DNASE2

3月14日，美国FDA批准了Madrigal Pharmaceuticals的Resmetirom（瑞美替罗，商品名：Rezdiffra）联合饮食和运动，用于治疗患有中重度肝纤维化的非肝硬化非酒精性脂肪性肝炎（NASH）/代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）成人患者。这是获得FDA批准的首款NASH疗法，是该领域一项重要里程碑。Resmetirom是一款“first-in-class”的每日一次、口服甲状腺激素受体THR-β选择性激动剂。THR-β激动剂具备调控多种肝脏代谢通路来治疗NASH的潜力，Resmetirom通过特异性靶向肝脏的THR-β受体，调节脂代谢，降低LDL-C、甘油三酯和致动脉粥样硬化性脂蛋白。此外，Resmetirom的安全性良好，对THR-α受体无活性，对骨骼或心脏参数无影响，也不影响甲状腺激素通路的其它激素。图1：Resmetirom作用机制Resmetirom获批的临床试验Resmetirom获批是基于MAESTRO-NASH的关键III期临床试验，其结果于今年2月发表在医学顶刊《NEJM》上。MAESTRO-NASH是一项启动于2019年3月的多中心、随机、双盲、安慰剂对照的III期临床试验，也是首个在NASH患者中达到FDA提出的两个主要终点的III期临床试验。研究结果显示，在NASH缓解且纤维化不恶化的主要终点上，高剂量组、低剂量组和安慰剂组的发生率分别为30%、26%和10%；在纤维化改善≥1级且NASH不恶化的主要终点上，三个组的发生率为26%、24%和14%；在次要终点LDL-C降幅上，三个组分别为-16%、-12%和1%。  图2：MAESTRO-NASHIII期临床试验NASH/MASH简介在介绍NASH之前，我们先来了解一下NAFLD（non-alcoholic fatty liver disease，非酒精性脂肪性肝病）的概念。NAFLD是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变（non-alcoholic hepatic steatosis）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。NAFLD不仅可以导致肝病残疾和死亡，还与代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、动脉硬化性心血管疾病以及结直肠肿瘤等的高发密切相关。随着肥胖和MetS的流行，NAFLD已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生物化学指标异常的首要原因。NASH是NAFLD的严重类型，５％以上的肝细胞脂肪变合并小叶内炎症和肝细胞气球样变性。不合并肝纤维化或仅有轻度纤维化（F0~1）为早期NASH；合并显著肝纤维化或间隔纤维化（F2-3）为纤维化性NASH；合并肝硬化（F4）为NASH肝硬化。图3：NAFLD疾病进程热门靶点一览NASH的发病机制十分复杂，是包括胰岛素抵抗、氧化应激、激素失调、慢性炎症、纤维化、免疫和肠道菌紊乱等多种风险因素，多种细胞类型和多种组织器官平行相互作用的结果，涉及肝脏、肠道和脂肪组织中的各种细胞。从生物学的角度来看，NASH药物研发的难点在于这些生物信号通路相互交织，互为因果，靶向其中的一个通路或靶点，有时在起到治疗作用同时难免带来副作用有时却不足以产生疗效。据Pharma ONE智能药物大数据分析平台统计，目前全球有近700款药物在进行NASH相关的临床研究。  图4：NASH全球在研药物数量来源：Pharma ONE智能药物大数据分析平台，中国医药工业信息中心较为热门的靶点包括GLP-1R、FXR、GCGR、THR-β、FGF21、PPAR等。从靶点角度来看，NASH药物研发根据其作用机制大致可分为以下几类：● 脂质代谢调节剂：这类药物通过调节脂质代谢来减少肝脏中的脂肪积累。例如，PPAR激动剂能够调节脂肪酸的氧化、储存和运输，从而减轻肝脏脂肪。ACC抑制剂和DNL途径的其他靶点也属于这一类，旨在减少肝脏脂质的合成。● 胰岛素敏感性改善剂：由于胰岛素抵抗是NASH发病的关键因素之一，改善胰岛素敏感性的药物能够间接减轻肝脏中的炎症和纤维化。GLP-1受体激动剂和SGLT2抑制剂是这类药物的例子，它们通过改善胰岛素敏感性和降低血糖来发挥作用。● 抗炎药物：炎症在NASH的进展中起着核心作用。针对特定炎症途径的药物，如CCR2/CCR5受体拮抗剂和IL-1β抑制剂，旨在直接减轻肝脏炎症。● 抗纤维化药物：随着NASH的进展，肝脏会发生纤维化，最终可能导致肝硬化。靶向纤维化过程的药物，如抑制TGF-β信号途径的药物，旨在阻止或逆转肝脏纤维化。● 肠道微生物调节剂：近年来的研究表明，肠道微生物在NASH的发展中扮演着角色。调节肠道微生物的药物，如益生元、益生菌和特定的抗生素，可能通过改变肠道微生物组成来对NASH产生积极影响。● 胆汁酸代谢调节剂：胆汁酸不仅在脂肪的消化和吸收中起作用，还能通过胆汁酸受体（如FXR）影响肝脏的炎症和纤维化过程。FXR激动剂是这一类的代表，它们通过调节胆汁酸的合成和分泌来改善NASH。 图5：NASH药物研发TOP 10靶点来源：Pharma ONE智能药物大数据分析平台，中国医药工业信息中心全球药物研发进展实际上，Resmetirom并不是全球首款获批上市的NASH治疗药物。2013年，印度Zydus Cadila研发的PPARα/γ双激动剂Saroglitazar在印度获批上市，用于治疗使用他汀类药物无法控制的II型糖尿病血脂异常或高甘油三脂血症。2020年3月，印度药物管理局（DCGI）批准其NASH新适应症，成为全球首款获批的治疗NASH的药物，但后来该药物在国际上反响平平。NASH药物曾一度被视为药物研发的黑洞，近年来许多被寄予厚望的分子纷纷折戟，比如口服FXR激动剂奥贝胆酸曾是全球第一个进入III期临床的MASH新药，于2016年5月被FDA批准用于治疗原发性胆汁性胆管炎（PBC）后，NASH适应症也迅速进入III期临床，但随后却因为“易引发严重瘙痒症状”副作用、“药物性肝损伤”等原因两度被FDA拒之门外，目前卡在了上市申请阶段。笔者在这里列出了目前进展至III期临床的治疗NASH的药物。其中值得注意的一点是，近几年大火的GLP-1类药物在NASH适应症上同样有亮眼的表现，司美格鲁肽、艾塞那肽以及Survodutide等一众药物均已进展至III期临床，即将在不久的将来登上舞台与Resmetirom争夺NASH百亿美元市场！表1：进展至III期临床的NASH治疗药物  来源：Pharma ONE智能药物大数据分析平台，中国医药工业信息中心END如需获取更多数据洞察信息或公众号内容合作，请联系医药地理小助手微信号：pharmadl001

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注非酒精性脂肪肝炎治疗药物临床研发进展来源《药学学报》2023年作者刘彩红, 侯少聪, 李平平中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室; 中国医学科学院代谢紊乱和肿瘤发生相关机制和靶点发现研究重点实验室摘要非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)正在成为全球范围内的慢性肝病, 与肥胖、高血压和糖尿病等代谢风险因素密切相关。其发病机制复杂, 涉及肝脏糖脂代谢紊乱、胆汁酸毒性、氧化应激、炎症、纤维化、肠道菌群失调和易感基因变异之间的相互作用。NASH治疗药物研发进展十分缓慢, 本文重点综述前景较好的几类NASH治疗药物临床研发进展及其作用机制, 如靶向肠肝轴类药物、改善代谢类药物、抗炎及抗纤维化类药物等, 旨在为NASH的新药研发提供最新参考。关键词非酒精性脂肪肝炎; 糖脂代谢; 肠−肝轴; 抗炎; 抗纤维化_正文_非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是世界范围内的慢性肝病, 占世界人口的25%, 中国人口发病率约20%~29%[1]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL)和非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 前者病症较轻, 而后者炎症反应进一步加重, 除了肝细胞脂肪变性外, 还表现为肝细胞损伤(气球样变)、炎症和纤维化。其中, 25%的NAFL患者可进展为NASH, 35%~50%的NASH患者进一步发展为肝癌, 最终需要肝移植[2]。然而, 尚未有FDA正式批准用于治疗NASH的药物, 在研药物在临床试验中存在瘙痒、肝损伤和心血管疾病风险等不良反应, 寻找高效安全的NASH治疗药物迫在眉睫。目前, 针对NASH治疗的药物研发聚焦于以下4类(图1): ①靶向肠−肝轴类药物靶点, 包括调节胆汁酸肝肠循环和信号转导、改善肠道菌群的组成等; ②改善代谢类药物靶点, 包括改善胰岛素敏感性、抑制脂质从头合成的关键酶或促进脂肪酸在线粒体中的氧化等; ③抗炎类药物靶点, 包括抑制炎症细胞招募或者阻断炎症信号传导、减少氧化应激和内质网应激、抑制肝细胞凋亡等; ④抗纤维化类药物靶点, 包括靶向肝星形细胞、减少肝脏胶原分布、增强纤维分解等[3]。第1类和第2类以改善糖脂代谢为主的治疗策略目前研究较多, 并且大多受到各种核受体的调控[4]。NASH的治疗目标是延缓、阻止、逆转疾病的进展, 改善临床结局, 包括降低肝硬化及其并发症的发生, 降低肝移植的需求, 提高存活率, 改善生活质量等。在药物研发过程中, 临床治疗终点的准确选择对于NASH药物疗效的评价意义重大, 是否能够反映临床结局、预测临床获益是终点选择的基本原则。下面将对已经进入临床试验阶段的NASH治疗药物研发进展及相关临床设计进行综述。1NASH治疗药物临床主要评价方法和终点NASH新药研发的有效性评价终点包括临床结局终点和肝组织学替代终点, 以及血清生化检查、影像学检查等其他探索性终点[5]。临床结局终点主要是全因死亡率和肝脏相关死亡率, 然而, NASH进展为肝硬化的过程是缓慢的[6], 若以全因死亡率和肝脏相关死亡率降低作为主要研究终点, 可能需要对早期NASH患者随访长达10~15年, 这无法践行于新药研发和审批中。因此, 我国指导原则、FDA和欧盟药监系统都选择肝组织病理学作为替代终点, 包括脂肪性肝炎和纤维化的改善[7]。对于非肝硬化NASH研究, Ⅱb期的药物临床试验(探索性临床试验阶段)建议使用的组织学替代终点为: NASH改善, 纤维化不恶化(NAS评分降低≥2分, 其中至少1分是小叶炎症或气球样变); 或纤维化改善≥1级, NASH不恶化; Ⅲ期临床试验(确证性临床试验阶段)可接受的组织学替代终点为: NASH消退(气球样变消失, 小叶内炎症灶的减少或消失), 纤维化不恶化; 和/或纤维化改善≥1级, NASH不恶化。对于代偿期NASH相关肝硬化的临床试验, 仍建议以临床结局改善为终点评价, 但组织学的改善也是Ⅱ/Ⅲ期临床试验重要治疗终点之一, 即肝纤维化改善≥1级, NASH不恶化[8, 9]。此外, 我国、美国等食品药品监督管理机构允许在临床试验早期概念验证阶段及药物研发后期使用无创生物标志物作为探索性终点及次要终点。无创生物标志物中, 与评价糖脂代谢相关的有体重、体质量指数、腰臀比、空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗如胰岛素抵抗的稳态模型评估(homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)、血脂等; 与肝脏炎症/损伤相关的有丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、细胞角蛋白18(cytokeratin18, CK18)片段等; 与评价肝纤维化相关的有肝纤维化测试、增强型肝纤维化(enhanced liver fibrosis, ELF)测试、NAFLD纤维化评分(NAFLD fibrosis score, NFS)、III型前胶原N端前肽(procollagen type III N-terminal propeptide, Pro-C3)、纤维化-4指数(fibrosis-4 index, FIB-4)、AST与血小板计数(platelet count, PLT)比值指数(AST/PLT ratio index, APRI)等。总之, 对于非肝硬化NASH临床评价, 早期概念验证阶段可采用无创指标作为探索性终点; 在后期探索和确证性临床试验阶段, 主要采用肝组织学替代终点, 同时需要长期随访以评估这些组织学替代终点是否与临床结局终点一致。对于合并肝硬化的NASH新药研发, 应结合临床结局、组织学及无创指标共同作为疗效终点。文章内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明【来源：凡默谷公众号】。2靶向肠−肝轴类药物靶点2.1 法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)激动剂FXR是核受体超家族的成员之一[10], 在肝脏和小肠中高度表达, 其天然配体为胆汁酸(bile acid, BA)。FXR在调节胆汁酸合成、吸收、转运、肝肠循环及与脂质吸收和合成相关的过程中发挥关键作用[11]。基于FXR靶点的NASH治疗药物的研发很早就已经开始, 这一类药物目前进展最快。此类在研药物均为FXR激动剂, 可通过肠道和肝脏两方面的作用改善糖脂代谢。在肝脏, FXR激活后可与其下游小异源二聚体伙伴(small heterodimer partner, Shp)、肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor 4, Hnf4)等基因相互作用, 抑制肝脏胆汁酸合成酶如细胞色素P450家族7亚家族A成员1(cytochrome P450 family 7subfamily A member1, Cyp7a1)等基因的表达, 减少胆汁酸的合成[12]; 并且降低脂肪酸和甘油三酯(triglyceride, TG)合成通路中硬脂酰辅酶a去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase1, Scd1)、二酰基甘油酰转移酶2(diacylgycerol acyltransferase, Dgat2)和Lipin1的表达, 从而减少单不饱和脂肪酸甘油三酯的含量。在肠道, FXR激活后可上调靶基因成纤维细胞生长因子15/19(fibroblast growth factor15/19, Fgf15/FGF19)的表达, FGF15/19可分泌入血, 经血液到达肝脏后同样可抑制胆汁酸的合成, 从而减少肠道脂质吸收[13, 14]。FXR激动剂可分为两类, 一类是具有胆汁酸结构的化合物, 如Intercept Pharmaceuticals研发的奥贝胆酸(obeticholic acid, OCA); 一类是不具有胆汁酸结构的非固醇类化合物, 如Tropifexor、Cilofexor、TERN-101、EDP-305和MET-409等[15]。OCA在结构上与天然胆汁酸有相似之处, 但引入了一个乙基基团, 使其比天然胆汁酸具有更强的FXR激动效果。2016年5月, 美国FDA有条件加速批准其用于治疗原发性胆汁性胆管炎, 这鼓励了许多企业跟随Intercept的脚步进行FXR靶点的研究。OCA在临床前研究中可显著减少胆汁酸总量及疏水性胆汁酸的含量, 从而显著减少肠道TG及胆固醇的吸收[16]。OCA是全球第一个进入III期临床的NASH治疗药物, 而其上市历程却并不顺利。在REGENERATE临床Ⅲ期研究中, 治疗18个月时, OCA高剂量组中23%的患者实现了纤维化改善≥1级且NASH不恶化, 而安慰剂组仅有12%患者达到这一指标(P=0.0002)[14], 治疗效果很好。但OCA容易引发严重的瘙痒症状, 并可导致低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein, LDL-C)升高和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein, HDL-C)降低, 较高剂量OCA还可导致晚期肝病患者肝功能恶化, 这极大限制了临床应用。2020年6月, FDA认为OCA的治疗收益并未超过潜在风险, 拒绝批准其用于治疗NASH引起的肝纤维化。2023年6月, FDA再次拒绝了OCA用于治疗NASH引起的肝硬化前纤维化的新药申请, 提出需要完成长期随访的临床数据, 以证明其安全性和有效性, Intercept的挫折再次验证了NASH新药研发赛道的残酷性。由于怀疑OCA的不良反应是具有胆汁酸结构导致的, 目前在研的其他数款FXR激动剂均与OCA结构不同, 不具有类固醇类结构, 希望能在保持疗效的前提下降低不良反应[15]。拓臻生物(Terns Pharmaceuticals)的TERN-101是一种强效的非胆汁酸FXR激动剂, Ⅱa期临床数据显示TERN-101治疗可显著降低ALT、校正T1(cT1)弛豫时间和磁共振成像−质子密度脂肪分数(MRI-PDFF), 对LDL-C影响比较轻微, 但是也会导致瘙痒和HDL-C降低, 治疗相关不良事件为轻度/中度[17, 18], FDA已授予TERN-101治疗NASH适应症的快速通道资格认定。EDP-305也曾获得过FDA的快速通道资格认定, 不过EDP-305并未展现出比OCA更好的疗效, 也会导致瘙痒等不良反应, Enanta公司提前终止了72周的ARGON-2研究, 转而寻求联合治疗方案[19]。Metacrine公司的MET-409在疗效及不良反应方面也并未展现出显著优势, 目前已经停止相关项目的研发[20]。Gilead Sciences研发的Cilofexor显著减少NASH患者的肝脏脂肪变性、肝脏生化指标和血清胆汁酸水平, 而未改变肝纤维化评分[21]; Bayer研发的Tropifexor也未显著改善NASH或纤维化组织学变化[22], Cilofexor及Tropifexor作为单药治疗NASH的希望不大, 临床试验重点转向联合治疗。肠道FXR激活后可在回肠末端刺激肠道产生FGF19, FGF19能够抑制脂肪生成和糖异生, 增强脂肪酸氧化和糖原合成, 调节胆汁酸合成和脂质稳态。FGF19类似物NGM282(Aldafermin)由NIDDK和NGM生物制药公司合作开发, 可显著降低肝脏脂肪含量并改善肝功能, 但其Ⅱb期临床未能达到主要临床终点, 后续开发已被终止[23]。由于FXR的重要生物学功能, 基于FXR靶点的NASH治疗药物的研发很早就已经开始, 这一类药物目前进展最快, 但产生的瘙痒等不良反应又限制其在临床上的应用, 备受期待的FXR激动剂OCA的上市申请再次遭受FDA拒绝, 而结构优化后的其他数款FXR激动剂也并未产生更好的疗效及更低的不良反应, 临床试验重点转向联合治疗。研究人员正在努力改进这些药物并找到更好的治疗方案, 以满足患者的需求。2.2 胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide1receptor, GLP-1R)激动剂GLP-1主要由回肠和结肠中的L细胞分泌, 通过与胰岛、肠道、大脑等组织的GLP-1R结合, 触发一系列生理反应, 涉及胰岛素分泌、胃排空延迟、食欲抑制、糖代谢改善等, GLP-1R是糖尿病领域的成熟靶点。GLP-1R在肝脏中的表达量相对较低, 不过越来越多的数据表明, GLP-1R激动剂可以通过多种途径改善NASH患者的肝脏组织学特征[24], 主要机制是减轻体重、降低糖化血红蛋白及脂毒性、改善胰岛素敏感性、抑制肝脏脂肪变性和炎症[25]。目前多个GLP-1R激动剂已进入NASH临床试验研究[26]。司美格鲁肽(Semaglutide)是Novo Nordisk公司研发的长效GLP-1R激动剂, 用于治疗成年2型糖尿病及肥胖, 因其优秀的降糖减重效果备受关注。2020年10月30日, FDA授予其治疗NASH的突破性疗法资格。在治疗NASH和代偿性肝硬化患者中, Semaglutide能够改善肝酶、肝脂肪变性、体重、糖尿病和血脂指标, 但并未显著改善纤维化[27]。Novo Nordisk公司已在中国启动Semaglutide用于非肝硬化性NASH的III期国际多中心临床试验。值得一提的是, Semaglutide与FXR激动剂Cilofexor及乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)抑制剂Firsocostat联用的Ⅱ期试验达到了主要终点, 疗效及安全性良好[28]。利拉鲁肽(Liraglutide)能够改善NASH患者的肝脏组织学, 在接受Liraglutide治疗的患者中, 39%的患者在48周内达到NASH缓解, 而接受安慰剂治疗的患者达到了9%。然而, 经减重调整后, 组织学反应与安慰剂组无显著差异, 提示Liraglutide的益处可能与减重有关[29]。新一代的双靶点和多靶点疗法在靶向GLP-1R之外, 还靶向胰高血糖素受体(glucagon receptor, GCGR)及葡萄糖依赖性胰岛素多肽受体(glucose-dependent insulinotropic peptide receptor, GIP)介导的信号通路。2023年6月, Merck公司公布了其GLP-1R/GCGR双重激动剂Efinopegdutide治疗NAFLD的Ⅱa期临床试验结果, 相较于GLP-1R激动剂, Efinopegdutide具有较长的血浆半衰期, 降低患者肝脏脂肪水平的效果更为显著。Eli Lilly公司的Tirzepatide是一种GLP-1R/GIPR双重激动剂, 在一项事后分析中, 与服用安慰剂的患者相比, 服用Tirzepatide26周的患者与NASH相关的ALT和Pro-C3等生物标志物显著降低[30]。此外, 2023年6月, 第83届美国糖尿病学会公布了Eli Lilly公司的GLP-1R/GCGR/GIPR三重激动剂Retatrutide在肥胖和NAFLD治疗中的Ⅱ期临床试验数据, 与安慰剂相比, 所有剂量的Retatrutide治疗均显著减少肝脏脂肪水平及NASH相关生物标志物(K-18和Pro-C3)。总体而言, GLP-1R激动剂在NASH早期治疗中显示出一定的潜力, 在改善脂肪代谢及胰岛素敏感性、减轻体重方面作用显著, 并且作为降糖减重的成熟靶点, 其用药安全性展现出一定优势。肥胖和2型糖尿病患者出现脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌的风险较高, 高危人群的早期诊断尤为重要, GLP-1R激动剂可用于此类患者的早期个体化治疗, 患者同时需要改变生活方式, 调整饮食结构, 增加体育锻炼。3改善代谢类药物靶点3.1 甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors, THR)激动剂THR包括THRα和THRβ, 虽然这两种异构体在大多数组织中都有表达, 但THRβ是在肝脏表达的主要形式, 而THRα在心脏和骨骼中高表达[31]。基于两者在不同组织的分布, 制药业一直在努力开发具有THRβ选择性的化合物, 用于治疗代谢疾病, 同时避免对心脏及骨骼的不良反应。THRβ能够结合甲状腺激素T3或T4, 形成一个激活的复合物, 然后通过结合到DNA上的甲状腺激素响应元件(thyroid hormone response element, TRE)来调控能量代谢、脂质代谢等相关基因的表达。THRβ激动剂可以提高线粒体功能, 促进脂肪酸氧化和能量代谢, 从而减少肝脏脂质堆积; 调控胆汁酸及胆固醇代谢, 减轻肝脏负担; 抑制肝内炎症和氧化应激, 减少免疫细胞浸润, 降低纤维化相关蛋白的合成[32]。因此, THRβ激动剂具备调控多种肝脏代谢通路来治疗NASH的潜力。Resmetirom是Madrigal Pharmaceuticals研发的一款潜在“first-in-class”THRβ口服选择性激动剂, 能够被肝脏特异性摄取, 两项Ⅱ期临床试验结果均显示, Resmetirom可显著降低NASH患者的肝脏脂肪相对含量[33, 34]。2022年12月19日, Madrigal Pharmaceuticals宣布, Resmetirom治疗NASH的Ⅲ期临床试验MAESTRO-NASH达到主要终点(纤维化改善≥1级且NASH不恶化)和关键次要终点(LDL-C及NASH生物标志物显著降低), 安全且耐受性良好。2023年4月, FDA授予Resmetirom治疗伴肝纤维化的NASH成人患者的突破性疗法认定; 2023年9月, FDA接受Resmetirom的新药申请(NDA)并纳入优先审评, 用于治疗伴有肝纤维化的NASH成人患者。此外, 还有很多在研的用于治疗NASH的THRβ激动剂药物, 如Metabasis/Viking的VK2809、歌礼制药(Ascletis)的ASC41和拓臻生物的TERN-501等。VK2809[35]是一款肝脏靶向性前体药物, 在肝脏被特有的CYP3A4酶切断后释放活性化合物, 其IIa期临床试验结果显示出很好的降脂能力, 目前已进入Ⅱb期研究。ASC41也是一款肝脏靶向性前体药物, 与Resmetirom相比, ASC41与THRβ受体结合亲和力更强, 在I期临床试验中取得良好数据, 不过其在美国的一项II期临床试验处于撤回状态, 陷入了Viking的诉讼风波。TERN-501在DUET IIa期研究中能有效减少患者肝脏脂肪含量并达到了主要和次要研究终点。THRβ选择性激动剂通过调控脂肪代谢、胰岛素敏感性、炎症和纤维化等多种作用机制发挥作用, 在临床试验中获得了积极结果, 同时THRβ选择性激动剂在肝脏部位被特异性摄取, 对骨骼或心脏参数无影响, 不良反应风险较低, 此类药物有可能在NASH治疗中率先获得突破。在一些情况下, 特别是当NASH与THR功能失调相关时, THRβ选择性激动剂可用于个性化治疗。3.2 过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)激动剂PPAR是调节糖脂代谢、炎症和纤维化的一组核受体, 其亚型包括α、β(或δ)和γ。PPARα主要在肝脏表达, 调控成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21, FGF21)分泌、脂肪酸β氧化、脂肪酸吸收、脂蛋白酯酶活性及极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein, VLDL)输出等一系列过程[36]; PPARβ主要表达于骨骼肌、脂肪组织等, 调控脂肪酸氧化、促进胰岛素敏感性; PPARγ在脂肪组织中高表达, 主要调节机体免疫、胰岛素抵抗及脂肪细胞分化[37]。IVA337(Lanifibranor)是Inventiva公司开发的一种泛PPAR激动剂, 在一定剂量范围内能激活3种PPAR受体亚型, 协同改善胰岛素抵抗及脂质代谢。Ⅱb期临床试验结果显示, Lanifibranor显著降低了脂肪变性及纤维化评分, NASH改善且纤维化无恶化[38], FDA也因此授予Lanifibranor治疗NASH的“突破性疗法”称号, 其Ⅲ期临床试验正在多个国家和地区开展。中国生物制药附属公司正大天晴与Inventiva签署协议, 允许在中国研发、制造和商业化Lanifibranor。2023年7月, 正大天晴就Lanifibranor向国家药监局CDE递交申请并获同意拟纳入突破性治疗药物程序, 国际多中心III期临床试验即将在中国启动入组, Lanifibranor是中国第一个进入临床Ⅲ期的NASH口服药物。深圳微芯生物的西格列他钠(chiglitazar sodium)也是一种泛PPAR激动剂, 获NMPA批准用于配合饮食控制和运动, 改善成人2型糖尿病患者的血糖控制, 展现出治疗NASH的潜力, 其Ⅱ期试验正在进行。此外, Genfit研发的PPARα/β双效激动剂ElafibranorⅢ期临床试验效果不佳, 没有达到NASH缓解且纤维化不恶化的治疗目标而被中止。Zydus Cadila研发的PPARα/γ受体激动剂Saroglitazar于2020年3月被印度药品管理局批准用于治疗NASH, 但该适应证尚未通过美国FDA的审批。PPAR的3种亚型具有相似的生物学功能, 也有各自的特点。单一受体激动剂对NASH治疗无显著作用, 而PPAR泛激动剂以一种均衡有效的方式靶向所有3种PPAR亚型, 显示出良好的治疗效果。因此, PPAR泛激动剂是未来靶向PPAR治疗NASH的研发方向之一。而NASH患者的具体病情和病史可能有很大差异, 其最佳治疗策略可能是综合性的, 包括药物联合治疗、生活方式干预和可能的手术干预。3.3 FGF21类似物FGF21是肝脏分泌的肝脏因子, 这类因子由肝脏分泌, 分泌后既反过来作用于自身, 也可以作用于全身其他组织。FGF21表达受到PPAR调控, 主要通过其受体FGFR1发挥功能。FGF21是调节葡萄糖和脂质代谢、胰岛素敏感性、能量稳态的基本代谢信使, 也可通过抑制c-JNK和NF-κB信号通路发挥抗炎作用[39]。内源性FGF21的半衰期极短, 治疗药物一般是通过化学修饰或基因工程改造获得的半衰期更长的类似物。Akero公司的FGF21衍生物AKR-001(Efruxifermin)研发进展较快且潜力较大, 目前FDA已授予其用于NASH治疗的快速通道资格。Efruxifermin是基于人体免疫球蛋白G1的Fc片段与FGF21融合的长效FGF21类似物, 比天然FGF21的半衰期更长, 受体亲和力更强[40]。2022年9月13日, Akero公司宣布Efruxifermin在Ⅱb期HARMONY研究中获得了积极数据, 28和50mg剂量的Efruxifermin在短短24周内均达到了改善肝脏纤维化的主要终点及多个次要终点, 且Efruxifermin耐受性良好, 最常见的不良事件是1级或2级胃肠道事件, 研发者对Efruxifermin寄予厚望。然而, 2023年10月, Akero公布Efruxifermin治疗代偿性肝硬化NASH患者的IIb期研究中期分析结果未达预期, 第36周时, 试验观察到了肝纤维化改善的主要终点趋势, 但不具有统计学意义, 不过在肝损伤和纤维化非侵入性标志物、血糖控制和脂蛋白方面观察到统计学意义上的改善, 未来将进一步观察96周的长期数据。此外, BMS-986036(Pegbelfermin)是聚乙二醇化的FGF21类似物[41], 但其Ⅱb期临床试验(FALCON1和FALCON2)结果不如人意, Bristol Myers Squibb已经停止了对Pegbelfermin的开发[42]。FGF21类似物作为治疗NASH的新型药物, 具有调节代谢、抗炎和改善病理损伤等优点, 能够显著缓解肝纤维化, 其组织学改善效果是目前公布数据的NASH药物中最为显著的, 并且其治疗作用不仅局限于肝脏, 还可能对全身脂质代谢产生积极影响, 这对NASH患者尤为重要。不过FGF21类似物治疗代偿性肝硬化NASH患者的效果暂未达到预期, 多数以注射形式给药, 并且产生胃肠道相关不良反应, 仍需要进一步研究来评估其长期疗效、安全性和给药方案的优化, 以及与其他治疗方法的组合应用。3.4 靶向肝脏脂质生成通路肝脏TG的来源主要有从头合成(de novo lipogenesis, DNL)和3-磷酸甘油(glyceraldehyde3-phosphate, G3P)途径, DNL的底物是乙酰辅酶A, 碳水化合物和脂肪酸代谢均可产生乙酰辅酶A, SCD1、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FASN)、ACC、DGAT2是DNL过程中的关键酶, 其表达受到核受体PPAR、FXR等的调控[43, 44], 直接抑制DNL关键酶以减少肝脏内TG堆积是治疗和预防NASH的重要策略之一。3.4.1 SCD1抑制剂SCD1是将饱和脂肪酸(如硬脂酸和棕榈酸)转化为单不饱和脂肪酸(如油酸和亚油酸)的限速酶[45], Aramchol是Galmed自主研发的一款口服新型脂肪酸胆酸偶联物[46], 通过抑制肝细胞和肝星形细胞中SCD1的表达发挥作用: 在肝细胞中, 抑制SCD1能够减少单不饱和脂肪酸的合成, 促进胆固醇逆向转运, 减少肝脏脂质堆积, 增加GSH/GSSG比率, 减少肝脏氧化应激; 在肝星形细胞中, 抑制SCD1会导致PPARγ的特异性上调, 从而阻止胶原蛋白的产生。Aramchol治疗NASH的Ⅱb期研究结果显示, Aramchol可有效降低肝脏脂肪浸润, 并具有良好的安全性和耐受性[47]。2023年1月4日, Galmed宣布Aramchol用于治疗NASH的Ⅲ期ARMOR研究开放标签部分达到主要终点。数据显示, 在经过48周治疗后, Aramchol显著改善NASH患者的肝纤维化程度, 显著降低多项肝损伤、肝硬化与纤维化生物标志物的水平。3.4.2 FASN抑制剂FASN是位于SCD1上游的脂肪酸合成酶。歌礼药业FASN抑制剂TVB-2640(ASC40)可抑制肝内DNL, 并直接抑制炎症和纤维化通路。Ⅱa期临床试验结果显示, ASC40可以剂量依赖的方式显著改善NASH患者的糖脂代谢、炎症和纤维化[48]。2021年3月23日, 歌礼药业发布新闻稿称, ASC40获得美国FDA快速通道资格, 用于NASH适应症。3.4.3 ACC抑制剂ACC是位于FASN上游的脂肪酸合成酶[49], ACC有2个亚型, ACC1位于细胞质, ACC2位于线粒体, 前者催化产生的丙二酰辅酶A用于DNL, 后者产物则可抑制脂肪酸氧化限速酶CPT1的活性。因此, 当将两个亚型同时敲除后, 虽然可降低DNL从而减少肝脏脂肪含量, 但同时激活了G3P途径, 增加了肝脏对血液里游离脂肪酸的摄取, 进而通过G3P途径合成TG, 通过VLDL分泌到肝外, 从而导致血脂升高; 同时虽然缺少ACC2产物对CPT1的抑制, 脂肪酸氧化增加, 但是由于DNL的抑制, 导致PPARα的配体大幅减少, 因此脂肪酸氧化增加的幅度并不足以抵消G3P途径带来的脂质的绝对增加。因此, 针对肝脏脂质合成通路的药物研发应综合考虑DNL和G3P两个途径的作用, 和TG合成最后一步关键酶DGAT2抑制剂联用能解决ACC抑制剂的不良反应。针对ACC下游脂肪酸合酶FASN也存在着类似的问题, 其产物也是PPARα的配体, 因此FASN在肝脏的敲除可能会因为脂肪酸氧化被抑制而增加肝脏脂质水平, 但抑制下游的SCD1则不会有此问题[50, 51]。目前, 处于临床阶段的ACC抑制剂有Firsocostat和PF-05221304(Clesacostat)。如前所述, Firsocostat与Cilofexor及Semaglutide联用的疗效及安全性较好。Clesacostat能有效抑制肝脏ACC以降低NASH患者肝脏DNL, 但其单药临床试验结果疗效不佳, 并且会导致高脂血症[52]。Pfizer已停止Clesacostat作为单药治疗的相关试验, 在此之前, Pfizer研发的DGAT2抑制剂Ervogastat也从NASH管线中移除, 重点转向Ervogastat和Clesacostat联合治疗[53]。Ervogastat/Clesacostat组合疗法的非临床试验结果和Ⅱa期临床试验(NCT03248882、NCT03776175)结果积极, 使其获得治疗NASH合并肝纤维化的快速通道资格。3.4.4 DGAT2抑制剂DGAT2是催化TG合成最后一步的关键酶[54]。PF-06865571(Ervogastat)是Pfizer研发的治疗NASH的DGAT2抑制剂。DGAT2抑制剂能阻止脂肪酸储存为TG, 从而抵消ACC抑制剂导致的高脂血症[51], 如前所述, Ervogastat和ACC抑制剂Clesacostat联合治疗具有良好的安全性和耐受性。总之, 干预脂质合成通路来治疗NASH仍然具有前景, SCD1抑制剂具有良好的安全性和耐受性, ACC抑制剂及FASN抑制剂会产生高脂血症的不良反应, 临床上在针对此类靶点进行药物开发时须考虑周全, 进行联合给药或采取其他方法以消减其不良反应带来的不利影响, 同时需要充分考虑个体差异、不良反应和药物相互作用等因素。3.5 钠-葡萄糖协同转运蛋白(sodium-dependent glucose transporters, SGLT) 1/2抑制剂SGLT1和SGLT2都是上皮葡萄糖转运的重要介质, 在肾脏葡萄糖的重吸收中起重要作用, 是治疗糖尿病的主要靶标[55]。SGLT-2抑制剂卡格列净(Canagliflozin)可降低78%的脂肪含量, 有效改善炎症。T2DM合并NAFLD患者(n= 57)经SGLT-2抑制剂达格列净(Dapagliflozin)(每天5mg)治疗24 周后, 血清ALT、AST均有明显改善[56], 展示出治疗NASH的潜力, 不过此类药物目前尚未展开大规模的临床试验。4靶向炎症通路的药物靶点NASH发生时, 肝脏脂质堆积会引起肝细胞损伤, 激活免疫细胞释放炎症因子, 炎症进一步加剧细胞凋亡及坏死, 促进胶原生成及细胞外基质沉积, 从而导致肝脏纤维化或瘢痕形成, 肝脏炎症和纤维化会导致门静脉高压, 进而显著增加产生危及生命的食管静脉曲张风险。半乳糖凝集素-3(galectin-3, Gal-3)是一种β半乳糖苷结合蛋白, 介导细胞间的黏附, 参与炎症细胞的迁移和活化, 促进细胞外基质积累及组织纤维化过程[57]。Belapectin是Galectin公司研制的一种Gal-3抑制剂, 能够预防NASH肝硬化食管静脉曲张的发生[58]。NAVIGATE临床Ⅱb/Ⅲ期试验结果显示, Belapectin在NASH引起的肝硬化患者中疗效与安全性良好。趋化因子受体2/5(CC-chemokine receptor2/5, CCR2/5)的异常激活可导致单核细胞和巨噬细胞向炎症组织募集, 并激活肝星形细胞, 导致纤维化[59]。Cenicriviroc是一种口服的CCR2/5双重抑制剂, 但其Ⅲ期临床试验结果未达到主要终点, 临床试验被迫终止[60]。Caspase是一类细胞内半胱氨酸蛋白酶, 通过活化IL-1β、IL-18和IL-33等促炎因子, 调控凋亡和炎症[61]。Emricasan是一种全caspase抑制剂, 但其IIb期临床试验结果显示, 未达到治疗NASH的主要终点[62, 63]。5抗纤维化类药物靶点细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulated kinase1, ASK1)可激活TNFα的下游p38/JNK通路, 导致细胞凋亡和纤维化[64]。Selonsertib是一款ASK1抑制剂, 但两项评估Selonsertib治疗NASH导致的晚期纤维化患者的安全性和有效性的III期试验均未达到主要终点, 该项目已终止[65]。赖氨酰氧化酶样2(lysyloxidase-like2, LOXL2)通过催化胶原的交联促进纤维生成。Simtuzumab是一种靶向LOXL2的单克隆抗体, 两项评估Simtuzumab治疗NASH导致的晚期纤维化患者的IIb期试验, 由于缺乏预期的疗效而提前终止[66]。靶向脂质代谢的药物通常适用于NASH早期阶段, 减少肝脏内的脂肪积累, 从而延缓或阻止NASH向纤维化的进展; 而靶向炎症及纤维化的药物更适用于进展到晚期的NASH, 伴随着明显的肝纤维化或肝硬化, 这些药物旨在减轻或逆转肝脏中的疤痕组织, 治疗晚期NASH通常更具挑战性, 因为肝脏已经受到了严重的结构和功能损害, 可能需要更复杂的治疗方法。因此, NASH的早期干预非常重要, 在疾病的早期阶段采取适当的措施可有效预防严重肝病的发展。6小结与展望NASH的药物研发面临着临床诊断困难、动物模型数据难以转化为临床结果、发病机制复杂等困难。肝活检仍然是临床确诊NASH的金标准, 但存在有创和取样随机性等缺陷, 非侵入性诊断技术的开发对评估药物疗效将会更加直观全面。目前尚无NASH动物模型能够完全模拟人类NASH病理特征, 需要建立基于不同病因的NASH动物模型以全面模拟人类NASH的发生发展, 同时研究并使用其他创新性临床前模型, 如人源化的肝脏NASH类器官和肝脏芯片。NASH病因复杂、多样, 肝脏功能异常的同时合并全身代谢紊乱, 单药治疗存在一定缺陷, 目前多种药物的联合治疗方案已投入Ⅱ期临床试验, 与单一用药相比或许会有突破性的进展, 多靶点药物开发也是NASH领域的研究热点方向。NASH是一类异质性很强的疾病, 而目前大多数NASH临床试验的受试者招募采用的是“非精准化”方案, 这也增加了新药研发的难度, 因此, 在开展临床试验时应该对患者进行更精细的分类, 从而实现更精准、个性化的治疗, 最终提高新药研发成功率。综上所述, FXR激动剂OCA及THRβ激动剂Resmetirom是目前治疗NASH前景较好的药物, 其他进展较快的药物还包括FGF21衍生物Efruxifermin、PPAR激动剂Lanifibranor、SCD1抑制剂Aramchol及GLP-1受体激动剂Semaglutide等(表1)[15, 28-30, 33-35, 38, 40, 46, 47, 58, 67]。以上潜力较大的药物均靶向肝脏脂质代谢, 而针对炎症和纤维化靶点(CCR、Caspase、ASK1、LOXL2)进行开发的药物都宣告失败, 这可能是由于从脂毒性到细胞损伤、炎症和纤维化的信号通路复杂交错, 而靶标所处的病理生理学通路越下游, 其改善疾病发展的难度就越高。由此看来, 改善脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗仍然是目前治疗NASH较好的策略。同时, NASH的发生发展与肝外组织如肠道和脂肪组织等关系密切, 肠道是人体重要的营养物质吸收器官, 在脂质代谢中有着重要作用, 也可通过肠道菌群、FGF19及神经酰胺等方式影响肝脏生理和代谢, FXR激动剂和THRβ激动剂取得较好临床试验结果的原因可能也与其能够直接(FXR激动剂)或者间接(二者都可调节胆汁酸代谢)影响肠道功能, 同时作用于肝脏和肠道有关。而FGF21是由肝脏分泌的因子, 也可同时作用于肝脏和脂肪组织, 从而显著改善NASH相关病理表现。因此, 未来靶向肠道组织, 或者同时靶向肝脏、肠道组织及脂肪组织等的药物研发也可能是极具潜力的方向之一。作者贡献刘彩红负责文献调研及文章撰写; 侯少聪负责思路指导及文章修改; 李平平负责主题制定及文章审阅参考文献详见《药学学报》2023年文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

近年来，包括信使RNA（mRNA）、小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）在内的核糖核酸（RNA）治疗已经迅速发展为现代医学的一个新支柱。其中，基于mRNA制备而成的新冠疫苗更是在抗击引起严重急性呼吸道综合症的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）方面发挥了巨大作用，其超快的序列设计速度和易于大规模生产的特性为应对紧急和不断变化的医疗危机提供了新的可能。在如今mRNA药物获得成功的大背景下，将线性mRNA进一步通过首位连接合成环状RNA（circular RNA, circRNA）来提高mRNA的稳定性并延长蛋白质的翻译时间又成为了mRNA治疗领域的新热点。简单来说，环状RNA是一种首尾共价连接的闭合单链RNA，它无需mRNA中常见的5’帽子和3’-poly(A)尾巴就可以保持稳定的状态，这是由于其共价闭合的结构本身就可以阻止核酸酶的降解。生物体内天然形成的环状RNA大多由mRNA前体（pre-mRNA）通过反向剪接（back-splicing）形成，并分布于细胞质中，其半衰期从18.8小时到23.7小时不等，而其同源的线性RNA半衰期仅有4.0~7.4小时。虽然大多数天然的环状RNA是非编码RNA，即不能翻译成蛋白质的RNA，但有研究证明人工合成带有IRES（内部核糖体进入位点）序列的环状RNA是可以在体内和体外进行翻译的。因此，近年来有越来越多的国内外研究人员和生物公司在研究环状RNA在体内外翻译机制，同时研发出多种体内外合成环状RNA的技术，这些技术也极大地促进了环状RNA治疗领域的发展。基于以上背景，本文将从体外合成环状RNA、体内合成环状RNA以及国内外各大环状RNA公司采用的合成方法这三个方面进行阐述，期望提高人们对环状RNA治疗领域的了解。 体外合成环状RNA的技术方法1.1 化学合成环状RNA目前环状RNA的化学合成技术主要以磷酰胺（phosphoramidite）化学和固相合成为基础，并以天然的核苷三磷酸酯衍生物为原材料来进行制备的。这些衍生物采用非活性保护基团取代天然核苷三磷酸酯中的反应性氨基和羟基，能够实现3’-5’磷酸二酯连接并去除保护性基团，同时能最大程度避免2’-5’磷酸二酯键的形成及其它副反应的发生。后续经过合成后的处理和纯化，就可以生成高纯度的寡核苷酸。然而，目前的环状RNA化学合成技术只能合成少于70~80个核苷酸（nt）长度的环状RNA（图1）。图1：体外化学合成环状RNA1.2 酶促连接合成环状RNA酶促连接合成通常通过体外转录（IVT）反应实现，该反应需要DNA模板、反应缓冲液和噬菌体RNA聚合酶。噬菌体RNA聚合酶通常来源于T7、SP6或T3噬菌体，其中较常见的是T7 RNA聚合酶。IVT反应允许以较低的成本进行更长的环状RNA合成，因此酶促合成是目前主流的环状RNA合成方法。但需注意的是，野生型噬菌体聚合酶自带的run-off性质可能导致合成不完整的RNA序列，因此有些研究通过突变野生型噬菌体RNA聚合酶来改善体外转录的质量，减少副反应的发生。由于酶促连接是现阶段使用较多的体外合成环状RNA的方法，因此下文将对酶促合成进行重点介绍，而酶促连接又可进一步分为T4连接酶连接和核酶连接两种。1.2.1 T4连接酶合成环状RNA来源于噬菌体T4的多种连接酶都可以催化RNA连接反应，这其中包括T4 DNA连接酶（T4 Dnl）、T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1）和T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2）。当然，这种连接需要线性RNA前体上的受体区域（acceptor substrate）有3’-OH，且供体区域（donor substrate）有5’单磷酸才能进行。1) T4 Dnl连接T4 Dnl可以连接双链DNA或DNA/RNA杂交链（图2A），该方法通常需要利用一个与连接处互补的DNA（cDNA）模板或cDNA“桥”（bridge）来实现。这种方法的优点是连接的准确性较高，但是它要求线性RNA前体在连接处没有明显的RNA二级结构，且在双链区不能有高比例的尿嘧啶（U）。此外，T4 Dnl针对DNA/RNA杂交链的连接效率低于双链DNA（dsDNA）连接，因此实际上只有少数研究会使用该方法进行RNA连接。2) T4 Rnl 1连接T4 Rnl 1是一种比较常见的单链RNA（ssRNA）连接酶，它可催化单链RNA末端的3’-OH对活性的5’端进行亲核攻击，形成共价的3’-5’-磷酸二酯键，进而形成环状RNA（图2B）。有些研究也会在此过程中使用cDNA“桥”来防止线性RNA前体折叠成不必要的二级结构。值得注意的是，T4 Rnl 1对5’末端和3’末端的核苷酸明显偏好性：其对3’末端的核苷酸偏好为A>G≥C>U，而对5’末端核苷酸偏好则为pC>pU>pA>pG。该连接方法的优点是仅可以合成极短的环状RNA（短至6~8 nt），但对于较大的RNA分子的连接效率会显著降低。与T4 Dnl类似，线性RNA前体末端若具有明显的RNA二级结构会大大降低T4 Rnl 1的连接效率。此外，该反应还存在分子间末端连接（低聚物）的严重副反应，该副反应会随着线性RNA前体浓度的增加而增加，并会限制环状RNA的产量。3) T4 Rnl 2连接T4 Rnl 2与T4 Rnl 1相似，它也可催化RNA末端的3’-OH与5’末端形成共价的3’-5’-磷酸二酯键。不过T4 Rnl 2在连接双链RNA（dsRNA）时要比连接单链RNA厉害得多（图2C）。基于这一特点，当线性RNA前体折叠成二级结构，即接头区域为双链结构时，T4 Rnl 2的连接效率要比T4 Rnl 1高得多；而且利用外源RNA“夹板”序列（RNA splint），T4 Rnl 2还能实现对单链RNA末端的连接。不过此方法不能用于连接较短的RNA前体，这是因为当线性RNA前体的长度短于30 nt时，其连接处形成的复合物是不稳定的。与T4 Rnl 1一样，T4 Rnl 2也存在对大片段RNA分子连接效率低和副反应多的问题。综上，T4 Dnl和T4 Rnl 1适用于没有复杂二级结构的RNA环化；而T4 Rnl 2更适用于接头区域为双链的线性RNA前体，因此在实际操作中需要根据线性RNA前体的二级结构来选择不同的T4连接酶。需注意的是，所有这些连接酶合成方法都不能实现大片段RNA分子的环化，也不能完全避免分子间末端连接的副反应。图2：T4连接酶合成环状RNA的策略1.2.2 核酶合成环状RNA1） I型内含子自剪接系统（Group I intron self-splicing system）1982年，科学家在四膜虫（Tetrahymena thermophila）的rRNA转录本中首次发现了I型内含子，它同时也是第一个被发现的核酶——无需任何蛋白质的帮助就可以帮助初级转录本RNA进行自我剪接（self-splicing）。自那以后，在许多生物和病毒基因组的tRNA、mRNA和rRNA中也陆续发现了很多能够自我剪接的I型内含子。尽管这些I型内含子来源于完全不同的初级转录本，但它们的催化中心结构却惊人得相似。根据二级结构可将I型内含子划分为10个结构域，并分别命名为P1~P10，其催化中心位于P4-P6（P4, P5, P6）和P3-P9（P3, P7, P8, P9）结构域的交界处，P1和P10则分别为5’和3’剪接位点（splice site），而其他围绕着保守的催化中心的序列则负责维持核酶的稳定性和正确折叠（图3）。图3：Tetrahymena thermophila I型内含子的二级结构示意图利用I型内含子自剪接的特点进行改造的体外合成环状RNA系统正是目前最为常见的体外合成环状RNA的技术，该技术也被称为PIE法（permuted introns and exons），只需GTP和Mg2+就能实现RNA的连接（图4）。图4：PIE法制备环状RNA的原理用于PIE合成的体外转录模板通常采用来自Anabaena tRNALeu基因或T4噬菌体的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, td）基因上的I型内含子序列，这两种I型内含子都已被证实可以高效促进RNA的环化。以td基因内含子改造的PIE系统为例（图5），它主要包含td内含子的5’端内含子序列（5H）、3’端内含子序列（3H）、相邻外显子序列（E1和E2）、内部引导序列（internal guide sequence, IG）、待环化的RNA（RC）以及为促进折叠和稳定内含子而添加的末端同源臂序列。RNA的环化过程大致如下：（1）一个鸟苷亲核物插入RC-5H交界处（5’ SS）并置换RC的3’末端；（2）该鸟苷继续进一步插入3H-RC交界处(3’ SS)，在与RC 5’末端连接时取代3H的3’末端，从而形成环状RNA。由于该催化反应的关键是E1和E2与内含子序列发生碱基互补配对，因此E1和E2序列也都会被纳入新生的环状RNA中。图5：I型内含子PIE系统的二级结构示意图与化学连接和酶促连接相比，PIE方法可用于较大片段的线性RNA前体环化，而且其反应条件和纯化方法也比较简单。现有的研究已经可以通过设计特定的PIE转录模板对几乎任何序列的线性RNA前体进行高效的环状RNA合成。基于以上优势，PIE法是目前研究最多和使用最广泛的RNA连接方法。然而PIE方法仍存在明显缺陷：1. 由于RNA二级结构的复杂性，不同的RNA序列会导致最终形成的环状RNA结构存在巨大差异；2. 此外，由于外源外显子序列的引入，最终形成的环状RNA序列将与原始的线性RNA前体序列不同，这可能会对环状RNA的功能验证产生负面的影响。2） II型内含子自剪接系统（Group II intron self-splicing system）:II型内含子（Group II introns）是一类发现于细菌和细胞器基因组中的可移动遗传物质，它们被认为是真核生物中剪接体内含子和逆转录转座子的祖先，其包含一个具有催化活性的内含子RNA（“核酶”）和一个内含子编码蛋白（intron-encoded protein，IEP），两者共同介导内含子在基因组内进行增殖。II型内含子RNA通过与剪接体内含子类似的转酯反应催化其自身的剪接，产生拼接的外显子和一个切下来的内含子套索RNA（lariat RNA）。IEP是一种多功能的逆转录酶（reverse transcriptase, RT），它能通过稳定具有催化活性的RNA结构来协助剪接。在剪接后，IEP还会与切除的内含子RNA相连，组成一种可以入侵基因组DNA的核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）（图6A）。II型内含子RNA同样具有保守的二级结构，其长度为400~800 nt，大致可分为六个区域DI-DVI（也可称为D1-D6），它们从结构上来看就像一个“车轮”（图6B）。其中DV是活性位点的核心，包含所谓的催化三碱基（catalytic triad）“AGC”和一个“AY”（Y代表碱基C或T）凸起，这两者都能结合具有重要催化作用的Mg2+离子；而DVI包含一个隆起的腺苷作为分支位点（branching site），其2’-OH基团用于亲核攻击内含子5’剪接位点上的磷酸基团，起始剪接反应并形成套索RNA。DI是最大的结构域，包含上下两半部分，其中的EBS1可以与5’剪接位点交界处的内含子结合位点（IBS1）配对，以确定剪接的确切位置；DII和III是两个较小的结构域，对组装活性内含子结构和激活剪接反应方面起着关键作用，其中DIII还可作为“催化效应器”来加速催化反应；DIV是一个茎环（stem-loop）结构，其loop序列上包含maturase（成熟酶）的ORF，靠近其5’端的亚结构域DIVa含有一个对IEP具有高亲和力结合位点（图6B）。II型内含子RNA还具有保守的5’和3’端序列，分别是GUGYG和AY，其与剪接体内含子的保守序列相似（即GU. . . AG）。图6：II型内含子的工作原理及二级结构示意图II型内含子序列上的一系列保守结构域（包括由希腊字母命名的结构域、外显子结合位点EBS和内含子结合位点IBS）还能通过远距离的三级相互作用形成保守的三级结构，进而将相距甚远的序列凝聚在一起形成新的活性部位，该活性部位会结合剪接位点和分支点（branch-point）的核苷酸残基，然后在Mg2+的帮助下来催化连接反应。科学家们基于II型内含子的自催化特性开发出了另一种体外合成环状RNA的PIE技术——利用反向剪接反应（inverse splicing）将一段RNA末端的5’剪接位点与该RNA的3’剪接位点连接起来形成环状RNA（图7）。图7：II型内含子PIE系统的原理图中科院上海营养与健康研究所的王泽峰研究员课题组及其创立的环码生物医药公司在基于II型内含子环化特性开发的体外环化技术以及环状RNA的体外翻译机制领域就取得了较大突破。他们于2022年发表了一个基于II型内含子环化且适用于大规模生产的体外RNA环化新技术，该技术可以实现高效共转录环化RNA的同时又能避免掺入无关序列，而且该环状RNA可以在细胞和小鼠体内进行高效翻译的同时又不会引起严重的先天性免疫反应。具体来说，他们是对来自破伤风杆菌表层蛋白（surface layer protein of Clostridium tetani, ctSLP）的一个II型内含子上的某个loop区域进行了切割，构建了一种分裂的内含子（split-intron）环化系统，然后将需要环化的序列插入到两段内含子中间，该环化序列两端还分别包含两个6 nt的短序列IBS3和IBS1。在体外转录时，RNA前体会通过II型内含子介导的自我剪接反应产生一个包含目的序列的环状RNA和一个分支状内含子RNA（branched intron RNA），该系统也被他们命名为“CirCode”，可以作为一个通用的平台来生产任何指定序列的环状RNA并用于蛋白质翻译（图8）。图8：环码生物体外环化技术CirCode系统的工作原理示意图3） 发夹状核酶（Hairpin ribozyme, HPR）HPR可以单链环状DNA为模板通过滚环（rolling circle）反应和自剪接反应产生环状RNA。带有HPR的线性RNA前体会折叠成两种具有切割活性的构象以暴露出3’端和5’端，进而通过自发连接成环状RNA（图9）。这种方法可以高效生产较短的环状RNA，但它的劣势在于由HPR催化的裂解和连接是一种动态平衡，这会导致形成的环状RNA并不稳定；此外，生成的环状RNA中会包含HPR序列，可能对环状RNA的功能产生不利影响。图9：核酶合成环状RNA的策略综合来看，在以上所有酶促连接合成环状RNA的方法中，PIE法显示出较明显的优势，并且被广泛用于基础研究和工业生产中（表1）。但值得注意的是，不同环化策略合成的环状RNA所触发的人体细胞免疫反应程度存在较大差异：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的陈玲玲团队于2021年报道，由I型内含子自剪接系统合成的环状RNA会分别引入~74 nt（td）或~186 nt（Anabaena）的外源序列，这些外源序列会触发较强的先天性免疫反应；相比之下，由T4 RNA连接酶合成的无外源序列掺入的环状RNA表现出最小的免疫原性。表1体外合成环状RNA的方法对比体内合成环状RNA的技术方法与体外合成环状RNA不同，体内合成环状RNA主要采用在活细胞中过表达促进环化的迷你基因序列的质粒载体来实现，待环化的序列会在转录后通过反向剪接反应自然环化。大多数体内RNA环化的迷你基因中包含至少一个待环化的外显子序列以及含有剪接元件的5’和3’端的内含子顺式元件。通过使用不同组合的内含子顺式元件，该技术几乎可以环化任何长度的序列（100 nt到5 kb），内含子顺式元件大致分为四种：(1)具有互补序列的内含子；(2)含有特定蛋白质结合位点的内含子；(3)具有核酶活性的内含子；(4)来自后生动物tRNA的内含子（图10）。2.1 内含子互补序列（intronic complementary sequences, ICS）合成环状RNA根据现有的全转录组高通量测序结果可知，大多数内源性环状RNA的两侧内含子上富含能够反向互补的序列，这些反向互补的侧翼内含子序列通过互补配对拉近待环化序列的上游受体和下游供体剪接位点在空间上的距离，进而促进反向剪接反应的发生。内含子互补序列（ICS）绝大部分来自生物内源基因上的重复片段或非重复片段，也有少量ICS是通过计算机模拟设计出来的，目前科学家们已经能够利用这种内源性的环状RNA形成机制将指定的RNA序列制备成环状RNA。2.1.1 重复性ICS在人类和灵长类动物中最常见的重复序列是Alu元件，它是约300 nt长的富含腺嘌呤（A）的保守序列，由一类短间隔重复元件（short interspersed repeat elements, SINEs）的逆转录元件进化而来。据估计，Alu元件约占人类基因组的11%，尤其在蛋白质编码基因的内含子中大量存在。除了使用灵长类动物内源基因上的Alu元件，还可以使用非灵长动物中能促进环化的内源基因内含子序列，例如来自Zkscan1、Hipk3和Laccase2等基因的内含子（图10）。2.1.2 非重复性ICS非重复性的内源性ICS包括所有跨越侧翼内含子的反向互补序列，例如在小鼠中能产生大量环状RNA的Y染色体性别决定区基因（sex-determining region-Y, Sry）就是一个含有非重复互补序列内含子的典型案例。通过RNA-seq可知在人体内源性环状RNA两侧的内含子中也存在大量的非重复性ICS序列，它们即使只有30~40 nt长也足以进行环化（图10）。2.2 特定蛋白质结合位点合成环状RNA研究表明多种RNA结合蛋白（RNA binding proteins, RBP）在生物体内有促进反向剪接的功能，因此我们可以将这类蛋白的结合位点整合到过表达环化载体中以介导目的RNA的环化。2.2.1 Musclebind (MBL)在果蝇和人类中，RBP蛋白Muscleblind（MBL）可与基因组上特定的保守位点结合促进这些基因座的RNA反向剪接。2014年就有研究人员将MBL结合位点应用到环状RNA的体内合成技术当中，并成功地在果蝇体内和人类细胞中实现高效的环状RNA表达（图10）。2.2.2 Quaking (QKI)RBP蛋白Quaking是另一个能促进反向剪接的反式作用因子，它首次在小干扰RNA（siRNA）的筛选中被发现，并被证明可以调控环状和线性RNA剪接产物的比例。后续研究发现它的作用机制与MBL蛋白大致相同，将QKI结合位点（ACTAACN1-20TAAC）引入到环化序列两侧内含子上就可以促进RNA的体内环化（图10）。除了上述介绍的RBP，还有NF90/110、RBM20、Fus、DHX9等蛋白可以调控环状RNA的体内合成。然而，目前对于这种将RBP结合位点引入到环化载体上的设计是否会存在不利的影响还不太清楚，后续还需要更深入的研究来了解RBP介导的环化反应机制。图10：体内合成环状RNA的方案2.3 使用tRNA内含子合成环状RNA在2015年一项针对果蝇的RNA-Seq分析结果显示，有一类含量丰富的tRNA内含子环状RNA（tRNA intron circular RNAs, tricRNAs）可以既不依赖剪接复合物（spliceosome）也不依赖自催化剪接反应独立产生。它们主要是由一组高度保守的宿主酶对含有内含子的tRNA前体进行切割后，由宿主连接酶RctB对切除的内含子进行分子内连接产生的。该系统已被证明能够在人类和果蝇细胞系中合成长度在75到800 nt的环状RNA：通过在含有果蝇tRNA基因骨架的内含子切割位点之间插入需要环化的RNA序列，就可以产生想要的环状RNA（图11）。图11：基于tRNA设计的体内合成环状RNA方案2019年有研究人员对该系统进行了优化，他们将一段具有自剪接能力的核酶序列取代了tRNA骨架，进一步提高了环化的效率，这种新的质粒构建被称为“龙卷风（Tornado）”系统，它在高效合成与小分子靶标结合的功能性环状RNA适配体（aptamer）方面具有强大的优势。2.4 使用PIE系统合成环状RNA在前文描述的体外合成环状RNA技术中属PIE法同样可以应用于体内合成环状RNA。假如在质粒载体中插入改造过的I型内含子PIE序列，将其转染到细胞中就可以获得目的序列的环状RNA。与上述体内环化系统不同，含有PIE序列的质粒首先会产生线性转录物，然后通过核酶介导的自剪接反应进行环化。早在90年代就已利用PIE法在大肠杆菌和酵母体内使用改造后的td基因骨架的质粒实现了环状RNA的体内合成。通过替换不同的外显子序列，此方法可以在生物体内（主要是细菌和真菌）稳定地合成各种中短长度的环状RNA（71~1130 nt），这种方式生成的环状RNA类似于从相同PIE序列的IVT反应中获得的剪接产物。但是在2017年的一项研究发现，将含有PIE序列的质粒转染到HeLa细胞中会强烈刺激细胞产生先天性免疫信号，导致转染细胞死亡；然而一个具有相同外显子序列但由ZKSCAN1基因内含子介导体内合成的环状RNA不会导致细胞死亡。造成该现象的原因可能是内含子序列的身份来源影响了环状RNA引起的先天性免疫反应，该发现也提醒我们免疫原性是我们在选择体内还是体外环化系统时必须要考虑的问题，其中体外环化系统可能更适合于没有哺乳动物mRNA剪接和先天性免疫信号系统的非后生动物，关于体内合成环状RNA方法的优劣势对比可参见下表（表2）。表2体内合成环状RNA的方法对比国内外各大环状RNA公司所采用的合成方法因为环状mRNA治疗是近几年才兴起的生物医药领域，所以开发环状RNA治疗的公司相对较少并且都很年轻。在国际上主要以ORNA Therapeutics和Laronde为代表，前者于2022年8月16日刚刚完成2.21亿美元的B轮融资，并且还与默沙东（MSD）公司达成一项总额高达36.5亿美元的合作协议；后者则获得了曾孵化Moderna公司的Flagship的4.4亿美元B轮融资。3.1 Orna Therapeutics该公司于2021年由来自麻省理工学院（MIT）的纳米治疗领域的顶级学者Daniel G. Anderson教授创办，它致力于开发一种完全工程化的环状RNA——oRNA疗法，用以治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和遗传性疾病。值得一提的是，Anderson实验室正是最早改造鱼腥藻（Anabaena）I型内含子实现体外合成长编码环状RNA的团队，因此Orna公司的环状RNA合成技术也主要采用了I型内含子自剪接系统（图3）。图12：oRNA合成策略Orna公司目前最为领先的项目是原位嵌合抗原受体（CAR）疗法（isCARTM，一种抗CD19的CAR），该疗法结合了oRNA和定制化的脂质纳米颗粒（LNP），可在患者体内制造出改良的免疫细胞用于治疗癌症。为此该公司还开发了一个专有的FoRCE筛选平台用于筛选新的IRES元件，新型IRES能够显著促进oRNA的表达水平（图13）。图13：FoRCE 筛选平台（来源：Orna）Orna在2020年5月后已申请了至少六项与环状mRNA组成和技术相关的专利，所有这些专利申请都披露了环状RNA的结构（包括IRES元件、间隔序列、序列修饰、稳定性）、环状RNA-LNP配方和CAR疗法的传递效率等实验数据。3.2 LARONDELARONDE公司由Flagship Pioneering公司于2021年5月成立，它致力于开发一种名为Endless RNATM（eRNA）的工程化环状RNA，用以表达治疗性蛋白质。LARONDE的知识产权由Flagship Pioneering公司拥有，其申请的专利涵盖了从环状RNA结构、疫苗接种、异源蛋白表达和治疗用途等应用的各个方面，目前已提交了至少12项专利，这其中也包含针对SARS-CoV-2的环状RNA疫苗。尽管LARONDE官网并没有太多它所使用的环状RNA技术的信息，但从其提交的专利来看，该公司主要采用的是T4 Dnl/Rnl连接的方式进行RNA环化。国内环状RNA治疗的生物公司呈现百花齐放百家争鸣的发展趋势，各个环状RNA公司的RNA环化技术各具特色，同时基于环状RNA的递送技术平台、肿瘤免疫、传染病治疗和基因治疗等项目上也在迅速推进。3.3 北京圆因生物（THERORNA）圆因生物于2021年4月由北京大学生命科学学院魏文胜教授创立，魏文胜教授也是基因编辑公司博雅辑因的科学创始人。圆因生物在2022年6月完成近3亿元的A轮融资，专注于利用其专有的环状RNA技术平台来开发下一代疫苗和创新疗法，特别是针对SARS-CoV-2的疫苗。他们在2022年5月发表的Cell文章中报道了编码SARS-CoV-2 spike三聚体RBD抗原的环状RNA疫苗能够在小鼠和猕猴体内引起有效的中和抗体和T细胞反应，且针对SARS-CoV-2野生型及突变株设计的不同环状RNA疫苗均能给提供有力的免疫保护（图14）。他们已于2021年8月提交了相关专利。从专利和文献中可以看出，圆因生物公司主要采用的是与ORNA公司类似的Anabaena I型内含子自剪接系统进行环状RNA的体外合成（图14）。图14：基于I型内含子自剪接的CircRNARBD环化示意图3.4 苏州科锐迈德（Curemed）苏州科锐迈德于2021年8月成立，尽管这是一个相当年轻的公司，但他们已发表了至少四篇基于环状RNA制备、肿瘤治疗和递送的论文，展示出其在环状RNA领域的巨大潜能。科锐迈德目前主要的研究成果包括：1）研发了一种针对新冠病毒的环状mRNA疫苗-cmRNA-1130，该环状mRNA疫苗可在小鼠体内诱导强大的免疫激活以及CD4+ T和CD8+ T细胞；2）在小鼠模型上首次证实了直接肿瘤内注射环状 mRNA 编码的细胞因子混合物，能够调节瘤内系统性抗肿瘤免疫反应，并增强抗 PD-1 单抗的肿瘤抑制效果；3）开发了基于环状mRNA的新型靶蛋白降解平台，利用环状mRNA编码bioPROTAC分子来降解靶蛋白，并将其命名为RiboPROTAC。在环化技术上，科锐迈德还建立了一套基于T4 td基因I型内含子自剪接的剪接位点自动化筛选优化系统，该系统可以找到最优成环位点，然后通过蛋白编码区或IRES连接成环实现无外源序列引入的环状RNA，且成环效率超过90%，该新型环状RNA体外合成技术被命名为“Clean-PIE”（图15）。据悉该成环系统已申请专利，在核酸疫苗、蛋白替代、基因治疗等领域具有良好的应用前景。图15：基于I型内含子自剪接系统开发的Clean-PIE系统3.5 环码生物（Circode Bio）环码生物成立于2018年，由在RNA领域深耕多年的中科院上海营养与健康研究所的王泽峰研究员和杨赟副研究员联合创立。王泽峰团队在2014年发现环状RNA可在人细胞内翻译生成不同功能的蛋白，颠覆了环状RNA是非编码RNA的认知，并开创了环状RNA作为一种新型mRNA疗法的应用。该公司已于2021年完成天使轮和Pre-A轮融资。环码生物拥有自主研发的体外环化专利，该环化技术利用了II型内含子自剪接核酶的活性可在体外环化任意长度的RNA（2~10 kb），该技术具有无外源序列残留、环化产物均一、环化效率高（60%~90%）、反应条件温和等特点，适合于工业化放大（图8）。此外，环码生物也非常注重对序列元件的系统性优化，他们建立了一套基于环状RNA的高通量筛选系统，用于高效筛选翻译起始元件，目前已完成数百万条序列的筛选并获得了大量翻译起始元件。在此基础上，还利用计算生物学的方法建立了针对环状RNA的序列设计优化平台，该平台可以设计优化翻译起始元件及编码区序列从而实现环状RNA的高效翻译。3.6 启环生物苏州启环生物医药成立于2022年3月，其首席科学家是在circRNA领域有着十余年研究积累的中国科学技术大学生命科学与医学部单革教授。启环生物专注环状RNA在生物预防和治疗方向的研发与应用，成立之初就不断探寻新的体外剪接成环方式，结合经典I型和II型内含子结构研究，进而建立了独创的结构组件和环化系统。目前已在IRES、体外环化和circRNA纯化技术方面突破国际专利壁垒，实现体外合成circRNA在生物治疗产业的技术革新，并提交多项国内外专利。启环公司利用自主研发的成环系统结合高效IRES翻译起始元件，已与国内外相关企业合作，在多条基于circRNA表达和调控的生物疗法管线进行布局。3.7 吉赛生物吉赛生物成立于2010年6月，是国内最早（2014年）布局环状RNA领域的公司，拥有深厚的原创技术积淀，已获得环状RNA领域国家发明专利12项。目前拥有全球独有的环化核心专利技术，已完成环状RNA制备整套生产工艺体系开发，建立了四大技术平台：环状RNA序列设计优化平台、环状RNA生产制备平台、环状RNA纯化平台、核心原料酶生产平台，可为全球环状RNA药物研发企业提供CRO服务和原料酶产品。从已申请的专利来看，吉赛生物主要采用T4 Rnl2连接进行环状RNA的体外合成。此外吉赛生物生信部还联合多伦多大学创建了专门的circBank数据库（网址：http://www.circbank.cn/），为环状RNA研究者提供最全面的人类环状RNA注释、circRNA-miRNA调控、翻译潜能预测、疾病突变位点、m6A修饰和环状RNA结构可视化等信息。总结与展望环状RNA因其卓越的稳定性有可能成为一个有效和安全的新一代疫苗接种平台。此前人工合成环状RNA大多是依靠以生物化学为基础的体外策略，但近年来出现了一些基于分子生物学的新方法，使得环状RNA可以直接在活细胞中产生。可以想象在未来将会诞生更多优良和标准化的人工环状RNA制备方法，而这些先进的环状RNA制备方法也必将大幅推进环状RNA生物学功能和分子机制的研究进程。参考资料[1] Chen R, Wang S K, Belk J A, et al. 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