MCM2

引言 真核生物的基因组DNA包裹在染色质中，因此真核DNA复制发生在染色质环境下。染色质的基本结构单位是核小体，由147 bp DNA缠绕的组蛋白八聚体组成，组蛋白多种翻译后修饰是表观遗传信息的承载基础。DNA复制时染色质打开然后重新建立，使得DNA复制和染色质复制的偶联，在此过程中亲本染色质携带的表观遗传信息被分配到新合成的子链DNA，因此染色质重建也是表观遗传信息继承的基础，维持基因组和表观基因组稳定。染色质重建的起始步骤是DNA复制偶联的核小体组装，同时也是表观遗传信息继承的关键一环，其核心是DNA合成和核小体组装的偶联。 碱基配对形成了双螺旋结构的DNA，两条链的互补性决定了DNA是以半保留的方式进行复制。组成DNA的两条链是反向平行的，因此解螺旋的DNA的两条单链具有方向，一条是5’-3’，另一条链是3’-5’，但是DNA聚合酶都是5’-3’方向进行合成的，导致复制叉上两条链的合成方向相反。由此DNA复制的一条链是向复制叉前进的方向连续合成，称之为前导链，而另一条链的合成方向和复制叉前进的方向相反，先合成小片段DNA然后连接成完整的DNA分子，这个机制是冈崎夫妇发现的，所以这些短片段称之为冈崎片段，这条链称之为滞后链。滞后链冈崎片段合成先是Pol α合成带有一段RNA的DNA引物，然后发生聚合酶Pol α到 Pol δ的转换，Pol δ继续合成冈崎片段。其间Pol δ通过链置换反应入侵前一个冈崎片段，将含有RNA的保真度较低引物置换，形成单链翘起，进而招募Fen1等核酸酶进行切除被置换的单链DNA，产生的缺口被DNA连接酶（酵母中是Cdc9）连接，保障冈崎片段成熟，形成完整连续的滞后链DNA。伴随冈崎片段合成，核小体也会迅速组装，以免DNA暴露。前期Whitehouse和Smith的研究表明，真核生物的冈崎片段大小与核小体DNA和连接DNA的长度相当，且连接位置在核小体近中轴区，提出滞后链上核小体可以阻碍Pol δ的行进决定冈崎片段的长度【1, 2】。由于没有直接证据，核小体组装和冈崎片段成熟过程的协同机制尚不明确，李晴课题组发展了电镜核酸技术，对此机制进行了解析。 2024年8月9日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心李晴课题组在Science Advances发表题为DNA polymerase δ subunit Pol32 binds histone H3-H4 and couples nucleosome assembly with Okazaki fragment processing的研究论文，巧妙利用DNA连接酶降解体系，应用电镜核酸技术观察酵母细胞中DNA复制叉中间体结构，发现核小体中组蛋白和DNA的相互作用决定了链置换的位置，而且DNA聚合酶δ的Pol32亚基在C端有一个组蛋白H3-H4的结合区域，可以直接贡献于后随链上的核小体组装，揭示了后随链上DNA合成和核小体组装的协同机制。 研究者在芽殖酵母中利用AID（Auxin-induced degradation）系统诱导Cdc9在DNA复制早期快速降解，抑制冈崎片段末端的连接，进而在透射电镜下观察DNA复制中间体，发现在超过94%的复制叉上都含有翘起的DNA结构（flap structure），并且这个翘起结构主要集中在其中一条子链上，进一步的分析表明有翘起发生在滞后链 (图1)。通过测量翘起结构 (Flap) 的两个主要特征 (图2)：Flap本身的长度和相邻Flap的间距，研究者发现，1)在野生型背景下，Flap的长度集中分布在52 nt左右，其长度受到Pol δ的链置换活性和Fen1的核酸酶活性调控，而且Flap的长度分布具有13-15 nt的步长，可能是由核小体中周期性组蛋白和DNA相互作用障碍链置换合成造成的。2）相邻Flap的间距与冈崎片段长度相似，集中在190 bp左右。该间距的增大来自于DNA复制偶联的核小体组装突变，例如经典组蛋白分子伴侣CAF-1大亚基Cac1的缺失突变（cac1D）以及Mcm2结合组蛋白突变mcm2-3A，两个突变分别会导致新合成组蛋白的组装缺陷和旧组蛋白回收缺陷，这个间距增加到280bp左右，表明冈崎片段的合成受核小体组装程度调节。 图1：电镜核酸技术观察DNA连接酶降解后的复制叉结构。图示复制泡结构；左图是Cdc9降解后，右图是未降解对照。（Credit: Science Advances） 研究者在Pol δ亚基非催化亚基Pol32缺失突变中观察到flap间距变大，和上述提到核小体组装突变cac1D以及mcm2-3A的间距变化类似 (图2)。研究者进一步通过体内、体外分析直接证明了Pol32的C端可以直接结合组蛋白H3-H4，并通过ReIN-Map方法证明Pol32调节滞后链上的核小体组装。最近有两篇报道也分别揭示Pol32参与亲本组蛋白往后随链的递送，与我们的结论一致【3, 4】。 图2：翘起结构 (Flap)的两个特征：Flap的长度 (A)和相邻Flap的间距(B)（Credit: Science Advances） 综上，李晴课题组应用电镜核酸技术直接观察复制叉滞后链的分子事件，发现Pol32介导了核小体组装，进而提供了冈崎片段合成过程中链置换的终止位置，为冈崎片段成熟和核小体组装协同机制提供直接证据(图3)。 图3：Pol32介导核小体组装与冈崎片段成熟协同机制。(i)　Pol δ催化冈崎片段合成；(ii)　冈崎片段合成后，通过Pol32快速组装H3-H4四聚体到新合成的DNA上；(iii)　Pol δ侵入先前产生的具有新生核小体的冈崎片段；(iv)　冈崎片段合成的重复循环，形成反应核小体间距的flap间距；在Pol32缺失突变体中，核小体组装水平下降导致核小体屏障的减少，进而导致冈崎片段增长。（Credit: Science Advances） 参考文献 1. D. J. Smith, I. Whitehouse, Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatin assembly. Nature 483, 434-U480 (2012). 2. N. C. Koussa, D. J. Smith, Post-replicative nick translation occurs on the lagging strand during prolonged depletion of DNA ligase I in. G3-Genes Genom Genet 11 (2021). 3. C. Tian et al., DNA polymerase delta governs parental histone transfer to DNA replication lagging strand. Proc Natl Acad Sci U S A 121, e2400610121 (2024). 4. A. Serra-Cardona et al., The PCNA–Pol δ complex couples lagging strand DNA synthesis to parental histone transfer for epigenetic inheritance. Science Advances 10, eadn5175 (2024). http://doi.org/10.1126/sciadv.ado1739 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 细胞是如何实现在分裂后可以记住自己的“身份”的是一个重要的生物学问题，理解这一问题对我们认识正常发育、癌变或者衰老至关重要。由异染色质（heterochromatin）包裹的基因沉默（gene silencing）区域可以通过染色质介导的传承维持状态，这是细胞能维持一部分记忆的机制。近期研究发现，异染色质相关的亲本组蛋白修饰（H3K9me3）在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）可以通过DNA复制实现遗传且该遗传不依赖于诸如沉默子（silencer）或者RNA沉默（RNAi）等的核酸机制【1,2】。沉默相关的组蛋白修饰再通过组蛋白甲基化转移酶（Clr4/Suv39h）的“读写”（read-write）功能将其拷贝到新生成的核小体组蛋白上，以实现异染色质的表观遗传（epigenetic inheritance）。在这一科学模型中，DNA复制偶联的亲本组蛋白遗传就对异染色质的表观遗传有着重要的作用。 2024年8月1日，哈佛医学院、霍华德休斯医学研究院（HHMI） Danesh Moazed研究组和北京大学李晴研究组合作在Cell杂志发表了题为A replisome-associated histone H3-H4 tetramer chaperone required for epigenetic inheritance的研究论文。在本研究中，作者结合AlphaFold-Multimer结构预测、遗传、生化、生物物理和测序等手段发现DNA复制体（replisome）中介导DNA复制压力信号通路（replication checkpoint pathway）的组分Mrc1/CLASPIN存在一段和介导压力信号无关的且在真核生物中保守的组蛋白H3-H4四聚体结合区域（图一）。该区域在结构预测和物理性质上类似于核小体DNA、H2B与H2A结合H3-H4四聚体时的复合体，暗示Mrc1/CLASPIN演化出类似于核小体的性质在DNA复制期间对H3-H4四聚体进行保护以进行传承。作者通过AlphaFold-Multimer筛选（screen）发现在所有DNA复制体组分蛋白中，Mrc1/CLASPIN对H3-H4四聚体的结合获得了最高的预测分数（ipTM）。由于Mrc1/CLASPIN全长超过1000个氨基酸且基本无序（unstructured），遗传和生化手段难以研究其功能与机制，AlphaFold-Multimer作为了一种全新的手段能够帮助研究人员快速发现潜在生物大分子之间的相互作用以推进实验验证来发现新的生物学机制。 图一：AlphaFold-Multimer预测一段演化保守的Mrc1/CLASPIN区域结合组蛋白H3-H4四聚体(Credit: Cell) 为验证AlphaFold的结构预测，作者首先通过生物化学手段确认了AlphaFold-Multimer预测的H3-H4四聚体结合区域的特异性，并通过生物物理手段确认在体外体系中，单个Mrc1的组蛋白结合区域结合一个H3-H4四聚体。之后作者基于AlphaFold-Multimer能量最小化的结构预测，设计了一系列在Mrc1组蛋白结合区域的突变，并确认在体外体系中一组疏水区域和一对酸性氨基酸对Mrc1结合组蛋白是必要的。作者之后又在裂殖酵母（S. pombe）与芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分别确认了Mrc1的组蛋白结合区域的突变会导致异染色质沉默丢失。这两种酵母在4.2-3.3亿年前的演化期间已经发生分化，裂殖酵母中的异染色质是基于H3K9me3建立的，而芽殖酵母中的异染色质是由Sir2/Sir3/Sir4介导的去乙酰化H4K16染色质。Mrc1介导的亲本组蛋白传承对两种酵母截然不同的异染色质体系都是必要的，体现出DNA复制体介导的亲本组蛋白遗传并非H3K9me3特异性的遗传，而是在全基因组层面的遗传。 作者之后通过eSPAN测序手段鉴定Mrc1是主要介导亲本组蛋白遗传到先导链（leading strand）还是滞后链（lagging strand）。前期研究发现，Mcm2与Pol1的组蛋白结合区域倾向于将亲本组蛋白遗传到滞后链【3-5】，而Dpb3-Dpb4倾向于将组蛋白遗传到先导链【6】。作者首先在芽殖酵母中发现，Mrc1全敲除或大片段敲除会导致亲本组蛋白更偏向于传递到滞后链。为了仔细研究Mrc1的组蛋白结合区域是否存在内在的亲本组蛋白传承偏好，作者在芽殖酵母和裂殖酵母中分别使用小片段敲除和点突变发现Mrc1组蛋白结合区域和之前发现的组蛋白结合组分相比没有明显的先导链-滞后链偏好。作者进一步确认了Mrc1的组蛋白结合突变体使得先导链和滞后链上的亲本组蛋白密度都有显著下降。据此，作者得出结论：Mrc1是一个在DNA复制体上的组蛋白分选组分（图二）。 图二：Mrc1是一个在DNA复制体上的亲本组蛋白分选组分（概念图）(Credit: Cell) 早期研究发现组蛋白分子伴侣蛋白（histone chaperone）FACT复合物（Spt16, Pob3/SSRP1）在染色质复制中具有重要的功能【7-10】。FACT的组分之一Spt16可以结合H3-H4四聚体【11】，暗示着Mrc1和FACT能在DNA复制期间共同或分别维持H3-H4四聚体的稳定。AlphaFold-Multimer筛选发现在DNA复制体上有多个FACT结合位点。通过遗传和生化手段，作者确认FACT与DNA复制体组分Tof1/Swi1/TIMELESS以及Pol1的结合对异染色质的表观遗传是必要的。这些研究暗示着FACT作为一个活动的组蛋白分子伴侣蛋白参与运输亲本组蛋白。 由于DNA复制体上存在多个可以结合组蛋白的组分，这些组分在复制体中占据不同区域，AlphaFold结构预测和冷冻电镜结构还发现这些组蛋白结合组分可以和FACT一起结合组蛋白。因此，作者提出DNA复制体上存在多个亲本组蛋白传承中间位点（Parental histone inheritance intermediate sites）（图三）： P位点（P site）：DNA复制体会介导核小体DNA脱离从而招募FACT复合体，此时的亲本核小体处于中间态【12】。 D位点（Distribution site, D site）：Tof1/Swi1/TIMELESS招募FACT-组蛋白至DNA复制体，Mrc1组蛋白结合区域安置于Cdc45/Mcm2并用于分配组蛋白至先导链和滞后链。 LG1位点（Lagging strand site 1, LG1 site）：Mcm2组蛋白结合区域可以和FACT安置于Tof1/Swi1/TIMELESS【13】。 LG2位点（Lagging strand site 2, LG2 site）：Pol1组蛋白结构结合区域与FACT安置于Ctf4/Mcl1/AND-1。 LD1位点（Leading strand site 1, LD1 site）：Dpb3-Dpb4安置于DNA复制酶 ε。 图三：DNA复制体上的多个亲本组蛋白传承中间位点模型图(Credit: Cell) 综上所述，该研究为DNA复制体介导的亲本组蛋白遗传通路建立了一个研究框架。未来仍需要通过实验结构生物学手段验证所有位点的存在，并更进一步研究不同位点之间的关系以理解亲本组蛋白如何在不同位点实现动态传承。 同期，哥本哈根大学Genevieve Thon研究组与Anja Groth研究组在Cell也发表了关于Mrc1/CLASPIN的工作，哥伦比亚大学贾松涛研究组与哥伦比亚大学医学院张志国研究组在Molecular Cell杂志发表了关于Mrc1与Mcm2/Cdc45结合部分对亲本组蛋白传承与表观遗传的重要功能的研究。 参考文献 1. Ragunathan, K., Jih, G., and Moazed, D. (2015). Epigenetics. Epigenetic inheritance uncoupled from sequence-specific recruitment. Science 348, 1258699. 10.1126/science.1258699. 2. Audergon, P.N., Catania, S., Kagansky, A., Tong, P., Shukla, M., Pidoux, A.L., and Allshire, R.C. (2015). Epigenetics. Restricted epigenetic inheritance of H3K9 methylation. Science 348, 132-135. 10.1126/science.1260638. 3. Petryk, N., Dalby, M., Wenger, A., Stromme, C.B., Strandsby, A., Andersson, R., and Groth, A. (2018). MCM2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication. Science 361, 1389-1392. 10.1126/science.aau0294. 4. Gan, H., Serra-Cardona, A., Hua, X., Zhou, H., Labib, K., Yu, C., and Zhang, Z. (2018). The Mcm2-Ctf4-Polalpha Axis Facilitates Parental Histone H3-H4 Transfer to Lagging Strands. Mol Cell 72, 140-151 e143. 10.1016/j.molcel.2018.09.001. 5. Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Gan, S., Zhou, H., Yang, W.S., Chen, C.L., Xu, R.M., and Zhang, Z. (2020). DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands. Sci Adv 6, eabb5820. 10.1126/sciadv.abb5820. 6. Yu, C., Gan, H., Serra-Cardona, A., Zhang, L., Gan, S., Sharma, S., Johansson, E., Chabes, A., Xu, R.M., and Zhang, Z. (2018). A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands. Science 361, 1386-1389. 10.1126/science.aat8849. 7. Wang, X., Tang, Y., Xu, J., Leng, H., Shi, G., Hu, Z., Wu, J., Xiu, Y., Feng, J., and Li, Q. (2023). The N-terminus of Spt16 anchors FACT to MCM2-7 for parental histone recycling. Nucleic Acids Res 51, 11549-11567. 10.1093/nar/gkad846. 8. Kurat, C.F., Yeeles, J.T.P., Patel, H., Early, A., and Diffley, J.F.X. (2017). Chromatin Controls DNA Replication Origin Selection, Lagging-Strand Synthesis, and Replication Fork Rates. Mol Cell 65, 117-130. 10.1016/j.molcel.2016.11.016. 9. Yang, J., Zhang, X., Feng, J., Leng, H., Li, S., Xiao, J., Liu, S., Xu, Z., Xu, J., Li, D., et al. (2016). The Histone Chaperone FACT Contributes to DNA Replication-Coupled Nucleosome Assembly. Cell Rep 14, 1128-1141. 10.1016/j.celrep.2015.12.096. 10. Wittmeyer, J., and Formosa, T. (1997). The Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase alpha catalytic subunit interacts with Cdc68/Spt16 and with Pob3, a protein similar to an HMG1-like protein. Mol Cell Biol 17, 4178-4190. 10.1128/MCB.17.7.4178. 11. Tsunaka, Y., Fujiwara, Y., Oyama, T., Hirose, S., and Morikawa, K. (2016). Integrated molecular mechanism directing nucleosome reorganization by human FACT. Genes Dev 30, 673-686. 10.1101/gad.274183.115. 12. Liu, Y., Zhou, K., Zhang, N., Wei, H., Tan, Y.Z., Zhang, Z., Carragher, B., Potter, C.S., D'Arcy, S., and Luger, K. (2020). FACT caught in the act of manipulating the nucleosome. Nature 577, 426-431. 10.1038/s41586-019-1820-0. 13. Li, N., Gao, Y., Zhang, Y., Yu, D., Lin, J., Feng, J., Li, J., Xu, Z., Zhang, Y., Dang, S., et al. (2024). Parental histone transfer caught at the replication fork. Nature 627, 890-897. 10.1038/s41586-024-07152-2. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.006 https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.017 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.002 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 表观遗传调控是指在不改变DNA序列的情况下，通过一系列化学修饰和染色质重塑等方式调节基因表达活动的过程。表观遗传的精细调控过程决定了基因的激活或沉默，在生物个体发育及其对环境刺激的响应中发挥了关键作用，并具有向子代细胞传递这些信息的能力。组蛋白在表观遗传信息向后代传递的过程中发挥了核心作用，其末端存在各类不同的化学修饰，在基因组不同位置富集，调节基因表达和DNA代谢。在细胞分裂过程中，组蛋白修饰在DNA复制的同时可以传递给子代细胞，复刻过去基因活动的记录。如何准确地将染色质信息传递给子细胞一直是表观遗传学领域的最重要及最难回答的问题之一。染色质的表观遗传记忆与亲代组蛋白H3-H4聚合体在新合成的子代DNA链上的转移过程紧密相关。然而，亲代组蛋白向子代细胞传递的具体机制一直未被完全揭示， 其中一个重要的原因是缺乏有效的遗传学手段去筛选相关的因子。 2024年8月1日，哥伦比亚大学生物系贾松涛教授团队和中国科学院微生物研究所单淳敏研究员团队合作在Molecular Cell杂志上发表了题为Mrc1 regulates parental histone segregation and heterochromatin inheritance的研究论文。该研究以裂殖酵母作为模式生物，用遗传筛选发现了复制体蛋白Mrc1在促进亲代组蛋白H3-H4聚合体向子代DNA链转移和表冠遗传过程中的发挥的关键作用，为深入理解表观遗传信息传递在DNA复制过程中的调控机制提供了全新视角。 在此之前的研究表明亲代组蛋白H3-H4向后随链的转移需要DNA复制机器中两个关键蛋白Mcm2和DNA聚合酶α。但是Mcm2在复制体的最前端，而DNA聚合酶α在复制体的后方，组蛋白是如何跨过复制体进行传递的并不清楚。另外，Mcm2在先导链上，它是如何调控后随链组蛋白的分布一直是一个谜。本研究发现，一个名为Mrc1的复制体蛋白在亲代组蛋白H3-H4向后随链的转移过程中发挥关键作用，从而确保异染色质的正确遗传。研究人员通过一系列包括高通量筛选、染色质免疫沉淀和eSPAN分析等在内的实验分析，详细阐明了Mrc1该功能的作用机制。他们发现Mrc1能够将Mcm2导向DNA聚合酶α，这对亲代组蛋白向后随链的转移过程至关重要。 该研究不仅从理论上突破了我们对真核生物表观遗传信息向子代传递方式这一保守生物学过程的认识，未来在医学等领域也具有重要指导意义。发现Mrc1蛋白在表观遗传信息传递过程中的核心调控作用将有助于更好地理解及开发先进治疗手段，防控癌症等与该过程失调相关的各类疾病。 值得一提的是，哈佛医学院 Danesh Moazed研究组和北京大学李晴研究组合作在Cell发表了相似的研究成果，来自哥本哈根大学Genevieve Thon研究组与Anja Groth研究组在Cell也发表了关于Mrc1/CLASPIN的工作。 模式图(Credit: Molecular Cell) 参考文献 https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.006 https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.017 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.002 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述