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IDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛议程发布（点击图片查看）：合作展位事宜请联系：李欣欣 158 0045 2389（报名即将截止，扫码报名）ADC二肽 Linker的进化史1.简介为了使内化的ADC能够释放其药物有效载荷，带有non-cleavable linker的ADC需要在溶酶体内部被降解，而对于那些cleavable linker的ADC，则需要在抗体与药物有效载荷之间的linker处进行裂解。长久以来，人们已经知道半胱氨酸蛋白酶家族的成员——组织蛋白酶，主要分布在溶酶体中。这些溶酶体是内化的ADC在经过受体介导的内化、内化囊泡与内体的融合以及运输至溶酶体之后所进入的细胞器。组织蛋白酶在蛋白质的分解代谢和自噬中扮演着重要角色，从在对代谢和营养有高度需求的增殖癌细胞中起了重要作用。人类的溶酶体组织蛋白酶家族包含15个成员，分为半胱氨酸（B、C、F、H、K、L、O、S、V、Z/X、W）、天冬氨酸（D、E）和丝氨酸（A、G）蛋白酶。在溶酶体的酸性pH环境下，半胱氨酸组织蛋白酶的酶活性最高。由于肿瘤微环境（TME）通常比正常细胞环境更为酸性，组织蛋白酶在TME中也处于活跃状态。在针对癌症治疗开发的ADC中，特别关注了在肿瘤中过表达的组织蛋白酶，尤其是组织蛋白酶B（CTSB）、组织蛋白酶L（CTSL）、组织蛋白酶S（CTSS）、组织蛋白酶H（CTSH）和组织蛋白酶K（CTSK）。目的是选择那些在肿瘤中相较于正常细胞可能具有更高活性的蛋白酶裂解linker，从而为ADC的治疗窗口做出贡献。在ADC中主要使用了由组织蛋白酶B裂解的linker。组织蛋白酶B由一个重链和一个轻链组成的二聚体。它是唯一具有羧肽酶活性（在底物的羧基末端裂解）和内肽酶活性（在蛋白质底物内部的肽键裂解）的组织蛋白酶。羧肽酶负责组织蛋白酶在溶酶体中的生理作用，而内肽酶活性则参与细胞外基质的降解，从而涉及癌症进展和转移。组织蛋白酶B的后一功能是因为它会被肿瘤细胞、肿瘤相关的巨噬细胞或免疫细胞分泌到细胞外空间。一般来说，组织蛋白酶对于肽序列的裂解特异性并不高，这与它们作为溶酶体中的通用降解酶的角色相符。              2.Cathepsin B-cleavable Linker2.1 Val-Cit Linker的进化史ADC中酶裂解型连接子的发展可追溯到20世纪90年代末。首代免疫结合物（如针对FUT3（Lewis Y血型抗原）的抗体克隆BR96（cBR96）与多柔比星（DOX）通过为在细胞溶酶体的酸性pH下水解裂解而设计的肼连接子相连）所遇到的稳定性问题，激发了寻找从ADC释放有效载荷的替代机制的研究。除了在循环中具有更高的稳定性外，也设想了对不同类型有效载荷的连接位点具有更广泛的适用性和更高的灵活性。ADC通过靶向介导的方式被细胞摄取并随后转运到溶酶体，这表明溶酶体酶是ADC代谢的理想选择。在众多溶酶体酶中，由于哺乳动物细胞溶酶体内组织蛋白酶B的高丰度，它被认为具有特别的潜力。BMS的科学家们从已知的苯丙氨酸-精氨酸（Phe-Arg）二肽底物序列出发，研究了一系列通过二肽的羧基末端与多柔比星（DOX）的氨基相连的带帽二肽前药。这些前药旨在评估它们是否能被组织蛋白酶B裂解，以及它们在人类血浆中的稳定性如何。考虑到DOX因体积过大可能不适合组织蛋白酶B的活性位点，他们还引入了一个由Katzenellenbogen设计的PABC spacer，该spacer设计用于在酶促裂解酰胺键后自我裂解并释放药物。根据序列的不同，带有PABC连接子的前药在组织蛋白酶B作用下的半衰期介于8分钟到34小时之间，而没有PABC间隔体的前药未显示出裂解。苯丙氨酸-赖氨酸（Phe-Lys）序列显示出较大潜力，并且也适用于紫杉醇和丝裂霉素C可被组织蛋白酶裂解的前药。带有此二肽裂解序列和自我裂解PABC间隔体的前药，在大鼠肝脏溶酶体中能够高效裂解，同时在人类血浆中展现出良好的稳定性。    图1：组织蛋白酶B介导的多柔比星从前药中释放这种前药设计成功地应用到了下一代的cBR96 ADC中，与使用酸敏感连接子的旧式ADC不同，这些新一代ADC易于通过组织蛋白酶B介导的裂解。使用苯丙氨酸-赖氨酸和缬氨酸-瓜氨酸连接子的靶向ADC，携带多柔比星（DOX）作为有效载荷，展现了强大的抗原特异性细胞毒性活性。在三种表达不同水平的FUT3（cBR96的Lewis Y血型抗原）癌细胞系上测试了cBR96-sc-Phe-Lys-PABC-DOX和非靶向IgG-sc-Phe-Lys-PABC-DOX结合物的细胞毒性效力，其中sc代表琥珀酰亚胺己酰，这是在硫醇加入经过马来酰亚胺己酰（mc）修饰的ADC前体分子后形成的。结肠癌细胞系HCT116未表达BR96抗原，而肺癌细胞系L2987则高表达BR96抗原。    非靶向ADC在两种细胞系上的IC50均为33 mM的多柔比星当量，cBR96-sc-Phe-Lys-PABC-DOX ADC在抗原阴性的HCT116上也是如此。相比之下，靶向的cBR96-sc-Phe-Lys-PABC-DOX ADC的效力为0.2 mM的多柔比星当量，因此相对于抗原阴性细胞和非靶向ADC展现出了4220倍的选择性。具有相同连接子的小分子化合物在大鼠肝脏溶酶体和人类血浆中进行了裂解测试。最初的观察显示，最高的裂解率在大鼠肝脏溶酶体中被检测到，这不能完全仅仅通过组织蛋白酶B的裂解来解释，暗示可能有其他酶涉及多柔比星的释放（下文有讨论）。当将更具毒性的细胞毒化合物，如MMAE，通过这些连接子，包括PABC spacer，与嵌合抗CD30单克隆抗体cAC10或抗Lewis Y单克隆抗体cBR96结合时，实现了下一个ADC里程碑。再次发现，与MMAE的连接的组织蛋白酶B可裂解连接子，在与酸裂解的肼连接海兔毒素相比，显示出更优越的性能。在还原了链间二硫键并随后与马来酰亚胺前体分子结合后，获得了药物抗体比（DAR）为8的ADC，这些ADC只显示出低度聚集。在用于MMAE连接的不同组织蛋白酶B可裂解连接子中，带有Val-Cit-PABC连接子的ADC在效力、特异性、血浆稳定性和体内功效方面表现最佳。这些发现为第二代ADC的开发提供了基础，这些ADC进入了临床研究，并最终成功地获得了在不同适应症中，包括血液和实体瘤的几个临床候选药物的批准。    图3：常见Val-Cit-PABC（蓝色部分）-MMAE（黑色部分） ADC结构          含有组织蛋白酶B可裂解二肽连接子的ADC在已批准的ADC以及目前正在进行关键性临床试验的ADC中占有显著地位。Brentuximab vedotin（Adcetris）是一种针对CD30的ADC，使用Val-Cit-PABC连接子和MMAE作为有效载荷，已被批准用于治疗表达CD30的复发性霍奇金淋巴瘤、全身性间变性大细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤。相同的linker payload被用于针对CD79b的Val-Cit-PABC-MMAE ADC（polatuzumab vedotin，Polivy），该药物已被批准与bendamustine和利妥昔单抗联合使用，用于治疗弥漫大B细胞淋巴瘤。第三，针对nectin-4的Val-Cit-PABC-MMAE ADC（enfortumab vedotin，Padcev）已被批准用于转移性尿路上皮癌。以及还有DS8201类的四肽linker后续再说。          2.2 Val-Cit-PABC-MMAE ADC的过早释放问题2.2.1 在小鼠模型中由于羧酸酯酶1c（Ces1c）导致的不稳定性在首个ADC，Adcetriss（由Seattle Genetics，现Seagen开发）于2011年成功获批之后，对组织蛋白酶可裂解的Val-Cit-PABC连接子进行了更详细的研究。在早期研究中，组织蛋白酶可裂解的cBR96 ADC在人类血浆中测得高稳定性（Val-Cit的推算半衰期为230天，Phe-Lys连接子为80天）。然而，在小鼠血浆中发现稳定性较低（Val-Cit的推算半衰期为30天，Phe-Lys连接子为12.5天）。这种不稳定性在在猴子或人类中未见到。通过细菌谷氨酰胺转移酶对位点特异性修改的Val-Cit-PABC-MMAE工程化抗体的研究揭示，稳定性和功效还取决于连接位点。通过各种酶抑制剂、蛋白质组学研究以及敲除小鼠的研究显示，导致Val-Cit连接子在小鼠血浆中与过早有效载荷释放相关的不稳定性的酶是羧酸酯酶1c（Ces1c），而非组织蛋白酶B。    羧酸酯酶1c（Ces1c）介导的过早裂解对ADC功效的影响通过SYD985进行了研究，这是另一种第二代HER2 ADC。SYD985包含一个蛋白酶可裂解的Val-Cit连接子，通过自我裂解部分与seco-duocarmycin（一种非活性前药，需要一个额外的化学环化步骤来释放活性代谢物seco-DUBA）结合。SYD985在Ces1c野生型和Ces1c敲除小鼠中进行了并行测试。与Ces1c野生型小鼠相比，SYD985在Ces1c敲除小鼠中的抗肿瘤活性显著增强，表明ADC通过抗体递送有效载荷是药效的主因，而非通过Ces1c介导的裂解系统性释放有效载荷。图4：SYD985是一种针对HER2的ADC，其结构由曲妥珠单抗、短聚乙二醇链、Val-Cit二肽和自我消除模块组成，后接一个环化模块以释放基于杜卡麦素的DNA烷化剂有效载荷seco-DUBA。为了提高携带杜卡麦素有效载荷的组织蛋白酶B可裂解ADC在血浆中的稳定性，研究团队探索了改变自我裂解间隔部分的影响。这项研究成功识别出一种meta-amide ma-PABC基团，这一发现使得连接子在小鼠血清中显示出了明显提高的稳定性。此外，如果在间位位置引入聚乙二醇基团，还能够降低疏水性，而不会对组织蛋白酶B进行的蛋白质裂解产生不利影响。    图5：在自消除部分引入meta-amide          2.2.2 中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase）介导的降解导致的中性粒细胞减少Agensys的人员研究了引起癌症患者常见不良事件——ADC诱导的中性粒细胞减少症的潜在原因。他们旨在阐明为何带有可裂解Val-Cit-PABC连接子释放MMAE有效载荷的ADC会导致患者出现中性粒细胞减少症，而与抗体和靶点无关，相比之下，通过不可裂解的马来酰亚胺己酰连接子（mc-MMAF）结合到MMAF的ADC治疗的患者中，并未显著出现中性粒细胞减少症这一不良事件。因此，他们研究了带有可裂解连接子（vc-PABC-MMAE）释放具有旁观者效应的有效载荷，以及带有不可裂解连接子（mc-MMAF）释放无旁观者效应有效载荷的ADC对中性粒细胞分化的影响，通过一个实验进行了考察，在该实验中，血液造血干细胞（HSC）分化为中性粒细胞。研究的ADC针对的是中性粒细胞上不表达的抗原，如ENPP3（外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3）、SLC44A4（胆碱运输蛋白样蛋白4）或鸡蛋溶菌酶。    图6：不同靶向的cleavable vc-PABC-MMAE和 non-cleavable mc-MMAF ADC示意图          在这个实验中，发现带有可裂解vc-PABC-MMAE连接子的ADC对分化为中性粒细胞的HSCs的细胞毒性更强，而非通过不可裂解的马来酰亚胺己酰连接子和MMAF有效载荷与相同抗体结合的ADC。这归因于中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）对可裂解Val-Cit连接子的胞外蛋白水解，随后释放自由的MMAE有效载荷，由于其旁观者效应，对中性粒细胞有毒。通过质谱确认了从相应ADC释放MMAE的情况；这一现象仅在与分化为中性粒细胞的HSCs（已显示表达弹性蛋白酶）孵育时观察到，而在与HSC条件培养基孵育时未观察到。使用丝氨酸蛋白酶抑制剂可以消除带有vc-PABC-MMAE的ADC的裂解，但半胱氨酸蛋白酶抑制剂则不能。总的来说，由分化中性粒细胞分泌的中性粒细胞弹性蛋白酶能够裂解ADC，从而释放出对中性粒细胞有毒的有效载荷。这些发现可能为扩大可裂解ADC的治疗窗口提供机会，通过设计具有更高特异性的连接子，这些连接子更倾向于特定的溶酶体半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B）而非丝氨酸蛋白酶（如中性粒细胞弹性蛋白酶）。          2. 3 组织蛋白酶B的降解机制基因泰克公司的研究人员利用外显子和基因敲除小鼠阐明了 Val-Cit-PABC-MMAE ADC 的分解和代谢物形成的其他机制通过CRISPR/Cas9介导的组织蛋白酶B基因在HER2阳性KPL-4细胞中的删除或通过shRNA在CD22阳性淋巴瘤细胞系WSU-DLCL2和BJAB中的敲减，对抗HER2或抗CD22的Val-Cit-PABC-MMAE ADC的效能没有影响。这明确暗示了其他酶可能补偿了组织蛋白酶B活性的丧失，以实现MMAE的释放。使用纯化的组织蛋白酶B、K、L和S进行的生化裂解实验显示，不仅组织蛋白酶B，而且组织蛋白酶S也能有效裂解Val-Cit-PABC-MMAE ADC。在研究带有非天然(R)-瓜氨酸氨基酸作为裂解位点的抗HER2和抗CD22 ADC时，发现在瓜氨酸之后的蛋白水解完全被阻断。有趣的是，这些抗HER2 ADC仍然活跃，并在KPL-4细胞系中显示出与可裂解顺ADC相比约一半的体外效能。这是由于抗体完全降解后形成了另一种活性代谢物，一个半胱氨酸残基保持附着在不可裂解的连接子Cys-Val-Cit(R)-PABC-MMAE上。通过质谱确认了这种有效载荷代谢物的形成，它仍能够结合微管目标，这解释了其效能。然而，当毒素从MMAE切换到PBD时，带有(S)-瓜氨酸顺反异构体的HER2 ADC被发现具有很高的效能，而切换到相应的不可裂解(R)-瓜氨酸顺反异构体则导致完全失去效能。这些发现表明，与mmae有效载荷不同，PBD有效载荷要求以未修饰的形式从ADC中释放，并且不容忍任何连接子片段附着在有效载荷上，以发挥其全部效能。    图7：Cathepsin-cleavable ADC with Val-Cit(S) linker and PBD payload          这些研究表明，对连接子化学和裂解机制的深入理解，以及与有效载荷结构活性关系（SAR）的良好匹配，可能有助于更好地设计ADC，在循环中具有更高的稳定性，与更好的耐受性、更高的体外活性、更强的体内抗肿瘤活性相关联，因而达到更高的治疗指数。          2. 4 组织蛋白酶B特异性降解的linker    面对含有vc的肽连接子易被如组织蛋白酶B、组织蛋白酶S、羧酸酯酶1c和中性粒细胞弹性蛋白酶等多种酶裂解的情况，Genentech和Spirogen的研究人员旨在提高肽连接子对组织蛋白酶B裂解的特异性。由于组织蛋白酶B的外肽酶和内肽酶活性都参与到细胞外基质蛋白的蛋白水解和肿瘤细胞侵袭中，因而在癌症进展中起到了重要作用，人们设想通过组织蛋白酶B对ADC的特定细胞外裂解可能更有效地诱导在肿瘤微环境（TME）中释放附着的细胞毒性有效载荷。除了溶酶体内有效载荷释放外，细胞外释放也是可能的，并且可能允许非内化抗体的有效载荷释放。因此，Wei等人采取了一种基于结构的方法来开发高度特异性由组织蛋白酶B裂解的拟肽连接子。他们提出了一个含有cBu-Cit基团的拟肽连接子。图8：cBu-Cit分子设计用于通过 cathepsin B 进行高度特异性裂解。          含有cBu-Cit的ADC在体内裂解被组织蛋白酶B特异性抑制剂抑制了75%，而被广谱蛋白酶抑制剂抑制了90%。相比之下，相应含有Val-Cit的ADC只能被广谱蛋白酶抑制剂抑制。因此，cBu-Cit基团对于组织蛋白酶B的裂解更具选择性，与Val-Cit相比，不需要其他蛋白酶来有效释放有效载荷。比较含有cBu-Cit连接子的ADC，无论是带有MMAE还是PBD有效载荷，都显示出类似的功效，这表明组织蛋白酶B的蛋白水解能力足以有效释放肿瘤细胞中cBu-Cit连接子的有效载荷。其他能够消化Val-Cit但不能消化cBu-Cit连接子的蛋白酶对于体外观察到的功效不是必需的。              2. 5 更加亲水的Val-Ala- 和Ala-Ala-linker与PBD以及IGN毒素取决于有效载荷的亲脂性，带有Val-Cit-PABC连接子的ADC常常存在形成聚集体的风险。作为Val-Cit二肽基序列连接子的替代方案，缬氨酸-丙氨酸（Val-Ala）基序，它也是组织蛋白酶B的底物，最初在第一代多柔比星（DOX）ADC中进行了探索。与Val-Cit一样，它也显示出高度的血浆稳定性。对于选定的第二代获批ADC的一个重要成功因素是转向更有效的有效载荷，如与DNA相互作用的calicheamicin衍生物和美登素和金盏花素类等微管结合剂。到目前为止，许多研究努力试图发现和验证具有不同作用模式的新型有效载荷类别，希望能成功地应用于ADC中——从而增加治疗选项的武器库。其中，DNA交联的PBD有效载荷因其异常高的效能而被认为特别有前景。然而，PBD有效载荷在ADC中的应用非常具有挑战性，因为它们有很强的疏水性从而导致ADC有形成聚集体的倾向，与Val-Cit-PABC连接子结合使用时这一问题更加明显。这一挑战通过将均一的位点特异性结合的ADC的药物抗体比（DAR）降低到不超过两个来解决，并且通过变化连接子的肽序列。为了实现这一目标，Seagen的科学家将来源于talirine的PBD有效载荷SGD-1910通过Val-Ala-PABC连接子位点特异性结合到抗CD33单克隆抗体的重链239位点的工程化半胱氨酸上。活性有效载荷代谢物SGD-1882通过裂解Val-Ala-PABC连接子释放。均一的vadastuximab talirine（SGN-CD33A）具有2的DAR，已经进行了治疗骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓细胞白血病（AML）的临床研究。    图9：Val-Ala-PABC-PBD的DAR2 ADC结构同样的结构也被应用于抗CD70的h1F6单克隆抗体，用于治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）和转移性肾细胞癌（mRCC）。这些位点特异性结合的ADC与随机结合的ADC相比，聚集体形成率仅为2%，而后者达到了20%以上，并且发现在大鼠血浆中稳定超过6天，没有发生解偶联。在CD70阳性的肾细胞RCC和NHL小鼠异种移植模型中，抗CD70 ADC在低至0.1 mg/kg的ADC剂量下，无论是单次或每周给药均显示出显著的抗肿瘤活性，同时在小鼠中表现出良好的耐受性。这些早期结果表明，PBDs可以在ADC中被使用。其他三种含talirine的ADC，即SGN-CD19B、SGN-CD123A和SGN-CD352A，已显示出有希望的临床前数据，并已在I期临床试验中进行研究；然而，所有三个含talirine的ADC项目已被终止（PBD的毒性还是太大了）。Spirogen的科学家通过将PBD二聚体之一的亚胺基团固定在其碳醇胺形式，并将N10氮作为cathepsin B可裂解的Val-Ala-PABC前药连接子的一部分，从而捕获了这一基团。PBD衍生物SG-3249作为Val-Ala-PABC连接子的一部分，并通过PEG-8间隔体延长，被证明结合了高效能与降低的疏水性。SG-3249的clogD为2.11，因此比talirine衍生物SGD-1910的clogD 4.71更亲水。与Stemcentrx合作，SG-3249与人源化IgG1抗体SC16 rovalpituzumab结合，获得的DLL3 ADC，rovalpituzumab tesirine（Rova-T），进行了III期临床试验，用于小细胞肺癌（SCLC）的一线维持治疗。然而，由于在预定的中期分析中，与安慰剂相比，接受Rova-T治疗的患者未显示出生存益处，该项目已被终止。    在Spirogen与ADC Therapeutics的另一项合作中，相同的有效载荷通过随机方式与人源化抗CD19抗体结合，生成了ADCT-402（loncastuximab tesirine）。释放的有效载荷代谢物SG3199可不可逆地结合到DNA，形成DNA链间交联，导致DNA复制中断和细胞死亡。SG3199对一系列人类血液肿瘤细胞系具有皮摩尔级的效力。在复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中观察到48.3%的总体反应率和24.1%的完全反应率。loncastuximab tesirine于2021年被批准为Zynlonta，用于治疗复发/难治性DLBCL。图10：Rova-T/ADCT402/ADCT301结构          为了解决PBD二聚体潜在的毒性问题，ImmunoGen的科学家设计了一类新的吲哚啉苯二氮卓伪二聚体（IGN），通过对二聚体中第二个亚胺进行受控还原获得带有单亚胺基团。这些单亚胺被认为是作为DNA烷化剂而非交联剂起作用。这些ADC与使用针对叶酸受体-α（FRα）和CD123以及EpCAM的抗体的相应PBD ADC进行了比较。含有IGN ADC的ADC显示出类似的体外功效，但与相应的PBD二聚体ADC相比，具有改善的旁观者杀伤效应和体内功效。    TAK-164，一个通过赖氨酸连接的ADC，带有全人源抗鸟苷酸环化酶C（GCC, GUCY2C）抗体，以及IMGN632，一个通过半胱氨酸连接的ADC，带有人源化抗CD123抗体（G-4723A），均通过丙氨酸-丙氨酸二肽连接子，目前正在针对GUCY2C阳性的结直肠和其他胃肠道肿瘤以及AML和CD123阳性恶性肿瘤的I期临床试验中。图11：TAK164与IMGN632结构          最后，这种IGN payload还允许采用一种合成策略，利用N-10胺进行羧肽酶可裂解连接子的连接。沿着这一思路，通过变化连接两个单体的间隔体，调整了代谢物谱。此外，通过氨甲酸酯连接到N-10氨基团的不同二肽连接子，如Ala-Ala、Val-Ala和Gln-Leu已被探索，并显示在体外筛选实验中被蛋白酶非常有效地裂解。这种IGN ADC的设计允许通过伪二聚体之间的spacer调节活性代谢物谱，通过亲疏水性调节bystander killing。    图12：带有 IGN的 ADC 中的不同间隔子，分别提供低（左侧）和高（右侧）旁观者杀伤倾向的代谢物。    ENDIDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛议程发布（点击图片查看）：合作展位事宜请联系：李欣欣 158 0045 2389