C4A family

摘要：重组腺相关病毒（AAVs）已经成为有前途的基因传递载体，导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基于AAV的基因疗法，欧洲药品管理局（EMA）也批准了一种。尽管AAV是多项临床试验中治疗性基因转移的领先平台，但宿主对AAV载体和转基因的免疫反应阻碍了它们的广泛应用。多种因素，包括载体设计、剂量和给药途径，共同影响了AAVs的整体免疫原性。对AAV衣壳和转基因的免疫反应涉及最初的先天感知。随后，先天免疫反应触发适应性免疫反应，以引起针对AAV载体的强烈和特定的反应。AAV基因疗法的临床试验和临床前研究提供了有关与AAV相关的免疫介导毒性的重要信息，但研究表明，临床前模型未能准确预测基因传递在人类中的结果。本综述讨论了先天和适应性免疫反应对AAVs的贡献，强调了挑战和潜在策略，以减轻这些反应，从而增强AAV基因疗法的治疗潜力。 1.引言 近年来，使用重组腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗取得了令人鼓舞的成果。除了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的三种AAV基因治疗产品Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX，分别用于治疗Leber先天性黑蒙、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和血友病B型，欧洲药品管理局（EMA）最近还批准了一种AAV5-因子8载体（Roctavian）用于治疗血友病A型患者。目前，正在进行大量的AAV基因治疗临床试验，针对多种疾病，包括血友病、神经退行性疾病和肌营养不良症。然而，阻碍这些试验临床成功的一个因素是AAV的免疫原性，这在该领域仍然是一个未解决的挑战。 已经鉴定并分类了13种不同的AAV野生型血清型和100多种衣壳变体。AAV最初在1965年作为腺病毒（Ad）制剂中的污染物被发现，是自然存在于多种脊椎动物物种中，包括人类和非人灵长类（NHPs）的细小病毒，但从未与任何已知疾病相关联。AAV迅速成为体内基因传递的首选载体，并携带一个由反向末端重复序列（ITRs）包围的转基因表达盒，而不是病毒蛋白编码序列。这些ITRs源自野生型AAV2，是复制和包装所需的唯一顺式作用序列，但它们是非编码区域。AAV作为染色体外DNA存在，能够在非复制细胞中实现稳定转基因表达。尽管AAV的免疫原性较弱，但在AAV基因治疗临床试验中观察到的免疫反应限制了其治疗应用。由于AAV载体不包含任何表达的病毒基因组，因此在基因转移过程中引入的唯一外来抗原来源是病毒衣壳和转基因盒。然而，宿主对AAV载体和传递的转基因的免疫反应影响了有效和稳定的转基因表达。 已经做出了重大的研究努力来评估与AAVs相关的免疫介导毒性。免疫系统的主要作用是识别自身与非自身，以保护免受病原体侵害。包括补体系统在内的先天免疫反应可以被AAV衣壳和AAV基因组以及其他宿主特异性因素触发。随后的激活信号有助于招募抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞，这些细胞负责介导适应性免疫。许多报告已经剖析了适应性免疫反应对AAVs的作用。由于AAV在人类中的广泛传播，许多人群中普遍存在针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体（NAbs）。这些抗体可以阻止AAV转导目标细胞。此外，还可能针对传递的转基因产生抗体，这可能中和可溶性转基因产品并干扰成功的基因治疗。此外，针对衣壳的细胞介导的细胞毒性T细胞反应影响转基因表达，并导致转导细胞的清除，阻碍治疗效果。近年来，接受高系统剂量AAV治疗的SMA1、杜氏肌营养不良症（DMD）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）患者经历了不同程度的不良反应。这些结果在很大程度上可以归因于对载体的先天和适应性免疫反应。因此，了解免疫系统对AAV的反应对于提高AAV基因治疗的安全性和治疗效果至关重要。 AAV载体激活宿主免疫反应取决于多种因素，包括给药途径和剂量，宿主细胞和体液遇到载体的部位，载体组分以及转基因产品。直接注射到视网膜下空间，如第一个FDA批准的AAV载体的途径，导致较少暴露于血浆蛋白、循环抗体、血细胞和组织驻留的吞噬细胞。注射到其他部位，如中枢神经系统（CNS），可能在一定程度上限制了血清抗体在目标细胞进入之前的暴露。相比之下，AAV的静脉注射使载体广泛暴露于血细胞、血浆蛋白，包括抗体，以及广泛的组织驻留细胞，如肝脏内的Kupfer细胞。最大限度地发挥潜在的载体-抗体相互作用导致降低基因治疗的有效性或安全性。几乎所有衣壳类型和给药途径，广泛生物分布的AAV载体基因组到肝脏，取决于所给剂量。因此，虽然直接注射途径可能在很大程度上绕过了预先形成的抗体，但对载体组分的新的免疫反应可能仍然很强。最后，某些宿主反应仅在非常高剂量的静脉AAV中观察到，这表明这些宿主反应的阈值效应。这表明在评估AAV基因治疗的免疫反应时，需要考虑多种因素，而不仅仅是AAV载体的组成部分。 在这篇综述中，我们提供了针对AAV衣壳和转基因的先天和适应性免疫反应的概述，并讨论了规避这一主要障碍的策略，以发展成功的基于AAV的治疗性基因传递平台。 2.对腺相关病毒（AAVs）的免疫反应 免疫反应可以分为先天和适应性免疫反应。在以下部分中，我们简要概述了AAVs刺激的先天和适应性免疫途径，并讨论了AAV感染响应中激活的机制，这些机制导致转基因表达的抑制（图1）。 图1 AAV基因治疗中的免疫反应。AAV衣壳或引入的转基因可以被先天免疫系统识别，导致细胞因子产生、先天免疫细胞激活、补体激活，并为适应性免疫反应做好准备。在MHC I分子上的衣壳肽段或传递的转基因呈递导致CD8+ T细胞激活和转基因表达的清除。在MHC II上的抗原呈递激活CD4+ T细胞，这导致细胞因子的产生，并进一步诱导体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。Treg的激活导致细胞和体液免疫反应的抑制以及转基因表达的长期维持。AAV：腺相关病毒，APCs：抗原呈递细胞，FoxP3：叉头框蛋白3，GzmB：颗粒酶B，IFNγ：干扰素γ，MHC：主要组织相容性复合体，NAbs：中和抗体，PFN：穿孔素，rAAV：重组腺相关病毒，TCR：T细胞受体，TLR9：Toll样受体9，TNFα：肿瘤坏死因子α，Tregs：调节性T细胞。 2.1.对AAV的先天免疫反应 暴露于病原体时，先天免疫系统以一种非特异性方式被触发，并随后刺激激活更特异性的适应性免疫反应。在本综述中，我们简要讨论了感知AAV载体元素的关键参与者，这些元素导致先天免疫信号级联的激活。 2.1.1.病原体相关分子模式和模式识别受体 具有独特病原体相关分子模式（PAMPs）的外来病原体被高度表达在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上的模式识别受体（PRRs）识别。PRRs已被分类为不同的家族，即Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）和DNA传感器。相应的PRRs识别PAMPs主要激活信号通路，如通过适配蛋白如MyD88激活NF-κB。这些信号级联诱导主要组织相容性复合体（MHC）基因表达和促炎细胞因子或Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）的分泌。分泌的IFNs和细胞因子反过来介导表达限制病毒复制的基因，并刺激适应性和记忆免疫反应。适应性抗衣壳体液和细胞毒性免疫反应已被证明在体内受到限制，通过抑制先天免疫激活途径。 TLR介导的信号，触发先天免疫和随后激活适应性免疫反应，是重要的AAV感知机制。TLRs主要表达在免疫细胞上，如DCs和巨噬细胞，以及一些非免疫细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。细胞表面TLRs识别病原体的膜成分，如脂蛋白和脂质，细胞内TLRs识别病原体衍生的核酸。研究表明，细胞内TLR9有助于对转基因和衣壳的免疫反应。除了ITRs，插入的转基因、启动子序列和载体表达的RNA可能包含TLRs识别的炎症信号。存在于Kupfer细胞或DCs中的内体TLR9，特别结合双链DNA（dsDNA）载体基因组中的未甲基化CpG二核苷酸。研究表明，密码子优化，一种提高转基因表达的技术，可能增加AAV载体中的CpG基序。TLR9的参与有利于激活AAV特异性细胞毒性CD8+ T细胞反应，由于MHC I上抗原呈递的增加。由IFN诱导的免疫反应导致AAV在小鼠中传递的转基因表达的丧失。此外，TLR9/MyD88途径不仅对激活AAV衣壳的CD8+ T细胞反应至关重要，而且对肝脏和肌肉定向的转基因。研究表明，空AAV衣壳本身也可以触发先天免疫反应，可能通过非实质肝细胞表面的TLR2介导。或者，一些研究报告称，抗AAV衣壳免疫球蛋白（Ig）G2抗体的产生不依赖于任何特定的TLR，而是依赖于B细胞中固有的MyD88信号。此外，其他研究表明，自互补AAV（scAAV）载体与单链AAVs（ssAAVs）相比，表现出对转基因的增加的先天免疫反应，可能由于TLR9/MyD88信号级联的增强激活。 细胞质DNA传感器，如环状GMP-AMP合成酶（cGAS），被AAV基因组激活。AAV转导可能导致细胞将其线粒体DNA释放到细胞质中，从而激活细胞质DNA传感器。另一种可能性是，AAV衣壳的蛋白酶体降解在进入后导致基因组暴露，然后可能被DNA传感器感知。最近的研究指出dsRNA传感器在先天感知AAVs中的作用。ITRs的内在启动子活性可以在细胞质中产生dsRNA中间体，这可能刺激黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因（RIG）传感器。在AAV转导人肝细胞后，一些人类受试者观察到MDA5和RIG-1的上调，触发IFN-β的产生。在灵长类视网膜中AAV转导后，也观察到高水平的MDA5和RIG-1。需要进一步的研究来阐明dsRNA形成在AAV转导细胞中启动适应性免疫反应中的作用。 2.1.2.AAV与补体系统 补体系统由多种可溶性和膜结合蛋白组成，是无细胞先天免疫系统的一部分。它可以通过三种不同的途径被激活——经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径与抗体结合到抗原靶标上协同工作，而替代途径是通过外来大分子与循环补体成分的相互作用而被激活，因此不需要预先形成的抗体。这三条途径汇聚在补体成分C3转化酶上，它将C3蛋白裂解为功能性亚基C3a和C3b，最终形成终端膜攻击复合体。 AAV介导的补体激活成为了许多近期研究的焦点。一项研究表明AAV衣壳与C3相互作用，导致巨噬细胞中AAV2的摄取增加，并随后上调了如IL-8、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白等细胞因子。缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠对AAV没有表现出强烈的体液免疫反应，这表明补体系统在产生AAV特异性抗体中发挥作用。 在DMD和SMA1的临床试验中，接受静脉AAV剂量>1×10^14病毒基因组(vg)/kg的患者表现出补体激活和血栓性微血管病(TMA)的症状。此外，最近在一份新闻稿中报告，两名接受5×10^13 vg/kg AAV-LK03的甲基丙二酸血症(MMA)患者在最近出现了TMA。这些患者中替代补体途径的激活似乎导致血小板激活并与白细胞和内皮细胞结合，从而触发消耗性血小板减少症、微血管性贫血和播散性血管内凝血，这由D-二聚体和纤维蛋白裂解产物的升高证明。在一些患者中，这些机制可以发展成一系列不同程度的症状，如呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）在AAV给药后（NCT03362502和NCT03368742）。这种综合征通常在输注后5-10天发展。Eculizumab的治疗已在AAV接受者中用于TMA综合征，以中断TMA级联。然而，这些试验的结果尚属初步，需要进一步调查。 2.2.适应性免疫反应 除了启动对AAV的初级免疫反应外，先天免疫还为适应性反应做好准备。适应性免疫反应诱导抗原特异性反应，同时创建免疫记忆。适应性免疫由两个主要机制组成：通过B细胞和抗体的体液免疫，以及通过细胞毒性CD8+ T细胞的细胞免疫。CD4+辅助T细胞在体液和细胞免疫中都是关键的中介，通过激活B细胞和细胞毒性T细胞。 在初次接触AAV后，先天免疫细胞通过PRRs的表达和细胞因子的释放被广泛激活。在长期接触AAV后，如DCs的APCs通过转导或吞噬作用摄取AAV颗粒，并向B或T细胞激活呈现处理过的抗原。B细胞识别可溶性或呈现的抗原并产生抗体。T细胞的激活涉及辅助CD4+细胞，它们进一步诱导炎症反应和激活CD8+细胞毒性T细胞，导致去除AAV感染的细胞。在炎症信号解决后，调节性T细胞抑制免疫反应以恢复稳态。以下部分将强调适应性免疫反应在AAV基因治疗中的作用。 2.2.1.体液免疫反应 体液免疫是通过产生针对特定抗原的抗体来介导的。抗体通过多种机制发挥作用：NAbs阻止病原体进入细胞，覆盖在病原体表面的抗体将它们标记为吞噬作用，或抗体结合导致经典补体途径激活的开始。 体液免疫反应，特别是NAbs的产生，对AAV成功基因传递构成了最有效的障碍之一。AAV转导后，APCs向CD4+辅助T细胞呈现抗原，这导致B细胞成熟、扩增、类别转换，并增加针对AAV衣壳的抗体产生。 在人类中，抗AAV NAbs（以其损害AAV感染或病理学的能力为特征）通过自然接触野生型AAVs形成。根据AAV衣壳变体的不同，2-60%的人类血清含有限制AAV基因治疗应用的抗体。其中，抗AAV2和AAV1 NAbs是AAV衣壳变体中最常见的NAbs。然而，抗AAV NAbs通常在多个衣壳变体之间高度交叉反应，可能由于AAV衣壳变体之间的高度同源性。一些研究表明，在AAV给药后，产生的抗体对其他未给药的AAV衣壳变体也具有交叉反应性。对AAV NAbs的表征显示IgG1是NAbs中的主要亚类，其次是IgG2和IgM。接受AAV基因治疗的患者也会发展出特异性抗体，防止AAV的后续再剂量。在一项研究中，NHP中AAV8的再给药没有导致转基因表达增加，但观察到抗AAV抗体水平增加。然而，目前的治疗方法表明，由于载体稀释或丢失，可能需要在新生儿、儿童和成年退行性疾病患者中重复给药AAV。 结合抗体（BAbs）参与免疫细胞的招募和触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。一项研究报告称，在体外存在BAbs的情况下增加了衣壳内化。此外，与接受NAbs免疫的小鼠相比，接受BAbs免疫的小鼠显示出更有效的肝脏转导。BAbs在AAV免疫反应中的作用目前正在进一步调查中，可能会突出BAbs可能的作用以及重新考虑筛选技术的必要性。 大多数系统性（静脉内）AAV基因治疗的临床试验已经排除了针对使用的血清型的显著抗衣壳抗体的患者。例如，BioMarin AAV5-FVIII载体（Roctavian）的关键试验排除了可检测到抗AAV5 NAbs滴度和抗AAV5总结合抗体（TAb）滴度的患者。目前测量抗衣壳抗体的检测包括TAb检测和NAb检测，但NAb检测和TAb检测都难以标准化。NAb检测是基于细胞的或基于小鼠的，因此昂贵、耗时，并有低估TAb滴度的风险。由于TAb检测筛选出针对AAV衣壳的所有抗体，包括中和和非中和的，所得的滴度更为保守和安全。此外，FDA和EMA已经批准了不同的衣壳血清型，每种产品都需要开发不同的抗AAV抗体检测。例如，AAV9的伴随诊断检测不适用于AAV1、AAV2或AAV5。最近的一项研究建立了基于Meso Scale Discovery（MSD）的检测，用于定量BAbs和NAbs，允许快速和定量评估AAV特异性抗体。 除了体液免疫反应外，T细胞介导的反应在限制AAV基因治疗中也起着重要作用，如下一节所强调的。 2.2.2.衣壳特异性T细胞反应 T细胞反应由多种T细胞亚群介导。效应CD4+ T细胞通过细胞因子产生诱导炎症和免疫激活。而细胞毒性CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素和炎症细胞因子介导感染细胞的靶向杀伤。此外，Tregs通过与免疫细胞的直接相互作用或产生免疫抑制细胞因子，防止超免疫激活，并将免疫反应恢复到稳态。 在动物研究中，由AAV引起的细胞介导的免疫反应导致转基因表达丧失并不普遍观察到。启动T细胞反应需要通过APCs进行抗原呈递。内源性或细胞内抗原在MHC I上呈递，而外源性或细胞外抗原在MHC II上呈递。在某些APCs中，交叉呈递允许通常在MHC II上展示的外源性抗原在MHC I上呈递。研究表明，浆细胞样DCs、常规DCs和CD4+ T细胞之间的合作导致AAV颗粒在MHC I上的交叉呈递，随后激活CD8+ T细胞。细胞介导的免疫反应首次在血友病临床试验中观察到，其中AAV2表达人类凝血因子9（hFIX）的肝脏传递导致肝脏转氨酶升高和转基因表达丧失。后续研究证实了衣壳特异性CD8+ T细胞的存在。衣壳特异性CD8+ T细胞的扩增可能清除AAV转导的细胞，导致转基因表达丧失和靶器官炎症。此外，APCs在MHC II上呈递衣壳肽段，导致CD4+ T细胞激活。CD4+ T细胞的激活导致细胞因子的产生，进一步激活体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。在随后的研究中，接受高剂量AAV8-hFIX的人类受试者观察到衣壳特异性T细胞反应，导致肝脏酶升高和hFIX表达下降。类固醇治疗降低了肝脏酶并部分恢复了hFIX表达。此外，中等剂量的AAV给药导致可检测到循环的衣壳特异性T细胞，但没有观察到转氨酶升高和转基因表达丧失。进一步的研究表明，衣壳特异性免疫反应是剂量依赖性的，低剂量的AAV载体给药更有可能引起可由类固醇管理的轻度炎症。额外的表征显示衣壳特异性CD8+ T细胞在体外通过MHC I上的衣壳肽段交叉呈递后消除人类肝细胞。 与其他试验观察到的T细胞免疫反应不同，特别是在肌肉导向的试验中，并没有清除转基因表达。包括在大多数肌肉传递试验中使用非分泌性转基因，以及反应性T细胞的凋亡等因素，使得分析这些结果变得复杂。在α1-抗胰蛋白酶（AAT）缺乏症和Glybera研究中，除了CD8+ T细胞外，还报道了CD4+叉头框P3+（FoxP3）T细胞的浸润。同样，在DMD临床试验中限制或未观察到衣壳特异性T细胞反应。由于Tregs具有抑制免疫反应的能力，因此在局部肌肉导向的AAV基因治疗中诱导免疫耐受和转基因的长期表达归因于Tregs。尽管如此，肢带型肌营养不良的AAV基因治疗导致了衣壳特异性T细胞反应。 需要额外的研究来进一步表征T细胞免疫反应以及Tregs在诱导免疫耐受中的作用，这需要合适的动物模型。一些研究已经集中在模仿在动物中观察到的人类免疫反应。向AAV衣壳引入卵清蛋白免疫优势表位并未能触发特定的杀伤。然而，将扩增和激活的衣壳特异性T细胞转移到小鼠体内，导致转基因表达减少和转导细胞的丧失。此外，用表达VP1衣壳蛋白的AAV或腺病毒免疫小鼠，导致衣壳特异性T细胞的诱导。另一项研究利用嵌合抗原受体（CAR）技术创建衣壳特异性T细胞。AAV-CAR T细胞在体外对多种AAV衣壳变体有反应，并在体内减少了转基因表达。然而，AAV的趋向性和免疫反应在人类和小鼠中并不相同。需要进一步的研究来创建能够准确模拟人类AAV特异性T细胞反应的动物模型。 除了在引入AAV后观察到的细胞介导反应外，免疫记忆在第一次接触AAV后形成，无论是通过AAV基因治疗还是暴露于野生型AAV。这种记忆反应的激活不需要先天免疫反应。与体液免疫类似，衣壳特异性T细胞反应在年幼儿童中较少见，可能在婴儿期在感染野生型AAV后产生。研究表明，在二次AAV暴露后，衣壳特异性记忆T细胞会产生细胞因子并获得细胞毒性表型。一些研究对健康人类受试者的T细胞反应进行了表征，并报告了10-100%的人类受试者具有针对多种AAV血清型的功能性循环衣壳特异性T细胞。进一步分析证实，大多数AAV特异性CD8+和/或CD4+ T细胞属于中央记忆亚群。尽管AAV特异性免疫反应对基因治疗和再剂量研究至关重要，但传递的转基因可以引起免疫反应。下一节将讨论针对转基因的免疫反应。 3.针对转基因的免疫反应 传递的转基因产品通常包含外来抗原，因此它们可能诱导体液或细胞免疫反应，中和分泌性转基因并清除转导细胞。在暴露于AAV传递的转基因后，APCs通过转导或吞噬作用获得蛋白质产物，并在MHC I或MHC II分子上呈现处理过的抗原，分别导致细胞或体液免疫反应。针对转基因的免疫反应持续到转导细胞被清除，或由Tregs或T细胞耗竭抑制免疫反应。然而，与腺病毒和慢病毒载体相比，由于AAV对APCs的转导效率较低，AAVs诱导针对转基因的免疫反应的风险较低。在这篇综述中，我们总结并讨论了转基因免疫反应的复杂性。 迄今为止，AAV基因治疗中针对转基因的免疫反应主要在肌肉导向的临床试验中报告。在一项研究中，AAV的肌肉传递在一些患者中导致了针对转基因的抗体形成，这在NHP研究中已被预测。此外，研究表明，在没有残留蛋白表达或大片段缺失的基因转移的人类受试者中，针对转基因的免疫反应风险更高，而在具有错义突变的受试者中，基因传递更易被耐受。一些临床试验通过简单地不招募有更高风险发展反应的患者来控制针对转基因的免疫反应。在大多数肝脏导向的临床试验中，排除了有蛋白替代疗法免疫反应史或空突变的人类受试者。然而，在庞贝病临床试验中，AAV被肌肉注射，观察到缺乏功能性酶表达或非常低水平的患者出现免疫反应，类似于蛋白替代疗法中观察到的情况。在一项肌肉传递AAV的AAT临床试验中，只有在一个具有常见非病理性多态性和较不常见的HLA-单倍型的人类受试者中观察到转基因免疫反应。此外，当在肌肉传递hFIX中包括具有错义突变的患者时，未观察到转基因免疫反应。最近的一篇摘要表明，包括在转基因蛋白中存在的N-末端表位的基因组缺失的DMD患者，对转基因免疫反应的风险更高。这些观察表明，残留蛋白表达水平和患者基因型在影响针对转基因的免疫反应方面发挥了更关键的作用。此外，在临床环境中，眼部和鞘内AAV基因传递显示出有限的与转基因相关的免疫反应，可能是由于它们的分隔和减少的抗原呈递。AAV衣壳变体是另一个促进针对传递转基因的免疫反应的因素。在APCs中转导效率较低的衣壳可能具有较低的风险诱导针对转基因的免疫反应。 总结来说，针对转基因的免疫反应主要在没有残留蛋白表达的患者中观察到；因此，临床研究更倾向于选择具有错义突变的受试者或在蛋白替代疗法中没有反应的受试者。然而，这种方法排除了需求最迫切的目标人群。为了满足这一未满足的需求，已经采用了几种策略，将在第5.3节中描述。 4.监管批准后的AAV载体免疫反应 临床试验在标准化条件下进行，涉及的小规模、同质人群与批准后的患者选择和治疗条件不同。因此，可能会观察到安全性概况和反应的差异。迄今为止，已有三种基于AAV的药物（Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX）获得FDA批准，为许可后研究提供了更大的数据集。在这一部分，我们简要讨论与Luxturna和Zolgensma相关的整体安全性概况和免疫反应。 4.1.Luxturna Luxturna（voretigene neparvovec）是FDA批准的第一种用于治疗双等位基因视网膜色素上皮特异性65千道尔顿（RPE65）突变相关视网膜营养不良的眼部AAV基因治疗。通过单次AAV基因传递，将RPE65基因的功能性拷贝直接传递到视网膜细胞，恢复患者的视力。无论是对AAV2衣壳还是转基因，都没有观察到有害的免疫反应。报道了Luxturna的轻微免疫反应，并通过Luxturna的视网膜下传递前后的系统性皮质类固醇治疗得到了控制。同样，在用AAV2-ND4（玻璃体内注射）治疗的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中，体液和细胞免疫反应有限。Luxturna和LHON患者观察到的轻微免疫反应可以归因于局部注射到含有高浓度免疫调节神经肽和细胞因子的分隔环境中。 4.2.Zolgensma Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）是FDA批准的第一种基于AAV的基因替代疗法，用于治疗SMA。Zolgensma由一个自互补的、复制缺陷的AAV9组成，编码功能性SMN蛋白，通过单次静脉注射以1.1×10^14 vg/kg体重的剂量给药。 Zolgensma能够实现临床相关的治疗结果，并在减少SMA患者的过早死亡方面取得了有希望的结果。来自临床试验和市场后监测的数据显示，存在诸如肝毒性、血小板减少、TMA、心脏事件和神经节病等安全风险。在SMA许可后，报告了肝转氨酶的暂时升高，这些通过强的松治疗得到了解决。所有SMA患者都接受了预防剂量的强的松，但激素治疗的剂量和持续时间是可变的。当转氨酶水平低于正常上限的两倍时，才开始逐渐减少剂量。表现出急性肝衰竭的患者接受了暂时的高皮质类固醇剂量。对于接受长期激素治疗的患者，建议咨询内分泌学家以评估肾上腺功能不足。 肝毒性可能归因于衣壳特异性的细胞介导免疫反应。在急性疾病的情况下，即使经过长期皮质类固醇治疗，也可能考虑使用氢化可的松进行应激剂量。迄今为止，强的松已被证明在SMA临床试验和许可后经验中有效地恢复了肝转氨酶水平。然而，尽管接受了类固醇治疗，仍有SMA患者出现急性肝毒性的证据。诺华最近报告了两名儿童SMA患者因急性肝衰竭死亡。这些患者的肝功能严重受损，并迅速发展为肝性脑病和多器官衰竭。死亡发生在Zolgensma治疗后6-7周，开始逐渐减少强的松后。 除了肝毒性，其他不良反应包括短暂的血小板减少症。在一个患者中，观察到血小板减少症和多器官衰竭的晚期发作，但机制仍然不明。在接受Zolgensma治疗的1400多名患者中，FDA报告了9例TMA病例。EMA报告了在接受Zolgensma治疗的800名患者中有5例TMA病例。在基因治疗后第12天被诊断为TMA的一名患者，由于多种因素，面临致命结果。有趣的是，报告了该患者补体激活的生物标志物可溶性C5b9复合物（sC5b9）的水平增加。患者逐渐恶化，症状符合非典型溶血性尿毒症（aHUS）。根据儿童aHUS的治疗建议，患者接受了依库珠单抗治疗，这是一种单克隆抗体，已知可抑制补体因子C5的裂解。依库珠单抗注射导致EsC5b9 C3水平恢复正常，C3减少，C4正常，血小板计数轻微增加，表明1个月后TMA恢复。然而，在第40天，由于表皮葡萄球菌感染的发生，TMA复发，患者不幸心脏骤停。另一项研究报告称，在Zolgensma治疗1周后，也有三名患者发展为TMA，这表明了免疫介导的病因。其他因素，如并发细菌感染和最近的疫苗暴露，也促成了TMA。在两个病例中报告了通过替代途径激活补体系统，接受依库珠单抗治疗的一名患者没有显示出显著的临床改善。需要进一步调查，以评估依库珠单抗在由AAV基因治疗引起的TMA中的有效性。值得注意的是，其他基于AAV9的基因治疗在DMD和Danon病中也报告了伴有补体激活的TMA。未来的研究需要阐明补介导因素在SMA患者TMA中的作用。 最近的一项研究报告了一名接受Zolgensma治疗的SMA患者出现血嗜性淋巴组织细胞增多症（HLH）。连续3天使用高剂量的甲泼尼龙，随后几天逐渐减量，导致临床改善。因此，需要仔细监测炎症标志物，以避免因HLH导致的致命性。 5.少AAV基因治疗中免疫反应的策略 在这一部分，我们讨论可能的策略，以规避针对AAV衣壳和转基因的有害免疫反应，从而实现成功的转基因传递和表达（表1）。 表1 AAV基因治疗中的免疫反应及可能的调节策略 5.1.减少针对AAV的先天免疫反应的策略 正在积极开发免疫调节技术，以减少AAV载体的免疫原性，并允许安全和重复的干预。尽管在大多数试验中施用的皮质类固醇有助于调节免疫介导的毒性并实现长期转基因表达，但有些病例需要更复杂的类固醇方案和额外的方法，以潜在地减少载体和转基因的免疫原性。 5.1.1.克服Toll样受体激活和DNA感应 TLR激活在触发针对AAV载体的先天免疫反应中起着关键作用。规避TLR激活的策略旨在减轻这些反应。TLR9缺陷的小鼠显示出高水平的转基因表达，这一观察促使几个小组修改转基因序列，以干扰TLR9介导的识别。通过耗尽AAV基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR9信号，已被证明可以增强AAV介导的基因表达。耗尽CpG二核苷酸在免疫原性AAVrh32.33.33载体中显示出稳定的转基因表达，并减少了效应T细胞（Tef）的浸润。此外，CpG缺失在血友病B小鼠的肌肉注射中导致显著减少的CD8+ T细胞浸润，但没有影响抗体水平。ITR区域也含有高CpG含量，因此一项研究产生了功能性无CpG ITR。然而，由于ITR在包装中的关键作用，载体产量减少了约三倍。在另一项研究中，已报告在AAV基因组中加入TLR9抑制（TLR9i）DNA序列可以减少小鼠和猪的免疫反应。TLR9i由多个TTAGGG副本组成，也可以阻断DNA传感器，如cGAS。此外，抗疟药羟氯喹（HCQ）可能作为TLR9抑制剂。在小鼠和人体组织中，HCQ在AAV传递前1小时给药增强了转导效率。其他修改包括工程化表达盒，以便从3′ ITR阻断转录。因此，不会生成dsRNA，并且可以避免源自与细胞质dsDNA和dsRNA结合的先天免疫反应。在AAV表达盒中引入设计用于dsRNA传感器或其下游信号通路的短发夹RNA，可能用于规避dsRNA介导的先天免疫反应。采取多学科方法阻断TLR9激活和DNA感应，以规避先天免疫反应，可能会改善临床反应。 5.1.2.逃避补体系统激活 限制补体激活可能防止炎症反应和随后的组织损伤。Apellis Pharmaceuticals提出了使用一种名为APL-9的聚乙二醇化合成环状肽，它抑制补体激活的所有三条途径，以防止对AAV的补体激活。在I期测试中，静脉注射单剂量的APL-9能够限制补体激活，持续时间长达12小时。没有报告严重的不良事件，APL-9治疗能够完全抑制AH50溶血活性。在最近的一项研究中，APL-9减少了APCs上的CD86水平，AAV摄取和细胞因子/趋化因子分泌，以响应体外的AAV。由于在IgG耗尽的血清中确认了经典途径的参与，减少AAVs与抗体之间相互作用的治疗可能在防止补体激活方面有效。正在测试大量的补体抑制剂，从小分子抑制剂、siRNAs、适体、反义寡核苷酸、抑制肽、药理学药物到阻断抗体等，以抑制补体激活。依库珠单抗是一种针对补体超激活的单克隆抗体，通过抑制C5和MAC形成发挥作用。依库珠单抗已成功用于限制SMA和DMD AAV基因治疗中的补体激活(NCT03362502, NCT03368742, NCT03381729, NCT02122952)。未来需要进行进一步的研究，以抑制AAVs通过补体系统激活。 5.1.3.减少抗原呈递细胞中的转基因表达 正在开发限制免疫细胞激活的策略。例如，TLR9抑制性寡核苷酸恢复了由scAAV给药触发的增加的巨噬细胞浸润。限制泛素化并逃避蛋白酶体介导降解的蛋白酶体抑制剂可以减少MHC I分子上衣壳肽片段的呈递。通过阻断其他细胞的不需要表达，实现目标组织和细胞特异性表达的microRNA(miRNA)介导的去靶向是另一种策略。这种方法可以减少先天免疫细胞的抗原呈递，并随后阻断对AAV传递的转基因的适应性免疫反应。下面讨论了限制对AAV衣壳和转基因的适应性免疫反应的其他方法。 5.2.减轻对AAV衣壳的适应性免疫反应 AAV基因传递后的适应性免疫反应限制了转基因表达，并产生了抑制AAV重复剂量的免疫记忆。因此，正在采用几种策略来限制适应性衣壳特异性免疫反应。在以下部分中，讨论了克服针对AAV衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应的策略。 5.2.1.克服体液免疫反应的策略 AAV基因治疗受到NAbs形成的阻碍，因此采用了多种策略来克服体液免疫反应。需要系统给药AAV的患者尤其处于NAbs的更大劣势。一种方法是剂量受试者缺乏对AAV的预先存在的免疫力，这在年轻患者中更为常见，但在青少年和成人中则相当少。 由于NAbs的高流行率，已经采用了几种策略来抑制或消融基因治疗受试者的体液免疫反应。抑制体液免疫的主要方法是使用免疫抑制药物（IS）。一种广泛适用的策略是使用B细胞耗竭单克隆抗体。研究表明，使用利妥昔单抗，一种抗CD20抗体，进行B细胞耗竭后，NAb滴度降低的有希望的结果。利妥昔单抗与雷帕霉素，mTOR抑制剂，或与雷帕霉素和皮质类固醇的组合，在临床试验中成功诱导耐受并防止抗体形成。贝利木单抗，一种抗B细胞激活因子(BAFF)的抗体，是另一种B细胞耗竭抗体，在控制自身免疫疾病方面显示出有希望的结果。此外，使用ibrutinib，一种B细胞抑制剂，在小鼠模型中减少了针对AAV的初级抗体反应。然而，全身性IS可能增加感染风险，并且对于完全缓解高滴度NAbs无效。除了传统的IS，AAV载体和合成疫苗封装雷帕霉素(SV[rapa])的联合给药，ImmTOR，是另一种有希望的方法。ImmTOR治疗导致抑制AAV特异性抗体形成，并减少了B和T细胞的激活。最近的一篇摘要显示，ImmTOR与贝利木单抗联合给药减少了抗AAV IgM抗体，提供了更持久的抗AAV IgG抗体抑制，并允许在小鼠中多次重新给药AAV8载体。当ImmTOR与ibrutinib组合时，观察到减少的效果。然而，将ImmTOR与空AAV8联合给药给健康人体受试者只延迟了NAbs的形成。 多种方法专注于直接逃避NAbs。一种方法利用细菌衍生的抗体降解酶。另一种方法是血浆置换，它用于减少循环抗体，但可能无法完全根除NAbs或需要多个周期。此外，血浆置换去除总抗体含量，因此增加了传染病的风险。为了克服这个障碍，一项研究使用AAV特定的血浆置换柱从NHP的血浆中耗尽抗AAV NAbs，而不影响总IgG水平。另一项研究表明，AAV9颗粒结合到Sepharose珠子上在大鼠中选择性地耗尽抗AAV抗体。这种方法的治疗窗口有限，因为血浆置换不去除产生抗体的细胞。在另一项研究中，使用盐水冲洗或带气囊导管隔离目标组织与系统循环。这种策略相对侵入性，并且可能不适用于所有目标组织和AAV的系统给药。此外，在这项研究中，使用了NAbs低的NHP，这种方法在NAbs高的动物中的有效性需要进一步评估。建议使用最小暴露于NAbs的途径。在一项血友病临床试验中，与系统给药途径相比，AAV的肌肉传递对预先存在的NAbs不太敏感。此外，在动物模型中，直接将AAV传递到CNS被良好耐受。然而，改变给药途径可能会潜在地减弱转导效率并改变AAV载体的生物分布。 其他方法专注于AAV衣壳以调节体液免疫反应。一种方法是使用诱饵空衣壳吸收循环NAbs。空衣壳的添加通常不是有效的，可能会加剧AAV的免疫毒性并降低转导效率。此外，除了携带转基因的衣壳外，还生产大量空衣壳，这给过程增加了额外的复杂性和相关成本。 衣壳工程是另一种方法，用于生成具有所需趋向性和降低免疫原性的重组AAV。在NAb识别位点的修改可以提高转导效率。或者，通过定向进化产生的衣壳可以逃避NAb感应。与自然变体相比，由AAV2、AAV8和AAV9变体的残基组成的工程化AAV-DJ变体已被证明在存在人类静脉注射IgG的情况下转导肝细胞。此外，从人源化小鼠模型中分离的AAV3b对NAb识别不敏感，并且在人类肝细胞中具有更高的转导效率。尽管如此，与使用当前可用且研究充分的衣壳相比，工程化AAV衣壳是耗时的、劳动密集的，并且需要识别NAb识别位点。为了避免工程化AAV衣壳的复杂性，建议对AAV衣壳进行化学修饰，包括聚乙二醇化和聚合物封装。然而，这些化学修饰可能会潜在地降低转导效率，降低产量，改变AAV载体的生物分布，并导致抗聚合物抗体的形成。除了化学修饰的衣壳外，多项研究表明，外泌体封装的AAV可以在预先存在的免疫存在下转导目标细胞，诱导耐受性，并赋予AAV改变的趋向性。然而，用外泌体封装AAV可能进一步复杂化生产过程并引入核酸或蛋白质污染。 通常，AAV基因治疗的单一治疗可能不够。除了AAV基因治疗后的免疫反应外，暴露于野生型AAV导致预先存在的免疫力，阻碍了AAV再剂量。多项研究表明，CD28/B7和CD40/CD40L阻断导致炎症反应的缓解并允许载体再给药。在这个策略中，CTLA4融合蛋白与B7的相互作用比CD28具有更高的亲和力，导致免疫反应的下调。这种方法与一种抗CD40配体抗体结合使用，阻断了B细胞的刺激信号。尽管结果有希望，但CD28/B7和CD40/CD40L阻断广泛抑制NAbs并需要进一步调查。此外，血浆置换、衣壳诱饵和更换衣壳变体的缓解策略不是有效的。此外，免疫抑制和使用抗体降解酶不针对AAV特异性免疫反应。需要进一步研究开发更具体和有效的方法。更换衣壳变体是另一种允许AAV再剂量的选择，但受到AAV衣壳的不同趋向性、NAbs的交叉反应性和开发不同产品的复杂性的限制。逃避允许基因治疗的体液免疫反应仍然难以捉摸。包括给药途径、所需剂量和目标组织在内的几个变量在选择适当策略中起着关键作用。此外，使用除B细胞耗竭之外的其他策略，如针对IL-1β和IL-6的抗体、etanercept（TNFα抑制剂）或anakinra（IL-1R阻断剂）可能有助于调节AAV基因治疗中的体液免疫反应。使用一种或多种策略可能允许在否则不符合条件患者中进行AAV基因治疗。 5.2.2 克服细胞介导免疫反应的策略 与可以预测的患者体液免疫反应不同，患者对AAV的细胞介导反应在临床试验中差异很大。自从在血友病临床试验中首次观察到以来，通过免疫抑制方案广泛抑制了衣壳特异性T细胞反应。在AAV临床试验中使用的IS治疗包括类固醇、单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。类固醇通常用于临床试验，以通过影响T细胞受体信号减少T细胞激活和细胞因子产生。此外，它们增加抗炎细胞因子的产生和Treg增殖。类固醇通过抑制血管生成、白细胞迁移到炎症部位以及改变免疫细胞死亡和迁移来抑制炎症反应。如前所述，糖皮质激素被用于所有人类受试者中，以抑制Zolgensma试验中的衣壳特异性T细胞反应，然而在类固醇逐渐减少期间，两名患者死于急性肝衰竭。多项临床研究表明，使用类固醇未能防止转基因逐渐丧失。因此，一些研究专注于使用免疫抑制剂药物组合和优化治疗时机。环孢素和他克莫司下调IL-2转录，从而抑制T细胞增殖和激活。他克莫司的日常给药允许NHP中AAV传递的转基因持续表达。麦考酚酸莫非特（MMF）优先耗尽T和B淋巴细胞中的鸟苷核苷酸，并抑制它们的增殖。环孢素和MMF的组合在Glybera临床试验中使用，但未能抑制所有人类受试者的免疫反应。后续研究表明，在AAV剂量之前开始免疫抑制和额外的皮质类固醇治疗是有益的。体外研究表明他克莫司和环孢素抑制Treg增殖。一项研究表明，他克莫司治疗损害了肾脏和肝脏移植患者的Treg功能，而雷帕霉素对Treg有有益的效应。因此，雷帕霉素与利妥昔单抗或强的松的组合已在AAV临床试验中频繁用于诱导耐受。此外，环孢素和非耗尽性CD4受体抗体诱导Tregs并允许在小鼠中重新剂量。建议使用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米。体外和临床前动物研究表明，硼替佐米的给药可以防止内化的AAV降解，减少衣壳呈递，并增加通过增强AAV的核转移来提高转导效率。尽管应用广泛，系统性免疫抑制可能会导致Treg抑制和多种不良效应，包括肠道并发症、肌肉疼痛和头痛，这使得其他策略受到关注。 在AAV运输过程中，AAV衣壳表面的酪氨酸残基可以被磷酸化并随后泛素化，这导致衣壳降解并呈现在转导细胞表面。因此，建议突变表面酪氨酸，这导致AAV衣壳的呈递减少，T细胞毒性降低，并需要治疗剂量。多项研究减少了AAV的治疗剂量，并使用了转基因的超活性变体。并非每个转基因都有超活性版本，并且可能并不总是导致减少的T细胞反应。 除了前面讨论的策略外，降低给药剂量和去除空衣壳已被提出。这种方法试图减少AAV衣壳对抗原呈递的可用性。然而，降低AAV剂量可能会降低转导效率，并导致NAbs中和AAV。 Tregs的浸润和肌肉导向AAV基因治疗试验中转基因的长期表达强调了Treg在诱导免疫耐受中的作用。因此，Treg诱导表位，Tregitope，被纳入AAV衣壳结构，成功扩大了Treg并抑制了CD8 T细胞。除了工程化AAV衣壳，ImmTOR颗粒在衣壳特异性T细胞和体液免疫反应方面显示出有希望的结果。然而，这些新策略需要进一步的功效和安全性调查，因为它们是非抗原特异性治疗。 为了诱导局部和特异性耐受，另一项研究结合了Tregs抑制免疫反应的能力以及CAR的抗原特异性。在这项研究中，使用了AAV特异性CAR Tregs和多克隆Tregs，尽管存在衣壳特异性T细胞反应，但允许转基因表达。 在临床上，衣壳特异性T细胞反应主要通过使用类固醇来控制。免疫抑制增加了感染风险，并且在需要高剂量AAV时效果较差。因此，开发一种新的抗原特异性策略似乎是不可避免的。 5.3.减轻转基因免疫反应 为了避免针对传递转基因的免疫反应，已提出几种方法，包括限制目标人群、免疫抑制、使用组织特异性启动子、miR技术以及免疫细胞疗法。 短期使用环磷酰胺治疗，这是一种烷基化剂，可减少促炎细胞因子的产生，在小鼠和犬模型中成功实现了基因表达。此外，在犬研究中，使用环孢素、抗胸腺细胞球蛋白和MMF的短暂免疫抑制预防了免疫反应并实现了转基因表达。除了系统性免疫抑制外，临床前研究指出了组织特异性启动子在减少针对传递转基因的免疫反应中的作用。当转基因由普遍性启动子驱动时，与肌肉特异性启动子相比，观察到较低水平的转基因表达和强烈的体液和细胞免疫反应。此外，使用肌肉特异性启动子在犬模型中实现了转基因的稳定表达，而没有免疫反应。此外，NHP的一项研究报告称，肝脏导向的表达可能有助于限制抗转基因抗体，诱导耐受，并允许重新使用不同衣壳变体的再剂量。 其他研究利用Tregs来抑制与转基因相关的免疫反应。一项研究使用多克隆Tregs来抑制蛋白替代疗法中因子8和9的免疫反应。然而，Tregs的低频率和潜在的非特异性免疫抑制限制了多克隆Tregs的应用。因此，多项研究产生了转基因特异性CAR Tregs，在抑制转基因诱导的免疫反应方面显示出有希望的结果。TRuC Tregs是通过将抗人凝血因子VIII (hFVIII) 的单链可变片段与T细胞受体融合而开发的。这项研究表明，与FVIII-CAR Treg相比，F8-TRuC Treg具有更优越的抑制功能。B细胞抗体受体（BAR）是通过将因子8抗原和T细胞刺激信号域结合而产生的。BAR T细胞在体外和体内成功消除了FVIII反应性B细胞。随后，通过将Tregs与BAR构建物共转导而创建的BAR Tregs，在抑制转基因特异性B细胞方面显示出有希望的结果。尽管免疫细胞疗法在抑制转基因免疫反应方面取得了有希望的结果，但其临床安全性和有效性需要进一步调查。 目前，临床研究中招募了可能具有较低转基因免疫反应风险的受试者。利用新开发的方法使我们能够包括更多的代表性研究对象。 6.结论 关于患者对AAV基因治疗的免疫反应仍有许多未知之处。然而，基于正在进行的临床试验和治疗数千而非少数患者的许可后数据，不断积累的证据。为了进一步了解AAV基因治疗的免疫反应的发展，需要对入选受试者进行进一步的免疫监测，包括监测血清因子的策略、外周血免疫细胞的表征以及组织分析。然而，缺乏免疫测定的标准协议以及无法收集相关样本导致研究间的变异性，并进一步复杂化了研究结果的解释。开发标准协议以监测AAV临床试验中的受试者将有利于该领域的更好比较。然而，当前试验中存在的剂量、给药途径和使用多种衣壳血清型的变异性可能进一步使比较和解释AAV基因治疗的免疫反应更加复杂。 在大多数试验中，系统性免疫抑制被广泛施用以调节AAV基因治疗临床试验中的免疫反应，尽管有一些显著的不良效应。然而，免疫抑制方案、剂量和时机也都非常多变，并且该领域没有共识。适当的动物模型来测试当前或新药物并不容易获得，这使得标准化协议变得困难。应用新开发的战略可能比广泛、非特异性的免疫调节更有针对性，可能有助于改善结果并减少并发症。 自1995年第一次AAV临床试验以来，已经观察到有关AAV安全性和免疫反应的显著临床数据，然而免疫反应仍然是成功AAV基因治疗的障碍。克服免疫反应的新兴策略将使AAV基因治疗的全部潜力对数千人的生活产生积极影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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*仅供医学专业人士阅读参考一个全新的防癌、抑癌信号通路出现了。今天，由澳大利亚国立大学Si Ming Man领衔的研究团队，在著名期刊《自然·免疫学》上发表一项重要研究成果。他们首次发现，炎症小体蛋白NLRC4，竟然还有一种独特的非炎症抗癌功能。具体来说，NLRC4会通过组建一个独特的蛋白复合体激活DNA损伤反应，减轻DNA损伤的积累，进而抑制癌症的发生或进展[1]。从研究结果来看，NLRC4可能是唯一能有效防止肿瘤发生/发展的炎症小体蛋白。这一发现也为癌症的防治指出了新方向。▲ 论文首页截图说起炎症小体，大家应该不会陌生。它是先天免疫系统的重要组成部分。作为一种模式识别受体，它可协调宿主对感染和自身炎症性疾病的反应。以本研究涉及的NLRC4来说，它主要负责识别细菌鞭毛蛋白和III型分泌系统的成分。在被激活后，NLRC4不仅会通过下游一系列分子，促进细胞因子的产生，诱发炎症，还可以诱导细胞焦亡，进而抑制感染的发生和进展。不过，近年来，有些研究发现炎症小体似乎还有一些非炎症/非免疫相关的功能。为了进一步探究炎症小体蛋白的其他功能，Si Ming Man团队以抑癌蛋白APC突变驱动的癌症小鼠模型，全面探索了炎症小体与癌症之间的关系。在研究一开始，Si Ming Man团队分别构建了五个炎症小体缺失的Apcmin/+小鼠模型，并观察与Apcmin/+小鼠相比，另外五种小鼠模型的肿瘤负担情况。从统计结果来看，只有Apcmin/+Nlrc4-/-小鼠在20周龄时，小肠中肿瘤的数量比Apcmin/+小鼠显著增加。其他炎症小体缺失小鼠的肿瘤负担与Apcmin/+小鼠相比均没有显著性差异。随后，研究人员还从多个角度比较了不同小鼠模型肿瘤的情况。最后证实，限制肿瘤发生的炎症小体蛋白是NLRC4，而不是NLRP3、NLRP6、AIM2和caspase-11。▲ 仅炎症小体NLRC4缺失影响肿瘤小鼠负担由于NLRC4是炎症小体，Si Ming Man团队很自然想到，NLRC4缺失带来的抗肿瘤效果，会不会是因为炎症反应受到影响导致的。大量研究结果表明，在这个肿瘤小鼠模型中，NLRC4缺失的抗癌作用与NLRC4的促炎作用无关，甚至与它这个家族中已知的促炎信号均无关。这一发现激发了研究人员的好奇心。考虑到APC是通过促进转录因子β-catenin的降解，从而抑制细胞增殖和肿瘤发展。因此，他们想知道NLRC4缺失的抗癌作用是不是与β-catenin有关。研究结果又让Si Ming Man团队大失所望——β-catenin没受影响。这一下子就失去了研究方向。为了揭开背后的谜团，他们开展了系统性的磷酸化蛋白质组质谱分析。在分析结果时，他们发现，在Apcmin/+Nlrc4-/-小鼠和Apcmin/+小鼠之间，差异最大的是与辐射响应和紫外线响应相关的蛋白。这说明，炎症小体NLRC4与DNA损伤之间存在潜在联系。▲ NLRC4与DNA损伤之间的关系浮出水面随后，Si Ming Man团队检测了DNA损伤标志物γH2AX的水平。确实，他们发现与Apc+/+小鼠相比，Apcmin/+小鼠的小肠中含有更多的γH2AX阳性细胞，而Apcmin/+Nlrc4-/-小鼠的γH2AX阳性细胞更多。这表明NLRC4可减轻细胞中DNA损伤的积累。▲ NLRC4可减轻细胞中DNA损伤的积累紧接着，Si Ming Man团队探索了NLRC4减少DNA损伤积累的机制。他们发现，NLRC4会与ATR相互作用，增强ATR-ATRIP复合物对Caspin的招募，进而激活检查点激酶1（CHK1），促进DNA损伤反应（细胞周期停滞、DNA修复或细胞凋亡[2]）。简单来说，炎症小体NLRC4会通过一种不依赖于促炎功能的机制，促进DNA损伤的修复或促进DNA损伤细胞的凋亡，进而抑制肿瘤的发生或进展。▲ 机制示意图总的来说，Si Ming Man团队这项研究成果让我们对先天性免疫、DNA损伤感受/响应和癌症发生发展之间有了新认知。此外，这一发现有望带来新的抗癌靶点，为癌症的防治带来新希望。参考文献：[1].Shen C, Pandey A, Enosi Tuipulotu D, et al. Inflammasome protein scaffolds the DNA damage complex during tumor development. Nat Immunol. Published online October 14, 2024. doi:10.1038/s41590-024-01988-6[2].Patil M, Pabla N, Dong Z. Checkpoint kinase 1 in DNA damage response and cell cycle regulation. Cell Mol Life Sci. 2013;70(21):4009-4021. doi:10.1007/s00018-013-1307-3本文作者丨BioTalker

摘要：手足口病（HFMD）是由小核糖核酸病毒科肠病毒属的病毒引起的一种病毒感染，主要影响儿童。尽管大多数HFMD病例不会引起大的问题，但肠道病毒71型（EV71）的爆发可能产生高风险的神经系统后遗症，包括脑膜炎、脑炎、肺部疾病和死亡率。在亚洲，由EV71引起的HFMD已经出现为一种高度致病潜力的急性传染病，这需要国际医学界的关注。摘要的主体部分：包括NCBI、PubMed、Google Scholar、ProQuest、Scopus和EBSCO在内的一些在线数据库也被用来通过与主题相关的关键词进行数据挖掘。付费文章是通过Siksha O Anusandhan University的中心图书馆设施获得的。这项工作描述了肠道病毒71的结构、爆发、分子流行病学以及不同的EV71疫苗。已经开发了许多疫苗，如灭活全病毒、减毒活病毒、亚病毒颗粒和DNA疫苗，以治疗患者。在亚太国家，灭活EV71疫苗接种仍然面临疫苗标准化、注册、价格以及病原体监测和测量协调方面的相当大的障碍。简短结论：近几十年来，HFMD已经成为亚太国家的严重健康危害。在中国大陆和其他HFMD高发国家，灭活EV71疫苗将是保护儿童健康的重要工具。在生产灭活EV71疫苗时，中国大陆确保保持高标准的疫苗质量。第三阶段临床研究被用来确认疫苗接种的安全性和有效性。 1.背景 肠道病毒71型（EV71）通常会引起5至7岁以下儿童的手足口病（HFMD）或疱疹性咽峡炎和神经系统异常。它在手、足和口腔处引起严重的皮疹，看起来像水泡。症状还包括发热和疼痛性类似水泡的溃疡。这种病毒可以通过粪便、唾液、痰液、呼吸道飞沫等直接从感染者传播给另一个人。此外，EV71也可以通过与感染者接触的钢、铁、纸、塑料等间接传播。通常，5至7岁年龄组的儿童由于免疫力较低，容易受到EV71病毒的影响，而成人很少受到这种病毒的影响，因为他们大多数具有免疫原性。HFMD会导致严重的健康危害，如中枢神经系统异常、呼吸问题、心血管障碍、无菌性脑膜炎、小脑共济失调、类脊髓灰质炎性瘫痪、急性脑干脑炎、心肺衰竭、暴发性神经源性肺水肿，以及死亡率的增加。HFMD通常在高温、温暖地区或春夏季节2和5中被触发，并且在温暖或潮湿的地区迅速传播。HFMD可能更多由EV71引起，而较少由柯萨奇病毒A16（CVA16）、A5、A6、A7、A9、A10、B1、B2、B3和B5引起。肠道病毒71也被称为肠道病毒A71（EV-A71），属于小核糖核酸病毒科。有时，EV71会在儿童中引起类似脊髓灰质炎的疾病和脑炎。根据Chen等人的说法，EV-A71感染对男孩比女孩构成更高的风险，但这种病毒的作用机制仍不清楚。EV71感染是全球公共卫生的主要威胁。Solomon等人报告称，存在100多种人类肠道病毒血清型，包括3种脊髓灰质炎病毒、23种柯萨奇病毒A（CA）、6种柯萨奇病毒B（CB）、31种回声病毒和39种编号的肠道病毒（EV68-71, EV73-102, EV104-107和EV109）。这些感染主要在儿童中检测到，很少在成人中检测到。此外，Lee等人确定人类肠道病毒在系统发育上分为A、B、C和D四种类型。然而，这些不同的EV71菌株是通过从感染者的唾液、痰液、鼻粘液和粪便材料中收集的细胞培养或PCR检测到的。2019年，Alexandra等人发现EV71可以通过粪-口途径进入宿主体内，最初靶向胃肠道上皮细胞而不是呼吸道。之后，它逐渐感染宿主。 2. 正文 2.1.方法论 对截至2021年的文献进行了基本和全面的概述，以识别EV71的病毒感染。考虑了许多离线和在线数据库。Elsevier、Springer、Taylor & Francis imprints和Hindawi等声誉良好的出版商发表的综述文章和研究论文被视为本综述文章数据收集的主要来源。一些在线数据库，包括NCBI、PubMed、Google Scholar、ProQuest、Scopus和EBSCO，也使用与主题相关的关键词进行了数据挖掘。通过Siksha O Anusandhan University的中心图书馆设施访问了付费文章。会议论文、杂志、网页和书籍章节也作为文献的其他来源进行了审查和访问，以最大化关于当前瓶颈、研究程度和主题潜在效用的信息。在这篇综述中，讨论了肠道病毒71的结构、爆发和分子流行病学以及不同的EV71疫苗。EV71感染是全球公共卫生的主要威胁。感染主要见于儿童，很少见于成人。 3.EV71的结构 肠道病毒71的结构是一种单链RNA病毒，RNA基因组大小约为7.4 kb。Folegatti等人报告称，不同的肠道病毒具有不同的结构、序列、基因组和生物活性。EV71是非包膜的，呈二十面体结构，直径约为20-30 nm。此外，EV71的编码区域分为P1、P2和P3三部分。P1编码4种结构病毒蛋白，如VP1、VP2、VP3和VP4。同样，P2编码3种非结构蛋白，如2A、2B和2C，而P3编码4种非结构蛋白，如3A、3B、3C和3D。P2和P3结合形成用于结构蛋白生产的蛋白酶。此外，EV71的衣壳有60个副本的VP1、VP2、VP3、VP4，结构蛋白结合形成原型。进一步地，5个原型形成一个五聚体，12个五聚体结合形成一个病毒颗粒。相比之下，VP1、VP2和VP3存在于病毒衣壳的外层，这3种蛋白质影响宿主免疫系统。此外，VP1的一些中和表位被用作疫苗的生物标志物。基因型A具有原型菌株（Br Cr），而B具有5个亚基因型（B1至B5），C具有5个亚基因型，如C1、C2、C3、C4和C5。EV71依赖于VP1。此外，RNA基因组的5'和3'端存在一个非翻译区（UTR）。5'UTR具有帽独立翻译的内部核糖体进入位点，并与VPg（病毒蛋白）结合，而3'UTR具有聚A尾。翻译成多蛋白的RNA被病毒2A蛋白酶、3D蛋白酶和3C蛋白酶连续切割。病毒蛋白3D显示RNA依赖性RNA聚合酶活性。进一步地，小核糖核酸病毒科病毒基因组由IRES组成。因此，病毒可以进入宿主细胞并在细胞质中释放病毒基因组，IRES可以被病毒RNA解释。在病毒翻译和复制时，病毒需要IRES特异性反式作用因子（ITAFs）。它需要其他因素，如T细胞限制性细胞内抗原1（TIA-1）和TIA-1相关蛋白（TIAR）进行病毒翻译和复制。TIA-1和TIAR与病毒基因组的5'非翻译区的相互作用可以增加复制。EV71的结构如图1所示。 图1 EV71的结构表示 4.肠道病毒的分类 肠道病毒被分类为多种类型，如脊髓灰质炎病毒（PV）是肠道病毒属的一种微小、非包膜病毒，具有单链正核糖核酸基因组，约为7500nt Picornaviridae科。PV是脊髓灰质炎的致病因素，其中运动神经元是主要靶标。PV运动神经元嗜性部分是由于PVR（PV受体）的表达。在这方面，EV71与EV社区相关，但已被拆分为PV、人类EV属A，分为许多属。此外，肠道病毒68在年轻形式的肠道病毒70中诱导下呼吸道感染，这是极端急性出血性结膜炎流行病的代理，其中EV71（肠道病毒71）在多个国家加剧了无菌性脑膜炎和手足口病（HFMD）和脑炎。无菌性脑膜炎、疱疹性咽峡炎、爆发性肌痛（胸膜痛、Bornholm综合征）、手足口病、心肌炎、心包炎、腹泻、皮疹和鼻窦感染是几种疾病的迹象。在特定的先天性畸形中，也许在糖尿病的一些情况下，它们也可以发挥作用。在所有中，回声病毒引起的疾病是无菌性脑膜炎、有或没有咳嗽的发热感染和皮疹。表1描述了EV71的不同类别。 5.EV71受体与宿主细胞结合 一些重要的EV71病毒受体，如P选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）、人类清道夫受体（hSCARB2）、人类树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3抓取非整合素（DC-SIGN）、膜联蛋白A2（AnxA2）、硫酸肝素（HS）和唾液酸化糖链，具有与宿主细胞结合的能力。病毒受体与宿主细胞结合后，病毒外壳分离，RNA被释放。如图2所示，在宿主细胞内开始蛋白质翻译和病毒复制。 图2 EV71病毒受体与宿主身体结合过程 6.EV71在不同国家的爆发情况 最初，手足口病（HFMD）是在1957年4月在新西兰发现的，当时有8名儿童感染，而在1960年代，手足口病的主要爆发是由CVA16病毒引起的。1969年，在美国一名9个月大患有脑炎的婴儿中检测到了EV71。该病毒也在加利福尼亚被识别出来，之后它传播到了世界各地。1997年，亚太地区首次发生了手足口病的重大爆发。 1981年，手足口病首次在中国上海被识别出来。后来，在2008年，中国大约检测到488,955例病例，死亡率为126人。2008年至2012年间，中国疾病预防控制中心宣布，大约有7,200,092名感染患者被识别出来，死亡率为2,457人。EV71在中国是C4基因型的流行病。2008年5月3日，中国卫生有关部门通报说，EV71的爆发大多发生在阜阳、安徽、浙江、广东等特定地区。2008年，共发现3,3736例病例，其中22例患者死亡，而42例为严重复杂病例。大约415阜阳市24 h检出患者。2008年5月5日，浙江省发现约6,300名患者死亡率为 26 例，其中 5,151 名患者被发现安徽省手足口病病例8531例在中国被发现，受影响婴儿的年龄小于6岁或2岁。在台湾，1998年发现了大约129,101名手足口病患者，其中405名患者被发现患有脑膜炎和脑炎等神经系统疾病，死亡率为78人。2008年，通过手足口病识别出387名重症患者感染了EV71，台湾的死亡率为14人。1998年在台湾，44.4%的患者被识别为EV71，1999年为2%，2000年为20.5%。 1998年检测到的大多数EV71病例为C型基因，而1/10被识别为B型基因。EV71的死亡率在1998年为78人，2000年为25人，2001年为26人。林和邹将1998年台湾的爆发分为两个阶段。第一阶段是在6月7日，大约有405个重症病例，91%的5岁以下婴儿死亡。此外，发现16%的病例出现在六个月或更小的儿童中，而43%是7-12个月的儿童，65名中有78名儿童因肺水肿或出血而丧生，这些都与致命病毒有关。第二阶段发生在10月4日，在台湾南部发现的病例很少。2011年至2012年间，越南首次发现感染EV71的手足口病儿童，大约有200,000例病例，死亡率为207人。大约在2012年的前7个月，检测到63,780例手足口病病例。越南国家婴儿医院副院长Tran Minh Dien宣布，58.7%的病例是由EV71引起的。在韩国，2009年春季首次发现手足口病感染患者并住院治疗；几天后发现所有患者都因严重并发症死亡。此外，手足口病在1997-2000年发生在日本，在1997年发生在新加坡和马来西亚。陈等人证明，EV71主要在亚太国家看到。而且，目前在中国、香港、韩国和越南发现了EV71的C4基因型，而在日本、马来西亚和台湾发现了B5基因型。在澳大利亚，2013年6月，大约有100名儿童感染了EV71，其中悉尼发现了四例。在柬埔寨，2012年4月至7月间，死亡率为64人，2人存活，他们都是7岁以下的儿童。感染的儿童在24小时内死亡，主要症状是呼吸问题、发热和神经异常。2012年7月6日，在24例中发现了15例EV71阳性。之后，感染率逐渐下降。2012年7月15日，世界卫生组织宣布柬埔寨没有EV71。 7.分子流行病学 肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）的基因型在不同国家被检测到，如表2所示。1969年，在美国一名患有脑炎的儿童体内检测到EV-A71。之后，在1970年代，感染在美国、欧洲和澳大利亚的儿童中迅速传播。2017年，Shin等人报告称，EV-A71由衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1具有抗原性和中和因子。此外，Yi等人报告称，基于VP1核苷酸序列，EV-A71可以被分类为A、B和C三个独立的基因组。基因组A包含原型EV-A71菌株（BrCr-CA-70），1969年首次在美国检测到，但直到2008年才在中国检测到。根据Solomon等人的研究，基因组B被细分为B1、B2、B3、B4和B5等亚基因组。此外，基因组C也被分类为C1、C2、C3、C4和C5等亚基因组。而且，C4基因组再次被细分为C4a和C4b谱系。然而，基因组D首次在印度检测到，基因组E和F首次在非洲被确认。此外，EV71在亚太地区更为常见。在亚太地区，直到2008年才检测到基因组A，但自1997年以来就已识别出基因组B和C。此外，自1990-2016年以来，像B3、B4、C1和C2这样的亚群在这一地区迅速传播。同时，C4和C4a也在这一地区流行，其中C4a的核苷酸和氨基酸突变与C4b相对相同。进一步研究发现，C4a向C4b的变化是中国神经病毒性流行病增加的主要原因。从遗传和抗原分析来看，据报道C4a不仅从中国传播到越南，而且在2011年在越南南部的胡志明市高度传播。Bible等人报告称，EV-A71菌株也在亚太地区以外传播。从1963年到1986年，在荷兰检测到B0、B1和B2亚群。此外，在1987年，B基因组被C、C1和C2取代。根据流行病学研究，B1、B2、C1和C2亚群逐渐在欧洲、澳大利亚和美国传播。除此之外，从1997年开始，B3-B5、C4和C5在亚太地区被看到，但在该地区之外没有被看到。渐渐地，EV-A71开始在全球传播。从1900年到2016年，由B0、B1和B2、C2、C3、C4a和C4b亚群引起的感染迅速传播。从分子流行病学研究的基础上，发现突变的EV-A71在全球传播，而B5亚群与B1、B4、C2和C4具有不同的抗原性。 8.EV71中的临床症状 在EV71感染患者中最常见的疾病是发热（81%），伴有皮疹（70%）、失眠（66%）、呕吐（62%）、倦怠（40%）、肌阵挛（60%）和共济失调（42%）。在47名客户中进行了脑脊液（CSF）评估，其中45名为多核细胞增多症，中位数为94/ml，范围在15-920/ml之间。然而，他们中没有人的CSF标本中分离出病毒。CA16最常见的诊断载体是手足口病（HFMD），而CA5、CA9和CA10在其他公认的HFMD肠道病毒中被静态识别为HFMD的来源。EV71和CA16是高度神经毒性病毒，已在患者中引起严重的中枢神经系统问题，这些中枢神经系统并发症已被确定为致命HFMD的主要原因。来自西澳大利亚、日本、马来西亚的临床实验表明，由于CA16和EV71，手足口病（HFMD）的皮疹可能是多变的。由于CA16在手臂和腿部出现的皮疹或红斑，比EV71病毒的大水疱更多，其中皮疹在这些病毒中最常见且呈点状。EV71患者的感染三到四天的特征是口腔、牙龈、腭、丘疹和水疱性黏膜疹在唇部、臀部、脚部的分布。一些主要的临床症状在表3中简要显示。 9.病理机制 肠道病毒71（Enterovirus 71，EV71）的病理机制流程图见图3。EV71主要发生在脑干脑炎，特别影响延髓，并与心肺功能障碍有关。EV71感染在亚洲更为常见，死亡率较高。EV71引起的高烧疾病持续3-10天。手足口病的传播不仅可以通过隔离患者来控制，还可以通过保持适当的卫生习惯，比如定期洗手和经常清洁可接触物体的表面。这种病毒会导致严重的健康危害并导致死亡。EV71是一种神经性病毒，主要目标是影响脑干。EV71可以通过两条途径进入中枢神经系统（CNS）。病毒可以通过血脑屏障进入CNS，也可以通过逆行轴突运输通过外周神经进入。EV71病毒还可以通过外周运动神经传播到CNS，骨骼肌会立即被CNS感染，不仅是通过运动神经元，还可以通过其他神经途径。 图3 肠道病毒71的病理机制流程图 根据马来西亚的尸检研究，在脊髓灰质、脑干、下丘脑、下丘脑和齿状核发现了炎症。神经病毒性被认为是死亡的主要原因。Li等人提出，VP1蛋白中的L97R变异增加了EV71的神经元趋向性，尽管VP1、5' NCR和蛋白酶2A的变异影响病毒的毒力。RNA序列中的变异变化会导致一些神经系统感染。EV71感染引起的肺水肿的作用机制是破坏内侧、腹侧和尾侧延髓，导致血液流向肺部。此外，患有EV71脑干脑炎的儿童也会发展成肺水肿。 也有报道称，异常的细胞因子激活会在肺部产生严重的炎症。从几项研究中发现，患有严重EV71脑炎的儿童具有细胞毒性T淋巴细胞抗原单倍型（CTLA-4）。还有报道称，EV71会引起无菌性脑膜炎和发热，这些是儿童的不良健康影响。根据尸检研究，发现台湾和香港的EV71感染死亡率是由脑干脑炎引起的。肠道病毒不仅受病毒因素的影响，还在其生命周期中增殖宿主因素。病毒和宿主因素的相互作用在病毒复制中起着关键作用。尽管基于细胞的系统和动物模型中组织特异性病毒毒力了解甚少，但未来需要更多的研究。 10 .EV71疫苗 一些EV71感染不仅有症状，而且无症状，并且可以通过疫苗来控制。迄今为止，已经开发了不同的EV71疫苗，如灭活病毒疫苗和病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗以及减毒活疫苗。从先前的研究中报告，与其他灭活疫苗相比，灭活全病毒EV71疫苗更有效。从先前的发生情况来看，也发现甲醛灭活EV71疫苗对任何动物模型都非常有效和具有保护性。 另一方面，甲醛灭活EV71疫苗被表达为一种佐剂疫苗，它在III期试验中引起交叉中和抗体的回归。根据报告，中国约有30,000名儿童在灭活EV71疫苗的III期临床试验中被治愈。2015年12月，中国食品药品监督管理局正式调查了2种灭活EV-A71疫苗，这些疫苗抑制了儿童中的严重手足口病。另一方面，在台湾和新加坡开发了甲醛灭活EV71疫苗，这些疫苗进行了I期临床试验，结果对预防EV71感染非常出色。尽管灭活EV71疫苗主要用于保护儿童，但它们有潜力抑制病毒基因组的复制。 病毒样颗粒（VLPs）疫苗与灭活全病毒EV71疫苗完全不同。VLPs疫苗具有衣壳蛋白的所有表面表位，并且比灭活疫苗的效果要小。除此之外，还开发了一些新的EV71疫苗，如DNA疫苗、亚单位疫苗和肽疫苗。EV71疫苗的开发在亚洲国家是积极和正在进行的。发达国家和发展中国家的疫苗研究人员和开发人员必须共同努力，开发一种安全有效的EV71疫苗。 11.结论 EV71是一种对全球婴幼儿和儿童构成生命威胁的疾病。这种病毒感染在亚洲迅速蔓延，导致儿童出现手足口病、神经系统异常等长期健康危害。手足口病是一种病毒性和传染性疾病。儿童在接触病毒后3天内被感染，并保持传染性直到10天。这种感染的主要症状包括发热、流鼻涕、打喷嚏、咳嗽、皮疹、口腔溃疡和肌肉疼痛等。迄今为止，尚未发现针对EV71病毒的特定治疗方法。症状轻微的儿童是非脊髓灰质炎肠道病毒感染的原因之一。大多数儿童可以完全康复，但有些可能会遭受严重的并发症或致命的病毒感染。因此，迫切需要治疗这些病毒感染。EV71疫苗是亚太地区乃至全球儿童的无价之宝。对灭活EV71疫苗的临床研究表明，它是对抗与EV71感染相关的严重手足口病爆发的有用武器。亚洲公司在EV71疫苗开发方面处于领先地位，表明这些亚洲国家的疫苗研发和评估有所改进。尽管如此，其他国家在针对婴儿和儿童的重要目标人群中的市场准入批准和应用面临技术和立法障碍。疫苗的可获得性、将EV71疫苗引入EPI的可能性以及疫苗标准的协调是障碍。因此，国际合作对于控制EV71疫苗在发展中国家的传播至关重要。世界卫生组织应带头制定EV71疫苗质量控制和评估标准。好消息是，美国国立卫生研究院的国家食品和药物控制研究所和国家生物标准与控制研究所正在合作为EV71疫苗制定世界卫生组织的中和抗体标准，这可能有助于标准化疫苗质量控制和评估。目前，只有中国成都研究所开发的日本脑炎（JE）疫苗获得了世界卫生组织的预认证。在成本效益高的EV71疫苗广泛可用之前，世界仍有很长的路要走。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 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