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撰文丨王聪肝脏疾病是一个全球性的健康问题，每年导致200多万人死亡。近几十年来，肝脏疾病的死亡人数增加了50%，预计在未来20年内还将翻倍。虽然肝脏是一个可以自我再生的器官，但这种再生特性也有其局限性。特别是在慢性和急性肝脏疾病或手术切除大部分肝脏后，肝细胞无法再充分再生，从而导致致命的肝功能衰竭。肝移植是终末期肝病患者的唯一选择，然而，由于供体器官稀缺，只有10%的患者能够接受挽救生命的肝移植。早在2013年，Lars Zender 团队在 Cell 期刊发表论文【1】，通过体内RNAi筛选，发现MKK4是肝脏再生的主要调控因子，抑制MKK4能够显著提高肝细胞的再生能力。此外，他们成立了一家名为HepaRegeniX的公司，致力于开发用于肝脏疾病治疗的MKK4抑制剂。2024年3月14日，德国图宾根大学的 Lars Zender 团队联合美国梅奥医学中心及初创公司HepaRegeniX的研究人员合作，在 Cell 期刊发表了题为：First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure 的研究论文【2】。这项临床前和临床1期研究表明，研究团队开发的First-in-class（首创新药）HRX-215（MKK4抑制剂）能够抑制肝细胞中的MKK4蛋白，从而促进肝脏再生，这可能预示着肝癌手术和肝脏移植的新时代，甚至有可能显著改善急性和慢性肝病的治疗。由于之前没有任何药物能够增加受损肝脏的再生能力，因此HRX-215临床数据的发表的是肝脏再生领域的一个里程碑。在之前的研究中，Lars Zender 团队揭示了抑制MKK4能够提高肝脏能力的机制，MKK4是一种MAP2激酶，是应激活化蛋白激酶（SAPK）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号网络的一部分。当细胞暴露于不同的应激刺激时，MKK4可以被激活。MKK4的下游底物JNK1也被MKK7激活，抑制MKK4可以解锁急性或慢性损伤肝脏中肝细胞的内源性再生能力，这主要通过MKK7和JNK1解除SAPK信号通路，转向由转录因子ATF2和ELK1介导的下游促再生转录程序。在这项最新研究中，研究团队首先验证了抑制MKK4的安全性，小鼠研究显示，长期抑制MKK4的表达，对各个器官及体重未产生任何毒性症状，也没有出现任何促进肿瘤的现象。这些数据支持了通过抑制MKK4来促进肝脏再生而不增加肝脏肿瘤风险的思路。研究团队基于MKK4蛋白结构开发了一款小分子抑制剂——HRX-215，在动物模型中进行的临床前研究表明，HRX-215（MKK4抑制剂）促进了小鼠和猪模型的肝脏再生能力，在肝病小鼠模型中显示出抗脂肪变性和抗纤维化作用，而猪在致死性的85%肝脏切除后，未接受治疗的6只猪只有1只存活，切除前使用HRX-215治疗的6只猪存活4只，切除后使用HRX-215治疗的6只猪存活5只。因此，HRX-215能够通过提高肝脏再生能力，从而实现以前不可能的肝脏手术。例如，在晚期肝癌患者中，往往无法切除所有癌变肝组织，因为这样大量切除会导致剩余肝脏衰竭。此外，HRX-215还能够为更多肝衰竭患者提供拯救生命的肝移植，因为在它的帮助下，可能只需要移植更小尺寸的肝脏组织。接下来，为了评估HRX215的安全性、耐受性和药代动力学，研究团队在48名健康志愿者中进行了一项安慰剂对照（治疗组36人，安慰剂组12人）的探索性1期人体临床研究。结果显示，治疗没有报告严重或危重不良事件，治疗组和安慰剂组之间轻度至中度不良反应率相当（治疗组36.1% vs. 安慰剂组41.7%）。全血细胞计数显示HRX215治疗组和安慰剂组之间没有显著差异。研究团队还通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）研究了HRX215的药代动力学，结果显示HRX215被快速吸收，并在达到最大浓度后呈双相消除。随着剂量的增加，药物暴露呈比例增加。当在进餐后给药时，HRX215的吸收延迟，但生物利用度显著提高。总体而言，这项1期临床研究观察到HRX215良好的药代动力学、安全性和耐受性，为未来的2期临床研究奠定了基础。该研究的领导者、Lars Zender 教授表示，HRX-215不仅是肝癌手术切除中急需的治疗选择，而且还能够帮助克服肝移植领域面临的器官短缺这一主要问题，在HRX-215帮助下，对于健康捐赠者而言，将他们的肝脏中较小的左半叶进行活体移植，对健康捐赠者的风险较小，但这部分肝脏太小，难以在移植后接管受体的肝脏功能。而在HRX-215的帮助下增强肝脏再生能力，从而让较小的肝脏左半叶移植成为可能。论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.03.026https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.02.023

导读肝脏具有独特的再生能力，在发生损伤后肝细胞迅速启动增殖程序，进行损伤修复。然而，在急性或慢性肝病中以及肝切除术后，肝细胞再生能力往往受损，无法恢复肝脏质量和功能。疾病相关的微环境通过复杂的细胞间互作降低肝细胞再生能力，但人们对潜在的分子机制知之甚少。德国图宾根大学的 Lars Zender 团队在肝再生领域深耕十余年，2013 年曾在 Cell 报道通过体内 RNAi 筛选鉴定出丝裂原活化蛋白激酶激酶 4（MKK4）是肝细胞再生的关键调控因子。压力信号活化 MKK4，进而活化 JNK1/2/3 和 p38，而 MKK4 的敲低上调 MKK7/JNK1 活化的 ATF2、ELK1 促再生转录程序，从而恢复肝细胞再生能力。尽管许多实验室以及初创公司进行 MKK4 抑制剂的开发，其靶向性、疗效仍不理想。2024 年 3 月 14 日，来自德国图宾根大学的 Lars Zender 和新加坡南洋理工大学等研究团队联合在 Cell  发表了题为 First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure 的文章。在证明系统性 MKK4 的抑制促肝再生的基础上，开发了强效、选择性的 MKK4 抑制剂，在多种动物模型中证明了安全有效性，并进入 Ⅰ 期临床试验。图源：Cell研究思路作者原创创新点1. 基于结构学的开发使抑制剂具有高选择性；2. 通过严谨的临床前实验证明 HRX215 具有良好的耐受性和安全性；3. HRX215 具有强大的促肝再生能力，为更大范围肝肿瘤切除以及肝小叶移植提供基础。主要研究内容1. 敲低 MKK4 促进小鼠肝脏再生，并且长期安全为了模拟 MKK4 抑制剂的系统作用，研究员构建了 dox 诱导的 MKK4 敲低鼠（CAG-rtTA; TRE-shMKK4），dox 诱导后进行部分肝切除（PH），显示 MKK 的敲低使 Ki67 阳性细胞增多，证明 MKK4 的系统性抑制促进肝再生。Dox 处理 12 个月后，shMKK4 鼠的体重以及组织病理学形态正常，表明了 MKK4 抑制剂的安全性。Figure 1. MKK4 的敲低促进小鼠肝脏再生，并且长期安全（图源：Cell ）2.  强效、选择性小分子 MKK4 抑制剂的开发和表征首先，研究员开始进行药物发现。因为受限于尚无足够分辨率的蛋白结构，他们从已报道的蛋白激酶抑制剂的脱靶谱中，选择了对 MKK4 具高脱靶亲和力的 vemurafenib（BRAFV600E 抑制剂）作为原型，经过 C 环置换、烷基磺酰胺修饰后产生二代抑制剂；接着解析了与激酶结构域的 NMR 结构，基于经验对 C 环修饰后，最终将选择性最高的 HRX215 作为临床候选药物。经过细胞和体内实验表明，HRX215 具细胞膜通透性，并且半衰期（3.4-3.9 h）允许进一步的体内药理学分析。Figure 2. 强效、选择性小分子 MKK4 抑制剂的开发和表征（图源：Cell ）3. HRX215 促进肝增殖、稳定肝细胞接着，研究员在体内探究 HRX215 的药效、安全性。与敲低 MKK4 一致，HRX215 以剂量依赖性方式促进 PH 后的肝细胞增殖，并且不诱导未手术肝的增殖；此外，HRX215 处理与 MKK4 敲低的肝的术后表达谱高度相关，表明 HRX215 的选择性。除了促进肝细胞增殖，肝 MKK4 的抑制具有肝保护功能。TUNEL 显示，HRX215 抑制 CCl4 诱导的肝损伤模型中的肝细胞凋亡；凋亡相关磷酸化蛋白阵列显示，HRX215 抑制 PH 后的肝细胞凋亡。最后评估安全性。通过血浆、肝脏代谢组学显示，HRX215 仅引起自身代谢物的变化；GAN-NASH 模型中，12 周的 HRX215 治疗不增加肿瘤数量，甚至降低肿瘤尺寸，但不影响异常增生，表明 HRX215 抑制肿瘤进展。Figure 3. HRX215 促进 PH 后的肝细胞增殖，减轻 CCl4 肝损伤模型中细胞凋亡（图源：Cell ）Figure 4. HRX215 长期治疗的安全性（图源：Cell ）4. HRX215 阻止 PHLF为了更好地验证人肝切除术后的情况，作者使用猪 PH 模型，其中 85% 肝切除会引发肝切除术后肝衰竭（PHLF），是严重的临床问题。与小鼠模型一致，HRX215 增加再生肝的体积，促进肝细胞增殖。在 85% 肝切除模型中，HRX215 有效阻止急性肝衰竭的发生（ICP 增加），维持肝的正常功能（代谢、合成凝血蛋白）。重要的是，HRX215 治疗阻止术后昏迷，以及肝脏变小、灌注不足，表明 HRX215 介导的肝再生有效阻止 85% 肝切除术后的致命 PHLF。Figure 5. HRX215 增加猪 85% 肝切除术后的肝再生（图源：Cell ）Figure 6. HRX215 阻止 85% 肝切除术后的肝衰竭（图源：Cell ）5. HRX215 具有良好的安全性、药代动力学特征最后在 48 名男性志愿者中进行Ⅰ期临床试验，显示 HRX215 不会引发不良反应。使用 LC-MS/MS 研究药代动力学，发现 HRX215 被快速吸收，达到最大浓度后以双相方式被清除；暴露量与剂量正相关；进食后给药延迟吸收但提高生物利用度。Figure 7. HRX215 的首次人体Ⅰ期临床试验（图源：Cell ）文章小结本文在证明系统性 MKK4 抑制剂肝再生的基础上，进行了 MKK4 小分子抑制剂的开发、临床前评估以及Ⅰ期临床毒性评估。图源：Cell参考文献：Zwirner S, et al. First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure. Cell. 2024 Mar 28;187(1-19).声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 巨噬细胞(macrohages)是免疫系统中的重要细胞，能够吞噬和消灭病原体，同时在抗肿瘤反应中也发挥着关键作用。然而，巨噬细胞的活化受到激活型和抑制型受体的平衡调控，这一平衡在正常组织保护和肿瘤生长促进中起到双重作用。 2月6日发表于Nature杂志上的研究“The nuclear factor ID3 endows macrophages with a potent anti-tumour activity”发现核因子ID3(nuclear factor ID3)是肝脏特有的巨噬细胞(Kupffer cells, KCs)的一个关键调节因子，它通过调整巨噬细胞表面的激活/抑制受体平衡，增强了巨噬细胞对活体肿瘤细胞的吞噬能力，并促进了自然杀伤细胞(Natural Killer, NK)和CD8阳性T细胞(CD8+ T lymphoid effector cells)的招募、增殖和活化，从而在肝脏中形成一个有效的抗肿瘤微环境。此外，ID3通过调节转录因子ELK1和E2A在SIRPA基因位点的结合，进一步调控巨噬细胞的活性。 该研究揭示了ID3在调控肝脏特有巨噬细胞中的新机制，为肝脏及其他肿瘤的免疫治疗提供了新的潜在靶点。 巨噬细胞抗肿瘤活性的新机制：研究揭示了核因子ID3在调控肝脏特有的巨噬细胞(Kupffer cells, KCs)中的关键作用，特别是其在巨噬细胞吞噬活体肿瘤细胞、招募自然杀伤细胞(Natural Killer, NK)和CD8阳性T细胞(CD8+ T lymphoid effector cells)方面的功能，为理解巨噬细胞在肿瘤免疫中的作用提供了新的视角。 ID3对激活/抑制受体平衡的调控：研究发现ID3能够通过调节巨噬细胞表面激活型和抑制型受体的平衡，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力，揭示了一个关键的调控机制，这对于理解巨噬细胞如何在肿瘤微环境中发挥作用具有重要意义。 转录因子ELK1和E2A在SIRPA基因表达调控中的作用：该研究进一步探讨了ID3如何通过影响转录因子ELK1和E2A在SIRPA基因位点的结合来调控巨噬细胞的活性，提供了关于巨噬细胞如何响应环境信号并在抗肿瘤反应中发挥作用的深入理解。 潜在的免疫治疗靶点：通过揭示ID3在肝脏特有巨噬细胞中的作用，这项研究为肝脏及其他肿瘤的免疫治疗提供了新的潜在靶点。特别是，ID3的调控作用可能为开发新的治疗策略，通过调节巨噬细胞的抗肿瘤活性来增强肿瘤免疫反应提供了基础。 基因敲除(Gene Knockout)和基因过表达(Gene Overexpression)技术：通过基因敲除技术，研究团队构建了ID3基因敲除的小鼠模型，以及通过基因过表达技术，在骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)和人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)来源的巨噬细胞中过表达ID3，用以研究ID3对巨噬细胞功能的影响。 流式细胞术(Flow Cytometry)和细胞分选(Cell Sorting)：利用流式细胞术分析和细胞排序技术来鉴定和分离特定的细胞群体，如KCs、BMDMs以及特定的免疫细胞，如自然杀伤细胞(Natural Killer, NK)和CD8阳性T细胞(CD8+ T lymphoid effector cells)，以研究这些细胞在基因敲除或过表达ID3后的表型和功能变化。体外细胞功能实验(In vitro Cellular Function Assays)：通过体外细胞培养和功能实验，如吞噬实验(phagocytosis assays)、细胞因子分泌测定(cytokine production assays)等，来评估ID3对巨噬细胞吞噬能力和炎症因子分泌能力的影响。 体内动物模型(In vivo Animal Models)：使用小鼠肿瘤模型来研究ID3对肝脏特有巨噬细胞在体内的抗肿瘤活性的影响。通过肿瘤细胞注射、基因敲除或过表达小鼠的构建，来观察ID3对肿瘤生长、转移以及免疫细胞浸润的影响。 分子生物学技术(Molecular Biology Techniques)：利用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)、Western Blot等分子生物学技术，来研究ID3对巨噬细胞中相关基因表达的调控作用，特别是与激活/抑制受体平衡、细胞因子和化学因子表达相关的基因。 转录因子结合分析(Transcription Factor Binding Analysis)：通过CUT&RUN技术等分子技术探索ID3如何通过影响转录因子如ELK1和E2A在SIRPA基因位点的结合来调控巨噬细胞的活性。 ID3的表达对巨噬细胞抗肿瘤活性的必要性：该研究显示，ID3在肝脏特有的巨噬细胞(Kupffer cells, KCs)中的表达是必要的，以赋予它们强大的抗肿瘤活性。在ID3基因敲除的小鼠模型中，KCs失去了对肿瘤细胞的吞噬能力，同时，自然杀伤细胞(Natural Killer, NK)和CD8阳性T细胞(CD8+ T lymphoid effector cells)的招募、增殖和活化也受到影响，导致肿瘤生长和转移的增加。 ID3通过调节激活/抑制受体平衡来增强巨噬细胞的吞噬能力：ID3能够调节巨噬细胞表面激活型和抑制型受体的平衡，特别是通过降低信号调节蛋白α(Signal Regulatory Protein α, SIRPA)的表达，从而增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。 ID3影响巨噬细胞中相关基因的表达：ID3的表达影响了一系列与巨噬细胞激活和抗肿瘤功能相关的基因的表达，包括促进炎症因子和化学因子的产生，如CCL3、CCL4、CCL5、IL-12、IL-15和IL-18，这些因子对于NK和CD8+ T细胞的招募和活化至关重要。 转录因子ELK1和E2A在SIRPA基因表达调控中的作用：研究发现，ID3通过阻止转录因子ELK1和E2A在SIRPA基因的启动子/增强子区域的结合，从而抑制了SIRPA的表达。这一发现揭示了ID3如何精细调控巨噬细胞活性的分子机制。 ID3表达的巨噬细胞在体内外具有强大的抗肿瘤活性：在体外实验中，过表达ID3的骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)和人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)来源的巨噬细胞展现出了增强的吞噬活性和炎症因子产生能力。在体内实验中，过表达ID3的BMDMs在注入小鼠肿瘤模型后能够显著抑制肿瘤生长和转移，同时促进NK和CD8+ T细胞的招募和活化。 ID3在其他类型巨噬细胞中的作用：该研究主要集中在肝脏特有巨噬细胞上，ID3在其他组织特定巨噬细胞或疾病环境中的巨噬细胞，如肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)中的作用和机制仍然不清楚。 ID3表达与肿瘤微环境的相互作用：肿瘤微环境是一个复杂的网络，包括多种细胞类型和信号分子。ID3在巨噬细胞中的表达如何受到肿瘤微环境中其他因素的影响，以及它如何影响巨噬细胞与其他免疫细胞的相互作用，还需要进一步研究。 ID3调控网络的全貌：虽然研究揭示了ID3通过影响转录因子ELK1和E2A来调控SIRPA表达的机制，但ID3可能还影响其他信号通路和基因的表达。因此，揭示ID3调控网络的全貌对于全面理解其在免疫调控中的作用至关重要。 ID3作为治疗靶点的潜力和限制：该研究为利用ID3表达的巨噬细胞开发新的肿瘤治疗策略提供了基础，但如何有效、安全地在临床上调节ID3表达，以及可能的副作用和耐药性问题，还需要进一步的研究和验证。 ID3与肿瘤异质性的关系：肿瘤具有高度的异质性，不同类型或不同个体的肿瘤对免疫治疗的反应可能不同。因此，探索ID3在不同肿瘤类型和不同肿瘤微环境中的作用，对于理解其在肿瘤免疫治疗中的潜力至关重要。 原文链接 https://www.nature.com/articles/s41586-023-06950-4 Deng Z, Loyher PL, Lazarov T, Li L, Shen Z, Bhinder B, Yang H, Zhong Y, Alberdi A, Massague J, Sun JC, Benezra R, Glass CK, Elemento O, Iacobuzio-Donahue CA, Geissmann F. The nuclear factor ID3 endows macrophages with a potent anti-tumour activity. Nature. 2024 Feb 7. doi: 10.1038/s41586-023-06950-4. Epub ahead of print. PMID: 38326607. 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。