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生命如同一部波澜壮阔的舞台剧，遗传基因是剧本，将剧本进行生动演绎的表演设计师则是表观遗传。在真核生物的细胞核内，染色质的化学修饰，及其凝聚与松弛状态的形成、维持与切换，影响着遗传信息的表达。这种机制被称为表观遗传调控，是生物表型复杂性和多样性的关键保证。组蛋白去乙酰化酶Rpd3是一类全局基因调控和共抑制因子，人源Rpd3S复合物的功能异常与肿瘤、心血管疾病发生相关，是健康维护及药物开发的重要靶点。 基础医学院李海涛教授团队和生命学院闫创业副教授团队合作在Rpd3S介导的染色质去乙酰化动态调控机制上取得重要突破，相关成果以“组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化（H3K36me3）指引下的多模式Rpd3S核小体去乙酰化”为题在《自然》（Nature）期刊作为研究长文发表，系统全面地对Rpd3S的结构、底物识别催化，以及修饰调控等过程进行了分子机制解析，揭示出甲基化指引的染色质去乙酰化动态和多模态模型，为疾病预防、药物研发、再生医学等领域带来了新曙光。 李海涛和闫创业为文章的共同通讯作者，基础医学院博士后管海鹏和2017级博士生王沛为并列第一作者，2020级博士生张沛参与了主要研究。本成果入选2023年清华大学最受师生关注的年度亮点成果。 为使生命这部编排精密的舞台剧顺利演绎，不同功能的组蛋白在相关酶的作用下发生甲基化、乙酰化等多种翻译后修饰，如同性格各异的演员穿着各色衣帽、使用各式道具上演环环相扣的多彩剧情。 1996年，Rpd3首次被报道作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）发挥作用，这一发现与同年组蛋白乙酰转移酶（HAT）GCN5的转录共激活功能发现一起，标志着现代表观遗传学的兴起。但在其后的20年间，Rpd3的分子结构及其调控机制一直没能得到深度解析，成为表观遗传领域的关键谜题之一。 随着冷冻电镜技术的发展和化学生物学的兴起，科研人员对揭开这一表观遗传调控机制之谜的愿望愈发强烈。2017年，李海涛带领课题组开始布局此项研究。 从最初的实验样本获取开始，难题与挑战就纷至沓来。在酵母中，Rpd3与多种亚基Sin3、Ume1、Rco1、Eaf3组装形成Rpd3S复合物。相比其他复合物，去乙酰化酶的催化模式更有动态性。“对我们来说，蛋白质的柔性太大。”李海涛说，如同运转中的风扇，无法辨认出有多少只叶片在转动，必须将风扇暂停，才能看清其叶片构造。而让蛋白质“暂停”的方法，则有赖于生化纯化与冷冻制样技术。 想要通过电镜捕捉到稳定的蛋白质结构，首先要在冷冻制样过程中将蛋白质均匀分散。去垢剂是应用较为广泛的优化蛋白质可溶性表达的条件，“我们试了很多种去垢剂，又试了聚乙二醇等，都失败了。” 管海鹏回忆道，“后来在李老师的指导下，尝试用甘油这类具有双极性的小分子。”甘油的浓度高于5%时，会影响成像衬度，使电镜图像的明暗差异降低，不利于识别。于是，团队在0%-5%的甘油浓度范围内展开梯度筛选实验，发现浓度在2.5%以上适宜优化样品。 从尝试去垢剂到甘油浓度实验，经过近一年的筛选，团队最终确定甘油浓度为3%时，酿酒酵母Rpd3S复合物在冷冻制样过程中呈现稳定的均匀分散状态，“这是我们课题组能解析出Rpd3S复合物分子结构的重要原因。”管海鹏说。 研究者用化学生物学手段合成出性质均一的修饰组蛋白，并成功组装出多种修饰组合类型的“人工设计”核小体，随后开展了Rpd3S与修饰核小体复合物的结构解析攻关。然而柔性的干扰仍然存在，对此，闫创业团队在处理柔性结构的数据方面经验丰富。于是，两个团队通力合作，放弃了过年的休息时间联手攻关。 终于，2020年正月初九，正在实验室里的管海鹏和王沛拿到突破性数据，意味着Rpd3S在被发现20多年后即将向人们展露其分子结构！彼时，整个研究团队在实验室和微信群中欣喜若狂，共同庆祝突破性数据的到来。 Rpd3S复合物整体结构以及亚基间相互作用与调控 Rpd3S复合物与核小体的结合 综合单颗粒冷冻电镜与化学生物学等跨学科技术，李海涛课题组解析出了酿酒酵母Rpd3S复合物在自由状态和结合H3K36me3核小体状态下的分子结构模型。“这足以发一篇重磅论文，但我们不满足止步于此。”李海涛说，“我们要进一步探究其修饰的调控机制，将捕捉到的Rpd3S结构‘快照’置于生理的生命动态调控过程中，才是有意义的。”随后攻关团队布局开展了生化酶活和酵母遗传学等功能实验。 去乙酰化可以维持基因的正常转录延伸并防止异常转录发生。Rpd3S会对甲基化核小体中的组蛋白H3、H4进行识别，然后去除组蛋白上乙酰化位点。在系统化探究这一调控模式时，研究者发现H3有5个乙酰化位点，H4有4个乙酰化位点，而甲基化的位点更多，需要通过大量生化实验不断验证每个位点酶活水平的变化。 “我们分段合成了不同的多肽底物，再利用化学链接的方式构建出带有不同修饰状态的组蛋白。”王沛介绍道。合成多肽应用了化学系教授刘磊的蛋白质精准合成技术，其制备的样本十分昂贵，合成操作需要研究者胆大心细。“虽然样本昂贵且量小，但操作时我们并不会紧张，因为李老师一直让我们放手去做，给我们创造了轻松的科研环境。”王沛笑着说，“他对我们的每一步小进展都给予鼓励，是我们的‘夸夸群群主’。” 在结构探究过程中，课题组意外发现Rpd3S具有独特的非对称架构。在Rpd3S中，Eaf3、Rco1、Rpd3、Sin3结合形成催化核心复合物，而其中的两组Eaf3-Rco1异源二聚体呈现出不对称组装方式，如同各司其职的左手与右手，会运用不同“道具”进行协同催化调控。 Rpd3S复合物在以修饰核小体为底物时的去乙酰化酶活 左手一侧，Eaf3、Sin3、Rco1的组合通过对两个H3K36me3标记、核小体DNA和连接DNA的多价识别，将Rpd3的催化中心定位在H4 N末端尾部附近，进行去乙酰化。 另一种调控模式位于右手一侧。Eaf3和Rco1对未甲基化的H3第四位赖氨酸（H3K4un）和H3K36me3进行组合读取，引导H3去乙酰化。但在该过程中，H3乙酰化的第9位赖氨酸（H3K9ac）修饰被特异性保留，课题组继而对这一特殊情况展开系统研究。研究者通过突变实验影响H3K9ac乙酰化的建立，发现缺失H3K9ac修饰几乎影响着H3和H4所有其他位点乙酰化水平的建立。课题组据此提出，H3K9ac修饰和H3K36me3修饰可以作为“种子”，被乙酰化转移酶NuA3、NuA4识别和快速H3、H4乙酰化修饰重新建立。 Rpd3S-NuA3/NuA4在转录过程中动态调控染色质乙酰化水平模型 在对Rpd3S“左右手”的探究中，由于复合物具有动态性，研究者只能看到其左手一侧，对于右手一侧的解析则使用了系统的遗传学及生物化学手段，从而全景式呈现了Rpd3S的结构与催化机制。 然而体外的酶活实验并不能代表复合物在体内的调控模式，课题组又进一步探究了野生型Rpd3S和突变株在酵母表型上的影响，其结果与体外的酶活实验结果吻合，完成了体内体外的双重验证，从而完善了转录延伸过程中染色质乙酰化修饰的动态调控模型。 Rpd3S复合物体内功能研究和催化模型 如今，医学正从以疾病为中心的传统模式迈向以主动健康为中心的康建医学（wellness medicine）新范式，在这一变革中，精准与数智医学日益成为关键的新生力量。基因序列本身不能完全决定生物体的宿命，表观遗传学信息的建立与解读更直接地表征了个体健康与疾病的状态。因此在生命的舞台剧中，只了解基因剧本是远远不够的，更需要掌握各位演员的表演机制，从而更精准地调控各幕剧情，让生命之姿活力绽放。 论文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-023-06349-1 原文链接： https://www.tsinghua.edu.cn/info/3045/115776.htm 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

引言 在真核细胞中，核小体是染色质的基本组成单元，其可以通过改变自身的定位、共价修饰组蛋白及置换组蛋白变体的方式来改变染色质的结构和调控基因表达。核小体的这些调控主要由染色质重塑复合物和组蛋白修饰复合物来执行。人源TIP60复合物（hTIP60）是一个具有 17 个亚基的超大型复合物（分子量约为1.7 MDa），它的独特之处在于同时拥有组蛋白变体置换和组蛋白乙酰化活性。根据酶活和分子组成上的相似性，hTIP60被认为是酵母中 SWR-C复合物（ySWR-C）和 NuA4复合物（yNuA4）的融合物。之前的研究表明，hTIP60在多种生物学过程中发挥重要作用，包括转录调控、DNA修复、细胞周期控制和胚胎发育等，同时hTIP60的突变被认为与多种癌症相关。 过往的研究报道了hTIP60 复合物的同源物如 ySWR-C、 yNuA4、hSRCAP-C等复合物的高分辨冷冻电镜结构，从结构生物学的角度阐明了这些复合物结合底物核小体并发挥活性的机制，另外也有一些研究通过晶体学、核磁共振波谱（NMR）等技术对 hTIP60 复合物的部分亚基如YL1、YEATS4、MRG15-MRGBP、EPC1-MBTD1等进行了结构分析，而hTIP60 复合物的完整结构信息一直处于空白状态，因此目前该复合物的组装及其结合核小体的模式仍然很不清楚。 2024年8月17日，复旦大学徐彦辉团队在Nature Communications杂志上在线发表了题为Structure of the human TIP60 complex的研究论文。该研究利用单颗粒冷冻电镜技术，结合交联质谱及体外生化功能分析阐明了hTIP60复合物精细的分子组装机制，并提出了该复合物作用于核小体的模型。 根据已有的关于hTIP60复合物的报道及其与yNuA4和ySWR-C复合物的同源性研究，由17个亚基组成的hTIP60复合物可被划分为5个模块，其分别为含有Snf2家族ATPase结构域的motor 模块、调节性的ARP模块、发挥乙酰化功能的HAT模块、含有多个组蛋白修饰阅读器的TINTIN（Trimer Independent of NuA4 for Transcription Interactions with Nucleosomes）模块、以及用于结合转录激活因子的TRRAP模块（图1）。 图1. 人源TIP60复合物的模块化组织和结构域示意图(Credit: Nature Communications) 徐彦辉课题组的这项工作报道了hTIP60复合物单体状态下的冷冻电镜结构，9.4 Å的整体冷冻电镜密度图表明该复合物主要由两大部分构成，这两部分被称为核心亚复合物（包括motor 模块及ARP模块）和 TRRAP模块，它们通过一段柔性区域连接（图1a），随后研究人员将这两部分的分辨率均细化至3.2 Å（图1b）。这些结构表明EP400亚基作为hTIP60复合物的骨架蛋白，整合了复合物的motor 模块、ARP（actin-related protein）模块和TRRAP 模块。在motor模块中，RUVBL1-RUVBL2六聚体是EP400亚基的ATPase结构域和YL1亚基组装的刚性核心。在ARP模块中，ACTL6A-ACTB异二聚体和一个额外的ACTL6A 亚基通过疏水作用与EP400 亚基的HSA螺旋进行接触；而亚基 DMAP1、EPC1和EP400之间的相互作用网络增强了ACTL6A-ACTB异二聚体和EP400-HSA之间的结合。在TRRAP模块中，EP400亚基的 SANT结构域及其C端区域与TRRAP亚基存在广泛的相互作用界面。总体来看，ARP模块与motor模块之间的连接非常稳定，而其与TRRAP模块之间的连接非常灵活，这是hTIP60复合物特有的结构特征。 除了上述已经确定的模块外，hTIP60 复合物的整体冷冻电镜密度图中TRRAP模块和核心亚复合物之间还存在了一些较弱的密度，这些密度可能属于hTIP60复合物其他的模块，包括HAT模块和TINTIN模块（图2a）。因此在hTIP60复合物中，其HAT模块、TINTIN模块和TRRAP模块都以灵活的方式连接到核心亚复合物中，这种结构上的可塑性可能有助于该复合物在细胞中识别复杂的染色质环境并找到合适的底物。 图2. 人源TIP60复合物单体的结构：(a). hTIP60 复合物在低轮廓水平（low contour level，左）和高轮廓水平（high contour level，右）的整体冷冻电镜密度图。(b). 人源TIP60复合物单体状态下的冷冻电镜重构密度图及三维模型。(Credit: Nature Communications) 此外，该研究还报道了与核小体结合的hTIP60复合物的较低分辩率的冷冻电镜结构，该结构显示核小体结合在hTIP60复合物的核心亚复合物和TRRAP模块之间（图3），值得注意的是，在对hTIP60-核小体复合物的冷冻电镜数据进行仔细的分析后，研究人员并未观察到hTIP60的核心亚复合物像其他重塑复合物那样（即催化亚基的ATPase结构域抓住核小体的DNA以进行染色质重塑）结合核小体的构象。 图3. 核小体结合状态下的人源TIP60复合物的冷冻电镜重构密度图及模型(Credit: Nature Communications) 综上所述，该研究揭示了hTIP60 复合物的 motor 模块、ARP 模块和 TRRAP 模块高分辨的结构信息，阐明了该复合物的分子组装机制及各模块之间的相互作用模式；并首次报道了和核小体结合的hTIP60复合物的冷冻电镜重构密度图，从结构生物学的角度对该复合物如何与核小体作用提供了见解，为继续探索hTip60复合物作用于染色质并调控基因表达的机制提供了线索。 参考文献 https://www.nature.com/articles/s41467-024-51259-z 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

2023年7月19日，Nature(《自然》)杂志在线发表清华大学李海涛课题组携手清华大学闫创业课题组、上海交通大学李兵课题组合作完成的题为“ Diverse modes of H3K36me3-guided nucleosomal deacetylation by Rpd3S ”（H3K36me3指引下的多模式Rpd3S核小体去乙酰化）的研究长文。研究团队通过化学生物学手段构建人工修饰核小体，利用单颗粒冷冻电镜技术解析了酵母Class-I类型组蛋白去乙酰化酶复合物Rpd3S的自由态和H3K36me3核小体结合态下的结构，并结合去乙酰化酶活分析以及酵母遗传学等功能实验，全面地对Rpd3S复合物的组装模式、底物识别催化和修饰介导调控等过程进行了分子机制解剖，揭示出甲基化指引的染色质去乙酰化动态和多样化模型。组蛋白去乙酰化酶分为多个亚家族，常常形成样式繁多的功能复合物，通过在不同染色质区域去除乙酰化发挥基因抑制功能。本项围绕Rpd3S的研究成果首次系统揭示了Class-I类型HDAC复合物发挥功能的结构基础，凸显了表观遗传调控的精妙复杂性，完美展示出大自然通过形成多亚基大分子复合物机器来获得高阶调控能力的精巧设计。研究表明，人体中Rpd3S复合物同源蛋白Sin3B的异常激活或表达与肿瘤发生有关，尤其涉及到肿瘤抑制基因和细胞周期调控基因。依赖于上下游修饰的动态组蛋白修饰调控是基因转录过程中的重要表观遗传机制。例如，组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K4me3）和H3第36位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K36me3）是区分转录起始位点和转录编码区域的标志【1, 2】。在酵母中，组蛋白甲基转移酶Set2可以被RNA聚合酶II直接募集，并特异性甲基化H3K36位点。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）Rpd3S复合物在转录编码区域被H3K36me3修饰所招募，并通过其去乙酰化酶活性抑制异常启动子的转录【3, 4】。因此，Set2-Rpd3S调控通路介导了H3K36甲基化和组蛋白去乙酰化的偶联从而维持基因的正常转录延伸并防止异常转录发生。Rpd3最初被认为是一种全局基因调控因子和共抑制因子，1996年首次报道其作为HDAC发挥作用【5, 6】。这一发现，与同年组蛋白乙酰转移酶GCN5转录共激活功能的突破性发现，奠定了现代表观遗传学新范式。在酵母中，Rpd3与Sin3、Ume1、Rco1和Eaf3进行组装形成0.6-MDa的Rpd3S复合物，通过Eaf3亚基的CHD结构域识别H3K36me3和Rco1的PHD结构域识别未修饰的组蛋白H3 N-端尾部（H3K4un）来定位与调控【7-9】。然而长久以来，Rpd3S复合物催化修饰核小体底物的分子识别模式及其去除组蛋白H3、H4各位点乙酰化修饰的特异性催化机理都缺乏深入的研究。李海涛合作团队通过样品制备条件的优化，利用冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）解析出Rpd3S复合物的3.2 Å分辨率的电镜结构。研究成果展示出Rpd3S复合物的独特分子结构，其中双拷贝的Eaf3和Rco1蛋白形成异源二聚体与Rpd3和Sin3不对称地结合形成一个催化核心复合物，而核心催化酶Rpd3受到其他亚基共同的复杂调控。同时两分子Eaf3-Rco1异源二聚体呈现出不对称组装方式，类似于两个手臂介导Rpd3S复合物的酶活催化。与此同时，李海涛研究团队结合复合物分子模型和ITC等生化技术重新定义了Rco1两个PHD结构域的识别互作机理：PHD1参与识别H3K4un并介导复合物的催化与定位；PHD2主要作为组装模块确保复合物组装的稳定性，但缺失组蛋白修饰的识别能力（图1）。图1. Rpd3S复合物的整体结构以及亚基间的相互作用与调控随后李海涛研究团队利用修饰多肽分段合成和化学连接方式合成了多种修饰组蛋白，包括H3K36me3H3K9acK14acK18acK23acK27acH3K9acK14acK18acK23acK27acK36me3H3K4me3K9acK14acK18acK23acK27acK36me3H3K9RK14acK18acK23acK27acK36me3H4K5acK8acK12acK16ac等修饰，并构建出复合修饰核小体底物以用于后续结构生物学和生化酶活研究。依托人工合成的修饰核小体以及进一步优化样品制备条件，李海涛合作团队成功解析出两种状态的Rpd3S- H3K36me3修饰核小体的结合催化复合物电镜结构，分别命名为“close”状态和“loose”状态，体现出Rpd3S复合物在去乙酰化催化过程中的动态性。其中至关重要的是，两个Eaf3蛋白的CHD结构域分别识别在一个核小体的两个H3K36me3修饰上面，提示染色质双H3K36me3修饰状态的建立与维持是Rpd3S复合物被招募进而行使去乙酰化过程的关键条件（图2）。图2. Rpd3S与H3K36me3修饰核小体的互作催化复合物结构与此同时，复合物结构中，Eaf3、Sin3和Rco1蛋白通过建立与双H3K36me3修饰、核小体DNA以及Linker DNA的多价识别，将Rpd3的催化中心定位在组蛋白H4 N-末端尾部附近进行去乙酰化酶活，这揭示了Rpd3S复合物去除H4 N端乙酰化的分子机理（图3）。图3. Rpd3S与H3K36me3修饰核小体间的分子互作细节为进一步探究Rpd3S复合物在多价态结合介导下对修饰核小体去乙酰化的特异性分子机制，李海涛团队合成H4（K5acK8acK12acK16ac），H3（K9acK14acK18acK23acK2 7acK36me3）的修饰组蛋白，并重组多类型修饰核小体作为底物参与酶活鉴定与分析发现。Rpd3S复合物对H3K14ac、H3K23ac以及H4K5ac和H4K12ac具有优先催化的能力。研究同时发现Rpd3S在高效去除H3和H4上的其他各位点的乙酰化修饰的同时，却特异性保留了H3K9位乙酰化修饰（H3K9ac），且加长酶活反应时间并不影响H3K9ac的保留。通过薛定谔软件将H31-16K14ac修饰多肽摆放入Rpd3S结构内部可见，H3K9ac的保留是由于PHD1对于H3K4un的识别从而使H3K9位点远离Rpd3催化中心所致。为进一步探究Rpd3S复合物去除H3 N端乙酰化的分子机理，研究者设计了PHD1结构域的突变，酶活结果证实了PHD1仅参与去除H3 N端乙酰化的分子机理。除此之外，通过特定设计的SBD结构域的突变（7mu）影响了左臂区域包括Eaf3B-CHD结构域的稳定性，酶活实验结果进一步证实了左臂区域对去除H3和H4 N端乙酰化的重要性，尤其针对于H4（图4）。图4. Rpd3S复合物识别结构域间协同调控去乙酰化活性然而复合物体外酶活实验并不能直接反应复合物体内的调控模式，故李海涛课题组研究人员进一步利用STE11-HIS3酵母报告系统去探究野生型Rpd3S和突变株在酵母表型上的影响。PHD1和SBD结构域的突变都能导致酵母异常转录的发生，且酵母整体的组蛋白H3和H4的乙酰化水平都不同程度上受到了影响，且与体外突变体的酶活实验结果完美吻合。综上，研究人员基于分子结构、生化实验和功能研究结果，提出了Rpd3S复合物去乙酰化的动态调控模型：Rpd3S在单个核小体上利用双分子的CHD结构域识别双组蛋白N端H3K36me3修饰从而将Rpd3的催化中心定位在组蛋白H4 N端尾部附近，从而实现H4高效的去乙酰化。另一种调控模式下，在一个组蛋白H3尾部附近，Rpd3S复合物通过Rco1-A 的PHD1结构域对H3K4un的识别和Eaf3-B CHD结构域对H3K36me3的识别协同实现H3高效的去乙酰化（图5）。图5. Rpd3S复合物体内功能研究和催化模型由于对去乙酰化过程中H3K9ac修饰被特异性保留的意外发现，李海涛研究团队通过引入体内H3K9位点突变（H3K9R）以影响H3K9ac乙酰化的建立，可以看到酵母体现出明显的生长抑制性表型。对H3和H4的整体乙酰化修饰水平进行进一步系统研究，研究者发现H3K9ac修饰的缺失进一步影响了近乎H3和H4所有其他位点乙酰化水平的建立，这暗示H3K9ac的存在对后续其他位点的乙酰化建立至关重要。鉴于乙酰化转移酶NuA3和NuA4都存在H3K9ac和H3K36me3的识别结构域，研究人员进一步提出了修饰重建模型：Rpd3S催化反应后，被保留的H3K9ac修饰连同H3K36me3修饰可以作为NuA3-NuA4招募和高乙酰化H3和H4重建的“种子”标记。Rpd3S和NuA3-NuA4作为“eraser–writer”反作用调控酶组合，在转录过程中动态调控基因表达（图6）。图6. “Rpd3S-NuA3/NuA4”在转录过程中动态调控染色质乙酰化水平模型原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06349-1会议推荐1大会信息  会议名称 | 2023第六届单细胞多组学研究与临床应用峰会会议时间 | 2023年9月14-15日会议地点 | 上海虹桥西郊丽笙大酒店大会规模 | 800人主办单位 | 生物谷扫码立即报名