STK38

共价探针与化学蛋白质组学相结合是研究小分子和蛋白质相互作用的有力方法。然而，在各种配体中创建反应性弹头以形成共价探针的过程通常较为困难，缺乏简便高效的构建共价探针的方法，此外，当前被报道的反应性弹头大多以靶向半胱氨酸残基为主，因此，需要开发新型的亲电试剂并开发一种方便有效的方法将这种潜在的亲电试剂引入配体，特别是可以高效用于后期蛋白质组学分析，并发掘激酶活性口袋内潜在的可共价修饰的氨基酸位点，希望为开发系列新型共价抑制剂提供重要基础。近日，暨南大学药学院李正球研究员、丁克教授、谭毅副研究员等作为共同通讯作者在Nature子刊Communications Chemistry上发表了题为：“Catalyst-free late-stage functionalization to assemble α-acyloxyenamide electrophiles for selectively profiling conserved lysine residues”的文章。作者发展了一个简捷高效的一步偶联反应，该反应可以在无任何催化剂的情况下将生物活性分子中的羧酸基团转变为高活性亲电基团--α-酰氧烯酰胺，可以帮助目标蛋白质的配体选择性标记。通过该方法合成了含有α-酰氧烯酰胺亲电基团的小分子探针、并成功嵌入针对EGFR L858R的激酶抑制剂erlotinib、广谱激酶抑制剂和天然产物当中，其中探针E3可以共价结合EGFR L858R突变体ATP结合口袋附近的赖氨酸残基K728，广谱激酶抑制剂探针可以结合一系列激酶的活性位点如CDK1、CDK2、CDK5的K33等，并且这种方法在天然产物中应用定量蛋白质组学技术同样成功鉴定了一系列重要赖氨酸残基。发现的可修饰保守赖氨酸残基将为构建新型靶向共价抑制剂（TCI）提供重要基础。近年来，靶向共价抑制剂（TCIs）因其显著的药物特性而受到广泛关注。与非共价抑制剂相比，靶向共价抑制剂具有更强的效力、出色的选择性和更长的作用持续时间。然而，这些抑制剂的反应活性通常仅限于α，β-不饱和酰胺，靶点仅为半胱氨酸残基。由于半胱氨酸残基及其突变的高反应性，患者在治疗过程中经常发生获得性耐药。此外，许多蛋白质结合口袋缺乏可靶向的半胱氨酸，因此有必要开发新的亲电试剂，这些亲电试剂可以靶向其他的亲核残基，如保守的赖氨酸和谷氨酸或天冬氨酸，并鉴定可配体的保守残基。共价化学与化学蛋白质组学相结合已成为原位条件下研究小分子-蛋白质相互作用的有力手段，它不仅可以识别结合口袋附近的可结合位点，还可以促进对天然蛋白质功能和小分子生物特性的理解。为了产生共价探针，通常需要将高度活化的亲电试剂如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、磺基四氟苯基（STP）酯等嵌入药效团，使周围的氨基酸残基在配体结合后被选择性标记。然而，在将亲电弹头结合到各种非共价配体的过程中通常会遇到困难，特别是复杂的天然产物。因此，非常需要开发一种方便有效的方法，用于在后期将潜在亲电试剂引入配体中。为了解决上述问题，作者在前期研究的基础上发展了一步偶联反应，在无任何催化剂的情况下将生物活性分子中的羧酸转变成潜在的亲电弹头-α-酰氧基烯酰胺，并将其引入共价抑制剂和天然产物。作者首先合成一系列小分子共价探针A1-A4，并采用pull-down/MS研究其在活细胞中的共价结合能力，结果表明A1可以共价标记多种癌细胞中的蛋白质，并且标记程度具有良好的浓度依赖性和时间依赖性，随后结合LC-MS/MS和pChem进行进一步分析，表明α-酰氧基烯酰胺弹头主要靶向赖氨酸残基，且A1可以共价结合MDA-MB-231活细胞中的蛋白激酶PFKAP的K688残基，NDKA的K12残基等，这些结果表明α-酰氧基烯酰胺是一种有效的可以共价修饰活细胞的蛋白质赖氨酸残基的亲电弹头。作者进一步评估了该弹头在共价激酶抑制剂中的应用。首先将该弹头引入EFGR L858R的非共价抑制剂erlotinib中合成一系列探针E1-E5，综合探针对EGFR激酶的抑制活性（IC50）的标记能力，E3具有较强的共价结合能力（IC50=8.283 nM），与母体erlotinib抑制活性水平相当，pull-down/WB结果显示E3具有更强的EGFR L858R共价标记能力。随后在erlotinib的竞争下进行靶蛋白鉴定，在erlotinib的存在下，E3对EGFR L858R的结合能力显著降低。进一步的LC-MS/MS实验也表明E3可以共价结合EGFR L858RATP结合口袋附近的K728，证明通过引入α-酰氧基烯酰胺亲电弹头可以将非共价抑制剂erlotinib转变为共价抑制剂并且可结合到新的赖氨酸位点，K728可能是开发新的靶向激酶抑制剂的赖氨酸残基。作者另外在广谱激酶抑制剂的基础上进行了验证，首先在广谱激酶抑制剂的母体化合物中不同部位引入α-酰氧基烯酰胺亲电弹头，形成新的共价探针X1-X4，随后在K562细胞中进行了标记验证，结果表明，探针X1-X4可以成功标记活细胞中的多种蛋白质，在较低浓度下可以观察到在～35kDa、～45kDa处探针有较明显的特异性标记，为了验证该特意标记的蛋白条带，作者进行了pull-down/LC-MS/MS实验进行鉴定，结果分析这两条特异性标记条带分别为激酶CDK1和MEK2，此外四个探针在10 µM浓度下共检测到了91个蛋白激酶，显示了探针对激酶的高标记能力，进一步采用pull-down/WB实验验证了探针对两种激酶共价标记，并且在洗涤一段时间后X1对激酶CDK1的标记能力仍旧没有减弱。作者进一步分析了探针用于分析全蛋白质组中激酶的保守赖氨酸残基的能力，结果表明四个探针共结合了不同激酶的64个赖氨酸残基，其中CDK1、CDK2、CDK5的K33、PAK2的K278、MKNK1的K78、MP2K2、MP2K1的K97、K101、NDKB的K12、AAPK1、AAPK2的K45和K56以及CSK21、CSK22、CSK23的K68（K69是ATP结合位点）。KPYM的K270是底物结合位点，发现一小部分已鉴定的位点（例如PGK1的K216或CDK1的K20）位于ATP结合口袋中，表明这些可能是共价修饰的位点并影响激酶功能。CDK1、CDK2、CDK5的K33、MEK2的K101、CHK2的K249、STK38的K118、MKNK1的K78突变为精氨酸后导致探针与相应激酶的标记谱降低，表明修饰主要发生在催化残基处。这些实验结果表明基于α-酰氧基酰胺的探针适用于分析整个蛋白质组中激酶的可结合保守赖氨酸残基。最后作者评估了α-酰氧基酰胺亲电弹头在天然产物中的应用。首先利用无催化的一步偶联反应和天然产物配体合成一系列的探针，随后进行了抗增值活性评估，结果显示含α-酰氧基酰胺的探针比含NHS的探针发挥出了更高的效力，也表明α-酰氧基酰胺的存在可以增强探针的抗癌效果。作者采用定量蛋白质组学进行了进一步的分析，结果表明，基于α-酰氧基酰胺的探针（Ar-2/3、BA-3、MA-2/3、UrA-2/3）比基于NHS的探针（Ar-1、BA-1、MA-1、UrA-1）产生更高的同位素比率，显示出对这些保守赖氨酸残基的优异标记能力。从这些探针中检测到不同的配体赖氨酸残基亚组，MA-3的修饰数量最高。用NHS-biotion的竞争性标记谱图显示Ar-2、MA-2、UrA-2、UrA-3剂量依赖性地阻断标记，证明这些探针确实与鸟氨酸转氨酶蛋白结合。MDA-MB-231活细胞中MA-1/3的结合位点图谱显示，两种探针均可成功识别已知靶标IMPDH2，标记位点K438是结合口袋中的相邻残基。这些结果再次证明，α-酰氧基酰胺亲电试剂可以应用于各种生物活性分子中，以分析已知或未知的靶标和相应的可配基保守赖氨酸残基，从而促进新的靶向共价抑制剂的开发。总之，本研究引入了一个简捷高效的一步偶联反应，在合成的后期将生物活性分子中的羧酸基团转化为高活性的亲电试剂α-酰氧基酰胺。这一过程与药效团中的各种功能基团兼容，从而具有广泛的应用。所得亲电试剂对蛋白质中的赖氨酸残基表现出显著的反应性。通过将这种强效亲电试剂整合到特异性激酶抑制剂厄洛替尼和广谱激酶抑制剂中，成功开发出能够共价结合目标蛋白的探针，鉴定了一系列不同激酶的可修饰保守的赖氨酸残基，为开发新的靶向共价抑制剂提供了有价值的线索。此外，这种方法的效用扩展到了天然产物中，它能够对未知靶标进行靶标分析和结合模式表征，并且可以作为NHS弹头的补充。研究含α-酰氧基酰胺探针与各种蛋白质靶标相互作用的能力为了解它们的生物活性开辟了新的途径。这些发现证明了生物活性分子中α-酰氧基酰胺亲电试剂在研究靶标结合和分析保守赖氨酸残基方面的多功能性和实用性。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

Researchers have shown that lysosomes, key organelles for maintaining cellular stability, can be repaired once damaged by a process termed microautophagy. They identified molecules called STK38 and GABARAPs as key regulators of this process. Depletion of microautophagy regulators lead to increased cellular senescence and a shorter lifespan, indicating the importance of this process. This study is highly significant for the achievement of healthy aging and points toward new therapies for age-related diseases. To age or not to age! How does aging affect organisms on a cellular level? What mechanisms help cells survive self-inflicted or external harm? It is known that lysosomes -- critically important cellular structures -- are crucial for digesting damaged cellular components and pathogens, and maintain stability within cells and tissues. But can they also be repaired, and if so, how? In a study published this month in EMBO Reports, researchers from Osaka University and Nara Medical University have shown that damaged lysosomes are repaired by a mechanism called "microautophagy" and have identified two key regulators of this process. Microautophagy is one of the three main types of autophagy in most higher organisms. It is a regulated process by which cellular components that have become dysfunctional or are no longer required are broken down. Although it is assumed to be involved in defense mechanisms collectively called lysosomal damage responses, the details remain unknown. Lysosomes frequently become damaged and lysosomal dysfunction has been linked to accelerated aging and a shortened lifespan. In this study, the researchers tried to understand the repair mechanisms. To identify a novel regulator of lysosomal damage response, they focused a signaling pathway called Hippo pathway which controls multiple processes such as cellular growth. They knocked down individual components of the Hippo pathway in the human cells, and then observed whether the cells could respond to induced lysosomal damage. This screening revealed that a protein called Serine-threonine kinase 38 (STK38) is essential for the lysosomal damage response. They then found that STK38 works with a protein complex called the "endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) machinery," which was already known to be linked to lysosomal repair. "STK38 recruits the protein 'vacuolar protein sorting 4' (VPS4) to damaged lysosomes and is crucial for disassembling the ESCRT machinery at the end of the repair process," explains lead author of the study Monami Ogura. They further found that lysosomal membrane repair by ESCRT machinery is mediated by microautophagy. They also identified that non-canonical lipidation of a subfamily of autophagy-related protein 8 (ATG8s) molecules -- the key autophagy proteins -- known as Gamma-aminobutyric acid receptor-associated proteins (GABARAPs) is required for this process. Lipidation, the process of modifying ATG8s with lipid extensions, is the main process involved in autophagy. In non-canonical lipidation ATG8s are lipidated into single-membrane endolysosomes, instead of double-membrane phagophore seen in canonical lipidation. The researchers showed that the GABARAPs are essential for the first step of the process of lysosomal repair. "We showed that non-canonical lipidation of ATG8s is crucial for the initial recruitment of the ESCRT machinery to damaged lysosomes and their subsequent repair," explains senior author Shuhei Nakamura. The team showed that depletion of the regulators of microautophagy increased the rate of senescent cells and shortened lifespan in C. elegans. Both STK38 and GABARAPs also have evolutionarily conserved roles, indicating the significance of this pathway in maintaining lysosomal integrity, healthy cellular function, and the prevention of cellular senescence and organismal aging. The detailed understanding provided by this study paves the way for increasing healthy aging and has great therapeutic value for the treatment of age-related diseases.