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器官移植已成为多种终末期疾病的唯一有效治疗手段，供体器官严重缺乏却限制了这一疗法在临床上广泛应用。基于干细胞的器官异种动物体内再生将是未来解决这一问题的理想途径。通过该途径获得的人源化器官不仅将具有更 器官移植已成为多种终末期疾病的唯一有效治疗手段，供体器官严重缺乏却限制了这一疗法在临床上广泛应用。基于干细胞的器官异种动物体内再生将是未来解决这一问题的理想途径。通过该途径获得的人源化器官不仅将具有更全面的细胞类型和更完善的器官结构与功能，而且由于供体细胞来源于患者自体，将有效避免异种器官或同种异体器官移植中存在的免疫排斥等问题。 中国科学院广州生物医药与健康研究院在《细胞-干细胞》（Cell Stem Cell）上，发表了封面研究论文，报道了利用胚胎补偿技术在猪体内成功再造人源中肾的策略。 该研究利用具有高分化潜能、强竞争及抗凋亡能力的新型人诱导多能干细胞，结合优化的胚胎补偿技术体系，在肾脏缺陷猪模型体内实现了人源化中肾的异种体内再生，这是迄今世界范围内首次报道的人源化器官异种体内再生案例。 基于胚胎补偿技术实现人源化器官异种体内再生存在诸多障碍，包括人源多能干细胞的分化能力不足，在异种动物胚胎内的生存能力低下、大动物模型提供的器官缺陷生态位难以形成、异种胚胎嵌合补偿技术体系不完善等，导致从猪体内培育人体器官的设想一直没有成功。 为了寻求突破点，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组、潘光锦课题组以及Miguel A. Esteban课题组组成联合攻关团队，围绕人体肾脏的异种再生这一世界难题开展了5年多的研究。 攻关团队对人-猪胚胎补偿技术体系进行了全方位的优化，确定了理想的胚胎补偿技术流程，即在桑葚到早期囊胚时期注射3-5个人源供体细胞，以构建嵌合胚胎，后者在等比例混合的胚胎培养基和干细胞培养基中培养24小时后，移植入发情周期同步的代孕猪，即可获得嵌合猪胎儿，成功实现了人源化中肾的异种体内再生。 该研究严格遵守相关伦理规定以及国际惯例，在3-4周胎龄内终止了妊娠。研究共获得2只胎龄25天，3只胎龄28天的中肾嵌合胎儿。这些嵌合胎儿的中肾内人源细胞占比最高可达70%，而人源细胞参与形成的中肾小管所占比例最高可达58%。针对肾脏发育关键功能性基因SIX1、SALL1、PAX2及WT1的免疫荧光染色结果证明，人源供体细胞已分化成为表达这些基因的功能性细胞，说明伴随着胚胎发育，肾脏缺陷猪胎儿体内的人源供体细胞将能够支持人源化肾脏生成。 这一成果首次证明了基于干细胞及胚胎补偿技术在异种大动物体内再造人源化实质器官的可行性，为利用器官缺陷大动物模型进行器官异种体内再生迈出了关键一步，对解决供体器官严重短缺难题具有重要意义。 研究工作得到中国科学院战略性先导科技专项“器官重建与制造”和国家重点研发计划等的支持。   研究示意图

我国器官移植存在巨大供需缺口，每年有约30万人等候器官移植。长期以来，科学家们一直试图通过使用动物器官来解决器官资源短缺问题，生物谷近期就报道过，转基因猪的肾脏可在人体内正常运转一周的相关研究。《猪猪立大功！JAMA子刊：猪肾脏可在人体内正常运转一周，异种器官移植再获重大进展！》免疫组织相容性供体的短缺是器官移植中普遍存在的问题。目前很有前景的一种替代方案是通过胚胎与多能干细胞（PSCs）互补技术，在大型动物体内产生人类器官（专业术语：种间嵌合体 interspecies chimeras）。科学家已经在小鼠和大鼠中，成功培育出人胰腺、胸腺和肾脏等器官。鉴于猪在生理学、器官大小以及胚胎发育方面与人类高度相似，因此猪是制造人类器官的一款理想“孵化器”。然而，在啮齿类动物以外的哺乳动物中，制造种间嵌合体一直是一项难度极高的挑战。中国科学院广州生物医药与健康研究院的赖良学研究员、戴祯研究员、Miguel A. Esteban研究员以及潘光锦研究员历经5年的攻坚克难，在猪胚胎中成功培育出人-猪嵌合中期肾脏结构，相关成果于以《Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation》为题目，于2023年9月7日以封面形式发表于Cell子刊Cell Stem Cell杂志上。这也将是人类借助生物工程技术解决供体器官短缺这一世界难题的重要一步。 （doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）第一步：制备4CL/N/B人多功能干细胞选择合适的培养体系，是制造多功能干细胞的关键，科研团队比较了mTeSR1、4CL, RseT（HENSM）、PXG、5iLA等5种培养基，通过将DsRed（一种红色荧光标记物）标记的多功能干细胞注射到猪胚胎后，发现4CL是最适合用于下一步实验的培养基。课题组曾报道，同时过表达MYCN和BCL2两个基因 (缩写：N/B)，可以大大增强小鼠、兔和猪胚胎的生态位竞争力。因此，课题组在4CL培养条件下，在人多功能干细胞中过表达N/B基因，尝试提高干细胞的生存力。实验结果也证实，4CL/N/B联合作用可以产生最高程度的嵌合能力。 制备4CL/N/B人多功能干细胞流程及验证（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）第二步：制备肾脏有缺陷的猪胚胎已有研究表明，通过基因工程手段在特定组织中削弱细胞竞争，可以制造出在器官形成方面有缺陷的动物。SIX1和SALL1基因在猪中肾和后肾中均有表达，对中肾小管的形成和输尿管芽的侵袭过程至关重要。研究团队运用基因编辑技术（CRISPR-Cas9），在猪胎儿成纤维细胞外显子1中敲除SIX1,然后通过体细胞核移植制备SIX1敲除的猪胚胎。在此基础上，进一步敲除SALL1，制备出SIX1和SALL1双基因敲除的猪胚胎。这种特定的胚胎具备一定的肾脏缺陷，为后续人多能干细胞的生长和分化提供了必要的胚胎互补环境。 制备SIX1和SALL1双基因敲除猪胚胎的示意图（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）第三步：制备人源化猪肾脏 制备人源化猪肾脏的基本流程图（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）科研团队将共计1820个注射了DsRe标记的4CL/N/B 诱导多功能干细胞的胚胎转移到13只代孕猪体内，根据伦理相关规定，在胎龄25至28天后终止妊娠。在胎龄25天收集到两个正常胚胎和四个退化胚胎，在胎龄28天收集了三个正常胚胎。免疫荧光检测显示，DsRed标记的细胞仅出现在中肾区域。HE染色也证实，嵌合体的中肾表现出与野生型胚胎相似的组织学结构。中肾区域的免疫荧光染色结果（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003） HE染色结果显示，胎龄28天嵌合体的中肾小管发育正常。（doi: 10.1016/j.stem.2023.08.003）展望与不足本项研究成果证明了基于种间胚胎补偿技术在异种大型动物体内再造人源化器官的可行性，对解决器官移植领域供体器官短缺的难题具有重要意义，但依然有一系列瓶颈有待克服：（1）退化猪胚胎的总体比例很高，体细胞核移植克隆猪的效率不高；（2）未来如果运用于脑细胞和生殖细胞，面临着严重的伦理问题；（3）器官由多种细胞组成，如果器官的血管细胞来自猪供体，移植以后可能会引起器官排斥反应。研究团队在还指出，本项研究还存在一些明显的不足之处：（1）需要进一步的研究来阐明，嵌合体中整的人类细胞是否与野生型猪中肾单位的发育状态一致；（2）优化多能干细胞的制备过程（外源因素、培养条件或注射程序），可能促进嵌合能力提升；（3）运用单细胞测序技术，研究不同发育阶段，供体细胞在胚胎中的动态变化。期待中国科学院广州生物医药与健康研究院科研团队的后续进展！参考文献：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(23)00286-2撰文 | 汤睿智博士编辑 | 蓁蓁精彩推荐：1、咖啡有益新视角！《柳叶刀》子刊：咖啡或是预防痴呆、帕金森等神经退行性疾病的有利武器，这类人风险减低4-8倍！2、“补VD抗癌”添新证！JAMA 子刊：发现维生素D提高癌症免疫治疗效果的关键因素，可使这类癌症的生存率提高 1.5 倍3、Science：肝脂蛋白调控新机制！低密度脂蛋白未必是导致心脑血管疾病的元凶4、劳动勿过“量”！《柳叶刀》最新研究：高强度体力劳动与痴呆、轻度认知障碍风险增加相关5、减肥困难的原因找到啦！Nature研究揭示肥胖损害人类海马体中的促食欲神经网络，或为极具潜力的肥胖治疗新靶点！