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本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： 非小细胞肺癌(NSCLC)在世界范围内具有发病率高、预后差的特点。深入了解非小细胞肺癌的发病机制，寻找新的治疗靶点，对改善非小细胞肺癌的预后至关重要。 8月1日，中国医科大学赵明芳研究团队在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了研究论文，题为“FGL1: a novel biomarker and target for non-small cell lung cancer, promoting tumor progression and metastasis through KDM4A/STAT3 transcription mechanism”，在这项研究中，研究人员发现纤维蛋白原样蛋白1 (FGL1)促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在机制上，研究人员发现Stat3作为一种转录因子，可以被募集到FGL1启动子上，增强FGL1启动子的活性。赖氨酸特异性去甲基化酶4A (KDM4A)与Stat3相互作用，促进甲基从H3K9me3中去除，从而增强Stat3介导的FGL1转录。此外，研究人员观察到Stat3和KDM4A部分通过上调FGL1的表达来促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。另外，FGL1在癌组织(n = 90)中的表达明显高于癌旁非癌组织(n = 90)。而且，与FGL1低表达的患者相比，FGL1高表达的患者总生存期(OS)更短。这些发现提示FGL1表达的动态变化可以作为预测非小细胞肺癌治疗效果的潜在生物标志物。 总之，本研究揭示了FGL1在非小细胞肺癌发生发展中的重要作用及其调控机制，提示其可能成为非小细胞肺癌患者的治疗靶点。 https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-03140-6#Sec10 背景知识 01 肺癌在所有恶性肿瘤中的死亡率排名第一，约占所有癌症相关死亡病例的21%。根据其组织病理类型，肺癌可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中后者约占所有病例的85%。尽管诊断方法有了显著进步，但相当一部分患者在晚期才被诊断出来，失去了手术机会。近年来，治疗模式的进步，特别是酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和免疫检查点抑制剂（ICIs）的引入，显著提高了晚期肺癌患者的生存率。然而，靶向治疗和免疫治疗的疗效仅限于特定人群。此外，不可避免地会出现药物耐药性，导致治疗失败。因此，探索新的治疗靶点仍然是未来努力的关键方向。 2019年，研究人员在Cell上发表了一项研究，强调了纤维蛋白原样蛋白1 (FGL1)作为一种新型免疫检查点的作用，它以受体-配体的方式抑制T细胞活性，可能调节对PD-1/PD-L1治疗的耐药性。同时靶向PD-L1和FGL1可增强肺癌患者的免疫应答和抗癌作用，FGL1作为一种新的免疫治疗靶点，有望成为预测PD-1/PD-L1治疗疗效的生物标志物。除了免疫抑制作用，FGL1还影响肿瘤过程，如上皮-间质转化(EMT)、增殖和耐药性。然而，FGL1更广泛的生物学功能及其在非小细胞肺癌中的作用尚未完全阐明。因此，FGL1在NSCLC中的生物学功能有待进一步研究。以往关于FGL1在肿瘤组织中异常表达的研究表明，IL6/Stat3信号通路、YY1、HNF1a等因素可能影响FGL1的转录。为了阐明FGL1在NSCLC中异常表达的原因，需要进一步研究FGL1的上游调控机制。 FGL1敲低抑制NSCLC的增殖和转移 02 研究人员通过表型实验来阐明FGL1对NSCLC细胞恶性行为的影响。在NSCLC细胞系中，研究人员发现A549和H1975细胞FGL1水平差异最大。因此，以A549和H1975细胞为实验模型，建立了稳定的FGL1沉默细胞系。采用MTS法和集落形成法评价了FGL1对NSCLC细胞增殖能力的影响。抑制FGL1表达可减少菌落形成，显著抑制增殖能力。随后研究人员对A549和H1975细胞进行迁移实验，发现抑制FGL1表达可抑制细胞迁移和侵袭。相反，FGL1在H1299细胞中的过表达增强了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。 FGL1敲低抑制NSCLC的增殖和转移 为探讨FGL1在体内的作用，研究人员将携带sh FGL1的慢病毒感染A549细胞建立异位异种移植瘤模型，并将其作为阴性对照慢病毒(sh NC)。这些结果表明，与对照组相比，FGL1敲低组的肿瘤生长显著下降。因此，FGL1通过促进肿瘤细胞的增殖和转移促进NSCLC的进展。FGL1可作为NSCLC新的治疗靶点和预测疗效的生物标志物，具有良好的临床应用潜力。 FGL1可预测NSCLC的疗效 03 研究人员收集了65例局部晚期或转移性NSCLC患者的外周血样本。患者的基线特征见表3。所有患者均接受标准一线ICI治疗，每2个周期进行1次疗效评估。非疾病进展(Non-PD)包括CR、PR和SD患者。共有42例患者采集了2次及以上的外周血标本。截至2024年1月31日，32例患者仍处于非PD状态，10例患者出现疾病进展(PD)。研究人员从外周血中提取CTCss并进行免疫荧光染色。结果显示，所有患者外周血CTCs中均可检测到FGL1。与基线相比，非PD组患者CTCs的FGL1表达显著降低。另一方面，与基线相比，PD组患者CTCs中FGL1的表达显著增加。更重要的是，研究人员发现随着治疗的进展，非PD组中FGL1的表达逐渐降低。相反，在PD组中，随着疾病的进展，患者的FGL1水平显著高于基线和2个周期的时间点。影像学结果显示，患者1接受以替雷利珠单抗为基础的一线治疗，治疗期间获得良好反应。随着FGL1+ CTCs比例的下降，患者的肿瘤评估显示为PR (PFS = 10.3个月)。而接受替雷利珠单抗一线治疗的患者2在治疗期间FGL1+ CTCs比例升高。肿瘤评估提示PD (PFS = 0.9个月)。患者3接受基于信迪利单抗一线治疗2个周期后，FGL1+ CTCs比例下降，肺部病灶减少。随后，FGL1+ CTCs比例增加，导致PD的肿瘤评估(PFS = 6.8个月)。此外，研究人员发现在CTCs中，KDM4A或Stat3的表达与FGL1呈正相关。FGL1与NSCLC预后密切相关，可作为预测NSCLC治疗后进展的生物标志物。 研究小结 04 综上所述，本研究结果表明FGL1在NSCLC组织中异常高表达，促进了NSCLC细胞的恶性行为。组蛋白去甲基化酶KDM4A作为Stat3信号通路的新型共激活因子，激活FGL1启动子，增加FGL1和其他Stat3靶基因的表达。CTCs上FGL1的表达可无创、实时监测NSCLC的疗效和预后，有望成为NSCLC精准治疗的潜在靶点。综上所述，本研究结果为开发新的靶向FGL1的NSCLC治疗策略提供了强有力的理论基础。 参考资料： https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-03140-6#Sec10 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

引言 B细胞是适应性免疫应答系统的重要组成部分，具有包括分泌病原体特异性抗体等多种免疫效应功能。生发中心（GCs）中的体细胞超突变和B细胞选择可提高抗体对免疫抗原的亲和力和特异性。因此，生发中心（GC）B 细胞对产生 GCs 和长效体液免疫至关重要。虽然关于生发中心调控的研究不在少数，且代谢可能影响了B细胞亚群的多样性，但生发中心B细胞（GC B）的形成与功能是否依赖或决定于一种共有的代谢方式，是一个极其令人感兴趣的问题。 2024年7月26日，清华大学生命学院江鹏团队在Nature Chemical Biology期刊上以长文的形式发表了题为Metabolic determinants of germinal center B-cell formation and responses（生发中心B细胞形成和反应的代谢决定因素）的研究论文。在本项工作中，研究人员揭示了高水平的核苷酸合成和氧化还原平衡能力是 GC B 细胞形成和反应所必需的，从而揭示了决定GC B 细胞命运的代谢基础和关键生化因素。 作者通过系统研究发现，在GC B 细胞的形成过程中，转录因子YY1选择性转录促进一碳代谢关键代谢酶MTHFD2的表达，后者通过代谢调控核苷酸前体物质和抗氧化能力从而调控B细胞生发中心形成；而通过靶向一碳代谢能够有效调控GC B 细胞的形成及特异性抗体生成。补充核苷酸和抗氧化剂可通过激活mTORC1信号通路而维持和提高GC B 细胞的形成及功能。重要的是，这一发现可以推广到还原力和核苷酸的另一个主要来源-磷酸戊糖途径。磷酸戊糖途径的抑制显著降低GC B 细胞的形成，而这一效应同样可以被核苷酸合成和抗氧化能力的回补而消除。这些实验结果表明，核苷酸合成和氧化还原平衡能力可能是GC B 细胞形成的共同的调控规律。 图1. 一碳代谢介导的核苷酸合成和抗氧化能力影响GC B 细胞形成(Credit: Nature Chemical Biology) 参考文献 https://doi.org/10.1038/s41589-024-01690-6 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 在基因组中，转录因子(transcription factors, TFs)通过特定序列的结合位点来调控基因表达。然而，不同TFs在基因启动子(promoters)和增强子(enhancers)中的结合位点常常呈现出相似的组合，这些结合位点如何编码多种重叠的基因表达程序仍然是一个重要的研究课题。 每个细胞都以独特的方式解释相同的基因组，这一过程的核心是序列特异性TFs，它们通过解读基因组中的调控序列语法来组织调控程序。然而，这些调控程序是如何编码的仍然大多不明。许多调控元件包含相似的TFs序列模式，大多数TFs广泛结合于调控序列，基因调控结果却因而变化不大。这导致我们目前难以仅从DNA序列预测基因表达模式，并且对大多数人类基因转录的调控方式还不清楚。之前的研究表明，TF结合位点的间距、方向和拷贝数，以及TF结合位点的亲和力，均能影响转录输出。然而，关于TF结合位点如何构建基因调控程序的普遍规律仍然很少，这限制了合理解释基因组或理解调控序列中突变对基因调控或疾病表现的影响。 7月17日Nature的研究报道“Position-dependent function of human sequence-specific transcription factors”，通过研究人类序列特异性转录因子在不同转录起始位点(transcription start sites, TSSs)的功能，揭示了TFs对转录起始的影响是位置依赖的。通过分析TF结合位点相对于TSS的位置，研究人员发现了多个具有高度优选位置的序列模式。 该研究利用自然遗传变异、内源性TF蛋白水平的扰动以及大规模并行分析自然和合成的调控元件的方法，展示了TFs结合对转录起始的影响是位置依赖的。具体而言，研究人员发现在不同的TSSs附近，某些TFs的结合位点具有显著的定位偏好。例如，NRF1、NFY和Sp1等经典激活因子不仅能够激活也能够抑制转录起始，其功能取决于它们相对于TSS的精确位置。该研究还展示了这些TFs和它们的间距共同引导了转录起始的位置和频率。这些发现揭示了相似的TF结合位点组合如何根据其空间配置产生不同的基因调控结果，并说明了DNA序列多态性可能如何导致转录变异和疾病。 该研究发现在转录起始点周围，TF结合位点的偏好位置是这些因子功能的反映，体现了它们在调控转录起始中的多种机制作用。该研究揭示了如何通过结合位点的空间配置来解码基因组中的调控信息，这对于理解基因调控和非编码DNA突变如何导致疾病有重要意义。 在基因组中，转录因子（Transcription Factors, TFs）通过特定序列的结合位点调控基因表达。然而，不同TFs在基因启动子（Promoters）和增强子（Enhancers）中的结合位点常常呈现出相似的组合，这些结合位点如何编码多种重叠的基因表达程序仍然是一个重要的研究课题。为了揭示TFs结合对转录起始的影响是否是位置依赖的，该研究利用自然遗传变异、内源性TF蛋白水平的扰动以及大规模并行分析自然和合成的调控元件的方法进行实验。 研究团队设计了三种不同的DNA插入片段，用于TSS-MPRA（Massively Parallel Reporter Assay）分析。每种设计包含400-500个DNA插入片段，长度为155 bp，并与4或5个独立的11 bp条形码耦合，以优化其分子特性和多样性，从而每种设计生成2000个DNA插入片段 。 通过分析TF结合位点相对于TSS的位置，研究人员发现了多个具有高度优选位置的序列模式。例如，NRF1、NFY和Sp1等经典激活因子不仅能够激活也能够抑制转录起始，其功能取决于它们相对于TSS的精确位置 。 细胞培养与RNA提取：研究使用U2OS、HepG2、HEK293T和Vero E6细胞，在37°C和5% CO2的条件下培养，培养基为含10% FBS的DMEM。使用siRNA和mRNA进行转染，并在24小时后收集RNA样本 。 csRNA-seq分析：csRNA-seq（small capped RNAs, ~20–60 nucleotides）和总小RNA-seq输入测序读数使用HOMER工具进行修剪，并与相应的基因组（GRCh38/hg38, GRCm38/mm10）比对。仅考虑唯一比对的读数（MAPQ≥10），并丢弃剪切或软剪切的比对读数，以确保准确的TSS位置 。 突变分析：通过TSS-MPRA评估TF结合位点突变对转录起始的影响，选择133个人类启动子和增强子进行突变。突变后的TF结合位点在其自然富集的位置上与转录抑制相关，而在其他位置上的突变则与转录起始增加相关 。 转录因子（TF）功能的依赖位置效应（Credit: Nature） 核苷酸频率偏差：在图a中，展示了在人类U2OS细胞的TSS附近的核苷酸频率偏差。这些数据揭示了在TSS区域内，核苷酸的分布存在显著的偏差。 TF结合位点富集：图b展示了许多TF结合位点在基因组范围内活跃TSS的特定位置上显著富集。NRF1、NFY和Sp1等TF在TSS上游显示出明显的富集，而在TSS下游则显著减少。 结合位点的富集或耗尽模式：图c展示了结合位点相对于TSS的位置分布，使用HOMER2工具识别出TF结合位点在TSS相对位置上的富集或耗尽情况，例如NRF1结合位点在TSS上游显著富集。 结合位点的功能分布：图d总结了463种已知人类TF结合位点在TSS相对位置上的富集或耗尽情况，展示了这些结合位点在不同位置的分布规律。 结合位点位置与转录活性的关系：图e和图f展示了NRF1结合位点相对于TSS的位置如何影响其转录活性。通过敲除NRF1，发现结合位点在TSS上游的TSS转录活性降低，而结合位点在TSS下游的TSS转录活性增加。 模型验证：图g通过过表达一个无转录活化域的NRF1突变体（dnNRF1），进一步验证了结合位点相对于TSS的位置如何影响转录活性。结果显示，当NRF1结合位点位于TSS上下游时，均会导致转录活性降低。 NRF1功能模型：图h展示了NRF1结合位点位置对TSS去抑制的模型，提出了NRF1在TSS上游结合位点可能通过空间阻碍机制抑制下游TSS的转录起始。 TF结合位点的定位偏好 研究发现，在转录起始点周围，TF结合位点的偏好位置是这些因子功能的反映，体现了它们在调控转录起始中的多种机制作用。例如，NRF1位点更倾向于位于TSS上游，而YY1位点则偏好位于TSS下游。 自然遗传变异揭示了位置依赖的功能和不同类别的转录因子（TFs）（Credit: Nature） 遗传变异对基因调控的影响：图a和b展示了基因组中的自然DNA多态性如何显著影响基因调控。在这两个示例中，SPRET小鼠株系中的遗传变异消除了NF-κB（p65）结合位点，这与下游转录起始的减少（图a）或解除转录起始的抑制（图b）相关。这些结果表明基因调控是位置依赖的，突变的结合位点相对于TSS的位置决定了其影响。 TF结合位点的功能依赖位置：图c显示了Sp1结合位点突变对转录起始的影响，结果表明这些结合位点对转录起始的影响是位置依赖的。变异使Sp1结合位点削弱，在其优选位置（上游TSS）时显著与转录减少相关，而在下游TSS位置时则显著与转录增加相关。 信号依赖的TF功能：图d展示了刺激NF-κB（p65）结合位点的突变在不同时间点的影响，表明这些结合位点的功能在受到KLA刺激后显著改变，进一步证实了TF功能的位置信号依赖性。 TF类别的分类：图e总结了TF结合位点的功能类别，分为纯激活因子（如PU.1），纯抑制因子（如ZEB2）和双功能因子（如Sp1）。这些分类表明TFs在调控转录起始中的功能依赖于其结合位点相对于TSS的位置。 全基因组分析：图f展示了全基因组范围内的TF结合位点突变影响，揭示了463种已知人类TF结合位点中有300种以上的结合位点在至少一个位置上与转录起始变化显著相关。TF结合位点的功能影响根据其相对于TSS的位置进行分类，表明这些TF在基因调控中的功能是高度位置依赖的。 合成DNA序列的实验验证 为了验证这些发现，研究团队设计了一种合成的150 bp DNA序列，并在整个序列中以2 bp为增量插入NRF1、NFY、YY1或Sp1的结合位点。TSS-MPRA捕捉到的结果显示，TF结合位点的插入常常导致新的TSSs出现，进一步支持了TF结合位点对RNA聚合酶II招募和定位的强烈影响。 自然增强子区域的验证 研究还在自然增强子区域进行了NRF1结合位点扫描，结果显示，NRF1结合位点的位置不仅影响转录起始的位置和频率，而且其他TF结合位点的存在也会对NRF1的功能产生影响。 疾病相关变异的分析 通过分析疾病相关的变异位点，研究发现这些变异位点通常位于TF结合位点附近，且这些变异会显著影响TSS选择，从而改变基因表达水平和基因调控程序。例如，GWAS鉴定的变异位点rs11122174位于一个NRF1结合位点内，显示出与邻近TSS位置相关的位点依赖性变化。 基因组中的TF定位效应 在全基因组范围内，TF结合位点的定位与其功能存在显著相关性。例如，活化因子如Sp1、NRF1和NFY在其结合位点位于TSS上游时促进转录起始，而当这些位点位于TSS下游时则抑制转录起始 。 多重TF结合位点的协同作用 通过分析多个TF结合位点的间距和相对位置，研究发现这些TF的协同作用能够显著影响转录起始的位置和频率。这些发现揭示了TF结合位点的空间配置在基因表达调控中的关键作用 。 该研究揭示了TF结合位点的空间配置如何解码基因组中的调控信息。这些发现对于理解基因调控和非编码DNA突变如何导致疾病具有重要意义。通过进一步的研究和实验验证，未来有望在精准医疗和基因治疗领域取得重要突破。例如，利用TF结合位点的定位偏好，可以设计更有效的基因调控工具，用于治疗因基因表达失调引起的疾病。 总之，该研究通过系统的实验设计和数据分析，揭示了转录因子结合位点的空间配置在基因表达调控中的关键作用，为理解复杂的基因调控网络提供了新的视角。未来的研究可以进一步探索其他TFs的定位偏好及其在不同生物学过程中的功能，从而推动基因组学和生物信息学的发展。 参考文献 Duttke SH, Guzman C, Chang M, Delos Santos NP, McDonald BR, Xie J, Carlin AF, Heinz S, Benner C. Position-dependent function of human sequence-specific transcription factors. Nature. 2024 Jul 17. doi: 10.1038/s41586-024-07662-z. Epub ahead of print. PMID: 39020164. https://www.nature.com/articles/s41586-024-07662-z 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述