摘要：本章介绍了历史上和当代双特异性抗体的发展历程，以及当前蛋白工程界和制药行业推动此类分子应用于医学治疗的巨大热情。你将详细了解它们独特作用方式及其背后的原理。对各种双特异性抗体构型的详细介绍将帮助你判断它们在特定生物学场景下的适用性。双特异性抗体在生产和质控方面的挑战将激发你的兴趣，以运用所学知识设计新的解决方案，让这一前景广阔的疗法在生产和质控技术上得到改良。
1.前言
本质上来说，双特异性抗体（bsAbs）是一类具有针对两个不同表位或抗原的特异性的分子。即使仅从这个角度来看，在应用上，它也比必须生产和鉴定两个单特异性分子更有优势。在临床上有时面对配体冗余所驱动的疾病时，能够同时靶向两个不同表位或抗原的bsAbs就能体现其不可估量的价值。而且，在过去的三十年中，我们积累了丰富而扎实的知识贮备，意识到某些生物学效应只能通过具有双特异性的单个分子的物理连接来实现，而不是单特异性的双分子混合物。这使得这样的专性bsAbs非常受到重视，以致于在2019年有87个bsAbs正在进行临床研究，其中包括2个已经获批上市的bsAbs。这些独特的生物学作用可以是空间性的，bsAb的双臂分别结合在哪对于抗体的功能至关重要：典型的例子包括连接两种不同细胞类型或将酶与其底物连接的bsAbs。另外一类专性bsAbs是时间性的，双臂的结合依次进行，并且由于动力学或空间原因，一只臂与抗原的结合依赖于另一只臂与其抗原的结合。
如本章所述，bsAb通常是在一个分子中整合了完整的天然样IgG和/或其中的片段，以及通过linker连接排列，保留了抗原结合能力的抗体片段。尽管bsAb使用了与被整合抗体片段相同的氨基酸序列，理论上这些氨基酸链能够构建出与被整合片段相同的结构域，但是所有氨基酸被重新整合成一个全长IgG抗体时，它们的抗原结合和功能特性可能就会发生改变。不过，通过从抗体文库中筛选的方法，可以定向筛选出特性符合要求的抗体，例如高抗原亲和力, 高产量，以及良好的生理性质和特定的结合方式。正是由于这些优势，研究人员正在积极开发在抗体早期发现阶段对全长抗体进行筛选的策略。
2.双特异性抗体的历史
大约50年前，Linus Pauling领导的小组中的科学家Alfred Nisonoff得出了一个关于抗体分子结构的重要结论：每个抗体分子都由两个对靶抗原具有相同特异性的结合位点组成。诺贝尔奖获得者Rodney Porter使用木瓜蛋白酶将抗体切割成了两个Fab片段和一个Fc片段,Nisonoff继续了这项工作并使用了另一种蛋白酶，胃蛋白酶来进行抗体的蛋白水解切割，结果得到了一个二价F(ab)2片段和许多来源于Fc片段的多肽。他认为产生这种现象的原因是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的切割位点分别位于重链二硫桥的两侧。之前人们认为两个Fab分别位于Fc片段的一端，而Nisonoff的发现改变了这个观点，他认为两个Fab片段都处于Fc片段的同一侧。随着对抗体结构认识的改变，很快便有人提出了人造bsAbs的想法：使用胃蛋白酶裂解，温和的还原和氧化两个具有不同特异性的F(ab)片段，于是Nisonoff和Rivers合成了一种双特异性的二价F(ab)2。他们运用同样的方法制备了针对小鼠免疫球蛋白（Ig）和铁蛋白的双特异性试剂，该试剂被用于通过电子显微镜观察小鼠淋巴细胞表面的Ig。
在接下来的20年中，Köhler和Milstein发明的杂交瘤技术被广泛使用并能高效的生产单克隆抗体。双特异性F(ab)2的产率也可以通过使用化学偶联剂（二巯基化物和硫醇激活剂）或硫醚键连接来提升。实际上，Milstein本人已经从杂交瘤的概念衍生出了“杂交-杂交瘤（hybrid hybridoma）”，设想了一种“四源杂交瘤（quadroma）”细胞，其中包含两种不同抗体的重链和轻链的编码基因能够组装并分泌一种bsAb（尽管它只是由两种重链和轻链混杂配对形成的产物之一）（图1）。
图1. 链错配问题 在一个细胞中表达4条不同的抗体链（图中分别用蓝色和绿色表示了分别对应不同抗体的链）时，通过排列组合可以预计产物是一种混有10种不同的潜在产物的混合物。多种抗体工程技术旨在让抗体链配对时倾向于形成所需的双特异性产物（图中心）
大约也是在那个时候，首次报道了bsAb可以通过重定向T细胞攻击肿瘤细胞来诱导有效的细胞毒性：一方面结合T细胞受体（TCR）以激活T细胞，另一方面结合淋巴瘤细胞系中表达的肿瘤相关抗原（TAA）Thy-1。在随后的几年中，有证据表明仅由化学偶联的F(ab)2片段组成的bsAb也能够介导T细胞活性重定向至肿瘤细胞。一方面，其功能不依赖于MHC；另一方面，诱导细胞裂解的极强效力这两个优势使得这种作用方式的bsAb至今都是临床发展的重点。
重组DNA技术的发展极大地影响了下一个十年bsAb的开发。1988年，单链可变片段（scFv）首次出现。它由抗体重链和轻链的可变区被一个柔性接头连接而成, 由此为多特异性抗体的设计开创了一个新时代。为了解决抗体各链随机结合的问题，现在可以将组成多个抗原结合位点/分子的序列放入一条多肽链中在大肠杆菌中表达，而且由于不存在糖基化的Fc片段，产率大幅提升。此外，有了重组DNA技术，我们还可以根据需求随意设计这些多特异性制品的效价，从而让它们能够满足更多的应用场景。但是，缺少Fc片段会导致抗体在体内半衰期短得多，必须通过在抗体上引入人血清白蛋白（HSA）或Fc融合的其它生物制品来弥补，来更好的发挥其生物学活性。因此，第一个公开发表的对称形式具有四价的双特异性分子，是一种将scFv与每个重链的C末端融合的单克隆抗体。此外值得注意的是，基于scFv的抗体容易聚集和稳定性较低的问题通常需要对最终产品进行重新优化。
1996年，Carter和同事们开创了另一种方法用于解决链错配问题（同时表达的重链和轻链随机配对，从而产生十种不同分子种类的混合物，图1)。Carter和同事们在观察到抗体重链二聚化是通过CH3结构域的二聚化（亲和力大约为10-15 nM）导致的之后，提出了“Knobs-into-Holes”工程设计的策略。该策略通过将抗体一条重链上一个侧链较小的氨基酸替换为一个侧链较大的氨基酸（“knob”），将另一条重链上一个侧链较大的氨基酸替换为一个侧链较小的氨基酸（“hole”），来诱导抗体的异二聚化，结果产生了超过95％的异二聚抗体产物(Fig. 7.2a)。之后，这种通过位阻效应制备不对称抗体的方法被不断优化，以进一步增加异二聚抗体的产率。此外，后续通过其他工程改造步骤，例如引入链间二硫键以及点突变，成功地改善了所得分子的热稳定性(Fig2b)。除了通过空间位阻的方法，抗体异二聚化还可以通过在异源重链的CH3结构域上引入带相反电荷的氨基酸(Fig2c)，或者同时运用空间位阻和静电排斥来实现(Fig2d)。为了实现更高的异二聚化效率，最近的方法引入了更广泛的突变，甚至通过使用天然存在于异二聚体分子中的异二聚化基序（motif），如BEAT body平台中使用的(Fig2e)。在21世纪的第一个十年中，科学家们提出了许多解决轻链错配的方法，例如使用共用轻链（common light chain）或具有物种特异性匹配性质的轻链；然而，直到2014年才出现了第一个可以促进同源的重-轻链选择性配对的正交互补平台。另一个有效的解决方案是使用CrossMab，这种异二聚体的每个臂上CH1和CL结构域的位置进行了互换。还有一种解决方案是用一对CH3结构域与两个Fab之一的CH1/CL的恒定区互换位置。
图2 使两个异源重链优先配对的工程方法 图中以卡通的形式显示了异源CH3结构域骨架，并在CH3结构域之间绘出了突变的氨基酸残基。(a),“Knobs-into-Holes”异二聚体 T366W + T366S/L368A/Y407V (PDB: 5DI8);(b),二硫键连接的“Knobs-into-Holes”异二聚体(PDB:5HY9);(c),通过引入带相反电荷的氨基酸形成的异二聚体 E356K/D399K + K392D/K409D(PDB: 5DK2);(d),位阻效应和电荷效应相结合的方法“EW-RVT,”包括 K360E/K409W + Q347R/D399V/F405T(PDB: 4X98);(e),基于BEAT body 异二聚体，基于TCR基序进行异二聚化(PDB: 6G1E)
在努力开发人工bsAbs的同时，还有一种古老得多的天然形成的一类双特异性抗体，具有开发成为治疗双特异性试剂的巨大潜力，其特殊的生物学性质引起了人们的关注。然而，在很长一段时间当中，人们并不清楚是什么样的结构生物学机制促使了它的产生。人们发现血清来源的IgG4抗体无法交联抗原并产生大型免疫复合物，而重组IgG4抗体能够很好地交联相同的抗原。此外，长期接触蜂毒素磷脂酶-A2（PLA2）的养蜂人血清中发现IgG4抗体水平升高，引起了人们对这些全长“单价”抗体的研究的兴趣。这些抗体可以阻断其他PLA2特异性抗体与PLA2结合：它们由两对重链-轻链组成，而其Fab臂发生了交换，导致每对重-轻链来自不同的抗体。在后来的研究中发现，Fab臂的交换是偶然地在翻译后发生的：首先大量互不相干的IgG4抗体阻碍了体内杂合抗体的形成。之后通过使用灵敏的实时FRET技术，科学家们发现Fab臂的交换可以在特定的氧化还原条件下在体内发生。通过总结这些现象，科学家们发明了当今构建bsAb最成功的技术之一，即“ DuoBody”技术平台。该技术平台在不同来源的IgG1半抗体的CH3结构域中引入突变，通过温和的还原和氧化反应进行受控的Fab臂交换（controlled Fab-arms exchange）。不同于在一个细胞中表达不同抗体链，利用duobody技术，我们甚至可以在细菌中共培养表达两种截然不同的半抗体并得到IgG4型的bsAbs。
综上所述，双特异性抗体的工程化，生产以及下游加工和质量控制方面的技术创新不仅导致如今出现了超过100种bsAb构型，而且还成功地将bsAb推动为当下基于抗体的疗法中，研究最火热、最具前景的化合物。在本章后面的小节中，我们将进一步介绍bsAb不同的生物学作用方式，不同的构型，并探讨其应用前景和局限性。
3.当今双特异性抗体的作用方式（mode of action，MOA）
从历史上看，某些只能通过用一个分子特异性结合两个靶点的抗体才能实现的生物学功能引起了科学界的广泛关注(图3)。表1列出了已经获批用于临床的治疗性抗体。除了3.1小节中图3a这种桥接不同细胞类型（例如T细胞重定向策略）的“反式”相互作用之外，bsAbs还能够桥接同一细胞上的两个受体（“顺式”相互作用）（3.2小节中图3b），以及靶向同一信号通路中的多个配体以克服它们在体内的冗余（3.3小节），或同时结合同一抗原的两个不同表位（3.4小节）。
图3.专性双特异性抗体的作用机制(a), bsAb 通过桥接效应细胞和靶细胞诱导细胞杀伤; (b) bsAb 结合同一细胞上的两个不同抗原诱导增殖、代谢激活或者凋亡; (c) bsAb 充当酶级联反应中的链接，使酶活化; (d) bsAb 作为载体介导载荷的运输
表1 获批用于临床的双特异性抗体
在某些情况下，激动性bsAbs可以增强细胞代谢和再生过程（图3b），或者可以串联某些酶级联反应（图3c和第3.5小节）。在某些特定的生物学场景中，我们还可以利用bsAb作为分子运输的载体。以此将载荷或者bsAb中的功能臂富集或逃离特定器官、组织或细胞区室，从而使载荷或者功能臂在这些区域发挥作用（图3d和3.6小节）。
3.1.桥接不同类型细胞的BsAb
这种方法主要是通过运用bsAb重定向T细胞，利用T细胞的细胞毒性以消除肿瘤细胞。bsAb充当T细胞与肿瘤细胞之间的物理连接，一条臂与T细胞结合，另一臂与肿瘤细胞结合。绝大多数以这种方式起作用的bsAb都选择与TCR复合物中的CD3ε结合，同时可以诱导T细胞活化而不依赖于TCR的抗原特异性以及MHC的限制，而且不需要辅助因子参与（例如CD4或CD8）。尽管此类药物在体外试验中展现出了令人鼓舞的疗效，但由于这些分子在体内诱导不受控制的细胞因子释放，以及难以生产等问题，限制了其在临床上的应用。直到blinatumomab（Blincyto®）惊人的临床效果披露后，人们才对T细胞重定向bsAb产生了浓厚兴趣，而因此，目前进行临床研究超过50％的bsAb都以T细胞重定向作为主要的作用方式。
Blinatumomab是一种由两个scFv组成，靶向CD19和CD3ε的bsAb。由于不包含Fc片段，因此它的分子量大小仅为55 kDa。其在体内的血清半衰期约为1小时，因此它的给药方式通常是使用便携式泵进行连续静脉输注。该药在非霍奇金淋巴瘤患者的治疗中已经展现出了疗效：它在复发/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中的完全缓解率达到惊人的的43％，这使其在2014年获得美国监管部门的上市批准。
T细胞桥接抗体如何发挥作用？此类bsAb通过桥接T细胞和肿瘤细胞以形成免疫突触，从而使TCR活化并让T细胞释放颗粒酶和穿孔素，最终诱导靶细胞凋亡。由于blinatumomab的临床结果令人印象深刻，以至于好几种双特异性T细胞桥接抗体（BiTE）均使用了它的构型且都具有CD3结合片段，不同点是靶向的肿瘤相关抗原（TAA）不同。影响T细胞重定向bsAb效果的关键因素包括：肿瘤细胞表面靶抗原的表达水平，其在细胞膜上的流动性以及与抗原表位与靶细胞膜之间的距离。还有证据表明，与TAA的多价结合可以让T细胞更紧密的与靶细胞连接，从而提高杀伤效果（例如多价TandAb具有两个CD3结合位点和两个TAA结合位点，以此来提高T细胞桥接的效率）。另一方面，CD3特异性结合臂通常具有相对较低的亲和力（约200 nM），使得bsAb能够与CD3复合物发生多次连续接触，并引发一种称为“连续杀伤（serial killing）”的现象，从而使单个bsAb分子连接的T细胞可杀伤多个靶细胞。
此外，不含Fc片段的或含有不能结合效应细胞的Fc片段的T细胞桥接抗体，与具有功能性Fc片段的T细胞桥接抗体相比似乎更有优势。甚至在靶向CD3的双特异性抗体出现之前，科学家们就通过沉默OKT3（Muromonab，一种单特异性抗CD3抗体，在移植医学中用作为免疫抑制剂）Fc片段的效应功能提高了其安全性。通过阻止Fc片段与Fcγ受体结合，可以避免免疫细胞表面CD3不受控制地聚集。以这种方式修饰的抗体可显著降低细胞因子的释放。与blinatumomab相比，第一个获批的bsAb catumaxomab由小鼠和大鼠的重-轻链组成的异二聚体，并且靶向CD3和Ep-CAM，含有功能性Fc片段。由于catumaxomab的Fc片段能够结合除了肿瘤以外表达在肝脏中Kupffer细胞上的Fcγ受体导致的的靶点毒性（on-target/off-tumor toxicity），静脉注射后会引起患者出现严重不良事件，如强烈的局部细胞因子释放和T细胞介导的肝毒性。大多数（67％）靶向CD3的T细胞桥接bsAb被用于治疗血液系统恶性肿瘤，其靶标包括CD19、CD20、CD33、CD38和CD123（B细胞成熟抗原，BCMA）。T细胞桥接bsAbs在实体瘤中的应用进展相对缓慢，这是因为许多实体瘤抗原在健康组织中也以低水平表达，这可能导致毒副作用。其他影响该类bsAb在实体瘤中应用的因素还包括抗体和效应细胞难以渗透进入实体瘤组织，以及肿瘤的免疫抑制性微环境。目前约有14种T细胞桥接bsAb正在进行治疗实体瘤的临床试验，靶点包括Her2、EGFR、PSMA和Ep-CAM。
长期使用T细胞桥接抗体治疗可能会由于肿瘤抗原的丢失而出现耐药。一个典型的例子是ALL患者中CD19阴性白血病细胞的增殖。其它抑制T细胞活性的机制还包括调节性T细胞的抑制功能或免疫检查点分子（例如PD-1和PD-L1）的表达。不意外的是，对PD-1/PD-L1抑制可以增强T细胞桥接bsAb的治疗效果。因此，目前基于bsAb的疗法通过同时阻断PD-1/PD-L1轴以及其它免疫检查点CTLA-4、LAG-3或TIM-3来增强T细胞活性已经在进行早期临床研究。一些联合疗法令人鼓舞的早期数据更加支撑了这种观点：与ipilimumab单药治疗相比，联用ipilimumab（Yervoy®）（抗CTLA4）和nivolumab（Keytruda®）（抗PD-1）治疗可显著延长黑色素瘤患者的无进展生存期（PFS）。在双特异性药物的设计中，科学家们已经设想了用Fc沉默的bsAb分别以高亲和力PD-1结合臂和低亲和力CTLA-4结合臂来阻断肿瘤浸润淋巴细胞上的PD-1和CTLA-4，与此同时还能减少bsAb与CTLA-4阳性的外周血T细胞的结合。该设计旨在提高bsAb的安全性和耐受性。
在临床上，使用T细胞桥接bsAbs对抗癌症已经逐渐从激活的效应细胞扩展为使用其它合适的效应细胞类型。Vγ9Vδ2 T细胞是一类涉及免疫监视并且能与肿瘤产生的磷酸化抗原反应导致代谢失调的细胞。该细胞通过bsAb重定向到EGFR阳性肿瘤，并能够诱导结肠癌细胞死亡。另一类适合被桥接的是自然杀伤（NK）细胞。研究人员通过基于scFv构型的三特异性抗体靶向CD16a受体，并融合了IL-15和Her2特异性结合片段实现了NK细胞的桥接。TandAb AFM 13，一种通过接头连接四个抗体可变区片段的抗体，分别拥有两个CD30和CD16a结合位点，能够诱导NK细胞介导的CD30阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤。
除肿瘤领域外，T细胞重定向策略也可能被应用于传染病的治疗。靶向病毒的bsAbs已被证明可将细胞毒性T细胞重定向至已经被乙型肝炎病毒，巨细胞病毒和HIV-1感染的细胞。此类bsAb能够诱导杀伤被HIV感染的细胞并抑制HIV的离体复制。最近的研究有望成功地将bsAb用于再生医学：通过靶向递送CD34阳性的内皮祖细胞至CD41阳性的血小板，可在急性心肌梗死的小鼠模型中有效地修复心脏。通过靶向干细胞抗原1，bsAb可以将PBMC的一个亚群递送至损伤部位，再加上血小板上GPIIb/IIIa的活化，导致损伤部位的炎症细胞和纤维化明显减少，而毛细血管密度增加，心脏功能恢复。
3.2.桥接受体阻断信号通路
桥接受体的bsAb中最成功的例子当属靶向酪氨酸激酶受体家族的抗体。这可能是因为它们靶点组合的协同特性，但是在某些例子中也由于其专性的双特异性。令人惊讶的是，迄今为止，所有受体桥接bsAb在体外和体内试验中表现出的功能，都不能通过参考其亲本抗体的特性来预测。例如，有一个很好的靶向EGFR和Met的bsAb是通过在含有大量bsAb的文库中广泛筛选而来，并且是唯一一个不会在Met/EGFR阳性细胞诱导该通路激活的候选物。要知道，通常二价抗met抗体会引起met分子发生交联并诱导肿瘤发生。因此，这种靶向Met和抗EGFR结的不对称的双特异性抗体被用来阻断Met和EGFR诱导的信号传导。另一个例子是靶向Her2和Her3的单价双特异性抗体。通过与Her2高亲和力结合，可以使抗Her3 Fab在局部富集，从而可以阻止Her3与其配体HRG的结合并抑制两个受体的信号传导。
靶向受体的bsAb也可以表现出激动活性。有研究表明，成纤维细胞生长因子21（FGF21）代谢途径的激活可以有效缓解肥胖和糖尿病，但由于其毒副作用，无法直接靶向该分子。因此，bsAb BFKB8488A（Roche）通过靶向广泛表达的成纤维细胞生长因子受体1C和仅在肝脏、脂肪组织和胰腺中表达的β-klotho受体激活了该代谢途径。并且，毒副作用被有效地限制在同时表达两种靶点的组织中。
3.3.克服配体冗余
仅仅通过抑制支持癌细胞生长的细胞因子通常不足以阻止癌细胞的增殖，因为癌细胞增殖所涉及的信号传导途径依赖于激活这些通路冗余的配体。在抗血管新生方面，克服配体冗余作用方式的bsAb与单特异性药物相比具有一定优势。例如，一款靶向并抑制VEGF和δ样配体4（DLL-4）的DVD-Ig构型的bsAb目前正在进行治疗结肠癌患者的临床研究。研究人员开发了一款人源化IgG1
靶向VEGF和Ang2的CrossMab来治疗眼科疾病。在该药用于糖尿病相关性黄斑水肿患者之前，应该对其Fc区进行的额外工程改造，一方面避免与Fc受体的结合以减少二级免疫反应，另一方面提高药物的全身清除效率。
3.4.靶向同一抗原的两个不同表位: Biparatopic 双特异性抗体
Biparatopic bsAb靶向同一抗原的两个不同表位并可以充当交联剂，通常会导致抗原聚集。在这方面，它的活性可以与抗体的混合物相比。此类抗体的一个例子是抗Her2的bsAb ZW25。它极强的结合作用体现为更高的亲和力，能够更好地在细胞表面阻断Her2以抑制Her2介导的信号传导。它Fc区经过工程化改造后，能够更有效地发挥效应功能。在治疗晚期胃食管癌和乳腺癌患者的临床试验数据显示，该抗体比赫赛汀疗效更好。此外，以该抗体为基础，研究人员开发了一款抗体药物偶联物（ADC）ZW49。研究人员预计该药物能够介导更强烈的细胞内化，所以应该能够更有效的在胞内裂解毒素，从而获得更好的临床结果，目前，该药物正在开展临床试验。
3.5.酶模拟
典型的充当酶复合物共作用因子的bsAb的例子是emicizumab（Hemlibra®），它是目前获批上市的第二款bsAb。这种抗体通过以微摩尔级别的亲和力同时结合IXa和X因子，在A型血友病患者中模拟VIIIa因子（FVIII的活化形式，在A型血友病患者中缺失）。作为一种预防性治疗，这种bsAb可以有效地缓解A型血友病患者的出血，无论患者体内是否存在VIIIa因子抑制物。该bsAb是通过对40,000个bsAb（由200种靶向IXa因子的抗体和200种靶向X因子的抗体排列组合）的活性筛选而来。为了解决链错配问题，该bsAb由两条异源IgG4重链二聚体和一条共用轻链（common light chain）组成。在40,000个bsAb中大约有0.3%在筛选中表现出酶模拟活性。研究人员对最佳候选药物的轻链通过构架和CDR重组进行了优化。后续进一步的优化包括人源化以降低免疫原性，电荷优化以减少聚集问题，以及等电点优化以实现基于离子交换色谱的双特异性产物与副产物的分离。最终，该药物于2018年在美国和欧洲获批。
3.6.双特异性抗体介导的转运:背负式劫持
该概念涉及专性BsAb，其能够将分子转运进/出某些组织或细胞区室。其中一个开拓性的例子是，由抗体作为靶向部分和蓖麻毒素A组成的分子，毒素在该分子被细胞内化后会释放毒性。另一个由抗体和突变型假单胞菌毒素组成的药物正在临床开发中。
目前，科学家正在对利用bsAb作为“特洛伊木马”进行深入研究。因为它们可以穿过脑血屏障并将活性化合物递送到该区域。最常见的方式是，它们通过一个抗原结合臂与铁转运蛋白受体结合，从而让整个分子通过胞吞途径进入。有一个此类bsAb另一结合臂与ß-分泌酶1（BACE1）结合，能够在小鼠和猴子模型中显著抑制该酶的活性，从而减少脑和脑脊液中β-淀粉样蛋白斑块的数量。
核内体似乎也是一个可以作为bsAb转运功能的靶标。例如，bsAb一方面可以靶向埃博拉病毒糖蛋白胞外暴露的保守的抗原表位并以病毒作为载体，随之一起被内吞进核内体。病毒的糖蛋白被蛋白水解切割后，病毒与内体受体的结合位点暴露出来，该位点的结合是病毒从核内体进入细胞质所必需的。另一方面，bsAb通过靶向内体受体，阻断病毒与其结合，从而阻止病毒进入细胞质。通过这种机制，bsAb能够在体外中和几种已知的埃博拉病毒株并为小鼠提供抗病毒保护。另一款靶向次级内体蛋白（late-endosomal protein）CD63的bsAb能够提高靶向Her2的抗体-药物偶联物的递送效率并降低其的外周毒性。双特异性结合还可以通过介导与Fc或HSA的非共价融合，让不含Fc的抗原结合片段进入新生儿Fc受体（FcRn）循环途径，从而避免被溶酶体降解，在体内具有更长的血清半衰期。多种抗体运用这种设计并证实了其可行性：基于VHH的bsAbs vobarilizumab和ozoralizumab，它们分别靶向IL-6受体和肿瘤坏死因子并融合了能够结合HAS的片段，目前处于临床II期研究中。另一款基于VHH的，利用HAS延长半衰期的药物是靶向VWF蛋白（von Willebrand factor）的caplicizumab（Cablivi®）。FDA已经批准该药的用于治疗血栓性血小板减少性紫癜的患者。
4.双特异性抗体的构型
bsAb在完成单特异性抗体无法处理的任务中的成功引起了人们的兴趣。科学家希望推动bsAb用于更复杂的生物学场景。为了实现它们多样化的功能，有时需要不同的结合价位，有时甚至需要控制两个结合位点的空间位置。这促使蛋白质工程界设计出许多巧妙的解决方案来满足其多样化结构的需求。因此，目前已经有超过100种可用的，不同的bsAb构型 (图4)。
在IgG类的天然二价抗体中，两个抗原结合位点是相同的，并且重链和轻链的可变区都参与抗原结合。化学偶联以及共表达两对不同的重-轻链会导致混合产物的产生，从而造成链错配问题： 这会降低目标产物的产量，需要对各链做标签化标记以进行额外的纯化步骤，并需要对最终产物重新分析和质控。目前研究人员已经开发了多种技术来增加所需双特异性分子的产率。除了可以根据bsAb的基本结构将它们分类之外，还可以通过bsAb所应用的工程化方法对它们进行区分。
4.1.基于片段结构的双特异性抗体
单链可变片段（scFv），一种由连接子（linker）将重链和轻链的可变区连接在一起组成的多肽链。作为最小的抗体衍生结构，它保留了完整IgG抗体的抗原特异性，并且成为了如今构建多特异性抗体最常用的构型(图4A2)。我们可以在这种构型中通过选择合适长度的连接子来调整重链和轻链的空间排列，而缺少Fc片段则可以规避抗体的同二聚化(图4A)。特别是后一特性还让其适合在原核微生物或低等真核生物中表达，从而使它的生产变得廉价和简单。它们的模块化性质让我们可以按照意愿选择特异性结合的效价：目前，多效价靶向每个靶点的构型正在进行临床评估。与此同时，其模块化特性让我们能够调整结构域的排列，以找到最佳的组合形式，以此解决基于片段的bsAbs在溶解性和稳定性方面的潜在问题。
图4 bsAb构型的选择抗体各链标示: 红色, VL1; 蓝色, VH1; 黄色, VL2; 绿色, VH2; 黑色, CL; 白色, CH1; 灰色, CH2; 浅蓝, CH3. (A) 基于片段结构的构型: A1 F(ab)2, A2 T细胞桥接双特异性抗体(BiTE), A3 diabody, A4 dual affinity retargeting (DART),A5tandemdiabody(TandAb);(B)对称融合构型,B1dual-variabledomain-Ig (DVD-Ig),B2IgG-(scFv)2,B3(scFv)4-Fc,B4cross-overdualvariableIg(CODV-Ig);(C)对称构型, C1 Two-in-One Ab, C2 DutaMab, C3 mAb(粉色表示做了突变处理的CH3结构域); (D)不对称构型, D1 “Knobs-into-Holes”异二聚化的IgG, D2 通过电荷作用异二聚化的IgG, D3 通过位阻效应诱导、二硫键稳定异二聚化的IgG, D4 通过位阻效应诱导、点突变稳定异二聚化的IgG,D5SEED-body(条纹表示异二聚化的CH3); (E) 解决了轻链错配的不对称构型, E1 大鼠-小鼠 杂合IgG (带边框的洋红色,小鼠CL;带边框的粉色,小鼠CH1;洋红色,小鼠CH3;带边框的深灰色,大鼠CL;带边框的灰色,大鼠CH1;深灰色,大鼠CH3), E2 共用轻链异二聚化IgG, E3通过突变CH1/CL和VH1/VL结合界面异二聚化的IgG, E4 DuetMab, E5 CrossMab
相比之下，diabodies（图4 A3）包含两条链，每条链具有一个VH和VL结构域，并通过很短的（通常为5个氨基酸长度）linker连接。因为linker的长度比scFv中装配抗原结合位点所需的长度短得多，所以两条链在相反的方向上形成二聚体，当其在同一细胞中共表达时形成双特异性异二聚体分子。而有证据表明，两个结合位点位置的变化会影响抗体的有效应。例如DART构型的抗体（图4A4），由两个diabody组成。其中，两个diabody被一个额外的半胱氨酸键将抗体中靶细胞和效应细胞的结合位点限制在比其他基于linker设计的构型更近的距离，因而可以诱导更有效的靶细胞杀伤。但是，不含有Fc区会使此类分子无法进入FcRn循环途径，从而导致较短的血清半衰期。然而，我们可以通过在抗体中融合Fc片段或HSA结合片段来改善它们的药代动力学性质。
4.2.对称的双特异性抗体构型
既要保留Fc片段又要克服链错配问题的另一种方法是选择未修饰的IgG构型作为基本骨架，并为其加上第二种特异性。因此，这种构型通常都是以二价的形式靶向每种抗原（图4B, C）。通过融合组成的构型通常包括附加在重链C末端的scFv以及Fab片段，例如(scFv)2-Ig（图4B2）；这里Fab片段的可变区和恒定区可以用scFv取代，(scFv)4-Fc（图4B3）。但是，在DVD-Ig（dual-variable domain-Ig）的构型中（图4B1），靶向第二种抗原的特异性是通过在重链N端添加另一对重-轻链可变区实现的。此外，最近报道的CODV-Ig（cross-over dual variable Ig，图4B4）构型通过将两个可变区阵列附加到每个Fab片段的恒定区来给抗体添加第二种特异性，并通过优化了的linker将VH和VL相连，以确保其正确的空间位置。
另一类工程化方法旨在通过引入突变和选择而不是共价连接的方法来生产对称的bsAb，同时保留其分子结构和IgG分子的大小(图4C)。其中包括“Two-in-One antibody”（图4C1），其可变区的CDR被修饰为可以特异性识别两种不同的抗原；DutaMab，其重链和轻链的CDR可以分别结合一种不同的抗原（图4C2）；mAb 具有从文库而来的抗原结合性Fc，通过在CH3结构域突变残基赋予其抗原结合能力（图4C3）。
4.3.不对称的双特异性抗体构型
此类设计的双特异性抗体构型的原理是通过在共表达四个多肽链后，为异二聚体的两个异源抗体链之间创造优先配对的条件(图4D, E)。这种构型的bsAb除了基本保留了抗体的天然构型和大小，此外，它们的巨大优势是最大程度减少了免疫原性非天然抗体序列（例如标签和linker）的使用。为了实现异二聚化，第一种策略是基于点突变的空间位阻效应（图4D1）或电荷效应（图4D2），之后再优化突变了的Fc区以保持分子的稳定性(图4 D3, 4)。最近，旨在实现异源二聚化的方法采用了更广泛的突变，例如运用链交换技术改造结构域的SEEDbody：利用了IgG3和IgA CH3片段易于配对的特性，将其中类似的结构分别引入bsAb的两条重链中（图4D5）；BEAT构型：利用TCR（T-cell receptor）两条链异二聚化的特性，将介导TCR链异二聚化配对的残基引入到Fc区上(图2E) 。最近，出现了一种适用于IgG1骨架CH3结构域的方法是先表达两个半分子抗体，之后组装，也称为受控的Fab臂交换（controlled Fab-arms exchange）。
通过利用一个scFv作为抗原结合位点（图4D5）或使用多个物种的抗体结构域(图4E1)，解决了不对称构型中轻链错配的问题。后来研究人员通过让两个结合位点使用同样的轻链的方法也解决了这个问题(图4E2)。它为两个结合配偶体使用序列相同的轻链（图4E2）。但用这种方法构建的bsAb的局限性在于这种bsAb不能利用已经存在的单特异性抗体，因此需要一系列配套的噬菌体文库和转基因动物平台来支持其抗体发现过程。此外，通过修饰重链和轻链之间的结合界面也可以让某个Fab优先形成，避免轻链错配(图4E3)。还有一种促使轻链正确配对的策略是，通过去掉Fab片段恒定区之间的天然二硫键并人为引入另一条二硫键，称为DuetMab构型(图4E4)。在CrossMab中，轻链和Fd（VH-CH1）片段的位置在两个不对称半抗体中互换了位置（图4E5）。依赖于轻链结合抗原的bsAb的分离纯化步骤如下：在“κλ-body”构型中，采用了两个不同亚家族（κ和λ）的独特轻链。在进行亲和色谱分离时，使用诸如Kappa选择和Lambda Fab选择之类的载板来选择性捕获包含κ和λ两个轻链的不对称bsAb。此外，能够与bsAb两个Fab相结合的抗原蛋白如今也可以被用作色谱载板来特异性捕获bsAb。
实际上，对某些不对称bsAb的设计进行微调，是为了通过下游生产纯化达到所需均质终产物的最佳产量。此类方案根据目标产物与副产物的微小区别，例如基于与重组纯化蛋白A结合能力的差异、所带电荷的差异或分子量差异，可以分别通过离子交换色谱或凝胶过滤柱进行分离纯化。由于bsAb结构的复杂性，导致了其需要灵敏的分析工具监控并分离纯化正确配对的产物。bsAb的分析由一系列互补的方法组成。分析的第一步通常是基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法来测定抗体的分子量，以便快速分析bsAb各链是否正确配对；第二步包括疏水层析（HIC）分析，可基于目标产物和副产物疏水性的不同测定bsAb的纯度。
值得注意的是，目前大多数不对称构型的bsAb对每种抗原都只有一个单价结合位点，想要引入靶向抗原的多个结合点仍然是未来蛋白质工程面临的挑战：多价结合所获得的亲和力效应可能会挖掘出抗体的潜力，通过提高结合位点的数量，从而增强与表达抗原的靶细胞的相互作用强度。
5.展望
在了解了几类双特异性抗体的构型后，我们可以得出结论，未来大多数打算用于治疗的候选分子都倾向于含有Fc片段，主要是因为它带来的较长的体内血清半衰期。此外，之前被证明对单克隆抗体有益的所有基于Fc的修饰也都适用于bsAb：选择合适的Fc类型来延长半衰期；通过点突变或改变糖基化来增强次级免疫反应；或通过减少点突变造成空间位阻或减少糖基化使其难于结合FcγR分子。或者，如果不需要介导次级免疫反应，则可以使用IgG2或IgG4类的Fc片段。IgG4介导天然异源二聚化的特性似乎更适合用作bsAb的骨架。
尽管目前在临床试验中的分子最多具有两个结合位点，但在一些抗体构型中，多价靶向特定抗原似乎会更有利。未来的抗体工程化还可以利用天然的多价抗体分子，例如基于IgA的四价构型或基于IgM的十价构型。
6.总结
在本章中，我们了解了几十年来bsAb的发展历程，并学习了它们的多种构型以及作用方式。每种构型都在调整针对目标抗原的效价、靶向两种抗原时距离和浓度的物理化学参数等方面表现出独特的性质。而它们在理化性质，制造要求，生产后分析和配制以及体内药代动力学性质方面就更加差异化。但是，对bsAb的结构和功能同质性以及生物学效应的要求与经典的单特异性抗体是高度类似的，这对于其在人体和医疗上的应用至关重要。
Take Home Messages
•根据生物学效应，BsAb可以充当两种单特异性抗体组合的混合物来发挥作用；也可以作为专性bsAb，将两种不同的抗原特异性组合在一起产生新的生物学效应。
•bsAb的专性作用要么是空间性的（两个抗原结合臂分别同时结合抗原），要么是时间性的（其中一条抗原结合臂与抗原的结合是实现另一臂结合活性的先决条件）。
•常用的bsAbs作用方式包括桥接不同细胞类型，桥接不同抗原，结合同一抗原的两个不同表位，靶向同一信号途径的两个抗原以及作为载体将携带的生物学功能递送至所需的器官和细胞室。
•bsAb的构型包括不含Fc片段的基于片段结构的构型；通过利用融合或突变方法添加第二种特异性的同源二聚化Fc的对称构型；以及通过空间位阻效应或者静电效应诱导两个异源Fc半分子结合的非对称构型。
•不对称构型通常通过点突变引入链配对基序，以诱导两个异二聚半抗体重链分子的优先配对。轻链错配的问题可以通过让两个不同的抗原结合位点共用序列相同的轻链；或者改造重-轻链结合界面，包括引入改造的二硫键；通过结构域交换或恒定区位置互换来解决。此外，对于具有κ和λ类轻链的抗体可以利用特异性结合κ和λ类轻链来进行分离纯化。
•抗原识别位点的效价在各种构型的抗体中是不同的，可以根据特定的生物学应用进行选择。目前的抗体工程技术甚至可以满足设计多价抗体的需求。
•使用IgG1、IgG2和IgG4不同骨架的bsAb构型可以调节不同的免疫效应功能。
下章预告：抗体偶联药物
往期内容：
第二章：抗体：发现及特性的历史
第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞
第四章：抗体展示系统
第五章：转基因动物用于产生人类抗体
第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用
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