MFSD2B

鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate, S1P)是真核生物中重要的活性鞘脂代谢物，在介导淋巴细胞迁移和保持血管完整性中起着重要的作用。细胞内S1P促进细胞增殖，胞外S1P促进免疫细胞运输，调节血管生成等。由于S1P磷酸基团的电负性，使其不能够通过自由扩散被动穿过细胞膜，因此如何实现S1P主动跨膜转运并释放到细胞外，就成为其能否发挥生理学功能的重要调控步骤。在过去的二十年里，已经鉴定了几种S1P转运蛋白，包括两个MFS蛋白超家族成员：Spns2和Mfsd2b，以及一些ABC转运超家族转运蛋白，Spns2是最早被鉴定和研究最广泛的S1P转运蛋白。具有重要生理学功能的主动跨膜转运蛋白的结构生物学和生物化学研究一直是领域内的热点和难点，因此利用结构生物学及生物化学手段，从分子机制上理解S1P的跨膜转运过程，对于深入了解S1P代谢异常疾病的发病机理，以及针对此类疾病进行靶向药物开发都具有重要意义。2023年12月20日，复旦大学代谢与整合生物学研究院任若冰课题组、陈立课题组、戴薇课题组合作，于期刊Cell Research 发表题为“Molecular basis of Spns2 facilitated sphingosine-1-phosphate transport”的文章，报道了S1P转运蛋白Spns2跨细胞膜转运S1P的结构基础和抑制机制。该研究利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术报道了人源Spns2结合底物S1P及抑制剂16d的胞内开放构象。同时，结合质谱利用基于细胞的S1P外流体外实验(该方法部分工作2023年8月于Biochemical and Biophysical Research Communications杂志发表)及评估斑马鱼心脏发育的体内实验(Spns2的敲除导致斑马鱼出现双心表型)，进行了Spns2关键氨基酸突变的功能研究，以破译Spns2识别S1P和转运S1P构象变化的关键残基。图1. 结合S1P的Spns2的冷冻电镜结构和Spns2介导的S1P转运生化特性结合S1P的Spns2由氨基末端结构域(NTD, 包括TM1-TM6)和羧基末端结构区(CTD, 包括TM7-TM12)组成的向内开放构象。两个结构域由一个长的柔性细胞质环和一个短的细胞内螺旋连接。S1P的磷酸基团与Spns2形成广泛的极性相互作用，特别是TM11上的Q463和S464残基，S1P的氨基与TM7上的S326相互作用。S1P的烷基尾部插入TM7-10上主要由疏水残基组成的口袋中，Y246和I429与S1P的烷基尾部相互作用。R227和R456位于空腔的细胞质入口，而R119位于空腔的中部，R200位于空腔外部靠近R119。残基D118、R119、R200和E207形成氢键网络，以稳定NTD的局部构象。此外，靠近细胞外侧的D137-R342和D128-K253之间的盐桥也可能在稳定Spns2的内向开放构象方面发挥关键作用。综合生化实验证明了这些位点在Spns2的S1P转运活性中的关键作用，并通过蛋白质印迹和免疫荧光定位验证了上述突变体的表达水平和质膜定位。此外，该研究还证实对S1P转运影响的突变体也显著降低了FTY720-P的转运活性，这表明与S1P类似的FTY720-P转运机制。该研究同时解析了Spns2结合抑制剂16d胞内开口构象的结构，并对最新报道的抑制剂33p进行了IC50测定。综上，该研究发现正电荷残基R227和R119对S1P转运至关重要，并可作为“支架”促进S1P的磷酸基团从细胞内侧翻转到细胞外侧。疾病相关残基R200可能在稳定NTD构象中发挥重要作用。D137-R342对于锚定胞内开口方向，R227-D445锚定胞外开口构象至关重要。该研究对S1P转运的结构和功能研究揭示了Spns2的S1P转运机制，为Spns2抑制剂新化学支架的优化或探索提供了基础。复旦大学代谢与整合生物学研究院任若冰课题组博士生庞滨、博士后玉蕾叶，戴薇课题组博士生李通为本文共同第一作者，复旦大学代谢与整合生物学研究院为第一完成单位。注：文中插图源于 Cell Research原文链接：https://doi.org/10.1038/s41422-023-00908-x本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

这项研究通过结构和功能分析阐明了Spns2的工作机制，为理解 S1P代谢和信号传导提供了重要的分子基础。 淋巴细胞的迁入和迁出对于维持淋巴组织的稳态和免疫功能的发挥是至关重要的。磷酸鞘氨醇（S1P）是一种重要的溶血脂类信号分子，在淋巴细胞迁出中扮演着关键作用。然而，S1P信号异常升高时会引起外周淋巴细胞过度活跃，导致自身免疫疾病，例如多发性硬化症（MS）。S1P分子在细胞内合成，但必须经跨膜转运进入循环系统，与细胞表面的GPCR受体S1PR1~5结合才能执行其信号传递功能。芬戈莫德（fingolimod）是一种靶向S1PR1的药物，已进入临床用于治疗发性硬化症（MS）。 多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性疾病，主要攻击中枢神经系统（脑、脊髓和视神经）。该疾病的特点是炎性脱髓鞘，即免疫系统攻击了神经纤维的髓鞘，导致电信号传递障碍和神经系统功能障碍，表现为感觉异常、肌肉无力、共济失调、语言障碍等症状。作为S1PR1的激动剂，芬戈莫德作用于淋巴细胞使其表面的S1PR1脱敏，导致这些淋巴细胞不能从淋巴结迁移进入输出淋巴管，从而缓解MS的症状。然而，芬戈莫德同样也会作用于内皮细胞和心肌细胞表面的S1PR1受体，引起严重的副作用，包括黄斑水肿和心动过缓。 S1P的跨膜转运主要通过特定的次级转运蛋白完成，目前已鉴定出的两种转运蛋白包括Spns2和Mfsd2b。淋巴液中的S1P主要来源于Spns2的转运，而血液中的S1P则主要来自于红细胞和血小板中的另一转运蛋白Mfsd2b。那么特异性抑制Spns2从而减少淋巴液中的S1P将有可能避免芬戈莫德这类S1PR1激动剂引起的副作用。此外，在小鼠模型的实验显示Spns2的功能缺陷能够减少癌细胞转移对肺部的侵袭。因此，Spns2是一个用于治疗自身免疫疾病和癌细胞转移的极具潜力的靶点，其结构和功能的研究对揭示S1P的转运机制和小分子抑制机制具有重要意义。 2023年5月23日，美国圣裘德儿童研究医院李佳学课题组和德克萨斯大学西南医学研究中心李晓淳课题组合作，在 Cell 期刊发表了题为：Structural and Functional insight into Spns2-mediated transport of sphingosine-1-phosphate 的研究论文。 该研究解析了淋巴管/血管内皮细胞中由Spns2介导的磷酸鞘氨醇的转运机制，为开发更先进的Spns2抑制剂奠定基础，有助于癌症、炎症和免疫疾病的治疗。 为了研究Spns2如何特异性的识别底物S1P，以及如何通过构象转变将S1P从细胞膜内侧运输到外侧，研究团队利用冷冻电镜技术解析了人源Spns2四种不同构象的结构，包括分别结合底物S1P和小分子抑制剂16d的向内开放状态、不结合底物的部分阻塞状态和向外开放状态（图1）。结合计算生物学和细胞功能实验，这些结构展示了Spns2介导S1P跨膜转运的完整循环过程，为理解该蛋白家族转运溶血脂类的工作机制奠定了基础，也为优化开发新型小分子抑制剂提供了依据。 图1. 不同构象的Spns2结构 Spns2的整体结构属于典型的MFS折叠构型，包含12个跨膜螺旋，分为N端和C端两个相对伪对称的结构域。值得注意的是，在所有构象中只有向内开放状态下的Spns2结合有S1P，说明在这一构象的Spns2对S1P有较高的亲和力。在循环转运过程中，Tyr246/Gly333、Tyr246/Asp445、Asp220/Arg456等成对的氨基酸像开关一样控制脂质转运通道的开放与闭合，以及底物结合口袋的形状变化。例如，在向内开放状态下，Tyr246和Gly333形成的氢键会阻塞脂质转运通道；当进入状态2时，这两个氨基酸残基之间不再存在氢键，而TM4的Asp220和TM11的Arg456之间形成盐桥，这两个跨膜螺旋近膜内端之间的距离随之缩短，从而使得内向开口关闭。对这些结构分析直接展示了在相同实验条件下多个状态之间的分子转变。 去年，有研究报道了首个Spns2特异性小分子抑制剂16d。为了研究该抑制剂的工作机制，研究人员还解析了结合16d的Spns2结构。当Spns2结合16d时，只有一种构象，即向内开放状态的结构被捕捉并解析。16d与S1P结合在Spns2相似的位置。与结合S1P的构象相比，Trp440发生了明显的构象变化，并远离结合位点，表明Trp440对16d的特异性结合起重要作用。该结构表明，16d通过直接与S1P竞争同一位点，并将转运蛋白锁定在向内开放状态以阻止其转运活性。 Spns2转运S1P需要偶联质子的跨膜转运（proton-coupled），还是仅仅依靠S1P的顺浓度梯度仍存在争议。研究人员利用细胞实验，证明了Spns2转运S1P并不依赖细胞膜内外两侧的质子浓度（即pH）和Na+离子浓度。此外，当细胞外的S1P浓度足够高时，Spns2还能将S1P转运至细胞内。这些实验表明，Spns2是一个S1P的协助扩散转运蛋白（facilitated-diffusion uniporter）（图2）。 图2. Spns2转运S1P的工作模型 总的来说，这项研究通过结构和功能分析阐明了Spns2的工作机制，为理解 S1P代谢和信号传导提供了重要的分子基础。