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ADC热潮之后，很多制药巨头在布局前沿技术赛道时瞄准了一个共同的方向——双抗。 根据医药魔方数据库，2024年前9个月，全球药企围绕双抗药物达成了31笔交易，数量上比之前三年的每一年都要多。 这其中也不乏制药巨头的重量级押注。8月，默沙东以7亿美元的首付款将同润生物一款处于I期阶段的CD3/CD19双抗CN201收入囊中。7月，诺华与Dren Bio就髓系细胞募集双抗的开发达成合作，交易总额达30亿美元。 与此同时，一些药企也在加快双抗药物的临床开发布局。比如阿斯利康在今年接连启动了TIGIT/PD-1双抗rilvegostomig的4项注册性临床试验，包括联合化疗对比K药的III期头对头研究。 更早下注的玩家已经步入收获。比如，罗氏的眼科双抗法瑞西单抗已成为其业绩增长的核心驱动，上市第2年的销售额便轻松突破25亿美元。强生的埃万妥单抗则在研发端实现了重要突破，联合兰泽替尼头对头击败奥希替尼，并借此拓展了新适应症。 本文对制药巨头的双抗产品管线进行梳理，并对管线较丰富的几家企业进行分析，揭示它们不同的布局重点与扩张策略。 制药巨头双抗产品及临床管线 罗氏：打造畅销产品，站上赛道制高点 在双抗赛道，罗氏已展现王者风采，强大的已上市产品阵容就是其实力的最好印照。根据医药魔方数据库，全球共有15款双抗获批上市，罗氏独占4款，与Genmab并列为全球拥有最多上市双抗产品的药企。不仅仅是数量上的领先，这些产品的商业化成绩亦斐然。立足于已有产品，罗氏徐徐铺开布局版图。 艾美赛珠单抗是首个非凝血因子类血友病药物，可每4周皮下给药一次。它巧妙地利用双抗的作用模式，同时结合凝血因子IXa（FIXa）和FX来模拟FVIII的凝血功能。凭借创新性与变革性治疗价值，艾美赛珠单抗逐步“征服”广大患者，销售额一路攀升，2024上半年创收21.43亿瑞士法郎（约合24.21亿美元），是全球销售额最高的双抗药物。 新一代FX/FIXa双抗RG6512也已推进至I/II期临床阶段，其与FIX和FX形成三元复合物的能力显著优于艾美赛珠单抗，有望以更低的剂量和更长的给药间隔实现突破。继罗氏之后，诺和诺德也看好血友病双抗的开发前景。Mim8的III期研究已传来捷报，预计年内申报上市。 在血液疾病领域，罗氏还先后推出了两款CD3/CD20双抗莫妥珠单抗和格菲妥单抗，形成差异化布局。莫妥珠单抗被设计成典型的1:1结构，疗效相对温和，更适用于惰性淋巴瘤，而格菲妥单抗具有2:1比例的CD20与CD3结合位点，对表达CD20的恶性B细胞产生更强的靶向作用，可以攻克侵袭性和难治淋巴瘤。 除淋巴瘤外，罗氏还希望借力双抗打破多发性骨髓瘤（MM）的现有格局。针对发病率第二高的血液肿瘤，与多数企业押注CD3/BCMA双抗不同，罗氏主要将希望寄托于FCRH5/CD3双抗cevostamab和GPRC5D/CD3双抗forimtamig。I/II期CAMMA 2研究显示，cevostamab针对三重难治性MM患者的总缓解率（ORR）为67%。 法瑞西单抗是当下罗氏增长势头最强劲的双抗产品。今年上半年，法瑞西单抗销售收入几近翻倍，达17.94亿瑞士法郎（+93%，约20.27亿美元），未来销售峰值或将超越巅峰时期的阿柏西普。 法瑞西单抗的成功不是偶然，这依赖于罗氏在眼科赛道的深厚底蕴，此前罗氏已打造出全球首个应用于眼科的抗血管内皮生长因子（VEGF）药物雷珠单抗。法瑞西单抗同时靶向VEGF-A和血管生成素2（Ang-2）两条不同的信号通路，获批了湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）、糖尿病黄斑水肿（DME）和视网膜静脉阻塞（RVO）继发黄斑水肿三大适应症。与单纯抗VEGF疗法相比，法瑞西单抗显著减少了眼部注射给药频率，只需每4个月给药1次。 眼科赛道，罗氏继续向着“进一步提高护理标准”的战略目标前进。两款靶向VEGF的双抗应运而生。下一代Ang2/VEGF-A双抗zifibancimig采用港式给药系统（PDS）尝试进一步延长nAMD治疗间隔；VEGF/IL-1β双抗经玻璃体内给药，用于治疗RVO继发黄斑水肿。 罗氏在实体瘤领域推进最快的双抗是靶向PD-1/LAG-3的tobemstomig，处于II期临床阶段。PD-1与LAG-3的协同作用已经得到充分验证，BMS的双免疗法Opdualag于2022年3月获批上市。围绕tobemstomig，罗氏重点开启了一项单药或联合TIGIT单抗tiragolumab一线治疗尿路上皮癌的注册性临床（NCT05645692）。 另有三款CD3双抗夯实罗氏在实体瘤领域的布局。CD3/HER2靶向的runimotamab主攻乳腺癌和胃癌；CD3/GPC3靶向的ERY974在探索治疗肝细胞癌的可行性；CD3/CLDN6靶向的SAIL66具备FIC潜质，CLDN6靶点尚未成药，其开发过程必定充满挑战，今年7月安进已终止开发同靶点双抗AMG 794。 双抗的身影也出现在罗氏的神经科学布局中。Aβ/TfR靶向的trontinemab是罗氏在阿尔茨海默病领域的一次大胆创新。 从作用机制上，trontinemab就体现出了与众不同之处，它运用罗氏大脑穿梭技术（brainshuttle），将靶向Aβ的单抗（gantenerumab）与可以和转铁蛋白受体1（TfR1）相结合的蛋白域融合，通过TfR1介导的胞吞转运有效协助抗体穿越血脑屏障。早期临床数据显示，与标准Aβ单抗相比，trontinemab能以相对较低的剂量（1.8和3.6mg/kg）快速且稳健地减少淀粉样蛋白斑块。 手握如此丰富的产品管线，罗氏已率先占据双抗赛道的竞争高地。在不断地开疆拓土中，罗氏还将继续扩大优势。 强生：血液肿瘤、实体瘤、自免全面出击 近几年，强生以每年推出1款产品的速度在双抗赛道强势崛起。2021年5月，全球首款c-Met/EGFR双抗埃万妥单抗在美获批EGFR外显子20插入突变非小细胞肺癌（NSCLC）适应症，其只需5分钟给药的皮下剂型也已申报上市。 埃万妥单抗正在抢占奥希替尼的市场份额，后者2024上半年销售额达32亿美元。MARIPOSA研究中，埃万妥单抗联合兰泽替尼头对头击败奥希替尼，显示出一线治疗EGFR外显子19缺失或外显子21 L858R置换突变NSCLC的PFS获益。MARIPOSA-2研究则聚焦奥希替尼耐药后的未满足需求。凭借这两项研究，埃万妥单抗接连拓展了2项新适应症。 2022年8月，全球首款CD3/BCMA双抗特立妥单抗首次在欧盟获批上市；一年后，全球首款CD3/GPRC5D双抗塔奎妥单抗也问世了。这两款双抗是强生统治MM业务的重要接力产品。 在MM领域，强生早已建立了霸主地位，从FIC蛋白酶体抑制剂硼替佐米到全球首款CD38单抗达雷妥尤单抗，再到BCMA CAR-T西达基奥仑赛和双抗，产品护城河深厚，持续引领着MM治疗手段的演变。MM这块大蛋糕也有很多玩家竞争，仅双抗这一类型药物的相关管线就达到65项，辉瑞的CD3/BCMA双抗elranatamab已经获批上市。 对于后续的双抗药物储备，强生着重开辟实体瘤，前列腺癌是强生下一个进攻方向。靶向CD3/PSMA的JNJ-8114、靶向CD3/KLK2的JNJ-8343、靶向PSMA/CD28的JNJ-9401都已进入临床阶段。 不过JNJ-8114的一项I期研究（NCT05441501）在今年3月刚刚完成，但却已消失在强生2024Q1的管线图中。此前，强生还放弃了另一款治疗前列腺癌的CD3/TMEFF2双抗管线JNJ-8902。 JNJ-8343建立在强生和Zymeworks 2017年的合作基础上。交易背后，强生看中了Zymeworks的Azymetric和EFECT平台，其中Azymetric平台通过对IgG样抗体的重链和轻链进行专有的氨基酸修饰，从而实现单抗到多抗的转换。 JNJ-9401同样诞生于合作模式。2021年10月，强生与Xencor就CD3/CD20双抗plamotamab和CD28双抗达成一笔超13亿美元的交易。不过并不是所有交易都能走到最后。今年6月，强生已经退回了plamotamab的全球权益。至于CD28双抗的开发，除JNJ-9401外，还延伸出了CD28/CD20双抗JNJ-1493这一产品，剑指非霍奇金淋巴瘤（NHL）领域。 靶向CD3/CD22的JNJ-8780也主要用于NHL，强生于2020年9月启动了该药物的首次临床试验（NCT04540796）。2022年9月，JNJ-8780的临床足迹扩张至中国，然而在2023年10月强生主动终止了这一研究（CTR20222211）。 事实上，之后强生仍开展了有关JNJ-8780的临床试验，不过主要作为联合的选项出现。2023年11月，强生启动了JNJ-1493联合JNJ-8780或CD3/CD20/CD79b三抗JNJ-8543的试验（NCT06139406）。双抗+双抗甚至三抗的组合，还是一个待验证的新方向，也期待强生的突破。 血液疾病领域，强生还布局了一款潜在FIC双抗JNJ-9968，用于治疗骨髓纤维化。该药物靶向CD3/CALR，而CALR（钙网蛋白）是一个极其新颖的未成药靶标，全球在研药物也仅有4款。有研究[1]证实，暴露在表面的CALR可以作为NK细胞的内源性激活剂，向骨髓细胞传递强大的促吞噬信号，协调先天免疫监视的各个方面。 在自免领域，强生也扎下了较深的根基，乌司奴单抗、英夫利昔单抗、古赛奇尤单抗、戈利木单抗等生物制剂每年为其带来了可观的业绩增量。从药物类型来看，这些产品都属于单抗，自免领域双抗药物的迭代也在推进中。 靶向IL-4Rα/IL-31的NM26治疗特应性皮炎（AD）的I期研究于2023年5月启动。一年后，强生又以8.5亿美元现金收购了聚焦于免疫学的Proteologix，目的就是丰富自免双抗管线。收购而来的IL-13/TSLP双抗PX128和IL-13/IL-22双抗PX130均处于临床前阶段，两者主要适应症都覆盖了AD。 针对AD，强生全球免疫疗法负责人David Lee认为双抗有“实现最佳疾病疗效的机会”[2]。AD是一种异质性疾病，不同的患者亚群有不同的致病通路，“目前的AD疗法要么仅能抑制单一致病通路且疗效有限，要么具有广泛的免疫抑制作用，但又会导致严重的安全性问题”，而双抗可以同时针对两种不同的致病通路，可能提供高标准疗效和缓解。 强生在双抗赛道的布局，策略性覆盖了实体瘤、血液学和自免领域这几个优势业务板块。目标明确，火力集中，如此步步为营之下，强生的收获是必然的。 阿斯利康：倾力打造肿瘤免疫双抗“双子星” 阿斯利康在双抗赛道上的布局渐近收获期。靶向PD-1/CTLA-4的volrustomig和靶向TIGIT/PD-1的rilvegostomig这两款肿瘤免疫（IO）双抗均已进入III期临床阶段，共同瞄准NSCLC大适应症，也是阿斯利康着重打造的“双子星”。 在肺癌领域，阿斯利康凭借一个个重磅产品持续引领着临床治疗变革，从一代EGFR-TKI吉非替尼到三代的奥希替尼，PD-L1单抗度伐利尤单抗和HER2 ADC德曲妥珠单抗肺癌适应症的快速拓展，又不断稳固阿斯利康肺癌领导者的地位。阿斯利康与第一三共合力打造的TROP2 ADC药物Dato-DXd也已申报上市，尝试覆盖非鳞状NSCLC人群。 有了小分子、单抗、ADC不同类型的产品之后，阿斯利康并没有停止对新技术的追逐，而且它希望立足现有产品基础打出一套更强的组合拳。双抗就是阿斯利康实现上述目标的重要资产。 透视现有的临床布局，可以发现阿斯利康为IO双抗开辟的版图主要围绕联合治疗展开。一方面是IO双抗与化疗的联合，可能实现比PD-1单抗更强的疗效。2023年10月，阿斯利康启动了volrustomig联合化疗一线治疗PD-L1表达＜50%的NSCLC的III期研究（NCT05984277），头对头K药。今年10月，阿斯利康又登记了rilvegostomig联合化疗一线治疗PD-L1阳性的非鳞状NSCLC的III期头对头研究（NCT06627647），同样对标K药。 在挑战K药的道路上，已经有先行者取得胜利。在一线治疗PD-L1阳性NSCLC的III期HARMONi-2研究中，康方生物的PD-1/VEGF双抗依沃西单抗相较于K药实现了更显著的PFS获益。 另一方面，阿斯利康倾力挖掘更具竞争力的“IO+ADC”组合。比如，rilvegostomig与Dato-DXd的联用。围绕该组合，阿斯利康已先后启动TROPION-Lung10和TROPION-Lung12两项III期研究，分别针对一线治疗PD-L1高表达的非鳞状NSCLC和辅助治疗IB-IIIB期NSCLC场景。 此外，靶向PD-1/TIM-3的sabestomig和靶向EGFR/c-Met的FPI-2053也可能有治疗NSCLC的潜力。Sabestomig已读出单药二线治疗IIIB-IV期NSCLC的I/IIa期研究数据（NCT04931654），19例患者中有2例实现未确认的部分缓解（PR）。 值得一提的是，上述双抗不仅在阿斯利康的肺癌布局中扮演重要角色，也是其进击消化道肿瘤领域的潜在利器。II期GEMINI-Gastric研究显示，接受rilvegostomig联合化疗治疗的40例HER2阴性胃或胃食管交界腺癌患者的确认ORR为52.5%。 靶向CD3/CLDN18.2的AZD5863（HBM7022）主攻胃癌、食管癌和胰腺癌等，由阿斯利康于2022年4月从和铂医药引进来的，交易时其还处于临床前开发阶段。“通过临床前资料，我们发现HBM7022在包括胃癌和胰腺癌在内的实体瘤中表现出强大的潜在功效。”阿斯利康肿瘤研发负责人Susan Galbraith当时表示。敢于在早期就出手押注，也充分说明阿斯利康对于这款中国创新资产的看好。 在实体瘤领域之外，阿斯利康也有两款双抗已推进至III期临床阶段，即gefurulimab和AZD0486。开发gefurulimab的主要目的是为涉及末端补体途径激活的慢性疾病患者提供皮下治疗选择。这是一种迷你双抗（25kD），由一个N端白蛋白结合型VHH和一个C端C5结合型VHH通过柔性linker连接而成。如此设计的巧妙之处在于，较小的分子量可以带来更好的渗透性，与白蛋白的结合能够延长其半衰期。 CD3/CD19靶向的AZD0486由阿斯利康以超12亿美元收购TeneoTwo获得。通过单药或联合BTK抑制剂、CD20靶向疗法治疗，AZD0486有望解锁滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等血液肿瘤适应症。今年8月，阿斯利康已经启动AZD0486联合CD20单抗利妥昔单抗一线治疗FL的III期试验（NCT06549595），计划招募1005例患者。 随着4款不同作用机制的双抗管线相继进入III期临床阶段，阿斯利康已经成为双抗赛道上实力不容小觑的明星玩家。结合联合治疗的策略打法，这些双抗可能将与更多已上市产品形成紧密捆绑的关系，为未来的市场竞争做好铺垫。 参考资料： [1]Jitka Fucikova, Radek Spisek, et al. Calreticulin and cancer[J]. Cell Research volume 31, pages5–16 (2021) [2]https://www.jnj.com/media-center/press-releases/johnson-johnson-to-acquire-proteologix-inc-to-lead-in-atopic-dermatitis-treatment 推荐阅读 安进双抗业务布局的启示 制药巨头的核药版图 制药巨头ADC布局：辉瑞有钱任性，罗氏抢占先机，AZ异军突起，默沙东雄心勃勃...... Copyright © 2024 PHARMCUBE. All Rights Reserved. 欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。 免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

THURSDAY, Aug. 22, 2024 -- Esoproedict can stratify Barrett esophagus (BE) patients as having a low or high risk for progression, according to a study published online Aug. 14 in the American Journal of Gastroenterology . Sarah E. Laun, Ph.D., from Previse in Baltimore, and colleagues validated Esopredict, a prognostic assay based on DNA methylation levels that stratifies future progression risk in BE patients using biopsies by defining the risk for progression. Esopredict includes four biomarkers: p16, HPP1, RUNX3, and FBN1, as well as age. Biopsies from BE patients meeting inclusion criteria were received from six collaborating sites. The first 99 patients comprised the training set; an additional 110 patients were analyzed as the validation set. Overall, 78 of the 209 patients progressed to high-grade dysplasia (HGD)/esophageal adenocarcinoma (EAC) within five years (progressors), and 131 had no progression (nonprogressors); 31 progressors who progressed at time intervals longer than five years were tested independently. The researchers found that the area under the receiver-operator characteristic curve for predicting progression to HGD or EAC was 0.76 and 0.73 in the training and validation sets, respectively. The odds of progression within five years were 6.4 times higher for patients in the higher-risk category (risk levels of high-moderate and high) for the Esopredict score versus those in the lower-risk category (risk levels of low and low-moderate). Comparing the low-risk level with other risk levels, similar trends were seen, with patients in the high-risk level 15.2 times more likely to progress than those in the low-risk level. "Clinicians will be able to use Esopredicts' risk stratification system with an individualized probability of progression score to determine the most appropriate management for their patients with BE," the authors write. Several authors disclosed ties to Previse, some of whom are inventors of the patented technologies described.

关注并星标智药公会2023年4月24日，国家药典委员会官网发布“关于通则0512高效液相色谱法修订草案的公示”，拟对2020年版《中国药典》第三部第456页暨第四部第61页收入的方法——0512高效液相色谱法部分内容进行修订，公示期自发布之日起3个月。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，以下简称HPLC）是色谱法的一个重要领域之一，HPLC具有分析速度快、分离效能高、检测灵敏度好等特点，已成为化学、医药工业等学科领域中重要的分离分析技术应用。一、了解色谱法常用专业术语1.  高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，以下简称HPLC）：是指采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。2.  色谱分析法（Chromatography）：简称色谱法或层析法，是一种物理或物理化学分离分析方法，该法利用某一特定的色谱系统（薄层色谱、高效液相色谱或气相色谱等系统）进行混合物中各组分的分离分析。3.  固定相：在色谱分离中固定不动，对样品产生保留的一相。4.  流动相：带动样品向前移动的另一相。5.  保留时间(retention time，tR)：定义为被分离组分从进样到柱后出现该组分最大响应值时的时间，也即从进样到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，常以分钟(min)为时间单位，用于反映被分离的组分在性质上的差异。二、常见的HPLC色谱柱，你知道几种？在药品检测领域，有“四大名谱”，它们分别为色谱、光谱、质谱、波谱，可以说只要有分析任务的地方都在使用色谱分析法，《0512高效液相色谱法》收载的常用的HPLC色谱柱种类，分别是：1)  反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。2)  正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。3)  离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。4)  手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。三、新旧0512高效液相色谱法主要内容抢先看根据2020年版《中国药典》实施以来的反馈意见，结合各国药典色谱法通则的修订变化，此次有以下几项内容有发生变化，红色字体为删除内容，蓝色字体为增订内容变更主要内容对照如下：1．进一步完善色谱参数调整范围（4）色谱参数调整品种正文项下规定的色谱条件（参数），除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当调整。若需使用小粒径（约2μm）填充剂和小内径（约2.1mm）色谱柱或表面多孔填充剂以提高分离度或缩短分析时间，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配，必要时，色谱条件（参数）可适当调整。色谱参数允许调整范围见表。注：F1为调整前原规定流速；F2为调整后流速；dc1为调整前原规定色谱柱的内径；dc2为调整后色谱柱的内径；dp1为调整前原规定色谱柱的粒径；dp2为调整后色谱柱的粒径；Vinj1为调整前原规定进样体积；Vinj2为调整后进样体积；L1为调整前原规定色谱柱柱长；L2为调整后色谱柱柱长；tR为峰保留时间；Wh/2为峰半高峰宽。2．增加滞留体积对梯度分离影响的描述可通过相关软件计算表中流速、进样体积和梯度洗脱程序的调整范围，并根据色谱峰分离情况进行微调。调整后，系统适用性应符合要求，且色谱峰出峰顺序不变。通常，较小的填充剂粒径需增加线速度，较大的填充剂粒径需降低线速度，在按上表调整流速时，要注意仪器的压力限值。若减小进样体积，应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满足要求。对于梯度洗脱，柱尺寸（柱长和柱内径）改变导致柱体积改变，会影响控制选择性的梯度洗脱体积。可通过调整梯度洗脱体积使其与柱体积成比例。由于梯度洗脱体积是梯度时间（tG）和流速F的乘积，因此需要对每个梯度段的梯度时间进行调整，以保持梯度洗脱体积与柱体积的比值恒定（表示为L×dc2）。由原来的梯度时间（tG1）、流速、柱长和柱内径，按下式计算新的梯度时间（tG2）。tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc)/(L1×dc)]梯度洗脱条件的调整可分步进行：（1）根据L/dp调整柱长和粒径；（2）根据粒径大小和柱内径的变化调整流速；（3）根据柱长、柱内径和流速的变化，调整每个梯度段的梯度时间。若减小进样体积，应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积，应使分离度和线性关系仍满足要求。应评价色谱参数调整对分离和检测的影响，必要时对调整色谱参数后的方法进行确认。若调整超出表中规定的范围或品种项下规定的范围，被认为是对方法的修改，需要进行充分的方法学验证。调整梯度洗脱色谱参数时应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨慎，因为此调整可能会使某些峰位置变化，造成峰识别错误，或者与其他峰重叠。如梯度微调后仍不能满足系统适用性要求，通常应考虑滞留体积的缘故或更换色谱柱。滞留体积（dwell volume，用D或VD表示)，也称为梯度延迟体积，是指从流动相混合点至柱入口之间的体积。梯度洗脱时，所采用设备的配置可显著地影响方法所述的分离度、保留时间和相对保留时间。如果发生这种情况，可归因于过大的滞留体积。因此，应考虑方法开发时的系统与实际使用系统之间滞留体积的差异，在开始梯度程序前增加一个等度平衡阶段，通过调整等度阶段时间来调整梯度时间点，以与所使用的分析设备相适应。如在品种项下给出了方法开发时所用的滞留体积，则原梯度表中所述的时间点（t，min）可用按下式计算的调整后时间点（tc，min）代替：tc=t−式中D为实际使用的分析设备的滞留体积（ml）；D0为方法开发时分析设备的滞留体积（ml）；F为流速（ml/min）。如验证证明分析方法应用时不需等度平衡，则可省略这一等度阶段。应评价色谱参数调整对分离和检测效果的影响，必要时对调整色谱参数后的方法进行确认。多个参数的调整将对系统性能产生累积影响，需要作适当的风险评估。对于组分或基质特别复杂的体系，如中药分析方法，进行其色谱参数调整时应特别谨慎。若调整超出表中规定的范围或品种项下规定的范围，被认为是对方法的修改，需要进行充分的方法学验证。3．在第一节增加（5）溶液制备的描述（5）溶液制备 为减少溶剂峰和色谱峰的畸变，制备供试品溶液和参比物质溶液可用流动相（或梯度起始比例流动相组成）作为溶剂；为提高供试品中待测成分与参比物质的保留时间和峰面积响应的一致性，制备供试品溶液和参比物质溶液的溶剂组成尽可能保持一致。如供试品和/或参比物质在流动相中的溶解性不够，可先用流动相组成中具溶解能力的某一溶剂或其它适宜溶剂制备供试品溶液或/和参比物质溶液贮备液，再用流动相（或梯度起始比例流动相组成）稀释到测试的浓度。在测试序列中，应取制备溶液的溶剂和/或稀释剂进样以确认其是否对待测物质峰有干扰。对于含量测定，单点对照法定量用供试品溶液与对照品溶液浓度应相同或相近，确保在分析方法线性范围内，并有足够的精密度。对于限度检测，如有关物质检测，除另有规定外，供试品溶液浓度应保证能准确检测0.1%的杂质，对照溶液或对照品溶液浓度应与所关注的限度浓度相当。4．对系统适用性试验进行修订和补充a.  明确分离度（Rs）应以半高峰宽（Wh/2）的计算结果为准（2）分离度（Rs）......无论是定性鉴别分析还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他杂质色谱峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5。分离度的计算公式为：式中tR2为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间；W1、W2及Wh/2,1、Wh/2,2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽，见下图。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（Rs）均应以峰宽 （W）半高峰宽（Wh/2）的计算结果为准。b.  增加峰谷比（p/v）作为系统适用性的参数（3）峰谷比若待测物质峰与相邻峰之间未达到基线分离，如在有关物质检测时，峰谷比（p/v）可作为系统适用性试验参数。下图表示部分分离两个色谱峰的示意图，峰谷比值计算公式为：式中Hp为小峰平行外推基线的高度H为小峰和大峰间曲线最低点平行外推基线的高度。峰谷比值计算示意图c.  定义灵敏度，修订信噪比（S/N）计算公式（4）灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比   （S/N）来表示。建立方法时，可通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。信噪比（S/N）用于定义系统的灵敏度，按下式计算：S/N=在使用规定的参比溶液获得的色谱图中， H为从目标峰最大值到基线信号的峰高，基线外延距离为目标峰半高峰宽的5倍；h距离为在目标峰5倍宽范围内观察到的最大和最小噪声的幅度，见下图。如可能，应平均分布在目标峰的两侧。通常，定量限的信噪比应不小于10，检测限的信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度试验溶液来评价色谱系统检测低含量成分的能力。d.  重新对拖尾因子（T）作出规定（4）（5）拖尾因子（T）除另有规定外，在检查和含量测定项下，以峰面积作定量参数时，T值应在0.8～1.8之间；以峰高作定量参数时，除另有规定外，T值应在0.95～1.05之间。以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出予以规定。e.  修订对重复性的要求（6）重复性  用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。除另 有规定外， 通常取各品种项下的对照品溶液或其它溶液，连续重复进样 5 次， 其 峰面积响应测量值（或内标比值或其校正因子）的相对标准偏差应不大于 2.0% ， 如品种项下规定相对标准偏差大于 2.0% ，则以重复进样 6 次的数据计算。视进 样溶液的浓度和/或体积、色谱峰响应和分析方法所能达到的精度水平等， 以满足 检测所需的精密度要求为前提， 对相对标准偏差的要求可适当放宽或收紧，放宽 或收紧的范围以满足品种项下检测需要的精密度要求为准并在品种项下予以规定。f.  增加保留时间和相对保留时间作为评价系统适用性参数的描述（7）其他参数保留时间和相对保留时间常用于评价系统适用性，如在品种项下列出但未明确为系统适用性要求，它们仅作为一种参考。实验得到的相对保留时间与品种项下规定值间的差异应为多少，没有适用的可接受标准。g.  对于复杂体系，提出可在品种项下附对照图谱来评价系统适用性对于复杂体系，可在品种项下附对照图谱，通过供试品图谱与对照图谱的比对来评价系统适用性。上述系统适用性试验及其可接受标准，根据方法验证特别是耐用性试验结果在品种项下描述。如上述的与品种项下描述的系统适用性试验及其可接受标准不同，则以品种项下描述为准。除品种项下描述的任何其他系统适用性试验及其标准外，不论品种项下描述与否，用于检查或定量分析时，重复性试验应满足本通则或品种项下的要求。在整个分析过程中，色谱系统应满足系统适用性要求，否则实验结果不被接受。5．在测定法中增加校准曲线测定法（6）校准曲线法对于复杂药物体系中的成分和/或待测成分量在较大范围变化的含量测定，可采用标准曲线法。标准曲线法可分为外标法和内标法。①外标校准曲线法：精密称取对照品（或工作对照品）适量，或精密量取对照品储备液适量，配制成不同浓度的系列溶液，精密量取系列溶液各适量，进样，记录色谱图，测量峰响应，用峰响应对浓度绘制标准曲线，通过最小二乘法计算出回归曲线方程。在相同的色谱条件下，再精密量取供试品溶液适量，进样，记录色谱图，测量供试品溶液中待测成分的峰响应，由待测成分的峰响应和回归曲线方程确定供试品溶液中待测成分的量。②内标校准曲线法：精密称取对照品（或工作对照品）适量，或精密量取对照品储备液适量，与精密量取的内标溶液混合，配成含等量内标物的不同浓度待测成分的系列溶液，精密量取系列溶液各适量，进样，记录色谱图，测量待测成分和内标物的峰响应比值，用峰响应比值对待测成分浓度绘制标准曲线，通过最小二乘法计算出回归曲线方程。在相同的色谱条件下，再精密量取加有与对照品系列溶液相同量内标物的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品溶液中待测成分和内标物的色谱峰响应比值，由待测成分的峰响应比值和回归曲线方程确定供试品溶液中待测成分的量。如适用，也可使用其他方法如标准加入法、内插法等，并在品种正文项下注明。参考文献[1] www.chp.org.cn作者简介滴水司南，男，生物医药高级工程师，立足于生物医药行业质量管理工作，专注于生物医药产业。【企业推荐】智药研习社近期研习会预告来源：智药公会声明：本文仅代表作者观点，并不代表智药公会立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com点击阅读原文，进入智药研习社~