CDR2

抗体在现代医学中发挥着核心作用，但目前还没有完全在计算机中设计与特定表位结合的新型抗体的方法。相反，抗体发现目前依赖于动物免疫或随机文库筛选方法。华盛顿大学David Baker团队证明，结合使用微调RFdiffusion网络的计算蛋白质设计与酵母展示筛选，可以生成抗体可变重链（VHH）和单链可变片段（scFv），以原子级精度结合用户指定的表位。为了验证这一点，研究人员使用多种正交生物物理方法（包括低温电子显微镜）对四种疾病相关表位的VHH结合物进行了实验表征，证实了针对流感血凝素和艰难梭菌毒素B (TcdB) 设计的VHH具有正确的免疫球蛋白折叠和结合姿势。对于针对流感的VHH，高分辨率结构数据进一步证实了CDR环构象的准确性。虽然初始计算设计表现出适度的亲和力，但使用OrthoRep进行亲和力成熟可以产生保持预期表位选择性的个位数纳摩尔结合物。团队进一步展示了单链可变片段（scFvs）的从头设计，通过结合设计的重链和轻链CDR创建TcdB和Phox2b肽-MHC复合物的结合物。低温电子显微镜结构数据证实了两种不同的TcdB scFv的正确免疫球蛋白折叠和结合姿势，其中一种设计的高分辨率数据还验证了所有六个CDR环的原子级精确构象。这种方法建立了一个框架，用于合理计算设计、筛选、分离和表征完全新生抗体，在结构和表位靶向方面都具有原子级精度。该研究以Atomically accurate de novo design of antibodies with RFdiffusion为题，于2025年2月28日发布在bioRxiv预印平台。背景抗体是蛋白质治疗药物中占主导地位的一类，目前全球已获许可的抗体治疗药物超过160种，预计未来五年市场价值将达到4450亿美元。虽然制药界对抗体治疗药物兴趣浓厚，但抗体治疗药物的开发仍然依赖于动物免疫或抗体库筛选，以确定与目标靶标结合的候选分子。这些方法费力、费时，而且可能无法产生与治疗相关表位相互作用的抗体。抗体的计算机设计工作已将残基移植到现有抗体结构中，采样替代天然CDR环以提高亲和力，并使用Rosetta序列设计来改善相互作用区域。基于结构和基于序列的深度学习网络已被训练来设计新的抗体序列，但从头（与针对该表位的现有抗体无同源性）设计结构准确的抗体仍然难以实现。最近在使用RFdiffusion设计结合蛋白（不是抗体）方面取得了进展，与之前的方法不同，它不需要预先指定蛋白质结合物骨架，从而允许设计具有与用户指定的表位固有形状互补性的非常多样化的结合物。然而，与其他从头界面设计方法一样，这些结合剂几乎完全依赖于与目标表位的规则二级结构（螺旋或链）的相互作用，因此原始（vanilla）RFdiffusion 网络无法从头设计抗体。设计从头抗体的理想方法将能够 1) 针对任何感兴趣的靶标上的任何特定表位；2) 重点采样CDR环，使框架序列和结构接近用户指定的高度优化的治疗性抗体框架；3) 采样设计抗体相对于表位的替代刚体位置。针对抗体开发的RFdiffusion变体Baker团队假设应该可以开发一种专门的RFdiffusion变体，能够设计从头CDR介导的界面，因为RFdiffusion可以设计的从头界面具有多样性和质量，并且界面形成的底层热力学是相同的。RoseTTAFold2 (RF2) 和RFdiffusion在整个蛋白质数据库 (PDB16) 上进行训练，这有助于克服PDB包含相对较少抗体结构（约8,100个抗体结构，而总结构超过200,000个）的问题，这增加了大型机器学习模型的训练难度。该团队着手开发RFdiffusion和RF2版本，专门用于抗体结构设计和结构预测，方法是对天然抗体结构进行微调。图示：RFdiffusion抗体设计概述。在这里，研究人员将原始RFdiffusion网络称为vanilla RFdiffusion，将他们描述的抗体特定变体简称为RFdiffusion。成功设计抗体实验表明，从头设计针对目标上特定表位的抗体结构域是可能的。设计的VHH针对流感HA和TcdB的低温电子显微镜结构数据与计算设计模型非常接近，表明该方法可以设计具有原子精度的VHH复合物（包括高度可变的H3环和整体结合方向），这些复合物与PDB中任何已知结构都非常不同。图示：设计的VHH的生化表征。设计的与TcdB结合的scFv的低温电子显微镜结构数据证明了RFdiffusion能够准确设计双链scFv。这是首次通过实验验证的具有结构精确结合的从头设计抗体案例。另外，这种方法的成功不能归因于记忆，因为PDB中不存在针对TcdB表位的抗体，这增强了该模型设计真正从头结合物的能力。图示：两种全新设计的VHH与流感血凝素和TcdB结合的低温电子显微镜结构表征。该团队的计算方法与从大型随机库中检索抗体的实验筛选方法在多个方面具有协同作用。首先，广泛用于抗体库筛选的酵母展示选择方法能够在大量设计中检索出亲和力最高的结合物，由于设计成功率很低，这一点目前是必要的。其次，筛选结合模式相似的设计中混合重链和轻链的组合库可以识别针对特定表位的scFv，正如案例里用到的TcdB和Phox2b肽MHC。在案例中，这种方法特别有利，因为很大一部分重组体可能由于其结构兼容性而具有功能性。第三，使用OrthoRep进行亲和力成熟可将初始VHH设计的测量亲和力提高到个位数纳摩尔或亚纳摩尔范围，同时保留原始设计的结合模式。从实际角度来看，这项工作的关键进展不仅在于能够针对目标生成纳米抗体和scFv（这通常可以通过纯实验方法实现），而且在于能够准确靶向特定结合表位。图示：两种TcdB结合scFv的低温电子显微镜结构表征。事实上，低温电子显微镜研究明确证实，研究人员通过计算设计的抗体能够以惊人的精度与目标表位结合。这种高设计精度对于治疗应用至关重要，例如阻断受体-配体相互作用的拮抗剂、避免与内源性分子竞争的抗体、诱导构象变化以触发信号传导的调节剂，或靶向保守或进化受限的病毒表位的抗体。局限性虽然这里的结果表明抗体从头设计是成功的，但仍有很大的改进空间。对于主链设计步骤，结合最近的架构改进和生成建模的新进展可能会产生具有更高可设计性和多样性的设计模型。RoseTTAFold2和RFdiffusion最近也已扩展到模拟所有生物分子（而不仅仅是蛋白质），将此功能整合到抗体设计 RFdiffusion 中应该可以精确设计针对含有非蛋白质原子（如聚糖）的表位的抗体。事实上，VHH_flu_01观察到的亚化学计量结合可以用附近聚糖N296的存在来解释，而这在最初设计此VHH时并未考虑到。ProteinMPNN在本研究中没有被修改，但设计与人类CDR序列更接近的序列预计会降低设计抗体的潜在免疫原性和可开发性。另外，抗体预测方法的进一步改进应该能够更好地对上游设计方法进行计算机基准测试，并提高实验成功率。将scFv转换为完整抗体应该很简单，因为可变的CDR序列保持不变。或者，这里使用的方法可以直接应用于Fab设计，只需省略重链和轻链之间的接头即可。随着这些进步，计算抗体设计有望成为常规方法。结语研究人员表示，使用RFdiffusion和相关方法进行抗体的计算从头设计可能会彻底改变抗体的发现和开发。RFdiffusion方法可以精确靶向给定抗原上的特定表位。随着方法的改进和成功率的提高，它有可能比免疫动物或筛选随机文库更快、更经济，因为后者需要对表位作图和结构表征进行广泛的跟踪。基于结构的抗体设计方法能够以结构知情的方式优化关键的药物特性，例如聚集性、溶解性和表达水平。这允许进行有针对性的修改，同时避免可能破坏抗体-靶标界面或损害抗体稳定性的突变。此外，从一开始就探索CDR环序列和结构的全部空间的能力，特别是对于CDR1和CDR2，它们在体细胞超突变之前天生就局限于种系V基因编码的序列空间，应该可以简化可开发性特征的优化和非免疫显性表位的靶向性。科学家预计抗体的合理设计将大大增加抗体疗法可处理的临床靶点和条件的数量。论文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.14.585103v2本文转自【ScienceAI】公众号--------- End ---------感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位或姓名-学校-职务/研究方向。

导读：埃博拉病毒（Orthoebolavirus）是一种危险的病原体，已造成30多起疫情爆发。然而，目前获批的疗法范围有限，且它们仅对埃博拉病毒有效，对其他正变形病毒缺乏交叉保护。2024年11月25号，中国人民解放军军事医学科学院陈薇和于长明团队共同在Emerging Microbes & Infections（影响因子：8.4）发表文章：A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection。他们发现先前分离的人类来源抗体 2G1 可以识别埃博拉病毒每个亚种的糖蛋白（GP），2G1可识别丝状病毒中高度保守的表位，并通过阻断 GP 蛋白水解实现中和。此外，研究人员利用mRNA技术制备了编码2G1抗体的mRNA-2G1-LNP制剂，发现其在细胞水平上表现出交叉中和能力，是蛋白形式IgG的十倍以上，并且它以低剂量阻断了 EBOV 和 SUDV 假病毒对小鼠的侵袭，无明显的肝毒性。这项研究表明，mRNA-2G1-LNP 制剂是抵抗埃博拉病毒的非常有潜力的候选干预措施。 应用技术: mRNA序列设计、mRNA序列优化、UTR筛选、poly(A)筛选、密码子优化、体外转录、mRNA磁珠纯化、mRNA-LNP包封、细胞转染、流式细胞术、表面等离子共振、ELISA、假病毒中和试验、冷冻电镜、受体结合抑制试验等。 01 研究背景 埃博拉病毒属于丝状病毒科，病毒呈长丝状体，直径大约为80-100纳米。埃博拉病毒粒子由包膜、基质和核衣壳组成，脂质双层结构的病毒包膜表面有许多由GP糖蛋白形成的7-10纳米长的三聚体刺突。埃博拉病毒属主要分为6个种，包括EBOV，SUDV，RESTV，BDBV，TAFV和BOMV。其中四种病毒（EBOV、SUDV、BDBV和TAFV）对人类致病，在过去四十年中引发了40多次疫情，病死率高达25%-90%。 膜蛋白GP是一种I型跨膜蛋白，全长676个氨基酸(amino acid, AA)，形成了病毒颗粒表面的刺突结构。在翻译过程中，它首先形成一个前体GP蛋白(preGP)，之后在第501aa位点被弗林蛋白酶或类弗林内切蛋白酶切割成一个由二硫键连接的GP1-GP2片段。三个GP1-GP2片段聚集形成的三聚体复合物是埃博拉病毒与宿主细胞受体结合与融合的位点，也是中和性抗体研究的主要靶点。GP蛋白的粘蛋白类似区(Mucin-like domain)处于GP1外侧，结构类似一个帽子。 埃博拉病毒不同亚种GP氨基酸序列差异高达59% ，这对广谱药物的开发构成了极大挑战。最近的一项研究表明，对EBOV的既往免疫力对SUDV的保护作用有限。两种获批的抗体药物仅靶向EBOV，不能交叉中和其他亚种。博拉病毒的多变种和逃逸变异、在未来疫情中变异的不确定性、疫苗不适用于特定人群以及抗体药物的长开发周期都说明探索广泛或快速起效对策的重要性。广谱型抗体是应对埃博拉病毒的有效手段，通常靶向未遮挡、高度保守的GP2亚基和GP1亚基的碱基区域，通过阻断受体结合后发生的GP切割和构象重排来实现中和效应。 02 免疫广谱中和抗体2G1的验证研究人员采用流式细胞仪分析2G1抗体结合广度，发现2G1可以同展示在239T细胞表面的六种埃博拉病毒亚种（EBOV，SUDV，RESTV，BDBV，TAFV和BOMV）的GP糖蛋白结合。他们还表征了2G1抗体在粘蛋白结构域存在（GPΔTM）或不存在（GPΔMuc）的情况下对EBOV GP的重组细胞外形式的亲和力，发现 GPΔTM和GPΔMuc的可比动力学常数分别为5.25nM和5.44nM。 埃博拉病毒的进入是由GP糖蛋白介导的，GP将病毒颗粒附着在细胞表面，将其递送到内体，并催化病毒膜和内体膜之间的融合，因此，抗体中和效应主要发生在晚期胞内体中的酸性环境。研究人员观察PH改变对2G1与GPΔTM、 GPΔMuc和裂解GP（GPcl）结合活性的影响。结果发现低pH值对2G1与GPΔTM和GPΔMuc的结合影响最小，同时，还发现2G1对GPcl结合力非常弱。 接下来，研究人员使用携带GP糖蛋白的重组HIV假病毒来检测2G1抗体的广谱性，结果发现，2G1对所有测试的埃博拉病毒亚种均表现出有效的广泛中和作用，半数最大抑制浓度（IC50）值范围为0.02至0.44μg/mL，优于对照抗体mAb114和FVM04。 为了剖析重链和轻链对结合的贡献，研究人员准备了2G1的野生型和推断种系交叉配对形式（IGL）。分析轻链（VL）和重链（VH）的可变区，比较显示 VL-IGL和VL-WT之间的氨基酸分歧（9/106）比VH-IGL和VH-WT之间的氨基酸差异更大（6/124）。与2G1-WT相比，2G1-HIGL/KWT和2G1-IGL与GP的结合活性显著降低（分别降低91.4倍和55.4倍）。相比之下，2G1-HWT/KIGL的结合能力仅比 2G1-WT 低 4.4 倍，强调了重链在结合中的关键作用。通过重链互补决定区（CDR）的丙氨酸扫描诱变进一步分析，在CDR2中发现了一个关键残基Y56，在 CDR3 中发现了三个关键残基C99、G100B和C100D，这些位置的突变导致2G1的结合能力大幅降低，EC50值比野生型高59.9至133.9倍。 03 光谱中和抗体2G1的中和机制  GP三聚体（由GP1-GP2异二聚体组成）上的表位，包括聚糖帽（GC）、头部、Mucin、GP1核心、GP1/2、碱基、IFL和HR2。在这些表位中，远离病毒膜的GC、Head和Mucin在空间上更容易接近，已被证明在疫苗接种过程中具有更高的免疫优势。然而，这些区域是种间序列分歧和自然进化突变的热点。靶向IFL、GP1核心和头部的抗体表现出高交叉反应频率，其中IFL与埃博拉病毒广谱型活性的相关性最强。ADI-15878等中和抗体的表位（完全或部分）位于IFL结构域中，已知它们可以中和至少四种直肠病毒。值得注意的是，来自疫苗接种者的2G1以及来自幸存者的 ADI-15878 识别出位于GP2 N端下方的疏水口袋，表明该区域作为广谱性埃博拉病毒药物或疫苗开发靶点的重要性。 为阐明2G1结合和中和机制的结构基础，研究者使用冷冻电子显微镜以2.98 Å的分辨率确定了2G1-Fab与EBOV GPΔMuc复合物的结构。2G1轻链和重链的中央连接几乎与GP1亚基的主体平行排列，三个 Fab 与每个GP三聚体接合。尽管2G1与ADI-15878具有相同的结合模式，但两种抗体之间存在明显的区别。2G1识别由IFLtip、HR1、GP1核心和GP2 N端组成的四级表位，该表位结合了针对埃博拉病毒病最有前途的广谱混合物成分的表位：ADI-15878（IFL+HR1）和ADI-23774（310口袋+IFL碱基+ GP2N端）。除了表位的差异外，ADI-15878还表现出与GPcl的强结合，并且据推测会阻碍受体结合后的融合触发过程。相反，2G1与GPcl的结合较弱，并通过阻断GP的上游切割来中和病毒。 04 编码抗体的2G1 mRNA的设计与优化 研究人员采用mRNA技术来表达2G1抗体的重链和轻链，初始mRNA序列包含Cap1结构、5'UTR（TEV）、2G1重链或轻链的编码序列、3'UTR（F-I）、100个核苷酸的poly(A)尾和元件之间的Linker。将mRNA转染HEK293T细胞，并在多个时间点收获培养上清液。结果发现，转染后48小时，2G1 抗体浓度达到最高限值为74.4ng/mL。 研究者优化了mRNA的组成元件以提高2G1抗体翻译效率： Cap1和Cap0两种不同类型的帽结构对抗体表达的影响没有统计学上的显著差异。 为了简化组件替换和优化，研究人员在初始mRNA序列设计时在不同的元件之间引入了Linker，然而，这些Linker可能会干扰mRNA二级结构。去除Linker后，抗体表达显著增加。 在HBA1、HBB及4种候选UTR组合序列中，天然HBA1和HBB UTR表现出最高的翻译效率。将HBA1和HBB的UTR序列交换组合，并且引入非洲爪蟾β珠蛋白（XBB）的5’UTR序列，结果发现，利用 HBA1-5' UTR的mRNA（HBA1-HBB和HBA1）显示出最佳的翻译效果，表达的抗体浓度超过1500 ng/mL。 用三磷酸尿苷（UTP）代替N1-甲基假尿苷酸（ψ）在细胞水平上对mRNA翻译的效率没有显著影响。 两种不同形式的poly(A)尾，即A30-linker-A70和A70C30的mRNA-2G1抗体表达水平没有显著差异。 编码序列的优化在数值上增强了抗体生产，尽管与未优化的队列没有显著差异。 使用两种针对亨尼帕病毒的抗体1E5和1B6验证优化后的mRNA元件的翻译效率，发现该mRNA骨架序列具有普适性，两种抗体表达水平可分别达到1835和5533 ng/mL。 将mRNA抗体的重链和轻链以五种不同的比例混合到细胞中，确定了其最佳摩尔比为1：1.1。配制LNP包封的mRNA-2G1（mRNA-2G1-LNP）。mRNA-2G1-LNP的包封效率约为89.7%，平均粒径约为 84.6 nm，在电子显微镜下呈现球形形态。在293 T细胞中，mRNA-2G1-LNP 的抗体表达水平要比用lipofectamine转染的高36.6%。在细胞上清液中，mRNA-2G1-LNP 表达完整 IgG和少量游离的轻链。为确定LNP制剂的稳定性，将mRNA-2G1-LNP在4℃下储存8周，监测包封效率、有效浓度和细胞水平表达的变化。第36天，包封率和有效浓度均未发生显着变化。储存终点mRNA-2G1-LNP的细胞水平表达水平是保持在第二周时观察到的52.4%。 05 mRNA-2G1-LNP的免疫保护效果研究人员评估mRNA-2G1-LNP在体外对rHIV-EBOV 的中和效果。在细胞感染前6小时，添加浓度为0.1 μg/mL的mRNA-2G1-LNP，能够中和90% 的假病毒。mRNA-2G1-LNP抗体对rHIV-EBOV的IC50值为16.4ng/mL，中和能力是 IgG 的19.8倍。在基于生物发光成像的BALB/c小鼠感染模型中评估 mRNA-2G1-LNP的体内保护活性。小鼠在攻击前12小时通过尾静脉注射不同剂量的mRNA-2G1-LNP，所有注射组均表现出良好的保护效果。最低剂量组0.125 mg/kg小鼠体内的总发光值仅为PBS组的11.9%，高剂量组小鼠未未检测到发光信号。 同样，mRNA-2G1-LNP体外可有效中和rHIV-SUDV，IC50 为 32.6 ng/mL，是IgG中和活性的12.5倍。在SUDV假病毒的小鼠攻击模型中，预防性注射mRNA-2G1-LNP可提供足够的保护，0.125mg/kg的最小剂量组小鼠体内总发光强度仅为对照组的6.72%，而高剂量组则完全阻断了小鼠感染rHIV-SUDV 。 通过尾静脉注射给予mRNA-2G1-LNP、 2G1抗体或空壳LNP，研究小鼠mRNA-2G1-LNP的表达动力学和代谢特征。注射mRNA-2G1-LNP 后，血清抗体浓度迅速升高。6h时，1和0.5 mg/kg mRNA-2G1-LNP剂量组的平均血清抗体水平分别为25.80和8.45μg/mL。24小时，血清抗体达到峰值：分别为31.73和11.36μg/mL。第7天，血清抗体浓度分别降至14.19和6.67μg/mL。值得注意的是，这些血清抗体浓度高于2G1在体外对真实EBOV的IC90值（3.2μg/mL）。在小鼠中观察到的人类2G1半衰期较短，估计约为三天，这可能限制了mRNA编码的抗体水平进一步增强和延长的可能性。 为评估mRNA-2G1-LNP在小鼠体内的肝毒性，研究者监测了给药后小鼠体重和肝功能的血清生化标准，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酐（CR）。所有注射组中小鼠的体重都表现出最初的下降，然后恢复，然后在第14天达到同等体重。mRNA-2G1-LNP和IgG组之间的体重没有显着差异。体重增加的早期波动可能与该阶段的密集采血工作有关。1mg/kg mRNA-2G1-LNP 的剂量对小鼠的肝功能没有显着影响，与PBS组相比，四种肝功能的生化标准没有统计学差异。 06 总结 据称，2G1抗体是第一个已报道的能够与所有六种埃博拉病毒亚种的天然 G结构结合的抗体。本研究证实了2G1抗体是一种广谱型的埃博拉病毒中和抗体，并阐明了其中和活性的结构基础和中和机制，从而为开发针对埃博拉病毒的广谱型药物提供了候选成分和设计原理。通过优化表达2G1抗体的mRNA元件，找到了一种普适性的、表达中和抗体的mRNA元件组合，为其他基于mRNA-LNP的治疗方法提供了重要的参考信息。 基于在mRNA序列设计和纯化方面的卓越经验，耀海生物重磅推出mRNA定制化合成服务，全流程涵盖质粒模板序列设计、IVT RNA制备、RNA纯化、RNA-LNP包封、mRNA和LNP质量检测。详细请联系菌菌：133 8033 2910。 参考文献  [1] Fan P, Sun B, Liu Z, Fang T, Ren Y, Zhao X, Song Z, Yang Y, Li J, Yu C, Chen W. A pan-orthoebolavirus neutralizing antibody encoded by mRNA effectively prevents virus infection. Emerg Microbes Infect. 2024 Dec;13(1):2432366. doi: 10.1080/22221751. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

郑希元, 刘国伟. 《医药新技术与专利法》[M]. 北京: 知识产权出版社, 2022, 212-215. 单抗药物市场之争[1] 2005年，日本小野制药和美国梅达雷克斯制药共同合作开发Nivolumab[2]（纳武利尤单抗,商品名为Opdivo，俗称“O药”），并于2006年提交PCT申请，公开号为WO2006121168A1，之后陆续在日本、美国、中国以及欧洲等药品主流市场获得专利授权。2009年，百时美施贵宝斥资24亿美元收购梅达雷克斯制药，将Nivolumab项目收入囊中，其临床试验、知识产权与后续开发权利由百时美施贵宝所主导。2014年7月4日，Nivolumab获得日本医药品医疗器械综合机构（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，PMDA）的上市批准，同年12月22日获得FDA的上市批准，2015年6月19日获得EMA的上市批准，并由小野制药在日本销售，百时美施贵宝在美国和欧洲销售。该药批准的适应证为转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、晚期肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤等。 此外，百时美施贵宝的竞争对手默沙东于2009年收购先灵葆雅，获得MK-3475（即帕博利珠单抗Pembrolizumab，商品名为Keytruda，俗称“K药”，一种新型的人源化IgG4-κ型单克隆抗体，通过作用于PD-1，阻断PD-1/PD-L1通路，进而有助于人体免疫系统攻击肿瘤细胞）的后续开发权。该药于2014年9月4日获得FDA的上市批准，又于2015年7月17日获得EMA的上市批准，用于治疗转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、晚期黑色素瘤。[3] 然而，正当默沙东还沉浸在Keytruda获得FDA批准的喜悦中时，百时美施贵宝一纸诉状将其告上美国特拉华州联邦地区法院,百时美施贵宝及其日本合作伙伴小野制药称，PD-1抑制剂的美国专利由小野制药获得，并已许可给百时美施贵宝，授权范围涵盖该药物在肿瘤领域的应用，默沙东侵犯了小野制药和百时美施贵宝在美国上市的PD-1抑制剂Opdivo的专利。据此，百时美施贵宝在起诉书中要求法院判决Keytruda侵权。对此，默沙东承认小野制药确实享有Keytruda产品的方法专利，但同时表示，该专利是无效的。经过几番诉讼，2017年1月，百时美施贵宝在专利纠纷中获胜，与默沙东达成和解协议：默沙东首先要向百时美施贵宝/小野制药支付6.25亿美元的专利许可费首付款，另外在2017年1月1日至2023年12月31日期间，默沙东需按6.5%的比例向百时美施贵宝支付销售提成，在2024年1月1日至2026年12月31日期间，需按2.5%的比例支付销售提成。[4]百时美施贵宝与小野制药则按照3∶1的比例平分这笔额外收益。2020年，默沙东的Keytruda全球销售额增长30%，达到144亿美元[5]，K药对于默沙东业绩的贡献占比达到30%，预计2026年的全球销售额可能达到243.2亿美元[6]。2020年，百时美施贵宝公司的Opdivo全球销售额达到79.2亿美元，当年获得了FDA的7项批准，其中2项与CTLA4免疫疗法Yervoy联合使用，用于关键的非小细胞型肺癌（NSCLC）领域。 百时美施贵宝与默沙东在国际市场上战得难解难分，然而在中国市场却是一片“和平”的景象。截至2022年2月28日，国内已有12款PD-1/PD-L1单抗获批上市，包括6款国产PD-1抗体[7][8]、2款国产PD-L1抗体[9]、2款进口PD-1抗体和2款进口PD-L1抗体。其中，8款药物2020年的市场表现如表2-10-1所示。[10]由于PD-1单抗药物是一类适应证很广的肿瘤免疫治疗药物，所以每家制药公司获批的适应证不尽相同，例如信迪利单抗获得国家药品监督管理局的批准，联合培美曲塞和铂类化疗用于非鳞状非小细胞肺癌（nsqNSCLC）的一线治疗，用于治疗至少经过二线系统化疗的复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤[11]，联合吉西他滨和铂类化疗治疗不可手术切除的局部晚期或转移性鳞状非小细胞肺癌，以及联合贝伐珠单抗注射液用于既往未接受过系统治疗的不可切除或转移性肝细胞癌的一线治疗；卡瑞利珠单抗除用于上述霍奇金淋巴瘤治疗外，还获批用于晚期肝细胞癌、食管癌、二线及以上鼻咽癌、一线鼻咽癌以及非小细胞肺癌的治疗[12]，并于2020年底正式被纳入国家医保目录。截至2022年2月28日，卡瑞利珠单抗和替雷利珠单抗是国内获批适应证最多的PD-1/PD-L1抗体（均为6项），替雷利珠单抗是医保覆盖范围最广的PD-1/PD-L1抗体（5项适应证）。 表2-10-12020年PD-1/PD-L1抗体市场表现 ②信迪利单抗是信达生物制药和礼来制药在中国共同合作研发的创新生物药，也是双方合作的首个硕果。2020年8月18日，双方签署协议，礼来制药将获得信迪利单抗在中国以外地区的独家许可，信达生物制药将获得累计超10亿美元款项。 ③2022年2月26日，百济神州发布2021年度业绩快报公告，PD-1抗体替雷利珠单抗2021年在中国的销售额为16.47亿元人民币。 下面笔者就小野制药在美国、欧洲和中国获得授权的同族专利的保护范围进行分析。 美国授权专利US8728474B2[13]的权利要求1如下所示。 1.一种用于治疗肿瘤患者的方法，包括给予患者药物有效量的抗-PD-1单克隆抗体。 欧洲授权专利EP1537878B1的权利要求1如下所示。 1.抑制PD-1的免疫抑制信号的抗-PD-1抗体在制备用于癌症治疗的药物中的应用。 中国授权专利CN101213297B的权利要求1如下所示。 1.人单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 氨基酸序列如SEQ ID NO:18所列的重链可变区CDR1； 氨基酸序列如SEQ ID NO:25所列的重链可变区CDR2； 氨基酸序列如SEQ ID NO:32所列的重链可变区CDR3； 氨基酸序列如SEQ ID NO:39所列的轻链可变区CDR1； 氨基酸序列如SEQ ID NO:46所列的轻链可变区CDR2；和 氨基酸序列如SEQ ID NO:53所列的轻链可变区CDR3， 其中所述抗体或其抗原结合部分与人PD-1特异性结合。 比较上述权利要求的保护范围不难发现，小野制药美国和欧洲授权专利的保护范围相比于中国授权专利的保护范围宽了不少，几乎是任何人未经允许将任何PD-1抗体用于治疗任何肿瘤或癌症的用途都将落入US8728474B2和EP1537878B1的保护范围内并构成侵权，然而这样的权利要求在中国是无法获得授权的。 [1] 郑希元，李海霞. PD-1单克隆抗体药物的相关专利分析［J］. 中国知识产权杂志，2017（8）. [2] Nivolumab所涉及的PD-1最早由日本京都大学的免疫学家本庶佑（Tasuku Honjo）于1992年发现，发现之初，就与日本小野制药进行联合开发。 [3] 从俊杰，宿央央，霍春芳，等. PD-1/PD-L1抗体的专利分析［J］. 今日药学，2017（6）：420-424. [4] 丁言. PD-1/PD-L1抗体烽烟再起［N］. 医药经济报，2017-03-15（F02）. [5] MERCK官网. Merck Announces Fourth-Quarter and Full-Year 2020 Financial Results［EB/OL］.（2021-02-04）［2021-11-10］. https://www.merck.com/news/merck-announces-fourth-quarter-and-full-year-2020-financial-results/. [6] 陈淑文. 全球前四畅销药“专利悬崖”危机逼近，艾伯维、默沙东、BMS如何应对？［EB/OL］.（2021-07-15）［2021-08-09］. https://mp.weixin.qq.com/s/1UZ8G5sy8bt6to1PpbJJVg. [7] 2021年8月3日，正大天晴康方（上海）生物医药科技有限公司的PD-1抗体派安普利注射液获得国家药品监督管理局批准上市，成为第5款获批上市的国产PD-1抗体，其适应证为复发或难治性经典霍奇金淋巴瘤（cHL）。 [8] 2021年8月30日，誉衡药业/药明生物研发的重组全人抗PD-1单克隆抗体——赛帕利单抗注射液（GLS-010注射液）获得国家药品监督管理局批准上市，用于治疗二线以上复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤（r/r cHL）患者。 [9] 2021年11月25日，国家药品监督管理局（NMPA）通过优先审评审批程序附条件批准四川思路康瑞药业有限公司申报的恩沃利单抗注射液（商品名：恩维达）上市，其是目前全球首个获批的皮下注射给药的PD-L1抗体，适用于不可切除或转移性微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复基因缺陷型（dMMR）的成人晚期实体瘤患者的治疗。2021年12月13日，NMPA批准基石药业（苏州）有限公司申报的舒格利单抗注射液（商品名：择捷美，重组抗PD-L1全人源单克隆抗体）上市，该药品适用于联合培美曲塞和卡铂用于表皮生长因子受体（EGFR）基因突变阴性和间变性淋巴瘤激酶（ALK）阴性的转移性非鳞状非小细胞肺癌患者的一线治疗，以及联合紫杉醇和卡铂用于转移性鳞状非小细胞肺癌患者的一线治疗。 [10] 青瓦PD-1商业大战背后的BD策略［EB/OL］.（2021-04-20）［2021-05-13］. http://www.pharmcube.com/index/news/article/6774. [11] 信达生物官网. 信达生物联合礼来制药宣布达伯舒（信迪利单抗注射液）获得国家药品监督管理局批准联合培美曲塞和铂类化疗用于一线治疗非鳞状非小细胞肺癌［EB/OL］.（2021-02-03）［2021-10-24］. http://cn.innoventbio.com/#/news/249. [12] 恒瑞官网. 注射用卡瑞利珠单抗［EB/OL］.（2021-06-08）［2021-10-24］. https://www.hengrui.com/product/innovativeMedicine.html#pie5. [13] 考虑到US8728474B2等6件美国专利的公开内容涉及诺贝尔获奖者Tasuku Honjo与另两位科学家Wood博士和Freeman博士的部分研究合作内容，美国联邦巡回上诉法院在2020年7月14日公布的Dana-Farber Cancer Institute， Inc.v.Ono Pharma.Co.，LTD.No.19-2050（Fed.Cir.2020）案判决中认定Tasuku Honjo及其团队成员与另两位科学家Wood博士和Freeman博士为共同发明人，他们均对涉案专利的发明构想作出了积极贡献。 目录 （下翻查看完整目录） 第1章 医药新技术与新政策  1.1医药技术发展新趋势 1.1.1抗体药物偶联物 1.1.2双(多)特异性抗体 1.1.3NTRK融合基因靶向药 1.1.4膜内外蛋白降解技术 1.1.5AI制药与基因疗法  1.2中国医药行业发展演变 1.2.1药品注册政策与上市分析 1.2.2医保谈判与集中带量采购 1.2.3授权合作与尽职调查  1.3中国医药专利制度演变  第2章 医药专利类型与授权、确权和侵权  2.1化合物 2.1.1新颖性判断规则变化 2.1.2创造性判断思路与比较分析 2.1.3无效宣告请求阶段的修改与举证  2.2盐 2.2.1中国典型案例分析 2.2.2美国典型案例分析 2.2.3中美案例比较研究  2.3晶型 2.3.1国内外新颖性评判标准 2.3.2鉴别方法与新颖性评判案例 2.3.3美国创造性评判标准与实践 2.3.4中国创造性评判标准与实践 2.3.5中美创造性评判差异及启示  2.4前药、代谢物和中间体 2.4.1前药侵权性质认定 2.4.2专利间接侵权法律制度 2.4.3前药与代谢物专利侵权案例 2.4.4代谢物专利布局案例 2.4.5中间体专利侵权案例 2.4.6启示与不同的声音  2.5医药用途 2.5.1瑞士型权利要求的演进 2.5.2医药用途权利要求撰写方式 2.5.3中国新颖性评判标准与案例 2.5.4中国创造性评判标准与案例  2.6制备方法与新产品制造方法 2.6.1制备方法专利侵权与创造性判断 2.6.2新产品制造方法专利侵权诉讼  2.7手性化合物 2.7.1药理活性与毒副作用 2.7.2中欧新颖性评判标准分析 2.7.3中美创造性评判差异分析 2.7.4审查差异与启示  2.8药物制剂 2.8.1药用辅料发明的中美评判标准 2.8.2剂型转换发明的创造性判断  2.9药物组合物 2.9.1化学药组合物创造性评析 2.9.2中药组合物创造性评析  2.10抗体 2.10.1肿瘤免疫疗法研究进展 2.10.2单抗药物市场之争 2.10.3中欧专利审查“支持”问题 2.10.4国外专利布局分析与举例 2.10.5国外专利布局考虑因素 2.10.6中欧专利审查创造性标准 2.10.7对我国医药企业的启示  2.11基因与微生物 2.11.1中国基因专利创造性评析 2.11.2美国基因专利创造性评析 2.11.3微生物可专利性演变 2.11.4微生物专利无效与侵权诉讼  2.12胚胎干细胞 2.12.1伦理要求变化 2.12.2可专利性案例分析 2.12.3中国相关法律规定 2.12.4其他国家/地区相关法律规定  第3章 医药专利法律问题  3.1优先权认定 3.1.1在后申请中缺少的技术特征 3.1.2技术方案是否实质相同 3.1.3在先申请是否为“首次申请”  3.2商业成功 3.2.1商业成功的中美相关规定 3.2.2中国关于“商业成功”的案例 3.2.3美国关于“商业成功”的案例 3.2.4商业成功在中国的可操作性探讨  3.3技术偏见 3.3.1“肯定的”技术偏见与“消极的”技术偏见 3.3.2中国无效诉讼案例 3.3.3美国同族授权专利审查档案 3.3.4案例分析与启示  3.4实验数据 3.4.1说明书充分公开问题 3.4.2补充实验数据问题 3.4.3补充实验设计问题 3.4.4实验数据真实性问题  3.5等同侵权 3.5.1数值范围特征 3.5.2封闭式权利要求 3.5.3放弃的技术方案  第4章 医药专利法律制度  4.1药品专利链接制度 4.1.1中美药品专利链接制度对比 4.1.2韩国和加拿大如何选择 4.1.3欧盟和印度如何选择 4.1.4中国实践中可能存在的困境  4.2药品专利期限补偿制度 4.2.1计算方法 4.2.2适用对象 4.2.3保护范围 4.2.4限制规定差异  4.3Bolar例外条款 4.3.1条款起源及发展状况 4.3.2中国Bolar例外条款 4.3.3Bolar例外条款与行政审批 4.3.4仿制药研发的未来出路  第5章 医药专利典型案例评析  5.1张某田诉欧意药业有限公司等侵犯发明专利权纠纷再审案 5.1.1案情概述 5.1.2最高人民法院的改判 5.1.3针对该案的法律分析 5.1.4该案所带来的启发  5.2礼来公司诉华生公司发明专利侵权案 5.2.1案情概述 5.2.2针对该案的法律分析 5.2.3该案所带来的启发  5.3国家知识产权局、中惠公司与众生公司发明专利权无效行政纠纷案 5.3.1案情概述 5.3.2光盘背景介绍 5.3.3判决要旨及诉讼应对策略 5.3.4新药光盘不能视为现有技术  5.4确认不侵犯专利权若干问题的分析 5.4.1案情概述 5.4.2法理分析 5.4.3侵权比对分析 5.4.4禁止反悔原则 5.4.5本案带来的启发 案例索引 后记