E2F2

【导读】 化疗后的疾病复发是卵巢癌(OC)的一个主要临床挑战，但关于肿瘤表观基因组如何调节支持化疗耐药的转录程序，我们知之甚少。 9月28日，英国伯明翰大学研究学者在期刊《Communications Biology》上发表了题为“The chromatin landscape of high-grade serous ovarian cancer metastasis identifies regulatory drivers in post-chemotherapy residual tumour cells”的研究论文，本研究中，研究表明上皮肿瘤细胞显示出富含致癌转录因子MEIS和PBX基序的开放染色质区域。化疗后的微环境显示了深刻的肿瘤异质性，以及对染色质富集TP53、TP63、TWIST1和耐药通路激活转录因子结合基序的可及细胞的选择。OC化疗耐药肿瘤亚群在治疗前就已存在，并以应激相关基因表达为特征，在化疗后富集。核受体RORa, NR2F6和HNF4G被发现是这些细胞的候选转录驱动因子，而E2F2和E2F4结合位点的关闭表明治疗后的肿瘤具有低增殖能力。 因此，对卵巢癌细胞化疗后存活的基因调控图谱的描述揭示了潜在的化疗耐药核心转录调控因子，为改善临床结局提供了新的治疗靶点。 https://www.nature.com/articles/s42003-024-06909-9#Sec8 背景知识 01 高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见和最致命的卵巢癌亚型，每年影响全球23.9万名女性，5年生存率仅为25%。绝大多数(80%)患者被诊断为晚期FIGO III期或IV期疾病，并有转移进展的证据。患者常表现为广泛的腹膜腔播散，最常见的转移部位是网膜。 晚期HGSOC的治疗方案包括铂类化合物的化疗和减瘤手术。尽管大多数病例在初期有临床反应，但化学耐药性极为常见，70-95%的患者在两年内出现疾病复发。过去30年，人们对化学耐药的机制进行了深入研究，主要集中在耐药信号通路的扰乱和基因表达谱上。机制包括铂类化合物转运泵的失调、DNA损伤修复（DDR）通路和细胞死亡响应的紊乱，但对化疗治疗的耐药机制的数量和复杂性超过了更具靶向性的疗法。 上皮性肉瘤样癌（HGSOC）的体细胞突变谱非常复杂，存在极端的拷贝数变异，TP53突变的普遍性几乎达到100%，并且存在异常高的肿瘤异质性。对转移性卵巢癌的详细转录分析揭示了肿瘤、间质和浸润性免疫细胞群的细胞类型构成。研究表明，化疗可调节肿瘤微环境中的转录程序，与IL6相关的炎症网络和应激反应基因与不良治疗反应和加速疾病复发有关。此外，最近的一项纵向单细胞转录组研究鉴定并验证了与复发和生存期缩短相关的应激相关肿瘤细胞表达谱。 对化疗耐药的分子机制了解得较少的是，调控应激、DNA损伤响应或细胞死亡信号转导的转录程序的基因调节机制。事实上，作为单一疗法或与化疗联合使用的表观遗传疗法是克服耐药的一种潜在选择，目前正在进行临床评估。 研究发现肿瘤细胞中与压力相关的化疗耐药的转录调控因子 02 研究人员对19,122个上皮肿瘤细胞的染色质景观进行了更详细的分析。研究人员对分群子集的特征分析揭示了肿瘤子集内基因、峰值和位点活性的异质性。所有样本都显示出明显的EPCAM、LAPTM4B、KRT7、PAX8基因活性以及MEIS1位点富集，支持上皮细胞类型，但包括MUC16在内的其他肿瘤标志物在样本间的变化更大。在治疗前的细胞中，MEF2家族、TP53和TP63的选定位点显示出显著富集，而在治疗后的细胞中，TP53/63的富集更为明显，在40-60%的样本中可见。 化疗富集的与压力相关的肿瘤细胞的转录驱动因子 研究人员已经发现，腹膜转移灶内的HGSOC化疗耐药性受到一组可识别的与压力相关的基因标志物的促进，该标志物可在预先治疗的肿瘤细胞亚群中检测到，因此有必要在这些数据中检查肿瘤压力基因活性评分。与先前的研究结果一致，在化疗后，每细胞和每样本的肿瘤压力评分均显著增加，这表明可能存在对化疗耐药的与压力相关的肿瘤细胞的选择。值得注意的是，该队列中出现疾病复发的两名患者（post_F和post_G）也是肿瘤压力评分最高的患者。 为了探究驱动这种应激/化疗耐药肿瘤细胞状态的主要转录调控因子，研究人员识别出每个样本的chromVar motif分数与应激标志物分数的相关性。这一分析识别出与应激分数显著相关的结合位点活性，其中包括转录因子RORA、GATA、NR2F6和HNF4G。尤其是，与应激分数呈最强负相关性的结合位点包括E2F2和E2F4，它们是DNA复制和细胞周期的激活调节因子。这些结果表明，化疗耐药应激相关肿瘤细胞的增殖率较低，这与先前的研究结果一致，即慢周期肿瘤细胞具有增强的化疗逃逸能力。 此外，研究人员通过基因活性差异分析和结合位点富集分析确定了5114个在化疗前和化疗后肿瘤细胞中存在差异的基因以及286个富集的结合位点。CNA（拷贝数变异）轮廓揭示了未经治疗肿瘤细胞中的多种遗传学异常，尤其是染色体3、19和20的增益，而化疗后肿瘤细胞中观察到的CNA较少。为了突出标记出大部分对化疗敏感（化疗前）和对化疗耐药（化疗后）的肿瘤细胞的可能转录调节因子，研究人员接下来确定了在化疗后具有不同活性的基因和TF（转录因子）结合位点的交集。这使得研究人员能够识别出在对化疗敏感和对化疗耐药的细胞中同时具有高基因活性和富集结合位点的TF（转录因子）。KLF15、MEF2B、NRF1和CUX2被确定为四个可能的化疗敏感性主调节因子，而另外37个转录因子被确定为在化疗耐药中具有潜在重要性的因子。 研究小结 03 总之，研究人员对转移性卵巢肿瘤细胞的染色质景观的分析揭示了相当大的异质性。化疗后的肿瘤细胞增加了染色质可及性，包括可被干性和耐药驱动因子(如TP63、TP53、TCF7和TWIST1)调节的区域。这些数据为转移性卵巢癌化疗后转录程序的基因调控机制提供了深刻的认识，并确定了一系列潜在的治疗靶点，以进一步探索对抗化疗耐药性和改善HGSOC患者的结局。 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s42003-024-06909-9#Sec8 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

中文摘要 IL-32是广泛表达于人体各组织的细胞因子，具有9个亚型。研究发现，IL-32可通过多种途径调控免疫细胞及其他细胞功能，协同多种细胞因子参与炎症的发生发展，直接或间接地发挥促炎或抑炎的作用。IL-32对肿瘤的发生、侵袭及迁移也有重要的影响，其作用的差异可能与IL-32的亚型及复杂的肿瘤微环境差异相关。此文旨在阐释IL-32在炎症和肿瘤中的作用及相关机制。 正文 IL可协同其他细胞因子组成功能复杂的调控网络，在机体的信息传递、免疫调节中发挥重要作用。IL-32是IL家族的一员，其9个亚型的大小和结构存在不同程度的差异，在炎性疾病和恶性肿瘤中发挥不同的功能。研究发现，在不同情况下，IL-32既能促炎也能抑炎，既有促癌也有抑癌作用。这些看似矛盾的作用与IL-32的亚型功能区别、复杂的作用机制和疾病微环境密切相关。Dahl等于1992 年首次在活化的T细胞及自然杀伤（natural killer，NK）细胞中发现大量表达的IL-32，将其命名为NK细胞转录物4（NK cell transcript 4，NK4）。NK4含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸序列，提示其可能在细胞黏附中发挥作用。Kim等则发现，NK4可诱导TNF-α和IL-8等促炎细胞因子的表达，自此NK4被更名为IL-32。本文就目前已知的IL-32在炎症和肿瘤中发挥的作用及其机制进行综述。 1 IL-32的结构特征与分泌特点 1.1 IL-32的结构与亚型 IL-32基因组全长约1 200 bp，位于人类16号染色体p13.3，包含8个外显子和1个内部信号序列，无跨膜区域。IL-32具有9个亚型，包括IL-32α—θ和IL-32small，大小、结构、功能各不相同，见图1和表1。IL-32的部分亚型间可通过剪接互相转化，如生物活性最强的IL-32γ可剪接成人体含量最高的IL-32β；不同亚型还可以通过相互作用影响彼此功能，如IL-32α可抑制IL-32β对IL-10分泌的促进作用。 1.2 IL-32的细胞表达特点 IL-32主要存在于灵长类动物体内，牛、狗、山羊、兔子和马等其他哺乳动物体内也发现有IL-32的表达，但与人类IL-32的同源性远低于大猩猩等灵长类动物。啮齿类动物不自主表达IL-32，但重组人IL-32（recombinant human IL-32，rhIL-32）可在小鼠体内诱导促炎细胞因子分泌，提示IL-32可在啮齿类动物体内发挥作用。IL-32在NK细胞、单核巨噬细胞和T淋巴细胞等免疫细胞中大量表达，在肺、小肠、结肠、前列腺、心脏、胎盘、肝脏、肌肉、肾脏、胰腺和脑等非免疫组织细胞中也有部分表达。正常生理状态下，IL-32在人体内呈基础性表达，但受脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）、病原体相关抗原物质、TNF-α和IFN-γ等细胞因子或氧化应激刺激时，IL-32的表达量明显提升。 作为缺乏跨膜区域的不稳定性亲水蛋白，IL-32 的作用部位和表达方式仍存在争议。Tomasi等通过队列研究发现，血液循环中IL-32水平差异很大，IL-32可能受内环境影响通过内质网和高尔基体生成囊泡释放、细胞凋亡或坏死所致内容物释出等途径进入血液循环。研究显示，肝脏中IL-32水平与酒精性脂肪性肝病严重程度呈正相关，且循环中的IL-32水平也随肝损伤严重程度上升，可能由肝细胞应激或死亡释放IL-32所致。 IL-32表达受其他因子调控，如嗜酸性粒细胞中的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子以胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-1依赖性方式诱导IL-32α、IL-32β、IL-32γ和IL-32δ的表达。类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）患者关节滑膜成纤维细胞中IL-1β和TNF-α可促进IL-32γ表达。TNF-α可通过激活脾酪氨酸激酶、蛋白激酶Cδ（protein kinase C-δ，PKCδ）、c-Jun 氨基末端激酶、c-Jun氨基末端激酶信号通路促进IL-32α、IL-32β、IL-32δ和IL-32γ表达。 2 IL-32的促炎与抑炎作用 IL-32可通过多种途径调控免疫及其他细胞功能，协同其他细胞因子直接或间接地影响炎性疾病的进展，发挥促炎或抑炎作用（图2）。 2.1 IL-32的促炎作用 IL-32可通过核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）途径、p38丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化途径、caspase-1途径和caspase-3 途径4条主要信号转导通路发挥作用，与多种免疫细胞相互作用，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和巨噬细胞炎性蛋白2等因子的产生，诱发炎症。RA患者关节滑膜中大量表达IL-32，其水平与关节炎严重程度正相关。将rhIL-32注射至C57/BL6野生型小鼠的膝关节可导致关节肿胀、炎性细胞浸润和软骨损伤，而在TNF-α缺陷型小鼠中这些现象均不明显。将分泌IL-32β的CD4+ T细胞移植至胶原诱导的RA模型中可加重关节炎，且这种促炎作用可通过阻断TNF-α的分泌来减轻。RA中IL-32α能诱导破骨细胞前体分化为多核破骨细胞，生物活性更强的IL-32γ可在此基础上将多核破骨细胞活化为骨吸收破骨细胞，促进骨的破坏和吸收。 除RA外，在炎症性肠病，尤其是活动期克罗恩病的肠上皮细胞中，IL-32表达量也明显增多，使NF-κB通路激活，促炎因子IL-1β、IL-6水平上升。下调IL-32可降低这些炎性因子水平。IL-32也在血管炎中发挥作用。在无基础IL-32表达的转基因小鼠体内，TNFα和IL-1β等促炎细胞因子可通过NF-κB途径诱导IL-32β表达，IL-32β又可诱导中性粒细胞和促炎因子浸润和血管细胞黏附分子表达，加剧血管炎症，促使其向脓毒血症转化。此外，IL-32的促炎作用被认为可能与HCV核心蛋白协同加重肝炎症状、促进2型糖尿病与局限性皮肤和黏膜利什曼病的发展、幽门螺旋杆菌感染所致胃炎的进展相关。 2.2 IL-32的抑炎作用 虽然IL-32促炎作用的研究结果居多，但仍有部分研究显示，IL-32还具有抑炎作用。Park等发现，在用胶原抗体（collagen antibody，CA）和LPS诱导产生炎症的小鼠关节中，NF-κB和信号转导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）3信号通路均被激活，促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高，抑炎因子IL-10水平降低，粒细胞、单核巨噬细胞、NK细胞和T细胞等局部大量浸润。而由于IL-32β可抑制促炎信号转导通路的激活和促炎细胞因子的产生，减少CTL和NK细胞的浸润，减轻CA和LPS诱导的关节炎症反应，因此IL-32β转基因小鼠经过相同处理后上述变化均不明显。Spi-1原致瘤基因（Spi-1 proto-oncogene，PU.1）是转录因子Ets家族的重要成员，PKCδ可介导PU.1的磷酸化，磷酸化后的PU.1可作为转录因子介导IL-1β的表达。IL-32θ可抑制PKCδ介导的PU.1磷酸化，阻止下游促炎因子IL-1β的转录和表达，间接发挥抑炎作用。 3 IL-32与恶性肿瘤 炎症和恶性肿瘤具有很强的内部关联性，慢性炎症已被证实是肿瘤发生和发展的始动因素之一。炎性反应中的免疫激活和免疫紊乱影响恶性肿瘤的发生、进展及转移。食管癌、肝癌、胰腺癌和结肠腺癌等的发生均与其前期的炎性疾病相关。IL-32在胃癌、肺癌、食管癌、多发性骨髓瘤和胰腺癌等肿瘤中表现出促进作用；而在结肠癌、乳腺癌、慢性髓性白血病、前列腺癌和甲状腺癌等肿瘤中则发挥抑制作用，这种矛盾的作用与亚型和肿瘤微环境差异均有关。IL-32对恶性肿瘤发生发展影响的主要信号通路或发生机制见图3。 3.1 IL-32与胃癌 胃癌是全球第5大高发恶性肿瘤，很多胃癌患者在确诊时已处于癌症晚期阶段，故其预后普遍较差，死亡率高。Ishigami等对180例胃大部切除术后胃癌患者研究发现，IL-32阳性组（设定IL-32水平高于均值的10%为阳性）胃癌患者的肿瘤大小、浸润深度、淋巴结与血行转移率均高于IL-32阴性组患者，5年生存率低于IL-32阴性组患者。 Tsai等对胃癌患者手术切除的癌变组织进行免疫组织化学试验和PCR分析发现，癌变组织中的IL-32水平明显高于正常组织；将IL-32基因转至胃印戒细胞癌TSGH 9201细胞株后，该细胞形态特征发生明显变化，细胞前缘细长凸起呈纺锤状，其生长、迁移和侵袭能力增强。采用多西环素诱导过表达IL-32的细胞也有此特征。进一步研究发现，IL-32可促进IL-8、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2和MMP9等表达，间接促进癌细胞的生长。此作用与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路激活有关，β连环蛋白是IL-32与IL-8、VEGF、MMP2和MMP9之间的信号传递分子，若对其进行抑制，则IL-32无法发挥对IL-8等促炎因子的促分泌作用，但促炎因子正常分泌不受影响。利用IL-32干扰小RNA沉默IL-32表达，则磷酸蛋白激酶B、β连环蛋白、IL-8和VEGF水平均降低，胃癌细胞侵袭性下降。上述结果表明，IL-32可在胃癌组织中通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路促进下游细胞因子表达，导致胃癌细胞侵袭性增加。 对比弥漫型胃癌，肠型胃癌更易发生血行转移。Pavlovic等研究发现，肠型胃癌组织中IL-17含量显著高于弥漫型。IL-17由Thl17细胞产生，可与VEGF协同作用促进新生血管形成。当IL-32水平降低时， IL-17的含量也随之下降，胃癌血行转移能力下降。提示IL-32可通过IL-17等细胞因子间接影响胃癌的侵袭和转移。 3.2 IL-32与肺癌 肺癌是我国50岁以上中老年群体癌症死亡的主要原因。有研究发现，肺癌组织中IL-32大量表达。肺腺鳞癌细胞中的IL-6、IL-8和VEGF水平与IL-32正相关。流式细胞术检测发现，IL-32低表达肺腺癌细胞生长受抑、凋亡增多，创伤愈合迁移试验和Transwell侵袭试验证实IL-32低表达可降低肺腺癌的迁移和侵袭能力。Zeng等研究结果进一步发现IL-32对肺腺癌的促进作用与其激活NF-κB通路及诱导MMP2、MMP9等多种炎性因子表达相关。Gong等观察到，rhIL-32可促使人非小细胞肺癌细胞A549从卵石状变为长梭形，下调上皮细胞标志物钙黏蛋白E，上调间充质细胞标志物神经型钙黏蛋白、E盒结合锌指蛋白1和葡萄糖调节蛋白78水平。内质网应激抑制剂4-苯基丁酸可抑制此作用，提示IL-32可通过触发内质网应激诱导A549细胞上皮-间充质转化，促进非小细胞肺癌发展。但Yun等研究结果提示，IL-32γ基因转染的肺癌细胞较空载转染组的相同细胞生长受抑、Bcl-2相关X蛋白、caspase-3、caspase-9等促凋亡蛋白表达增加，其可通过NF-κB途径抑制肺癌细胞中DNA甲基转移酶1与金属蛋白酶3组织抑制剂的结合，抑制金属蛋白酶3组织抑制剂启动子甲基化发挥抑癌作用。IL-32α和IL-32β未发现有此作用。 3.3 IL-32与结肠癌 结肠癌是死亡率位居第2的恶性肿瘤，其治疗手段以手术为主，然而近50%的结直肠癌患者出现术后复发，后期治疗受限。具有调节机体炎症与免疫功能的细胞因子新疗法受到广泛关注。研究发现IL-32，尤其活性最高的亚型IL-32γ在结肠癌中高表达可抑制肿瘤细胞的生长侵袭。Bak等在结肠癌细胞HT29中观察到，IL-32θ可阻碍STAT3核转位，抑制下游具有拮抗上皮钙黏素、促进肿瘤侵袭转移能力的B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1和E盒结合锌指蛋白1的转录，降低结肠癌细胞生长侵袭能力。Yun等发现IL-32α可上调TNF受体1（TNF receptor 1，TNFR1）水平，抑制结肠癌的生长。他们在诱变剂氧化偶氮甲烷诱导的结肠癌小鼠模型中观察到IL-32α转基因组的肿瘤发生率、瘤体大小和质量均小于无IL-32分泌的普通对照组。分析表明，IL-32α转基因小鼠中TNFR1、裂解的caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bcl-2相关X蛋白表达均上调；增殖细胞核抗原、细胞凋亡蛋白抑制因子和X连锁凋亡蛋白抑制剂则减少。这表明，IL-32α通过上调TNFR1水平达到了抑制氧化偶氮甲烷诱导的致癌作用，提示IL-32α可协同TNFR1介导的细胞死亡信号传导，抑制结肠癌细胞发展。 3.4 IL-32与乳腺癌 乳腺癌占全球女性新发癌症病例的25%，是全球女性癌症死亡首要疾病。Pham等研究表明，IL-32θ通过诱导细胞衰老凋亡和永久性细胞周期阻滞抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长、侵袭和转移。DNA合成量试验结果发现，稳定表达IL-32θ的MDA-MB-231细胞（实验组）72 h增殖速度明显低于不表达IL-32θ者（对照组），前者的细胞克隆形成能力更弱、磷酸化组蛋白H2AX（一种DNA损伤标志物）检测荧光率、衰老相关的β半乳糖苷酶和脂褐素染色（细胞衰老指标）阳性率更高，总核仁面积更大，异常核形态（细胞核出芽、起泡、大小异常）和异常细胞分裂（异常的着丝粒、纺锤体两极之间的桥缺失、不对称分离等）更多更明显，处于分裂中期的染色体更少。E2F转录因子对G1/S转换具有重要作用，而IL-32θ在乳腺癌细胞中抑制E2F1、E2F2和E2F3的表达，使细胞周期停滞在G1期，抑制乳腺癌细胞生长。 Pham等也发现IL-32对乳腺癌具有抑制作用。巨噬细胞可通过CCL基序趋化因子配体18激活胞内PKCδ，进而激活STAT3和p65、p50，增加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、MMP9、环氧化酶2、上皮钙黏素转录水平，促进乳腺癌的EMT。而IL-32可以选择性抑制PKCδ，阻断该通路的下游信号，降低了乳腺癌细胞的侵袭性。而Wen等研究却表明，乳腺癌中癌症相关成纤维细胞分泌的IL-32可特异性结合精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸基序与整合素β3，激活下游p38 MAPK信号传导，促纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白等形成，增强了肿瘤细胞的侵袭性。 3.5 IL-32与其他肿瘤 IL-32在其他癌症中也发挥重要作用。Kang等通过cDNA微阵列法分析了25例肝细胞癌患者和25例健康受试者肝脏组织中IL-32 RNA表达水平，发现前者显著高于后者；又分别采用免疫印迹法、免疫斑点法和夹心ELISA检测了急性肝炎患者、慢性肝炎患者、肝硬化患者、肝细胞癌患者和健康受试者各25例的血清标本，发现肝细胞癌患者血清IL-32α浓度显著高于其他组，表明IL-32作为肝癌的标志物具有一定临床价值。血管浸润区附近肝癌细胞高表达IL-32提示IL-32对肝癌局部浸润和扩散转移具有促进作用。 皮肤癌的发病率近几十年逐步上升，其主要类型为基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑色素瘤。IL-32影响黑色素瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的免疫应答。研究显示，皮肤黑色素瘤中IL-32水平与NK细胞的浸润及溶细胞颗粒酶和穿孔素含量正相关， IL-32γ转基因黑色素瘤小鼠体内TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-4和IL-13等促炎细胞因子水平均较低，抑炎因子IL-10表达上升，提示IL-32γ在癌症发展期间可抑制肿瘤微环境炎症反应，对黑色素瘤起抑制作用。IL-32β转基因小鼠皮下植入的B16黑色素瘤细胞较不表达IL-32的普通小鼠生长缓慢。IL-32被证实可增强黑色素瘤内树突状细胞和巨噬细胞对CD8+ T细胞的协同激活及CCL基序趋化因子配体5与T细胞在肿瘤组织中的浸润，且可作为免疫治疗有效佐剂增强免疫检查点阻断疗法的疗效，有望通过IL-32β的抑制作用提高黑色素瘤患者的生存率。 4 结论和展望 IL-32作为IL家族一员，在与NK细胞、T细胞、上皮细胞及成纤维细胞等相互作用中，激活了NF-κB、p38 MAPK、caspase-1和caspase-3等信号通路，可调控TNF-α、IL-1β、IL-6等多种细胞因子水平，建立起复杂的相互作用网络，影响炎症相关疾病和肿瘤的发生发展。研究发现，虽然IL-32在多种炎症相关疾病和肿瘤中表达量明显上升，但发挥的功能作用有差异甚至相互矛盾。如其在骨关节炎中促进关节骨和软骨的吸收和破坏；在克罗恩病等炎症性肠病中激活NF-κB 通路，促炎因子IL-1β、IL-6水平上升，加重消化道炎性损伤；但IL-32β在人工诱导的关节炎小鼠炎症关节中能抑制炎症相关通路激活与炎性因子产生，减轻CA和LPS诱导的关节炎症反应。IL-32θ还可抑制PKCδ介导的PU.1磷酸化，阻止下游促炎因子IL-1β的转录和表达，间接发挥抑炎作用。 炎症与癌症息息相关。在胃癌组织中，IL-32高表达可使癌组织体积增大、浸润加深、淋巴结与血行转移率升高、5年生存率降低；在体外试验中，通过促使胃癌细胞长梭状变，可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路，促进IL-8、VEGF、MMP2和MMP9等细胞因子表达，协同IL-17作用，提高了胃癌细胞的生长、侵袭和迁移能力。肺癌组织中高表达的IL-32激活NF-κB通路，诱导MMP2和MMP9表达，促进肺腺癌进展。但也有研究显示，IL-32γ通过NF-κB途径抑制肺癌细胞中DNA甲基转移酶1与MMP3组织抑制剂的结合，抑制该酶组织抑制剂启动子甲基化，提高其组织含量，间接发挥抑癌作用。此外，IL-32对肝癌具有促进作用，对黑色素细胞瘤则具有抑制作用。 近期已在多种炎症相关疾病和肿瘤中检测到IL-32含量的动态变化，并有大量实验结果显示，这些动态变化在多种炎症相关疾病和肿瘤的启动、促进、恶化和转移中起关键作用，这为临床重新评价这些疾病的分子机制提供了更广阔的新视角。本文总结了IL-32与多种炎症和肿瘤相关疾病的最新研究进展，旨在从IL-32含量的动态变化的角度探讨炎症与恶性肿瘤的发病分子机制，以期通过整合现有证据，加深对IL-32在多种炎症相关疾病和肿瘤中发挥作用的机制认识。目前的研究对IL-32的作用机制和信号通路的研究深度、广度均显不足，很难具体定性IL-32在疾病中发挥的作用，对IL-32作用的认识不足，严重限制了以预防、诊断、治疗为目的进行人为检测、干预和利用的空间。有待进一步展开针对IL-32特定亚型在对某类疾病或某种信号通路中的作用等高关联度的系统研究。进一步探索IL-32在各类疾病中的作用，对发掘其为疾病诊断、预后标志物及治疗性药物等临床亟需生物制品造福于患者具有重要价值。 作者 邓业丽1  何浩1  张俊玲2, 3, 4, 5  王明丽2, 3, 4, 5 1安徽医科大学第二临床医学院，合肥 230032；2安徽医科大学中央与地方共建生物医学工程实验室，合肥 230032；3芜湖天明生物技术有限公司研发部，芜湖 241000；4安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032；5安徽医科大学临床医学院，合肥 230032 通信作者：王明丽， Email：1952987441@qq.com 引用本文：邓业丽, 何浩, 张俊玲, 等. IL-32在炎症和肿瘤中的作用及其机制研究新进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 252-259.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231013-00014 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

１. 为什么我们需要分子胶？分子胶有望成为细胞生物学和药物发现中不可成药靶标的突破性策略。传统上，小分子药物已成功用于调节酶的活性，由于它们的具有功能明确的结合口袋，能够结合细胞中的代谢物、配体和其他小分子。最适合药物化的蛋白质家族实际上是激酶和蛋白质受体，例如 GPCR 或核受体。然而，据估计，只有 10% 的编码基因组可通过传统小分子抑制剂进行药物化。其余 90% 包括参与蛋白质复合物或 DNA/RNA 结合的蛋白质，由于其功能，这些蛋白质往往具有平坦或突出的表面，并且已适应与其他蛋白质或核酸相互作用，但不与小分子相互作用。此外，转录因子和其他支架蛋白本质上往往是无序的，仅在蛋白质辅助因子存在的情况下折叠，因此通常无法与小分子结合。从概念上讲，PROTAC 通过结合并降解蛋白质作为治疗策略，增加了可药物靶点的数量，将非酶蛋白质包括在内。然而，PROTAC 却需要两个小分子配体，一个识别 E3 连接酶上的口袋，另一个结合感兴趣的靶标，因此，它们仍然需要靶标包含药物结合口袋。相反，分子胶很好地利用了不可成药的空间，通过创建或填充仅当两种蛋白质在胶水分子存在下结合时才出现的口袋。这为传统上不可成药的靶标的不同类型的调节提供了机会，例如，通过将靶标粘合到不同类型的效应蛋白上。分子胶的合理设计主要采用两种方法：即筛选以招募非天然效应物或增加对已知相互作用物的亲和力。IMiD 专注于蛋白质降解，通过招募转录因子作为 CRBN E3 连接酶的新底物，使药物转录因子成为可能；indisulam通过招募RNA 结合蛋白RBM39 降解为 DCAF15 E3 连接酶复合物，使药物成为可能。为了增加与天然 E3 连接酶的亲和力，Nurix 分子胶经过合理设计，可将 β-TrCP 募集到其天然底物 β-catenin（一种转录因子）上，且β-catenin的降解决定因子不存在磷酸化，正常情况下磷酸化后 E3 亲和力更高。在这种情况下，分子胶位于因β-catenin上缺乏磷酸基团而释放的口袋中，并且它重建了与β-TrCP的高亲和力表面。CypA 作为环孢菌素与钙调神经磷酸酶粘合以抑制其活性的效应蛋白而闻名 30 多年；然而，直到最近，CypA 才作为一种效应蛋白出现，可以更广泛地用于设计分子胶抑制剂，用于传统上难以药物治疗的靶点，例如 KRAS，作者应用结构引导设计来开发一种针对活性药物的分子胶。KRAS 的状态；这种分子胶将CYPA招募到 KRAS 上，阻断其他致癌相互作用，从而抑制 KRAS 驱动的细胞增殖。同样，分子胶被开发出来将 CRAF 粘合到其天然抑制蛋白14-3-3上。分子胶会锁定 CRAF/14-3-3 复合物，即使没有 CRAF 磷酸化（使复合物与 14-3-3 稳定在抑制性构象中所必需的）。下面，我们描述了一系列检测方法，这些检测方法将促进利用这些功能相互作用的分子胶的开发。分子胶可以彻底改变我们调节疾病相关蛋白质的能力，但它们的合理开发需要一个新颖的平台，其中的筛选方法和化学设计是重点，就像经典药物开发的情况一样。主要包括几种无细胞和细胞筛选方法，这些方法侧重于检测作为分子胶的小分子。２. 基于生化技术的分子胶筛选分子胶可使用一系列生化方法进行了鉴定，这些方法用于直接或间接监测蛋白质的接近或结合。通常，这些方法需要事先了解靶标和潜在效应蛋白。２.1 DEL胶筛选DNA 编码库 (DEL) 筛选是一种亲和力选择过程，可以筛选潜在的数万亿种化合物。每种化合物都单独标记有独特的 DNA 序列，然后可以对其进行扩增并用作化合物识别条形码。通常，使用拆分和库合成方法对库进行编码。简而言之，起始结构单元被标记有DNA序列，并且在添加第二个结构单元之后，DNA标签被延伸。通常，最多可以组装三个或四个结构单元的化合物，每一步都会产生数千个不同标记结构单元的混合物，从而形成巨大的 DNA 编码文库。DEL 筛选使用高蛋白质浓度（通常在 μM 范围内）来驱动配体结合复合物形成的平衡，读数与目标配体复合物的丰度相关。DEL 筛选（图1 A）已用于鉴定目标 BRD9 与 E3 连接酶 VHL 的分子胶。在这种方法中，BRD9 蛋白被固定，并使用 2 种不同的实验方法来鉴定潜在的小分子胶。将文库与固定化 BRD9 预孵育（允许形成二元复合物），或者将文库首先添加到 VHL，然后添加到固定化 BRD9（允许形成三元复合物）。为了控制非特异性结合，在不存在BRD9 的情况下将文库添加到固定基质中。洗涤 3 次后，蛋白质变性以释放结合物，并且 DNA 条形码经过 PCR 扩增和测序以鉴定结合化合物。为了计算富集，将二元结合的计数除以对照，将三元结合的计数除以二元结合，得到三元富集与二元富集的比率。较高的呈递物比率表明化合物与 BRD9 的结合更依赖于 VHL 的存在，这意味着更高程度的协同作用。该呈递物比率用于选择在与 BRD9 和 VHL 结合的三元复合物中具有不同程度协同性的小分子。筛选结果产生了一系列不同的结合行为，这取决于 VHL 配体和三嗪、BRD9 靶向核心之间的连接体的性质。然而，所有已识别的富集连接子本质上都相对较短且可循环。图１ .生化筛选技术被用来筛选分子胶。(A) DNA 编码文库涉及筛选带有独特 DNA 识别条形码标记的化合物，以找到促进相互作用的化合物。(B) 在束缚片段筛选中，将具有暴露的半胱氨酸残基的效应蛋白与目标肽和含有二硫键的片段文库一起孵育。对蛋白质具有固有亲和力的片段将与半胱氨酸紧密结合，并在检测中（通常通过 MS 或 FA）进行富集。(C) 在 TR-FRET 中，靶蛋白用供体荧光团标记，效应蛋白用受体荧光团标记。相互作用伙伴的紧密接近导致从供体荧光团到受体荧光团的 FRET。(D) AlphaScreen 是一种基于珠子的方法，依赖于两种感兴趣的蛋白质与特定珠子的结合。相互作用伙伴的紧密接近导致能量从一个珠子转移到另一个珠子并产生化学发光信号。(E) 在 E3 驱动的微阵列中，靶蛋白被固定到表面，并在存在和不存在假定的胶分子的情况下引入一系列效应器结合配偶体以测试任何相互作用。２.２ 束缚片段筛选(tethered fragment screen)束缚依赖于片段和目标蛋白质之间可逆共价键的形成。如果靶蛋白在靶位点附近含有半胱氨酸残基，则可以直接使用，或者可以使用定点诱变在方便的位置引入半胱氨酸残基。然后在部分还原条件下将蛋白质与含有二硫键的片段文库一起孵育。对蛋白质具有固有亲和力的片段将靠近半胱氨酸结合，并且相对于非结合片段，硫醇-二硫化物平衡将有利于这些片段。因此，结合片段被蛋白质有效地选择并在检测中被富集。２.３ 质谱检测先前已经表明，靠近可配体口袋的天然或工程半胱氨酸残基可用于促进稳定蛋白质-蛋白质相互作用的化合物的发现。这种二硫化物束缚方法已用于识别稳定 14−3−3 和 ERα 之间相互作用的化合物。此处，在存在或不存在ERα磷酸肽的情况下，将含有半胱氨酸的同种型 14−3−3 与含有二硫键的片段文库一起孵育。然后通过完整蛋白质质谱 (MS) 对蛋白质片段缀合物进行表征。２.４ 荧光各向异性(Fluorescence anisotropy，FA) 检测在束缚方法的一种形式，使用雌激素相关受体 γ 的 DNA 结合域 (ERRγ DBD) 的 14−3−3 结合基序中发现的天然半胱氨酸残基来构建可用于 FA 筛选的磷酸肽探针方法。ERRγ-磷酸肽用荧光探针标记，通过 FA 的增加来监测片段诱导的磷酸肽与 14−3−3 的结合，图1 B。在该筛选方法中，荧光标记的含半胱氨酸的肽是最初与 14−3−3 的结合较弱，由低 FA 出发（低各向异性）证明。观察到的各向异性的增加证明了在还原条件下与二硫化物文库孵育后通过化合物结合来稳定蛋白质-肽复合物（14-3-3 与标记肽的结合增加）。使用 FA（或荧光偏振）筛选包含 350, 000 个小分子的库。鉴定到了 NRX-1532，它们能够增加 β-TrCP 和突变 β-连环蛋白肽之间的结合亲和力。证明双磷酸化肽 (pSer33/pSer37) 与 β -TrCP 的结合亲和力为 2 nM，而非磷酸化肽 (Ser33/Ser37) 与 β -TrCP的结合亲和力明显较低 (>100 μM)。２.５ 时间分辨率荧光共振能量转移 (TR-FRET)基于 FRET 的方法的基本原理是供体和受体荧光团之间的能量转移。当这些部分彼此靠近时，入射光对供体的激发导致能量转移到受体。然后受体发射特定波长的荧光信号。因此，可以通过在每个伙伴上附加荧光标记并测量能量转移程度来监测分子之间的分子相互作用。Wang等人使用免疫调节药物 (IMiD) 衍生物 ALV-02–146–03 。在建立基于 TR-FRET 的 CRBN:Helios 二聚化测定之前，证明了与 CRBN 的参与。他们使用这种方法筛选了一个小型、集中的化合物库。经过几轮优化后的筛选导致了 ALV1 的设计，它已被证明可以诱导 Helios 的 CRBN 依赖性降解，图1 C。２.６ AlphaScreenAlphaScreen（ALPHA，放大发光邻近均质测定）是一种基于微珠的方法，用于研究微孔板形式中分子之间的相互作用。其原理依赖于将两种感兴趣的蛋白质结合到特定的珠子上。当两个分子之间发生相互作用时，这会导致两个珠子非常接近，在激光激发供体珠子时，使周围的氧气转化为更激发的单线态，然后扩散以与受体发生反应产生化学发光信号的珠子。该方法已用于测量 CDK12KD/CCNKΔC 和 DDB1 之间的相互作用。这里将生物素化的 FLAG-Avi-DDB1 构建体与 6HisCDK12KD/6HisCCNKDC（WT 或 G731 突变体）一起使用，从而可以证明存在改进的 AlphaScreen 信号/相互作用HQ461，表观 EC 50为 1.9 µM。AlphaScreen 测定还用于显示 THZ531 抑制 CDK12KD/CCNKΔC/DDB1 复合物的 HQ461 依赖性形成的竞争效应，图1 D。２.7 E3驱动的微阵列在诺华公司在未发表的通讯中描述的另一种方法中，1 个蛋白质微阵列用于筛选 VHL 和数千种蛋白质之间化合物诱导的相互作用，展示了一种 E3 连接酶驱动的目标不可知的分子胶发现方法。蛋白质微阵列是一种高通量方法，可用于并行监测许多蛋白质的相互作用。该方法由结合有捕获蛋白阵列的支持表面组成。随后，这允许在存在和不存在假定的胶分子的情况下引入结合配偶体，并监测相互作用，图1 E。发现几个小分子可以稳定 VHL 和 CDO1 之间的相互作用，CDO1 是一种参与调节的蛋白质。半胱氨酸代谢。这些化合物随后被证明可以促进 CDO1 的多泛素化和蛋白酶体降解。在使用微阵列的另一个例子中，人类蛋白质组微阵列被用来识别天然产物衍生的分子胶，用于靶向 E2F2 降解。３ 基于细胞的分子胶筛选方法从历史上看，分子胶的发现基本是是偶然发生的，而不是通过应用设计的策略。主要是通过基于活力/毒性的细胞筛选或基于报告分析的其他表型筛选来鉴定分子胶，并且它们作为分子胶的作用模式只是随后发现的。在过去几年中，为了寻找分子胶，出现了几种细胞方法。在下面描述总结这些方法（图 2）。图2 .基于细胞的筛选技术。已使用一系列方法来筛选分子胶引起的接近和降解。(A) 在 TR-FRET 中，裂解细胞并添加针对每个相互作用伙伴的特异性标记抗体。相互作用伙伴的紧密接近导致从供体荧光团到受体荧光团的 FRET。(B) 在 Nano-BRET 中，相互作用的伴侣被表达为与生物发光蛋白供体（例如荧光素酶）或荧光蛋白受体的融合蛋白。相互作用伙伴的接近导致从供体到受体的 BRET。(C) 在免疫共沉淀中，将结合伴侣和化合物添加到固定靶标中，然后对复合物进行免疫沉淀并通过 SDS-PAGE 进行分析。(D)在邻近连接测定中，POI表达为与混杂的生物素连接酶(例如BioID)的融合蛋白。添加生物素后，POI 附近的蛋白质被生物素化，随后在 MS 分析之前用链霉亲和素珠捕获。 (E) 酶片段互补依赖于用小标签（例如 HiBiT）标记 POI，该小标签可以与其互补亚基相互作用以形成纳米荧光素酶。POI 降解后，不会产生荧光素酶信号。(F) 在信号降解增益测定中，在 GFP 表达细胞中，POI 表达为与脱氧胞苷激酶(dCK) 的融合蛋白，将非天然核苷2-溴乙烯基脱氧尿苷 (BVdU) 转化为毒物。POI 降解后，细胞活力得以保留，并且可以测量GFP 。应当指出的是，免疫共沉淀和邻近连接是较低通量的筛选方法。3.1　活力/毒性测定活力测定测量细胞的代谢活动。例如，MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）−2,5-二苯基溴化四唑）测定基于代谢活跃的细胞将黄色四唑盐MTT 还原为紫色甲臜。甲臜的吸光度可以在酶标仪中测量。相反，细胞毒性测定测量由于细胞死亡而发生的膜完整性的变化。这种名为 Cell tox green 的检测方法使用一种染料，该染料被排除在活细胞之外，但优先对死细胞的 DNA 进行染色。当染料与 DNA 结合时，其荧光特性显着增强。活细胞的荧光没有明显增加。因此，染料与死细胞 DNA 结合产生的荧光信号与细胞毒性成正比。Indisulam最初是通过 MTT 活力测定发现的一种抗肿瘤药物。其作为 DCAF15 和 RBM39 胶合剂的作用机制于 2017 年才被确立。他们生成了具有Indisulam耐受性的 HCT116 克隆，并通过外显子组测序鉴定了错义突变。RBM39基因在3个克隆中发生突变。用 WT 或突变 RBM39 瞬时转染 HCT-116 细胞，然后用 indisulam 处理，结果表明 RBM39 突变赋予对 indisulam 抗性。蛋白质印迹分析显示，胰岛素中毒需要 RBM39 降解。从用 indisulam 处理的 CRISPR 工程 RBM39–3xFLAG HCT116 细胞裂解物中纯化抗 FLAG，然后进行胰蛋白酶消化和 MS 分析，结果显示 DCAF15 是招募伙伴。Stabicki等人使用了一种不同的方法。发现另一种Cyclin K 分子胶 CR8 。他们挖掘数据库，将临床和临床前小分子的细胞毒性与数百种人类癌细胞系中 E3 连接酶成分的 mRNA 表达水平关联起来。然后，通过对已识别的 E3 连接酶成分进行 CRISPR 介导的失活来验证这种依赖性，并检查这是否可以挽救相应的药物引起的毒性。他们确定了 CR8 毒性与 DDB1 mRNA 水平之间的相关性。运用定量蛋白质组 MS 来检查用 CR8 处理细胞后的蛋白质丰度，发现 Cyclin K 是唯一受影响的蛋白质。Cyclin K 的降解可以通过抑制蛋白酶体、 neddylation 或 E1 泛素激活酶来挽救。然后，他们进行了以 E3 泛素连接酶为重点的 CRISPR-Cas9 抗性筛选，并确定了 DDB1、CUL4B、RBX1、NEDD8、NAE1 和 UBA3 为涉及的关键蛋白。GSPT1/2 降解剂是通过使用细胞活力测定 CellTiter-Glo在五种患者来源的细胞系中筛选沙利度胺衍生物的重点文库来鉴定的。他们鉴定了几种有效的靶标（EC50 < 1 µM），其中一些在所有五种细胞系中均具有活性，而另一些则表现出选择性，暗示了不同的作用机制。他们通过在高浓度来那度胺存在下进行配体竞争实验以及在 CRBN 敲除细胞中进行细胞活力测定，证实了 CRBN 依赖性作用机制。他们通过对一些命中的免疫印迹显示新底物 GSPT1 的降解，但在与抗增殖效力相关的 Caspase-Glo 测定中诱导细胞凋亡，而不是 IKZF1。基于多重 MS 的蛋白质组学分析表明，化合物 6 (SJ6986) 在对 MV4-11 细胞（一种急性白血病细胞系）进行处理后，选择性降低了约 9000 种蛋白质中 GSPT1 和 GSPT2 的丰度。这是第一个报道具有生物利用度的 GSPT1 降解剂。3.2　报告基因检测报告基因测定通过将报告基因与感兴趣的转录因子的调控序列连接来测量基因表达，该报告基因的产物可以很容易地检测和定量。然后报告基因充当转录因子活性的替代物。常见的报告基因包括β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶和GFP（绿色荧光蛋白）。吸光度、荧光或发光检测方法通常用于测量表达的报告基因蛋白图2 E。在 A549 细胞中使用报告基因测定，HQ461 被鉴定为来自 NRF2 高通量筛选的命中结果。对 A549-HQ461 抗性细胞进行的全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选表明，HQ461 毒性需要 DDB1、RBX1 和泛素蛋白酶体降解系统的其他调节因子。按照之前针对 indisulam 发表的相同策略，他们生成了 HQ461 抗性 HCT116 克隆，并通过全外显子组测序鉴定了 CDK12 中的错义突变。用WT或突变CDK12瞬时转染HCT-116细胞，然后用HQ461处理表明CDK12突变赋予对HQ461的抗性。Western Blot 研究表明，HQ461 会诱导 Cyclin K 降解，并且在存在蛋白酶体或 neddylation 抑制剂的情况下可以抑制这种降解。3.3　TR-FRET 检测虽然 TR-FRET 测定主要用于筛选 PPI 抑制剂，但它们已成功用于分子胶的发现，图2 A.Tang等人发表了一种细胞裂解物 TR-FRET 测定法来筛选 SMAD4-SMAD3 相互作用的调节剂。通过使用细胞裂解物，他们避免了对纯化蛋白质成分的需要。2022 年，开发了一种内源性细胞 TR-FRET 测定法，测量靶标参与和降解，以分析 BRD4 的 PROTAC。它依赖于使用 BRD4 抗体、标记的抗物种纳米抗体作为供体，荧光标记的 BRD4 抑制剂 JQ1 示踪剂作为受体。该测定使用未修饰的细胞系，并且可以部署到其他感兴趣的蛋白质，这些蛋白质具有特定的抗体，并且可以识别示踪剂，甚至非特异性的示踪剂。3.4　NanoBRET 检测NanoBRET（纳米荧光素酶生物发光共振能量转移）是一种用于测量活细胞中的结合事件、信号传导途径或受体运输的检测技术。在 BRET 中，能量转移发生在荧光素酶供体和荧光团受体之间，图2 B。2023 年，研究人员使用 NanoBRET CRBN 占用测定来研究基于 CRBN 的降解剂的药理学。该测定测量活细胞中荧光 CRBN 示踪剂从 NanoLuc 标记的 CRBN 中置换后 BRET 信号的剂量依赖性减少。他们筛选了 14 种沙利度胺衍生物来建立构效关系。他们特别关注两种新底物：IKZF1（一种转录因子）和 GSPT1（一种翻译终止因子）。他们还对两种蛋白质进行了降解测定，以量化每种化合物所实现的降解。他们的数据为设计没有 GSPT1 活性的降解剂提供了方向，从而避免了广泛的细胞毒性。3.5　蛋白质降解：酶片段互补 (EFC) 测定EFC 基于两种重组 β-半乳糖苷酶 (β-gal) 酶片段，它们充当酶受体 (EA) 和酶供体 (ED)。单独地，这些片段是无活性的，但当组合时，它们形成一种活性β-半乳糖酶，水解其底物以产生化学发光信号。这些检测方法是 DiscoverX 几年前开发的，具有多种应用，其中之一是 PathHunter 降解检测方法，图2 E。在这种情况下，目标蛋白用小肽片段标记，而大 β-gal 片段则用小肽片段标记。包含在孵育时间结束时添加到裂解缓冲液中的检测试剂中。Bonazzi等人使用PathHunter发现了一种促进锌指转录因子 IKZF2降解的分子胶。锌指转录因子是具有挑战性的靶标，因为它们基本上是非结构化的并且没有配体结合位点。然而，密切相关的 TF（IKZF1 和 IKZF3）已成为 IMiD 的目标，IMiD 与 CRBN E3 连接酶结合，然后招募 IKZF1/3，诱导降解。基于这些理论，使用 IKZF1 分子胶降解剂泊马度胺作为 SAR 的起点。泊马度胺结合的 CRBN 与 IKZF1 锌指 2 中的甘氨酸 β-发夹结合。IKZF1 和 IKZF2 的锌指 β-发夹有一个氨基酸不同，这介导了泊马度胺对 IKZF1 的选择性。因此，作者旨在找到一种可以容纳IKZF2 锌指 2 中组氨酸的化合物。他们使用 PathHunter 细胞降解测定法对 ProLabel 标记的 IKZF2 或 IKZF1 进行 SAR，以鉴定促进 IKZF2 而不是 IKZF1 降解的化合物。使用 CRBN 敲除细胞系证实降解依赖于 CRBN，并报告化合物 DKY709 作为 IKZF2 的选择性分子胶降解剂。NanoBiT 和 HiBiT 系统是酶片段互补技术的其他示例，该技术依赖于用酶的小亚基标记感兴趣的蛋白质 (POI)，该酶的小亚基可以与其互补亚基相互作用形成发光复合物，图2 E与 PathHunter 类似，NanoBiT 和 HiBiT 系统的区别在于用于创建 POI 融合的小肽标签，通常只有 11 个氨基酸。较小尺寸的肽标签很有吸引力，因为它适合内源蛋白的 CRISPR-Cas9 基因组编辑，而且因为它不太可能干扰细胞内 POI 的正常生物功能。该方法首先是使用工程荧光素酶 NanoLuc 开发的，这是一种源自深海发光虾的 19 kDa 酶。NanoBiT 报告系统使用 11 个氨基酸肽 (SmBiT) 和 18 kDa多肽(LgBiT)，每个都与目标蛋白融合。两个亚基弱关联（Kd > 100 µM），因此它们的互补由靶蛋白的相互作用决定。该小组后来开发了 HiBiT 报告系统，该系统利用高亲和力（LgBiT Kd = 700 pM）11 氨基酸肽标签实现发光定量。在此系统中，HiBiT 标记的 POI 可以在细胞裂解并添加 LgBiT 和 NanoLuc 底物 Furimazine 后进行定量。研究小组表明，发光信号与细胞中的蛋白质水平呈线性相关，并且可以在低至 1 amol 的浓度下检测到该信号，相当于每个细胞约 10 个分子。HiBiT 技术已用于分子胶发现。例如 ，使用 HiBiT-BRD4 降解剂测定来鉴定在用分子胶化合物“1a”处理后参与 BRD4 降解的连接酶。他们使用泛素蛋白酶体系统中包含 1158 个基因的 CRISPR/Cas9 敲除文库，发现沉默 DCAF-16（Cul4 连接酶复合物的底物识别成分），在用 1a 处理后可以挽救 BRD4-HiBiT 信号。3.6　蛋白质降解：信号分析增益通过信号减少来测量活性的降解测定的一个局限性是筛选输出被诱导细胞毒性的化合物污染。2021 年，Koduri等人设计了信号增益测定来寻找 IKZF1 的降解剂。他们在 293 细胞中将脱氧胞苷激酶(dCK)的修饰（一种将非天然核苷2-溴乙烯基脱氧尿苷 (BVdU) 转化为毒物的酶）与 IKZF1 融合（图2 F）。因此，蛋白质降解可防止形成毒素并给出抗性的正选择读数。在 BvdU 存在的情况下，对文献中先前未表征的 IMiD 类分子进行化学筛选，结果将 MI-2-61 和 MI-2-197 鉴定为分子胶降解剂。3 MAPPIT哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱捕获（MAPPIT，mammalian protein-protein interaction trap）是一种基于 JAK-STAT 信号转导途径的用于研究 PPI 的二杂交系统。诱饵蛋白和靶蛋白（感兴趣的靶标和选择的效应蛋白）与缺陷的细胞因子受体嵌合体相关。当特定诱饵和靶蛋白嵌合体之间发生 PPI 时，活性会恢复，JAK-STAT 信号传导导致报告基因表达受 STAT3 响应启动子控制。该系统已扩展到包括各种适应，例如用于识别 PPI 调节剂的反向 MAPPIT、用于分析化合物和蛋白质之间相互作用的 MASPIT（哺乳动物小分子-蛋白质相互作用陷阱） 、用于高通量的阵列 MAPPIT阵列蛋白质的筛选。Petschnigg等人开发了一种类似的方法，称为 MaMTH，用于哺乳动物膜双杂交测定。在此测定中，膜诱饵蛋白标记有泛素的 C 端一半 (Cub) 和嵌合转录因子 (TF)，而胞质或膜结合的靶蛋白则标记有泛素的 N 端一半 (Nub) 。诱饵和猎物相互作用后，形成假泛素，该假泛素被胞质去泛素化酶识别，导致 TF 裂解并表达荧光素酶报告基因。4. Tango 和 split TEV 检测另一种有前途的方法是使用分离 TEV 或 Tango 检测。2006 年，有人开发了 Split-TEV 技术来监测哺乳动物细胞中的 PPI。该方法基于功能性 TEV 蛋白酶片段互补和随后的报告蛋白水解激活，因此结合了裂解酶和报告基因介导的检测的优点。他们证明这种方法可用于研究受体二聚化、受体信号传导、诱导型胞质 PPI 或受体酪氨酸激酶(RTK) 激活。他们还表明，当分子胶雷帕霉素诱导时，split-TEV 技术可用于测量细胞质中 FKBP 和 FRB 的相互作用。他们使用了“仅蛋白水解”分裂 TEV 报告基因测定，其中 FKBP 和 FRB 的相互作用导致 TEV 活性，导致荧光素酶的释放，该酶可以翻转荧光素以产生光。在该测定中，雷帕霉素浓度的增加导致发光单位的增加。2008年修改了Split-TEV方法，研究了三类受体，即G蛋白偶联受体、RTK和类固醇激素受体，并将其称为Tango。他们发现细胞内受调节的定位足以区分游离的和相关的 TEV 和转录因子融合伴侣，因此不需要裂解 TEV蛋白酶。因此，在他们的检测中，转录因子通过含有特定病毒蛋白酶 TEV 切割位点的接头与膜受体结合。受体的激活会招募与蛋白酶融合的信号蛋白，两个伙伴之间的相互作用导致转录因子的裂解和释放，该转录因子易位到细胞核，在那里激活荧光素酶报告基因。5. 分子胶表征的较低通量测定下面我们描述两种方法，更传统的 IP 和最近的邻近标记技术，可用于细胞中分子胶相互作用的低通量表征。5.1 IP 或亲和纯化分析在免疫共沉淀 (co-IP) 测定中，目标蛋白与固定在支持物上的特异性抗体结合。添加感兴趣的小分子后，对目标蛋白进行免疫沉淀，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和蛋白质印迹分析检测免疫沉淀蛋白及其结合配偶体的存在，图2 C如果小分子促进两种蛋白质之间的相互作用，则会检测到 co-IP 信号的增加，并表明该化合物作为潜在的分子胶成功稳定了蛋白质-蛋白质相互作用。沙利度胺是第一种分子胶，最初由 CIBA 于 1952 年发现，随后由格伦泰化学公司于 1957 年作为镇静剂开发，现在因其抗炎和抗肿瘤特性而被使用，直到 2010 年才被验证为分子胶。研究人员使用沙利度胺磁珠对细胞裂解物进行亲和纯化，并鉴定出与沙利度胺相互作用的 CRBN 和 DDB1as 蛋白。使用纯化的蛋白质，他们表明沙利度胺与 CRBN 结合，并由于其与 CRBN 的相互作用而与 DDB1 间接相互作用。2014 年，多个研究小组表明，沙利度胺类似物来那度胺可增加 CRBN 泛素化和降解 IKAROS 蛋白家族成员的活性。沙利度胺与 CRBN-DDB1 复合物的晶体结构确定了其作为分子胶的作用。5.2 .邻近连接分析BioID（邻近依赖性生物素识别）是一种依赖于大肠杆菌生物素连接酶 BirA的邻近标记方法，该酶在 R118G 处发生突变。POI在细胞中以BioID融合蛋白的形式表达，添加生物素后，会释放生物素酰-5'AMP，导致10 nm距离内蛋白质赖氨酸残基的混杂生物素化。然后用链霉亲和素包被的珠子沉淀蛋白质，并使用 MS 进行分析，图2 D。然而，BioID 的标记动力学很慢，因此需要足够的时间进行生物素标记（18-24 小时）。这限制了其在研究瞬态、短期 PPI 方面的应用。由此，设计了两种高效、混杂的 BirA 突变体，称为 TurboID 和较小的 miniTurbo，只需 10 分钟即可实现邻近标记。然而，TurboID 和 miniTurbo 都在哺乳动物细胞中表现出毒性。AirID（用于邻近依赖性生物素识别的前体 BirA）是另一种用于邻近标记的酶，由于其毒性降低，因此比 TurboID 有优势，但它需要更长的标记孵育时间。UltraID 是邻近连接酶库的最新成员；它的分子量为 19.7 kDa，是迄今为止设计的最小的酶，并且表现出高效的生物素化，而没有使用 TurboID 观察到的高水平背景标记。邻近连接测定已用于分子胶的研究。使用 AirID-CRBN 融合物，并检测到在用已知的分子胶泊马度胺处理后，SALL4 和 IKZF1 的生物素化有所增加。5. 结论和未来展望生化方法可能非常适合邻近诱导分子胶的识别和表征，并且预计它们在分子胶的合理筛选中的使用会增加。然而，由于其不同的作用机制和细胞系统内潜在复杂的相互作用，下游优化和验证仍然具有挑战性，这将需要结合下面将简要提到的方法。我们这里描述了一系列可用于创建先进的生化和细胞测定的技术，以系统筛选和验证潜在的分子胶。然而，需要仔细考虑这些测定的构建，以确保在测定中可以充分测量和控制蛋白质-蛋白质复合物浓度变化的检测（图3）。图3. 筛选考虑因素和未来机会。总结了筛选分子胶时的一些注意事项，以及未来可用于分子胶筛选的一些筛选技术的示例。(A) 在 MAPPIT 中，诱饵和猎物蛋白与缺陷的细胞因子受体嵌合体相关。当分子胶诱导诱饵和猎物接近时，嵌合体活性恢复，JAK-STAT 通路被激活，导致报告基因表达。(B) 在天然 MS 中，靶蛋白可以与各种效应蛋白和推定的胶一起孵育，并且可以使用 MS 直接测量未结合的蛋白质和/或所得复合物。(C) 在 Split-TEV 报告系统中，每个相互作用伙伴都用 N 端 TEV 或 C 端 TEV 标记，在分子胶诱导相互作用伙伴接近时，TEV 活性导致荧光素酶释放，在底物的存在。(D) 二聚化考虑因素。在旨在识别诱导二聚化的分子胶的 FRET 测定中，需要考虑可能有助于信号的复合物。在此示例中，不同批次的蛋白质分别用供体和受体标记，只有 50% 的胶诱导复合物会产生信号。(E) 信号窗口（背景信号和最大信号之间的差异）取决于相互作用蛋白的浓度、靶标和效应器之间的亲和力 (KTE)、胶水和效应器之间的亲和力 (KEG) 以及协同因子 α 。高通量筛选平台随后提供了一种从大型化合物库中识别潜在分子胶的有效方法。无论选择哪种方法，都应设计测定方法来测量测试化合物对感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作用的影响。在初步筛选中鉴定活性物质后，应采用正交方法，例如表面等离子共振(SPR)，以定量评估化合物引起的 PPI 变化。当然，增强 HTS 活性物质和那些正交验证的命中的相关性需要基于细胞的测定来评估细胞环境中的分子胶活性。与传统药物发现一样，结构信息对于理解分子胶调节 PPI 的分子机制至关重要。在可以表达和纯化蛋白质的地方，应利用 X 射线晶体学或冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 来探索如何填充口袋以提高亲和性或协同性和选择性。此外，核磁共振（NMR）光谱可用于阐明潜在分子胶与其结合伴侣的结合模式。除了考虑筛选方法和要粘合的蛋白质试剂之外，决定在生化测定中筛选哪些文库也同样重要。这应该与分子胶通常的运作机制有着复杂的联系。总之，与 PROTAC 相比具有更多药物特性的小分子可以有效诱导蛋白质接近并调节靶蛋白功能和浓度，这一发现为集中精力合理设计和发现提供了动力。我们正处于进入分子胶药物发现领域的激动人心的阶段，幸运的是，现在可以将分析方法、生物物理和结构研究以及人工智能驱动的机器学习方法方面的技术进步结合起来，以帮助更好地理解促进新的和增强的蛋白质-蛋白质相互作用的小分子的分子特性。我们可能正在见证药物发现的一场革命，这可能会带来广泛的新的靶向治疗机会。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓