首页截图 为了探究METTL3在胃癌中扮演了怎样的角色，研究团队首先分析了113例胃癌患者肿瘤组织与癌旁组织中METTL3的表达水平，发现METTL3在胃癌组织中显著上调，并且METTL3的高表达与患者疾病分期更高（偏向晚期），生存更差相关。 以上数据提示METTL3的高表达与胃癌患者的不良预后相关，有可能具有促癌的作用。因此研究团队利用小鼠模型验证METTL3是否会促进胃癌发展。他们构建小鼠皮下瘤模型，发现敲低METTL3后肿瘤的生长明显变慢，并伴随着肿瘤细胞增值标志物Ki67降低以及凋亡标志物活化型caspase3增加。 这些数据表明，在胃癌发生发展过程中METTL3发挥了促癌的作用。 METTL3促进胃癌发展 那么METTL3到底是如何促进胃癌的呢？ 因为METTL3是一种经典的m6A修饰酶，所以研究团队进行了m6A RNA测序（MeRIP-seq）以及METTL3结合RNA测序（eCLIP-seq）。分析结果显示，仅有287个基因同时出现在两个测序结果中，绝大部分与METTL3结合的mRNA位点没有m6A修饰。这表明在胃癌细胞中METTL3更有可能与不携带m6A修饰的mRNA位点结合，提示在胃癌细胞中METTL3很有可能具有m6A非依赖的功能。 为了知道这些被METTL3结合的mRNA有何德何能，能够让METTL3与之结合，研究团队分析了这些与METTL3结合的无m6A修饰的mRNA特征，发现在这些mRNA中富集了一系列促肿瘤的基因，如与p53、Wnt、Ras以及DNA损伤修复相关的基因。这暗示METTL3可能调控这些促癌基因的表达，以m6A非依赖的方式促进胃癌进展。 为了验证METTLE3是否是通过甲基化酶非依赖的方式促进胃癌进展，研究团队构建了METTL3的突变体，使其失去m6A甲基化酶活性（METTL3-mut），并将METTL3-wt或METTL3-mut转入胃癌细胞系中，比较其对胃癌细胞增殖、侵袭能力的影响。实验结果表明，在体外实验中不论是METTL3-wt还是METTL3-mut均显著增强了胃癌细胞的增殖与侵袭能力；小鼠模型试验也得到了相同的结论。 这些数据表明，METTL3促进胃癌进展不依赖其甲基化酶活性。 METTL3以m6A甲基化酶非依赖的方式促进胃癌进展 已有的研究表明，METTL3发挥m6A修饰功能时与METTL14、WTAP等蛋白一起定位于细胞核中，那么METTL3发挥促癌作用时定位于哪里呢？ 为了回答这个问题，研究团队检测了胃癌细胞系，以及正常胃上皮细胞细胞核以及细胞质中的METTL3含量，发现在胃癌细胞中METTL3主要位于细胞质中，而在正常细胞中METTL3主要位于细胞核中。 为了探究究竟是胞质中的还是细胞核中的METTL3发挥了促癌作用，研究团队在METTL3-mut的基础上构建了核定位信号突变的METTL3突变体METTL3-mut-cyto（突变体无法定位至细胞核，只存在于细胞质中），并将其转入胃癌细胞中。结果表明，METTL3-mut-cyto和METTL3-cyto都可以显著地促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这些数据表明，胞质中的METTL3能够以m6A非依赖的方式促进胃癌进展。 为了寻找METTL3在胞质中如何发挥作用，研究团队进行了免疫共沉淀和质谱实验，寻找METTL3在胞质中的相互作用蛋白，最终寻找到若干在胞质中与METTL3可能存在相互作用的候选蛋白。同时GO分析显示，与METTL3存在相互作用的蛋白质富集在翻译起始相关通路，提示METTL3可能会通过调控翻译过程来发挥促癌作用。 METTL3在胞质中以m6A非依赖的方式促进胃癌进展 为了证实上述的猜想，研究团队比较了METTL3-wt、METTL3-mut和METTL3-ko胃癌细胞的转录组以及翻译组差异。他们发现，METTL3的缺陷与否对转录组几乎没有影响；而过表达METTL3（不论是mut还是wt）则能够诱导翻译的激活，多聚核糖体显著增加。 更进一步地，研究团队发现翻译效率提升的几乎都是被METTL3结合的无m6A修饰的mRNA，并且GO分析表明这些翻译效率升高的基因，大多富集在组蛋白修饰以及细胞周期相关信号通路上。 这些数据表明，METTL3并不显著影响胃癌细胞的基因转录，而是影响了其结合的mRNA的翻译。 胞质中的METTL3提高其结合的mRNA翻译效率 为了知道METTL3是通过什么方式影响mRNA的翻译效率的，研究团队再次分析了他们的免疫共沉淀以及质谱数据，发现与METTL3相互作用的胞质蛋白中，含有多个翻译起始因子，包括mRNA poly A尾结合蛋白1（PABPC1）。 PABPC1是真核翻译起始复合物形成的必需成分，已有的研究表明PABPC1可以与mRNA 5’端翻译起始复合物eIF4F结合，从而使mRNA形成一个环状，促进mRNA的翻译[5,6]。因此研究团队推测METTL3与PABPC1的相互作用，可能调控了胃癌细胞的翻译效率。 体外结合实验表明，METTL3通过其C末端与PABPC1特异性结合，并且METTL3与PABPC1的结合是RNA非依赖的。并且免疫共沉淀实验发现，METTL3与eIF4F也存在相互作用。 进一步地，研究团队敲低了PABPC1或METTL3的表达，检测METTL3与eIF4F的相互作用，发现敲低PABPC1完全消除了METTL3与eIF4F的相互作用，表明METTL3是通过PABPC1间接地与eIF4F结合的；而敲低METTL3之后PABPC1与eIF4F的结合被削弱，表明METTL3可以增强PABPC1与eIF4F的结合。 这些数据表明，胞质中的METTL3可能是通过影响了cap–eIF4F–PABPC1–poly(A)复合物的稳定性，从而影响了mRNA的构型，进一步影响了mRNA的翻译效率。 胞质中METTL3与PABPC1结合，稳定cap–eIF4F–PABPC1–poly(A)复合物 METTL3通过与PABPC1结合来影响mRNA翻译，那么促进mRNA翻译是METTL3促癌的机制吗？如果是，那么具体的过程是如何的呢？ 为了回答上述问题，研究团队整合分析了MeRIP-seq、METTL3 eCLIP-seq、PABPC1 eCLIP-seq以及polysome-seq数据，最终发现175个由METTL3和PABPC1共同调控的基因，并且这些基因大多富集在组蛋白/染色质修饰以及细胞周期通路，提示METTL3可能通过上调这些促癌基因的翻译来促进肿瘤进展。 研究团队从175个候选基因中挑选了一些基因进行验证，包括经典的促癌因子SETD1A、SETD1B、MKI67和GATA2，结果表明，在METTL3或PABPC1敲低后这些蛋白明显减少，而过表达METTL3-wt或METTL3-mut后SETD1A、SETD1B、MKI67和GATA2的蛋白水平显著升高。这些数据表明METTL3可以通过促进经典的促癌因子的表达来发挥促癌作用。 METTL3增加经典促癌基因表达 现在已经在细胞系中阐明了METTL3的促癌机制，那么在患者中METTL3的表达与定位是怎么样的呢，与患者的预后有怎样的联系呢？ 为了解答上述的疑问，研究团队分析了癌症基因图谱中的数据，发现在多种癌症中PABPC1的表达与METTL3呈现正相关，并且METTL3的高表达与患者的不良预后相关。 临床样本分析发现，在胃癌患者中，随着临床分期的增加，METTL3的胞质积累明显增加，但细胞核中的METTL3没有明显增加。此外，METTL3的细胞质/核比例较高的GC患者的总体存活率显著较差；在前列腺癌患者的样本中也观察到了类似的结果。这些数据表明，胞质中METTL3的积累与肿瘤患者的不良预后相关。 METTL3在胞质中的积累与患者的不良预后相关 总的来说，这项研究成果发现了METTL3的一种全新的功能，定位在胞质中的METTL3通过与PABPC1结合促进一系列促癌基因的表达，从而以m6A非依赖的方式推动胃癌的进展。 同时这项研究也提示，胞浆分布的METTL3可能是胃癌和前列腺癌的一个有用的病理指标或治疗靶点。 然而，我们仍然有一些疑问期待后续的研究解答，比如，通常在细胞核中工作的METTL3为何会定位至细胞质中？如果能解答这个疑问，那么我们或许可以针对METTL3定位至细胞质的过程开发针对性的药物，帮助其找准自身定位，不要在错误的地点做不好的事情。 此外，为什么METTL3和PABPC1可以相对特异性的提高促癌基因的翻译效率呢？这其中的决定因素是什么呢？如果找到决定这种特异性的分子机制，我们或许可以开发出一次性抑制多种癌基因表达的抗肿瘤药物。 参考文献： 1. He PC, He C. m6 A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential. EMBO J. 2021;40(3):e105977. doi:10.15252/embj.2020105977 2. Lin S, Choe J, Du P, Triboulet R, Gregory RI. The m(6)A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells. Mol Cell. 2016;62(3):335-345. doi:10.1016/j.molcel.2016.03.021 3. Choe J, Lin S, Zhang W, et al. mRNA circularization by METTL3-eIF3h enhances translation and promotes oncogenesis. Nature. 2018;561(7724):556-560. doi:10.1038/s41586-018-0538-8 4. Wei X, Huo Y, Pi J, et al. METTL3 preferentially enhances non-m6A translation of epigenetic factors and promotes tumourigenesis. Nat Cell Biol. 2022;24(8):1278-1290. doi:10.1038/s41556-022-00968-y 5. Kranz A, Anastassiadis K. The role of SETD1A and SETD1B in development and disease. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2020;1863(8):194578. doi:10.1016/j.bbagrm.2020.194578 6. Fatscher T, Boehm V, Weiche B, Gehring NH. The interaction of cytoplasmic poly(A)-binding protein with eukaryotic initiation factor 4G suppresses nonsense-mediated mRNA decay. RNA. 2014;20(10):1579-1592. doi:10.1261/rna.044933.114