Akt x SOX2

DPI-4452相关信息梳理DPI-4452（CAS号：2941391-49-5）是一款靶向碳酸酐酶IX（Carbonic Anhydrase IX，CAIX）的多肽类化合物。CAIX作为一种在缺氧肿瘤微环境中高表达的跨膜蛋白酶，与肿瘤的增殖、侵袭及耐药性密切相关，而DPI-4452凭借多肽分子对靶点的高特异性结合能力，成为肿瘤靶向诊疗领域的重要研发候选物。以下从药物研发、作用机理及研究进展三方面展开详细阐述。一、药物研发DPI-4452的药物研发以“靶向CAIX阳性肿瘤的精准诊疗”为核心目标，依托多肽化合物的靶向优势，围绕肿瘤治疗与诊断探针开发两大方向推进，形成“靶点验证-分子设计-优化筛选-评价转化”的完整研发链条，关键环节及进展如下：1. 研发核心目标针对CAIX高表达的恶性肿瘤（如肾透明细胞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等），开发兼具高靶向性、高稳定性及良好生物相容性的多肽药物或诊断探针。治疗方向以抑制CAIX活性、阻断肿瘤缺氧适应性通路为目标，实现抑制肿瘤增殖、逆转耐药的效果；诊断方向则利用多肽的靶向性，构建肿瘤成像探针，实现CAIX阳性肿瘤的早期诊断与分期。同时，依托多肽分子的结构可塑性，探索“诊疗一体化”研发路径，提升肿瘤诊疗的精准度与效率。2. 关键研发环节DPI-4452的研发需经过多阶段递进式验证，各环节聚焦性能优化与疗效保障，核心任务明确：靶点验证与分子设计：研发初期通过临床样本分析证实，CAIX在肾透明细胞癌等肿瘤组织中的阳性表达率超80%，且与肿瘤分期、预后呈正相关，明确其作为靶点的有效性。分子设计阶段，以CAIX的活性位点结构为模板，采用多肽从头设计策略，筛选含酸性氨基酸残基（如天冬氨酸、谷氨酸）的短肽序列，通过引入环状结构（如二硫键环化）增强与CAIX活性中心的结合亲和力；同时在肽链末端引入修饰基团（如乙酰基、酰胺基），提升多肽的体内稳定性，减少蛋白酶降解。活性优化与筛选：通过体外酶活实验与细胞结合实验进行高通量筛选。酶活实验中，以CAIX催化的二氧化碳水合反应为检测指标，筛选半数抑制浓度（IC50）低于100 nM的候选多肽；细胞结合实验采用CAIX高表达细胞系（如786-O肾癌细胞），通过流式细胞术检测多肽与细胞的结合率，筛选解离常数（KD）低于50 nM的高亲和力分子。DPI-4452经多轮优化后，IC50值达15 nM，与786-O细胞的KD值达8 nM，兼具高效抑制活性与靶向结合能力。临床前评价：通过体外细胞实验与动物模型验证药物性能。体外实验证实，DPI-4452可抑制CAIX高表达肿瘤细胞的增殖（IC50=25 nM），诱导细胞凋亡，并逆转缺氧诱导的化疗耐药；体内实验采用裸鼠786-O荷瘤模型，尾静脉注射DPI-4452后，肿瘤体积较对照组缩小40%-50%，且对正常组织（如肾脏、肝脏）无明显毒性，最大耐受剂量（MTD）达100 mg/kg。针对诊断探针研发，将DPI-4452与荧光染料或放射性核素（如⁶⁸Ga）偶联后，在荷瘤小鼠模型中实现肿瘤的精准显像，肿瘤/正常组织信号比达8:1。临床试验进展：目前DPI-4452处于临床前研究后期阶段，部分诊断探针（如荧光标记DPI-4452）已进入Ⅰ期临床试验，用于肾透明细胞癌手术中的肿瘤边界定位，初步结果显示其可精准识别肿瘤组织，提高手术切除的彻底性。治疗用DPI-4452已完成临床前安全性评价，正在筹备Ⅰ期临床试验，拟评估其在晚期CAIX阳性实体瘤患者中的安全性、耐受性及药代动力学特征。3. 研发重点方向当前研发聚焦三大方向：一是“诊疗一体化”探针开发，将DPI-4452与兼具显像和治疗功能的核素（如⁶⁴Cu）偶联，实现“肿瘤定位-靶向治疗-疗效监测”一体化，目前已在动物模型中验证其可行性；二是联合治疗策略研发，将DPI-4452与抗血管生成药物（如舒尼替尼）或免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体）联合，通过“抑制CAIX通路+阻断血管生成”或“靶向治疗+免疫激活”的协同作用提升疗效，临床前实验显示联合治疗的肿瘤抑制率达70%以上；三是给药系统优化，将DPI-4452负载于纳米载体（如脂质体、聚合物纳米粒），延长体内循环时间，提升肿瘤部位富集量，降低脱靶毒性。二、作用机理DPI-4452的作用机理围绕“靶向结合CAIX-抑制酶活性-调控肿瘤病理进程”核心逻辑展开，通过特异性干预CAIX在肿瘤缺氧微环境中的功能，实现对肿瘤的精准调控，具体可分为三个关键环节：1. 与CAIX的特异性靶向结合CAIX是一种含胞外酶活性域、跨膜域和胞内域的跨膜蛋白，其胞外酶活性域为催化核心，活性中心含锌离子结合位点及底物结合口袋。DPI-4452作为多肽化合物，可通过被动扩散或内吞作用进入肿瘤微环境，其分子结构中的酸性氨基酸残基（如天冬氨酸）可与CAIX活性中心的锌离子形成配位键，同时肽链的环状结构可与底物结合口袋的疏水氨基酸残基形成疏水作用，通过“配位键+疏水作用+氢键”的多重相互作用，实现与CAIX的特异性结合。这种结合具有高度选择性，对CAIX的同源亚型（如CAI、CAII）的交叉结合率低于3%，可精准靶向CAIX高表达的肿瘤细胞。2. 抑制CAIX的酶催化活性CAIX的核心生物学功能是催化二氧化碳（CO₂）与水（H₂O）反应生成碳酸氢根离子（HCO₃⁻）和氢离子（H⁺），该反应在肿瘤缺氧微环境中尤为活跃：缺氧导致肿瘤细胞无氧糖酵解增强，产生大量乳酸，而CAIX催化生成的HCO₃⁻可作为细胞内pH缓冲剂，维持肿瘤细胞内pH稳定，同时排出的H⁺降低肿瘤微环境pH，促进肿瘤侵袭与耐药。DPI-4452与CAIX活性中心结合后，通过两种方式抑制其催化活性：一是占据锌离子结合位点，阻止锌离子介导的催化反应；二是封闭底物结合口袋，抑制CO₂与酶的结合。体外酶活实验证实，DPI-4452对CAIX的抑制率达90%以上，可显著降低HCO₃⁻的生成量。3. 调控肿瘤增殖、侵袭及耐药等病理进程DPI-4452通过抑制CAIX活性，从多方面调控肿瘤病理进程：一是破坏肿瘤细胞内pH稳态，CAIX被抑制后，肿瘤细胞无法有效清除无氧糖酵解产生的乳酸，导致细胞内酸中毒，抑制细胞周期进展（阻滞于G0/G1期）并诱导凋亡；二是改善肿瘤微环境，减少H⁺分泌使肿瘤微环境pH升高，抑制基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的活性，从而阻断肿瘤细胞的侵袭与转移；三是逆转化疗耐药，酸性微环境会降低化疗药物（如阿霉素、顺铂）的稳定性与细胞摄取量，DPI-4452改善微环境pH后，可提升化疗药物的胞内浓度，增强化疗敏感性；四是抑制肿瘤血管生成，CAIX通过调节H⁺浓度影响血管内皮生长因子（VEGF）的表达，DPI-4452抑制CAIX后可下调VEGF水平，减少肿瘤新生血管形成。三、研究进展近年来，DPI-4452的研究在分子优化、应用拓展及机制深化等方面取得多项突破，推动其从基础研究向临床转化加速，核心进展如下：1. 分子结构修饰与性能提升通过结构修饰显著提升DPI-4452的成药性：一是肽链环化修饰，采用非天然氨基酸（如鸟氨酸）替换天然氨基酸，形成更稳定的环状结构，使体内半衰期从2小时延长至6小时，蛋白酶降解率降低60%；二是糖基化修饰，在肽链引入葡萄糖残基，增强水溶性（生理盐水溶解度从1 mg/mL提升至5 mg/mL），同时通过葡萄糖转运体（GLUT1）介导的主动转运，提升肿瘤细胞摄取量；三是双靶点修饰，将DPI-4452与靶向整合素αvβ3的肽段偶联，构建双靶点多肽，同时结合CAIX与整合素，肿瘤富集量提升50%，且对CAIX低表达肿瘤也具有靶向性。2. 应用领域从单一肿瘤向多癌种拓展初始研究聚焦肾透明细胞癌，目前已拓展至多种CAIX阳性肿瘤：在结直肠癌研究中，DPI-4452可抑制HCT116细胞增殖，裸鼠荷瘤模型中肿瘤抑制率达45%；在非小细胞肺癌研究中，针对CAIX阳性的A549细胞，DPI-4452可逆转缺氧诱导的顺铂耐药，使耐药指数从3.2降至1.1；在胰腺癌研究中，DPI-4452负载的纳米载体可穿透肿瘤基质，提升药物递送效率，肿瘤抑制率达65%。诊断领域，荧光标记DPI-4452在膀胱癌、卵巢癌的术中显像中也展现出潜力，可精准识别微小病灶。3. 联合治疗策略的协同效应验证联合治疗研究取得显著进展：与抗血管生成药物舒尼替尼联合时，DPI-4452可抑制舒尼替尼诱导的CAIX上调，增强其抗血管生成效果，裸鼠模型中肿瘤体积缩小72%，较单独用药提升30%；与PD-1抗体联合时，DPI-4452改善肿瘤微环境酸性后，可促进T细胞浸润，提升免疫治疗响应率，CAIX阳性黑色素瘤模型中完全缓解率达35%，而单独PD-1抗体治疗仅为10%；与化疗药物顺铂联合时，DPI-4452可提升顺铂在肿瘤细胞内的积累量，使顺铂的IC50值从20 μM降至8 μM，降低化疗药物用量及毒副作用。4. 作用机制的深化与耐药性研究机制研究从酶活性抑制向信号通路调控延伸，发现DPI-4452不仅抑制CAIX的催化活性，还可通过结合CAIX的胞内域，抑制其与下游信号分子（如Src激酶）的相互作用，阻断PI3K/Akt通路激活，进一步抑制肿瘤增殖；耐药性研究方面，明确部分肿瘤通过上调CAXII（CAIX同源亚型）产生耐药，针对此开发的DPI-4452衍生物（可同时抑制CAIX和CAXII），在耐药模型中仍保持40%的肿瘤抑制率；此外，通过单细胞测序技术发现，DPI-4452可调控肿瘤干细胞的干性相关基因（如SOX2、OCT4）表达，减少肿瘤干细胞比例，降低复发风险。申明：仅实验室科研，不适应于人体，后果自负相关其他产品：NOTA-TATE DOTA-NOC DOTA-TOC LNC1007 DPI-4452供应商：上海楚肽生物科技有限公司返回搜狐，查看更多

喜欢我们，设为星标，接收最新类器官进展与资讯！知识星球搜索“肠道类器官”获取更加专业的培养基配方、标准方案、AI类器官工具和技术手册。  传播科学知识 促进同行交流 推动产业发展 服务国家战略  本公众号由Organoid Agent智能体强力赋能，让您的类器官研究始终站在潮头浪尖！ 推荐语       该研究针对脊髓损伤修复中现有脊髓类器官难以精准复现胸段脊髓区域异质性与空间结构的科学问题，提出工程化胸段脊髓类器官（enTsOrg）解决方案。其以成纤维细胞来源的诱导多能干细胞为基础，结合层状双氢氧化物（LDH）与基底膜水凝胶构建，可精准匹配胸段移植位点。在脊髓损伤小鼠模型中，enTsOrg 展现出高级成熟度与功能化特性，能有序分布关键神经元亚型，重建神经环路并恢复后肢运动功能。机制上，LDH 通过调控相关信号通路促进神经元存活与分化。该研究为神经损伤治疗中特定解剖区域类器官设计提供新范式，对推动脊髓损伤修复临床转化具有重要意义。 技术路线图 科学背景与研究现状 一、脊髓损伤治疗的临床困境与医学需求 脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）作为中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）严重创伤，已成为全球公共卫生领域的重大挑战。据世界卫生组织统计，全球每年新增 SCI 患者超 130 万人，患者多为青壮年，损伤后常伴随损伤平面以下永久性运动障碍、感觉丧失及自主神经功能紊乱，不仅严重影响患者生活质量，还需长期医疗照护，给家庭与社会带来沉重负担。 从病理机制来看，SCI 分为原发性损伤与继发性损伤两个阶段。原发性损伤由外力直接作用引发，导致脊髓组织撕裂、神经细胞坏死及神经纤维（轴突）断裂；继发性损伤则在原发性损伤后数小时至数周内持续发生，通过炎症反应、氧化应激、兴奋性毒性作用及胶质瘢痕形成等病理过程，进一步扩大损伤范围。其中，胶质瘢痕由星形胶质细胞过度增殖形成，会物理性阻断神经轴突再生，同时释放抑制性分子（如硫酸软骨素蛋白多糖），成为 SCI 修复的核心障碍。 当前临床治疗手段仍以对症支持为主，如早期手术减压解除脊髓压迫、使用甲基强的松龙抑制炎症反应等，仅能延缓继发性损伤进展，无法实现神经组织再生与功能重建。成年哺乳动物脊髓神经元的再生能力极弱，且损伤微环境恶劣，这一现状使得 SCI 修复长期处于 “治疗手段有限、预后极差” 的困境，亟需开发能突破再生瓶颈的创新性治疗策略。 二、神经修复技术的发展历程与现存瓶颈 （一）传统修复技术的探索与局限 在 SCI 修复研究中，科研人员先后尝试了神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）干预、轴突再生支架植入等技术。神经生长因子可促进神经细胞存活与轴突萌芽，但由于其在体内易被降解，且无法引导轴突定向生长至靶组织，临床效果微弱；生物支架虽能为轴突再生提供物理支撑，但缺乏神经细胞定植所需的微环境，难以形成功能性神经连接。 随着干细胞技术的发展，神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）移植成为研究热点。NSCs 具有自我更新能力和多向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为损伤脊髓补充细胞来源。近年来，诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）技术的成熟的成熟，解决了 NSCs 来源有限的问题，iPSC 可由患者自身体细胞重编程获得，避免免疫排斥风险，2024 年国际顶尖期刊《柳叶刀》报道的 iPSC 衍生神经细胞移植治疗 SCI 的 Ⅰ 期临床试验，证实了该技术的安全性。 然而，干细胞移植仍存在显著不足：一是细胞分化效率低，移植后仅约 10%-15% 的 NSCs 可分化为功能性神经元，其余多分化为星形胶质细胞，反而可能加重胶质瘢痕；二是细胞存活困难，损伤区域的炎症微环境导致移植细胞凋亡率超 60%；三是缺乏区域特异性，无法匹配脊髓不同节段（颈段、胸段、腰段）的细胞组成与神经环路特征，难以实现精准修复。 （二）类器官技术的兴起与核心短板 类器官（Organoid）技术的出现为 SCI 修复提供了新方向。类器官是通过干细胞三维培养形成的微型器官模型，具有与体内器官相似的细胞异质性、空间结构及部分生理功能。脊髓类器官（Spinal Cord Organoid，sOrg）可模拟脊髓发育过程，分化出运动神经元、中间神经元、胶质细胞等多种细胞类型，且能形成初步的神经环路，为 SCI 治疗提供了 “活体微型移植物”。 目前，脊髓类器官研究已取得一定进展。2022 年，《自然・方法》期刊报道的研究通过调控 Wnt、Retinoic Acid 等信号通路，成功诱导人 iPSC 形成具有背腹轴结构的脊髓类器官，其中运动神经元比例可达 30%。但现有脊髓类器官技术仍存在三大核心短板： 区域特异性缺失：脊髓不同节段具有高度特异的细胞组成与功能，例如胸段脊髓富含调控下肢运动的 HOXC9 阳性运动神经元和 Vsx2 阳性中间神经元，而现有脊髓类器官多为 “通用型”，胸段特异性细胞比例不足 25%，无法精准匹配胸段 SCI 的修复需求，移植后难以与宿主胸段脊髓形成功能整合。 功能成熟度不足：传统方法构建的脊髓类器官，其神经元电生理活性较弱，突触连接密度低，且缺乏髓鞘形成（髓鞘由少突胶质细胞形成，可加速神经信号传导），无法有效传递神经信号，难以实现运动功能恢复。 移植适配性差：类器官与宿主脊髓的界面整合是修复成功的关键，但现有脊髓类器官缺乏与宿主组织匹配的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM，由蛋白质、多糖等组成，为细胞提供支撑与信号调控），移植后易被宿主免疫细胞识别清除，且难以与宿主神经轴突形成突触连接。 此外，类器官构建的微环境调控机制尚未明确。虽有研究发现层状双氢氧化物（Layered Double Hydroxide，LDH，一种具有层状结构的无机纳米材料，可缓释生长因子、调控细胞信号通路）能促进神经细胞分化，但如何利用 LDH 精准调控脊髓类器官的区域特征与功能成熟，尚未形成系统方案。 三、科学问题的提出与研究必要性 综合上述研究现状，当前 SCI 修复领域面临一个核心科学问题：如何构建具有胸段区域特异性、高功能成熟度且适配移植微环境的脊髓类器官，以突破胸段 SCI 修复中 “细胞不匹配、功能难整合、存活效率低” 的瓶颈，实现神经环路重建与运动功能恢复？ 这一科学问题的解决具有迫切的必要性与重要价值： 从科学层面看，胸段 SCI 占所有 SCI 病例的 40% 以上，是临床高发类型，但由于缺乏胸段特异性修复工具，相关研究长期滞后于颈段 SCI。开发工程化胸段脊髓类器官（Engineered Thoracic Spinal Cord Organoid，enTsOrg），可填补 “胸段特异性类器官构建” 的技术空白，揭示脊髓节段发育的分子调控机制，为脊髓发育生物学研究提供全新模型。 从临床转化层面看，iPSC 衍生类器官的临床试验已证实其安全性，但区域特异性不足导致的修复效率低下，成为制约临床转化的关键瓶颈。enTsOrg 通过精准调控胸段特异性细胞比例、增强神经元成熟度及优化移植微环境，可大幅提升 SCI 修复效果。若该技术成功转化，将使 SCI 治疗从 “泛化干预” 升级为 “节段精准修复”，为全球数百万 SCI 患者带来功能恢复的可能，具有重大社会意义与临床价值。 综上，针对胸段 SCI 修复的工程化脊髓类器官研究，既是突破现有技术瓶颈的必然选择，也是推动神经修复领域从基础研究走向临床应用的关键桥梁，其开展具有不可替代的科学必要性与现实意义。 实验技术方法 一、核心技术：enTsOrg 的构建与培养 enTsOrg 以成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）为种子细胞，通过 “生物材料调控 + 分阶段信号诱导” 实现胸段特异性分化，全程需严格控制培养条件与时间节点，关键步骤如下： 1. 前期准备：iPSC 维护与关键试剂配制 （1）iPSC 培养与 pluripotency 验证 细胞来源：野生型成纤维细胞重编程的 iPSC（本研究使用 N12、N13a 细胞系）。 维护条件：Matrigel（Corning, 354277）包被的培养板，使用 mTeSR1 培养基（StemCell Technologies, 85850），37℃、5% CO₂培养。 ** pluripotency 验证 **：通过免疫荧光染色检测多能性标志物 ——OCT4（胚胎干细胞核心转录因子）、TRA-1-60（多能干细胞表面抗原），确保 iPSC 未分化状态（图 1a 基础实验）。 （2）关键试剂与作用（科普：试剂功能对应实验设计逻辑） 试剂名称 浓度 作用机制与实验意义 Y-27632 10 μM ROCK 激酶抑制剂，抑制 iPSC 单细胞解离后的凋亡，保障细胞成球效率 LDN-193189 1 μM BMP 信号通路抑制剂，阻断 iPSC 向中胚层 / 内胚层分化，定向诱导神经外胚层 CHIR99021 3 μM GSK3β 抑制剂，激活 Wnt 信号通路，促进神经干细胞（NSC）增殖与早期神经分化 视黄酸（Retinoic Acid, RA） 0.1 μM 调控脊髓 “头尾轴（A-P）” 发育，诱导 iPSC 向脊髓尾侧（胸段 / 腰段）分化，而非脑区细胞 Purmorphamine 1 μM SHH 信号通路激动剂，促进神经干细胞向腹侧运动神经元（MN）分化 BDNF/GDNF 10 ng/ml 神经营养因子，分别促进神经元存活 / 突触形成、运动神经元成熟，提升 enTsOrg 功能成熟度 层状双氢氧化物（LDH） 10 μg/ml 无机纳米材料，激活 PTCH1-SHH 通路、调控 RA 信号，提升胸段特异性神经元（HOXC9+/ISL1+）比例 2. LDH 与 LDH-Matrigel 的制备（核心生物材料调控技术） LDH 是实现 enTsOrg 胸段特异性的关键材料，需通过水热合成法制备，并与 Matrigel 复合形成支架，步骤与表征如下： （1）LDH 合成步骤 原料配制：将 NaOH（Sinopharm, 10019718）溶解于无 CO₂双蒸水，加入 Mg (NO₃)₂（80075918）与 Fe (NO₃)₃（80072718），确保 Mg²⁺/Fe³⁺比例符合层状结构形成需求。 预处理：60℃氮气氛围下搅拌 30 分钟，避免氧化影响材料结构；随后离心（转速未明确，常规 10000×g）洗涤 2 次，去除未反应原料。 水热反应：将悬浮液转移至水热釜，100℃恒温 16 小时，使 LDH 晶体充分生长；反应后再次离心洗涤 2 次，4℃保存备用。 （2）LDH-Matrigel 复合支架制备 配比：将 LDH 与 PBS/Matrigel 按 1:9（v/v）混合，终浓度 10 μg/ml，涡旋至均匀无沉淀，确保 LDH 均匀分散于 Matrigel（基底膜水凝胶，提供细胞外基质微环境）。 （3）材料理化表征（科普：表征技术的作用） 表征技术 仪器型号 检测目的与结果 X 射线衍射（XRD） Bruker D2 Phaser 分析 LDH 晶体结构，检测到 003、006、009、110 特征峰，证实 LDH 层状结构完整 X 射线光电子能谱（XPS） Thermo Fisher K-Alpha 分析 LDH 表面元素，检测到 Mg 1s（1296.2 eV）、Fe 2p（700.2 eV），验证元素组成符合设计 圆二色谱（CD） JASCO J-1500 分析 Matrigel 蛋白质二级结构，发现 LDH-Matrigel 仍保持 α- 螺旋构象，保障生物相容性 扫描电镜（SEM） Zeiss GeminiSEM 300 观察形貌：LDH 为直径～100 nm 的六边形片状纳米材料；LDH-Matrigel 表面更粗糙，利于细胞黏附 3. enTsOrg 的分阶段培养流程（时间节点精准控制） 严格按时间节点调控信号通路与培养环境，确保 iPSC 定向分化为胸段脊髓类器官，具体步骤如下： 培养天数 关键操作 培养基 / 试剂调整 Day 0 iPSC 单细胞解离，接种于超低吸附 96 孔圆底板（3×10⁴细胞 / 孔） 含 10 μM Y-27632 的 mTeSR1 培养基，防止细胞凋亡 Day 1 弃去 Y-27632 培养基，更换为神经诱导培养基 基础培养基（DMEM/F12+N2+B27）+1 μM LDN-193189 +3 μM CHIR99021 Day 3 加入 RA，启动脊髓尾侧分化 神经诱导培养基 + 0.1 μM RA Day 10 将神经球（直径～500 μm）包埋于 LDH-Matrigel 液滴中，转移至 24 孔板 分化培养基 + 0.1 μM RA +1 μM Purmorphamine（促进运动神经元分化） Day 14 将包埋的类器官转移至超低吸附 6 孔板，置于摇床（65 rpm）培养，模拟体内动态环境 维持分化培养基成分，促进类器官空间结构形成 Day 17 加入神经营养因子，促进神经元成熟 分化培养基 + 10 ng/ml BDNF +10 ng/ml GDNF Day 21/42 收集类器官用于后续检测（21 天为最佳移植时间，42 天用于成熟度对比） —— （2）对照实验：普通脊髓类器官（sOrg）培养 除 “不添加 LDH、仅用纯 Matrigel 包埋” 外，其余步骤与 enTsOrg 一致，用于对比 LDH 对胸段特异性的调控作用；同时设置 2D 诱导对照（iPSC 接种于 Matrigel 包被盖玻片，Day 10 加 10 μg/ml LDH）。 4. enTsOrg 的多维度检测技术（验证胸段特性与功能） 通过细胞形态 - 分子表达 - 功能活性三级检测体系，验证 enTsOrg 的胸段特异性、神经元成熟度与电生理功能，关键技术如下： （1）细胞层面：免疫荧光染色（检测细胞亚型与分布） 关键步骤： 类器官固定：4% 多聚甲醛（PFA）室温固定 4 小时，15%-30% 蔗糖梯度脱水，OCT 包埋冷冻切片（12 μm）。 封闭与孵育：5% 驴血清 + 0.3% Triton X-100 室温封闭 1 小时；一抗 4℃孵育过夜（抗体信息见表 1）；荧光二抗（Alexa Fluor 系列，1:500）室温孵育 1 小时；DAPI（1 μg/ml）染核 10 分钟。 成像与定量：Zeiss LSM880 共聚焦显微镜成像，ImageJ 软件定量阳性细胞比例。 核心标记物与意义（科普：标记物对应细胞类型）： 标记物 细胞 / 结构类型 实验意义 HOXC9 胸段脊髓特异性神经元 验证 enTsOrg 的胸段区域特性 ISL1/ChAT 运动神经元（MN） 检测运动神经元数量与成熟度 NeuN/NF200 成熟神经元 / 神经纤维 评估神经元成熟度与神经纤维形成 SOX2/Nestin 神经祖细胞（NPC） 监测类器官中祖细胞增殖与分化动态 GAD1/vGlut2 GABA 能 / 谷氨酸能中间神经元 分析抑制性 / 兴奋性神经元比例 （2）分子层面：转录组与蛋白表达检测 1. 空间转录组测序（ST-seq，核心技术）： 科普：与传统 RNA-seq（仅检测基因表达量，丢失空间位置）不同，ST-seq 通过 10× Visium 芯片（6.5 mm×6.5 mm 捕获区，~5000 个 spot，直径 55 μm），保留类器官中基因表达的空间分布信息，可分析 “背腹轴（D-V）”“头尾轴（A-P）” 的基因表达差异。 步骤：类器官切片贴附于芯片，原位裂解 RNA 并与 spot 上的 poly (dT) 引物结合，反转录为 cDNA；构建文库后在 Illumina NextSeq 2000 测序，使用 Space Ranger 软件定量，Loupe Browser 分析空间表达模式。 关键结果：enTsOrg 中 86.61% 的 spot 表现胸段特性（sOrg 仅 65.91%）， ventral 标记基因（如 NKX2.2）与 dorsal 标记基因（如 Pax2）呈空间分区表达。 2. 普通 RNA-seq 与 qPCR： RNA 提取：使用 RNAiso Plus（TAKARA, 9108）提取类器官总 RNA，Nanodrop 检测纯度（A260/A280≈1.8-2.0）。 RNA-seq：北京基因组研究所（BGI）构建文库，DNBSEQ-T7 平台测序（PE150），分析差异基因（如胸段 Hox 基因、神经成熟基因）。 qPCR：使用 PrimeScript 逆转录试剂盒（TAKARA, 2690A）合成 cDNA，TB Green Premix Ex Taq（RR820A）扩增，以 GAPDH 为内参，2^(-ΔΔCt) 法计算基因表达量（验证 Hoxc9、Hoxd9 等胸段基因）。 3. Western blot（蛋白表达验证）： 蛋白提取：RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取类器官蛋白，BCA 法测浓度。 检测步骤：SDS-PAGE 电泳（10%-12% 凝胶）→转印至 PVDF 膜→5% 脱脂奶封闭 1 小时→一抗（如 PTCH1、GLI1、p-PI3K）4℃孵育过夜→HRP 二抗室温孵育 1 小时→ECL 化学发光成像，ImageJ 定量条带灰度值。 （3）功能层面：电生理与钙活性检测 1. 多电极阵列（MEA，神经网络活性检测）： 科普：MEA 通过 64 个微电极（直径 30 μm，间距 100 μm）同步记录类器官表面多个神经元的电活动，反映神经网络的整体 firing 模式（如 spike 频率、振幅、网络爆发）。 步骤：35 天类器官接种于 Matrigel 包被的 MEA 板（Axion M384-tMEA-6B），培养 1 周后，Maestro Pro 系统记录 20 分钟，AxIS 软件分析 spike 振幅（enTsOrg 显著高于 sOrg）、firing 频率（enTsOrg 达 1.84 Hz，sOrg 仅 0.56 Hz）。 2. 全细胞膜片钳（单个神经元电生理）： 科普：通过玻璃微电极（4-6 MΩ）与神经元细胞膜形成高阻封接（>1 GΩ），直接记录单个神经元的动作电位（AP）、离子电流（如钠电流 INa、钾电流 IK），是评估神经元功能成熟度的 “金标准”。 步骤：类器官置于人工脑脊液（ACSF，含 NaCl、KCl、CaCl₂等，模拟体内环境），电流钳模式下记录自发 AP（sAP）与诱发 AP（iAP，10 pA 步阶刺激 500 ms）；电压钳模式下记录 INa（-80~+60 mV ramp 刺激）。结果显示：enTsOrg 的 iAP 数量（10.31 次）显著高于 sOrg（5.12 次），INa 峰值（-1004.71 pA）更大。 3. 钙成像（神经元活性动态监测）： 原理：神经元兴奋时 intracellular Ca²⁺浓度升高，Fura-2/AM（钙荧光探针）在 340 nm/380 nm 激发下的荧光比（340/380）可定量 Ca²⁺浓度，反映神经元活性。 步骤：类器官用 5 μM Fura-2/AM 37℃负载 30 分钟，HBSS 洗涤后，Sutter DG4 波长切换器激发，Hamamatsu ORCA-Flash4.0 CCD 采集图像（1 fps），Metafluor 软件分析 ΔF/F₀（ΔF = 瞬时荧光 - 基线 F₀）。结果：enTsOrg 在 KCl 刺激下 Ca²⁺响应更强（AUC=107.0 vs sOrg 95.45）。 二、动物模型与移植验证技术 通过胸段 SCI 小鼠模型验证 enTsOrg 的体内修复效果，关键技术包括模型构建、移植操作与功能评估： 1. SCI 动物模型构建 动物选择：7-8 周龄雌性 NOD-PrkdcscidIl2rgem1/Smoc（M-NSG）小鼠（免疫缺陷，避免类器官排斥），体重 20±2 g。 手术步骤： 麻醉：异氟烷吸入麻醉（1.5%-2% 浓度），背部剃毛消毒。 T9 椎板切除术：暴露 T9 节段脊髓，用显微剪刀行 2 mm 全横断，确认无脊髓连续性。 分组处理： enTsOrg 组：移植 21 天培养的 enTsOrg（LDH-Matrigel 包被）； sOrg 组：移植 21 天培养的 sOrg（纯 Matrigel 包被）； Matrigel 组：仅移植 Matrigel； SCI 组：仅横断不移植； 假手术组：仅椎板切除不横断。 术后护理：每日按摩膀胱 2 次（防止尿潴留），布洛芬镇痛，自由进食饮水。 移植时间选择依据：对比 21 天与 42 天类器官，发现 42 天类器官移植后急性凋亡率更高（TUNEL 阳性细胞多），且 21 天类器官含更多 SOX2 + 祖细胞（利于体内分化），故选择 21 天类器官移植。 2. 体内功能评估技术 （1）行为学检测（运动功能恢复） 1. Basso 小鼠量表（BMS）评分： 每周由 2 名盲法观察者评估小鼠后肢运动（0-9 分，0 分为完全瘫痪，9 分为正常运动），持续 14 周。结果：enTsOrg 组 4 周后 BMS 评分显著高于 sOrg 组，14 周达 6.5 分（sOrg 组仅 3.2 分）。 2. DigiGait 步态分析： 14 周时，小鼠爪部标记墨水，高速相机记录行走步态，DigiGait 软件分析步长（enTsOrg 组达 4.2 cm，sOrg 组 3.1 cm）、支撑时间、步态对称性（enTsOrg 更接近假手术组）。 3. 水平梯子实验： 小鼠在间距不均的梯子上行走，记录后肢踏空率（enTsOrg 组踏空率 18%，sOrg 组 45%），评估运动协调性。 （2）电生理与神经连接验证 1. 运动诱发电位（MEP）： 刺激部位：小鼠运动皮层（暴露脑表面，1.5 mA 电流）；记录部位：坐骨神经（双极电极）；AlphaLab SnR 系统记录信号。结果：enTsOrg 组 MEP 振幅（26.70 μV）显著高于 sOrg 组（9.62 μV），证实神经传导恢复。 2. 光遗传学验证： 原理：通过病毒标记 ChAT + 运动神经元，光抑制后观察电生理与行为变化，验证 enTsOrg 的功能性连接。 步骤：移植前 1 天向 enTsOrg 注射 300 nl rAAV-ChAT-eNpHR3.0-EGFP（AAV2/9，5×10¹² vg/ml），14 周后用 590 nm 黄光照抑制 ChAT + 神经元；记录 MEP 振幅（抑制后下降 35%）与小鼠步态（运动距离减少 20%），证实 enTsOrg 的运动神经元参与宿主神经环路。 3. 神经示踪： 顺行示踪（BDA）：7 周时向运动皮层注射 10% BDA（500 nl / 点，4 个点），2 周后观察 BDA 阳性轴突是否延伸至类器官； 逆行示踪（PRV）：向胫骨前肌注射 PRV-CAG-3Ms 病毒（2×10⁹ pfu/ml），7 天后观察 PRV 阳性细胞是否存在于类器官； 结果：enTsOrg 组可见 BDA/PRV 跨界面信号，sOrg 组仅类器官内有 PRV 信号，证实 enTsOrg 与宿主形成双向神经连接。 三、其他关键辅助技术 缺氧模型验证 LDH 保护作用：6 孔板中 21 天类器官置于厌氧袋构建缺氧环境（2 小时），TUNEL 检测凋亡率，发现 LDH 组凋亡率（12%）显著低于无 LDH 组（28%），证实 LDH 可减轻缺氧诱导的细胞死亡。 安全性检测：通过 HE 染色观察类器官移植后是否增生 / 成瘤，免疫荧光检测癌胚抗原（CEA）是否阳性，结果显示 14 周内类器官体积稳定，无 CEA 表达，证实安全性。 综上，本研究通过 “材料调控 - 类器官构建 - 多维度检测 - 动物验证” 的完整技术链，实现了 enTsOrg 的精准构建与功能验证，其中 LDH-Matrigel 支架调控、ST-seq 空间转录分析、MEA 电生理检测等技术为核心创新点，为胸段 SCI 修复提供了可推广的技术范式。 关键结果图表 该研究针对脊髓损伤（SCI）修复领域的核心问题展开：现有脊髓类器官（spinal cord organoid, sOrg）因难以复现胸段脊髓的区域异质性（如 HOXC9 + 运动神经元等特异性细胞）与精准空间结构，无法匹配胸段移植位点，导致神经环路重建效率低、运动功能恢复有限，这一问题在占 SCI 病例 40% 以上的胸段 SCI 中尤为突出，亟需开发具备区域特异性的类器官工具、、。基于此，研究提出猜想：通过生物材料调控（层状双氢氧化物 Layered Double Hydroxide, LDH 结合基底膜水凝胶 Matrigel）与分阶段信号诱导，从成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）构建工程化胸段脊髓类器官（engineered thoracic spinal cord organoid, enTsOrg），可精准复现胸段脊髓的细胞组成与空间结构，移植后能与宿主胸段脊髓形成功能性突触连接，进而重构神经环路并恢复后肢运动功能、。研究思路上，首先通过水热合成法制备 LDH（六边形片状纳米材料，直径约 100 nm），并与 Matrigel 按 1:9（v/v）复合形成 LDH-Matrigel 支架（保留 Matrigel 的 α- 螺旋蛋白结构且表面更粗糙，利于细胞黏附）；随后以 iPSC 为种子细胞，分阶段添加信号分子（LDN-193189、CHIR99021、视黄酸 RA 等）诱导神经分化，Day 10 将神经球包埋于 LDH-Matrigel，后续加 BDNF/GDNF 促进成熟，最终构建 enTsOrg（21 天为最佳移植时间）；同时构建 T9 节段完全横断的 SCI 小鼠模型（免疫缺陷 M-NSG 小鼠），通过行为学、电生理、分子生物学等技术验证 enTsOrg 的体内外效果与机制、、。 一、enTsOrg 在体外具备显著的胸段脊髓区域特性与成熟空间结构 为验证 enTsOrg 的胸段特异性，研究采用空间转录组测序（ST-seq）与免疫荧光技术，结果显示体外培养 21 天时，enTsOrg 中表现胸段脊髓特征的位点占比达86.61%，显著高于普通 sOrg 的 65.91%（图 1f），且胸段特异性基因（HOXC9、HOXB9、HOXD9）的表达水平经 qPCR 与免疫荧光证实均显著高于 sOrg（图 1g、h、i），表明 enTsOrg 能精准复现胸段脊髓的分子特征。从空间结构看，扫描电镜（SEM）观察到 enTsOrg 中心为密集的神经元胞体，周围环绕细长神经纤维，而 sOrg 的神经纤维较短（图 1c）；免疫荧光显示，enTsOrg 中成熟神经元（NeuN+）和神经纤维（NF200+）在 42 天时显著富集，且运动神经元（ISL1+/ChAT+）集中分布于类器官腹侧区域，与体内胸段脊髓的背腹轴（D-V）结构一致，而 sOrg 的神经元分布紊乱（图 1e、i）、。此外，ST-seq 分析发现 enTsOrg 中神经祖细胞（SOX2+、Nestin+）占比 32.24%，成熟神经元占比 67.76%，而 sOrg 中祖细胞占比更高（图 3d、e），说明 enTsOrg 在体外已具备更成熟的细胞组成，为移植后的功能整合奠定基础、。 二、enTsOrg 在体外展现更优的电生理功能与神经元活性 为评估 enTsOrg 的功能成熟度，研究采用多电极阵列（MEA）、全细胞膜片钳与钙成像技术检测。MEA 结果显示，培养 35 天时，enTsOrg 的神经元 spike 振幅显著大于 sOrg（图 1m），单位时间内 spike 数量更多（图 1o），网络爆发模式更复杂（图 1n），表明其神经网络活性更强。全细胞膜片钳记录显示，enTsOrg 中神经元的自发动作电位（sAP）频率达 1.84±0.44 Hz，显著高于 sOrg 的 0.56±0.12 Hz（图 1p）；在 500 ms 电流注射下，enTsOrg 神经元产生的诱发动作电位（iAP）数量为 10.31±1.20 次，远高于 sOrg 的 5.12±1.07 次（图 1q）；同时，enTsOrg 神经元的钠电流（INa）峰值达 - 1004.71 pA，显著大于 sOrg，证实其离子通道功能更成熟、。钙成像实验中，经 60 mM KCl 刺激后，enTsOrg 的胞内钙浓度（[Ca²⁺] i）升高幅度更大，钙响应的面积积分（AUC=107.0±5.60）显著高于 sOrg（AUC=95.45±2.96，图 1s），进一步证明 enTsOrg 的神经元对刺激响应更灵敏，功能活性更优。 三、enTsOrg 移植显著促进胸段 SCI 小鼠的运动功能恢复与神经环路重建 在体内实验中，研究将 21 天的 enTsOrg 移植至 T9 横断 SCI 小鼠模型，14 周行为学监测显示，enTsOrg 组小鼠的 Basso 小鼠量表（BMS）评分从 4 周开始显著高于 sOrg 组，14 周时 enTsOrg 组 BMS 评分达 6.5 分，而 sOrg 组仅 3.2 分（图 2b），且 enTsOrg 组小鼠后肢出现明显背屈和伸展动作，sOrg 组则以拖拽动作为主（图 2c）。DigiGait 步态分析显示，14 周时 enTsOrg 组小鼠的步长（4.2±0.3 cm）、支撑时间（0.45±0.02 s）显著优于 sOrg 组，步态对称性更接近假手术组（图 2d）；水平梯子实验中，enTsOrg 组小鼠后肢踏空率仅 18%，成功放置率达 36%，而 sOrg 组踏空率 45%、成功放置率 13%（图 2f、g），证实 enTsOrg 能显著提升 SCI 小鼠的运动协调性。神经环路重建方面，免疫荧光显示移植 7 周后，enTsOrg 组损伤区域的运动神经元前体细胞（Olig2+）、成熟运动神经元（ISL1+）和神经轴突（MAP2+）密度显著高于 sOrg 组（图 2h）；运动诱发电位（MEP）检测显示，enTsOrg 组的 MEP 振幅达 26.70±8.46 μV，显著高于 sOrg 组的 9.62±2.38 μV（图 2i），表明神经传导功能有效恢复、。此外，生物素化葡聚糖胺（BDA，顺行示踪）与伪狂犬病毒（PRV，逆行示踪）实验显示，enTsOrg 组中 BDA 阳性轴突可从宿主运动皮层延伸至类器官，PRV 阳性细胞可从后肢肌肉追溯至类器官，而 sOrg 组仅类器官内有 PRV 信号，无 BDA 跨界面信号（Extended Data Fig. 4a），证实enTsOrg 能与宿主脊髓形成双向神经连接，实现神经环路重构。 四、LDH 通过调控 SHH 与 RA 信号通路促进 enTsOrg 的胸段特性与神经元成熟 研究探究机制时发现，LDH 是 enTsOrg 功能优势的关键调控因子。体外实验中，Western blot 与免疫荧光显示，enTsOrg 中 SHH 信号通路相关蛋白（PTCH1、GLI1、NKX6.1）的表达显著高于 sOrg（图 6h、i），同时 RA 信号通路中的降解酶 CYP26A1 和受体 RARα 表达也显著升高（图 6i、l），表明 LDH 通过激活 PTCH1-SHH 通路和调控 RA 信号，促进 iPSC 向胸段运动神经元分化、。移植后 7 周，enTsOrg 组中 PI3K/AKT/GSK3β 信号通路的磷酸化水平（p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β）显著高于 sOrg 组（图 6m、n），该通路可增强神经元存活与轴突再生；同时，enTsOrg 中泛素介导的蛋白水解通路相关基因（如 UCHL1）和线粒体融合蛋白 MFN2 表达升高，前者促进蛋白降解与神经元成熟，后者维持线粒体功能、减少氧化应激损伤。 该研究总结与结论如下：成功构建的工程化胸段脊髓类器官（enTsOrg），通过 LDH-Matrigel 支架调控和分阶段信号诱导，在体外具备胸段脊髓的区域异质性（86.61% 胸段特性位点）、成熟空间结构与优异电生理功能；移植至胸段 SCI 小鼠模型后，能通过与宿主形成双向神经连接重构神经环路，显著恢复后肢运动功能，其机制与 LDH 调控 SHH/RA 及 PI3K/AKT 通路相关、。该研究的核心价值在于首次实现胸段特异性脊髓类器官的精准构建，突破现有 sOrg 区域匹配性差的瓶颈，为 SCI 修复提供 “区域定制化” 的类器官移植策略，同时为其他神经损伤的类器官治疗提供技术范式。新延伸问题与下一步实验方面，当前研究基于小鼠模型验证效果，下一步需开展大动物（如非人灵长类）实验以验证临床转化潜力；enTsOrg 的长期存活（如超过 6 个月）与成瘤风险需进一步评估；此外，优化 LDH 剂量与释放速率、结合康复训练增强功能整合等，均为后续需探索的方向，这些工作将为 enTsOrg 的临床应用奠定基础。 特色与创新之处一、首次实现胸段脊髓区域特异性类器官的精准构建，突破通用型脊髓类器官的区域匹配瓶颈 现有脊髓类器官（sOrg）多为 “通用型” 模型，仅能复现脊髓的基础细胞组成，无法精准匹配不同节段（颈段、胸段、腰段）的区域异质性，导致移植后难以与损伤位点形成功能整合，尤其对占脊髓损伤（SCI）病例 40% 以上的胸段 SCI 修复效果有限。本研究创新性地通过 “层状双氢氧化物（LDH）生物材料调控 + 分阶段信号诱导” 策略，从成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（iPSC）构建工程化胸段脊髓类器官（enTsOrg）：一方面，LDH 通过激活 PTCH1-SHH 信号通路、上调 RA 降解酶 CYP26A1 调控 RA 信号，定向促进胸段特异性神经元分化；另一方面，分阶段添加 LDN-193189（神经外胚层诱导）、RA（尾侧分化）、Purmorphamine（运动神经元诱导）等信号分子，精准模拟胸段脊髓发育过程。最终实现 enTsOrg 中 86.61% 的位点表现胸段脊髓特征，显著高于普通 sOrg 的 65.91%，且胸段特异性基因（HOXC9、HOXB9、HOXD9）表达水平经 qPCR 与免疫荧光验证均显著升高。该创新的核心意义在于：首次建立 “节段定制化” 脊髓类器官构建范式，使类器官能精准匹配胸段移植位点的解剖特征，为解决 “细胞不匹配导致的功能整合效率低” 这一 SCI 修复核心难题提供关键工具。二、创新性开发 LDH-Matrigel 复合支架，实现生物材料对类器官命运的靶向调控与移植微环境优化 传统类器官构建多依赖纯 Matrigel 或基础培养基，缺乏对细胞分化命运的主动调控能力，且移植后易因缺氧、炎症微环境导致细胞大量凋亡。本研究突破这一局限，通过水热合成法制备六边形片状 LDH 纳米材料（直径约 100 nm），并与 Matrigel 按 1:9（v/v）复合形成 LDH-Matrigel 支架：从理化特性看，该支架保留 Matrigel 的 α- 螺旋蛋白结构以维持生物相容性，同时因 LDH 的引入使表面粗糙度提升，显著增强神经元黏附效率；从功能调控看，LDH 不仅能在体外定向诱导胸段神经元分化，还能在移植后通过调控 PI3K/AKT/GSK3β 信号通路增强神经元存活，并通过提升线粒体融合蛋白 MFN2 表达维持线粒体功能、减少氧化应激损伤。体外缺氧模型验证显示，LDH 组类器官凋亡率（12%）显著低于无 LDH 组（28%），证实其对移植微环境的优化作用。该创新的意义在于：将生物材料从 “单纯物理支撑” 升级为 “功能调控载体”，实现类器官分化命运与移植微环境的双重优化，为提升类器官移植存活率与功能整合效率提供新策略。三、建立多维度、高分辨率的类器官功能表征体系，首次证实胸段类器官的成熟电生理功能与神经环路活性 以往类器官研究多聚焦细胞组成与分子表达，对功能成熟度的评估局限于简单的神经元标志物检测，缺乏对电生理活性与神经环路功能的系统验证，难以判断类器官是否具备 “功能性修复潜力”。本研究创新性地构建 “分子表达 - 电生理活性 - 钙信号响应” 的多维度功能表征体系：通过空间转录组测序（ST-seq）明确 enTsOrg 的背腹轴（D-V）基因空间分布（腹侧 NKX2.2+、背侧 Pax2+），匹配体内胸段脊髓结构；采用多电极阵列（MEA）检测显示，enTsOrg 的神经元 spike 振幅、单位时间 spike 数量显著高于 sOrg，网络爆发模式更复杂；全细胞膜片钳记录证实，enTsOrg 神经元的自发动作电位（sAP）频率（1.84±0.44 Hz）是 sOrg（0.56±0.12 Hz）的 3 倍以上，钠电流（INa）峰值（-1004.71 pA）显著更大；钙成像实验进一步显示，enTsOrg 对 KCl 刺激的胞内钙响应（AUC=107.0±5.60）显著强于 sOrg（AUC=95.45±2.96）。该体系的创新意义在于：首次从 “结构 - 功能” 层面证实胸段类器官具备成熟的神经信号传导能力，为判断类器官是否具备 SCI 修复的 “功能基础” 提供量化标准，避免仅依赖分子标志物导致的 “功能误判”。四、系统性验证类器官移植后的神经环路重构，首次实现胸段 SCI 小鼠的双向神经连接与运动功能恢复 多数类器官移植研究仅关注移植细胞的存活与局部细胞整合，缺乏对 “是否形成功能性神经环路” 的直接验证，导致观察到的功能恢复可能源于 “局部代偿” 而非真正的神经环路重构。本研究创新性地通过 “行为学 - 电生理 - 神经示踪” 的系统性验证策略，证实 enTsOrg 的神经环路重构能力：行为学层面，enTsOrg 移植组小鼠 14 周时 Basso 小鼠量表（BMS）评分达 6.5 分，显著高于 sOrg 组的 3.2 分，且步长、步态对称性、水平梯子成功放置率（36% vs sOrg 组 13%）均显著优化；电生理层面，运动诱发电位（MEP）振幅（26.70±8.46 μV）是 sOrg 组（9.62±2.38 μV）的 2.8 倍，证实神经传导功能恢复；神经示踪层面，顺行示踪剂 BDA（注射于运动皮层）可延伸至 enTsOrg，逆行示踪剂 PRV（注射于后肢肌肉）可追溯至 enTsOrg，而 sOrg 组仅类器官内有 PRV 信号、无 BDA 跨界面信号。该验证策略的创新意义在于：首次直接证实 enTsOrg 能与宿主脊髓形成 “双向神经连接”，而非单纯的细胞存活或单向轴突延伸，真正实现损伤区域的神经环路重构，为功能恢复提供核心机制支撑。五、深入解析 LDH 调控类器官命运的分子机制，为类器官优化提供可靶向的信号通路 以往类器官研究多停留在 “现象观察” 层面，对生物材料调控类器官分化的机制解析不足，导致后续优化缺乏明确靶点。本研究创新性地从 “材料 - 细胞 - 通路” 层面拆解 LDH 的调控机制：通过 Western blot、免疫荧光与转录组分析发现，LDH 不仅通过激活 PTCH1-SHH 通路促进胸段神经元分化，还能在移植后通过以下通路增强类器官功能成熟与存活：一是激活 PI3K/AKT/GSK3β 通路，提升神经元抗凋亡能力与轴突再生效率；二是上调泛素 C 末端水解酶 L1（UCHL1）表达，通过泛素介导的蛋白水解通路促进神经元成熟；三是升高线粒体融合蛋白 MFN2 表达，维持线粒体网络稳定、减少氧化应激损伤。同时，通过对比 enTsOrg 与 sOrg 的差异表达基因，发现 enTsOrg 中多巴胺能、GABA 能神经元相关通路显著富集，为理解胸段神经环路的功能协同提供机制线索。该机制解析的创新意义在于：将生物材料的调控作用从 “宏观现象” 深入到 “微观通路”，为后续通过靶向调控 SHH、PI3K/AKT 等通路优化类器官性能提供明确靶点，使研究成果具备可重复、可推广的理论基础。 可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考]一、动物模型缺乏免疫健全环境，难以模拟临床移植中的免疫排斥风险不足点分析 该研究采用免疫缺陷型 NOD-PrkdcscidIl2rgem1/Smoc（M-NSG）小鼠构建脊髓损伤（SCI）模型，此类小鼠因 Prkdc 基因缺陷导致 T/B 细胞发育障碍、Il2rg 基因缺陷导致自然杀伤（NK）细胞功能缺失，完全缺乏适应性与固有免疫应答。然而，临床 SCI 患者均具备完整免疫系统，移植异源（如他人 iPSC 衍生）或自体但经体外操作的类器官时，极可能触发宿主免疫排斥反应 —— 包括 T 细胞介导的细胞免疫（如攻击类器官表面的 MHC 分子）、抗体介导的体液免疫，以及巨噬细胞 / 小胶质细胞的吞噬作用。当前研究未评估免疫排斥对 enTsOrg 存活与功能的影响，导致实验结果与临床实际场景存在显著脱节，无法为后续临床转化中的免疫调控策略提供参考依据。例如，研究中 enTsOrg 移植后 14 周的存活率达 90% 以上，但在免疫健全环境下，类器官可能因免疫攻击导致凋亡率升高、功能衰退，这一关键风险未被纳入评估。改进建议引入免疫健全动物模型 ：选用野生型 C57BL/6 或 SD 大鼠构建 SCI 模型，分别移植自体 iPSC（无免疫排斥对照）与异体 iPSC 衍生的 enTsOrg，对比两组类器官的存活时间（通过 STEM121 标记追踪）、凋亡率（TUNEL 检测）及功能整合效率（MEP 振幅、BMS 评分），明确免疫排斥对修复效果的影响程度。模拟临床免疫抑制方案 ：在免疫健全模型中，采用临床常用的免疫抑制剂（如他克莫司、霉酚酸酯）干预，检测不同药物剂量下 enTsOrg 的存活与宿主免疫细胞（CD4+T、CD8+T、CD68 + 巨噬细胞）浸润情况，筛选既能抑制排斥又不增加感染风险的优化方案。类器官免疫原性修饰探索 ：通过基因编辑技术（如 CRISPR-Cas9）敲除 enTsOrg 中 MHCⅠ/Ⅱ 类分子相关基因（如 HLA-A、HLA-DR），或表面修饰抗炎因子（如 PD-L1、IL-10），在免疫健全模型中验证修饰后类器官的免疫逃逸能力与功能保留情况，为临床规避排斥提供技术路径。二、功能评估维度不完整，缺乏对感觉与自主神经功能的系统验证不足点分析 该研究的功能评估聚焦于运动功能（如 BMS 评分、步态分析、水平梯子实验），仅通过 von Frey 与热板实验初步检测机械与热痛觉，未对感觉功能进行系统量化，且完全未涉及 SCI 患者核心困扰的自主神经功能障碍（如排尿困难、排便失禁、体位性低血压）。从病理机制看，胸段 SCI 不仅损伤运动神经环路，还会破坏交感神经节前神经元（位于胸段脊髓侧角）与副交感神经通路，导致膀胱逼尿肌 - 括约肌协同失调、肠道蠕动减慢等严重并发症 —— 这些功能障碍对患者生活质量的影响甚至超过运动障碍。当前研究仅以运动功能恢复作为核心终点，无法全面评估 enTsOrg 对 SCI 的修复价值；同时，感觉功能评估仅检测 “痛觉阈值”，未涉及触觉辨别、位置觉等复杂感觉，也未通过神经示踪（如 CTB 逆行示踪背根神经节）验证感觉神经环路的重构，导致对 enTsOrg 修复 “感觉 - 运动整合环路” 的能力判断不全面。改进建议补充系统感觉功能评估 ： 增加触觉辨别实验（如网格纹理识别测试）、位置觉测试（被动移动后肢并记录小鼠定位反应），量化 enTsOrg 对精细感觉的修复效果； 采用钙成像结合背根神经节（DRG）共培养，观察 enTsOrg 与感觉神经元的突触连接效率； 通过 CTB（霍乱毒素 B 亚基）逆行示踪，检测 enTsOrg 的轴突是否延伸至宿主 DRG，明确感觉神经环路的重构情况。建立自主神经功能评估体系 ： 膀胱功能：采用膀胱测压技术（cystometry）记录膀胱容量、逼尿肌收缩压力与括约肌协同性，通过 HE 染色观察膀胱壁形态（避免长期尿潴留导致的纤维化）； 肠道功能：记录小鼠每日排便次数、粪便含水量，通过免疫荧光检测结肠肌间神经丛中胆碱能神经元（ChAT+）的数量，评估肠道蠕动调控能力； 交感功能：监测小鼠体位变化时的血压波动（体位性低血压测试），通过 Western blot 检测交感神经标志物（如酪氨酸羟化酶 TH）的表达，验证交感神经环路修复情况。三、长期安全性与稳定性数据不足，缺乏对类器官异常增殖与结构降解的监测不足点分析 该研究对 enTsOrg 移植后的随访周期仅为 14 周（约小鼠生命周期的 5%），虽通过 CEA 检测排除短期成瘤风险、通过体积测量显示无明显扩张，但未评估长期安全性与结构稳定性：一方面，iPSC 衍生的类器官可能存在 “潜伏性致瘤风险”（如残留未分化 iPSC），短期内虽无明显肿瘤形成，但长期（如 6 个月以上）可能因细胞异常增殖导致畸胎瘤或其他增殖性病变；另一方面，LDH-Matrigel 支架的长期降解行为未被监测 ——Matrigel 在体内 3-4 周即开始降解，而 LDH 作为无机纳米材料，其长期（如 12 个月）在脊髓组织中的蓄积是否会引发慢性炎症（如异物巨细胞反应）、是否会影响脊髓组织的电生理传导，均未被验证。此外，长期随访中 enTsOrg 的细胞组成是否会发生 “表型漂移”（如胸段特异性 HOXC9 + 神经元比例下降）、与宿主组织的界面是否会形成胶质瘢痕包裹（阻碍长期功能整合），也缺乏数据支撑。改进建议延长长期随访与安全性监测 ： 将随访周期延长至 6-12 个月（覆盖小鼠生命周期的 20%-30%），每 2 个月通过 MRI（7.0T 小动物 MRI）监测类器官的位置、体积与周围组织水肿情况，避免因组织切片导致的样本破坏； 定期取脊髓组织进行 HE 染色、Ki67（增殖标志物）免疫荧光，检测类器官细胞增殖速率，通过全基因组测序（WGS）排查是否存在基因突变导致的异常增殖； 检测 LDH 在脊髓、肝脏、肾脏中的蓄积量（通过 ICP-MS），观察长期蓄积是否引发器官毒性或慢性炎症（如 IL-6、TNF-α 炎症因子检测）。评估类器官长期结构与功能稳定性 ： 每 3 个月通过 ST-seq 检测 enTsOrg 中胸段特异性基因（HOXC9、HOXD9）的表达变化，避免表型漂移； 通过免疫荧光检测移植界面的胶质瘢痕标志物（如 GFAP、NG2），评估是否形成长期结构屏障； 定期进行 MEP 与电生理记录，验证 enTsOrg 的神经传导功能是否长期稳定（而非短期代偿）。四、机制解析深度不足，未明确关键细胞亚型与信号通路的交互作用不足点分析 该研究虽提出 “LDH 通过 SHH、PI3K/AKT 通路调控 enTsOrg”，但机制解析存在两方面局限：一是未明确关键功能细胞亚型——enTsOrg 包含运动神经元（α/γ-MN）、Vsx2 + 中间神经元、GABA 能神经元等多种亚型，研究未通过单细胞测序结合功能抑制（如光遗传学特异性抑制 α-MN），明确 “哪种细胞亚型是运动功能恢复的核心贡献者”，导致对 enTsOrg 修复机制的理解停留在 “群体层面”；二是信号通路交互作用未被解析—— 研究发现 LDH 可激活 SHH 与 PI3K/AKT 通路，但未明确两者的调控关系（如 SHH 是否通过下游 GLI1 激活 PI3K/AKT，或两者为独立通路），也未排除其他潜在通路（如 Wnt、Notch）的参与。例如，转录组数据显示 enTsOrg 中 Notch 通路相关基因（如 NOTCH1、HES1）表达上调，但未进一步验证其功能，导致机制解析不够全面，后续优化类器官缺乏明确的靶向靶点。改进建议明确关键功能细胞亚型 对移植后的 enTsOrg 进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），结合原位杂交（smFISH）定位，区分 α-MN、γ-MN、Vsx2 + 中间神经元等亚型的空间分布与基因表达特征； 采用 Cre-loxP 系统构建 “细胞亚型特异性光抑制模型”（如 ChAT-Cre 驱动 eNpHR3.0 抑制运动神经元、Vsx2-Cre 驱动 eNpHR3.0 抑制中间神经元），对比抑制不同亚型后 MEP 振幅与 BMS 评分的变化，明确核心功能细胞。解析信号通路交互作用 通过通路抑制剂干预（如 SHH 抑制剂 Cyclopamine、PI3K 抑制剂 LY294002），在体外培养中检测 “单独抑制某一通路” 对 enTsOrg 胸段特性（HOXC9 + 比例）与成熟度（sAP 频率）的影响，明确通路的独立作用； 采用 Co-IP（免疫共沉淀）检测 SHH 通路下游 GLI1 与 PI3K 的 p85 亚基是否存在相互作用，通过双荧光素酶报告基因验证 GLI1 是否结合 PI3K 启动子，明确通路间的调控关系； 补充 Notch、Wnt 通路的功能验证（如 Notch 激动剂 Jagged1 干预），通过 KEGG 富集分析整合所有差异通路，构建 “LDH 调控 enTsOrg 的通路网络”。五、临床转化适配性不足，类器官制备效率与移植方式难以满足临床需求不足点分析 该研究的 enTsOrg 制备流程存在临床转化瓶颈：一是 iPSC 制备周期长（从患者体细胞重编程到 iPSC 稳定培养需 4-6 周），且需严格质控（如排除核型异常），难以满足 SCI 患者 “急性期移植”（最佳移植窗口为损伤后 7-14 天）的需求；二是类器官培养依赖 “超低吸附板 + 摇床培养”，操作复杂且产量低（每 96 孔板仅产 20-30 个类器官），无法实现规模化制备；三是移植方式为 “直接包埋 LDH-Matrigel 液滴”，Matrigel 在体内快速液化（24 小时内），可能导致类器官移位，且手术中难以精准放置到损伤 cavity（缺损区域），无法适配临床中 SCI 患者损伤面积差异大的特点。此外，研究未评估 enTsOrg 对 “慢性期 SCI”（损伤后 3 个月以上）的修复效果，而临床中多数患者因延误治疗处于慢性期，此时损伤区域已形成致密胶质瘢痕，enTsOrg 是否能穿透瘢痕并整合，当前数据无法支撑。改进建议优化类器官制备效率与规模化 探索 “间充质干细胞（MSC）直接诱导类器官”：MSC 来源广泛（骨髓、 adipose），无需重编程，可缩短制备周期至 2 周内，同时通过添加 LDH 与信号分子定向诱导胸段特性； 采用生物反应器（如搅拌式生物反应器）替代摇床培养，实现类器官的批量生产（单次培养产量提升至 1000+），并通过自动化质控系统（如 AI 图像识别）筛选大小均一、活性高的类器官。改进临床适配的移植策略 开发 “可降解支架 - 类器官复合物”：将 enTsOrg 负载于聚己内酯（PCL）- 明胶复合支架（降解周期与类器官整合周期匹配，约 8-12 周），支架设计为 “多孔结构” 以促进宿主轴突长入，同时通过 3D 打印定制支架形状，适配不同患者的损伤 cavity 大小； 探索 “微创移植技术”：采用内镜辅助下的椎管内注射，结合术中 MRI 定位，确保类器官精准放置到损伤位点，减少手术创伤。验证对慢性期 SCI 的修复效果 构建慢性期 SCI 模型（损伤后 12 周），对比 enTsOrg 与 “enTsOrg + 胶质瘢痕抑制剂（如软骨素酶 ABC）” 的修复效果，通过免疫荧光检测瘢痕厚度变化与类器官轴突延伸长度，评估 enTsOrg 穿透慢性瘢痕的能力，为临床覆盖更多患者群体提供数据支撑。 求点赞 求分享 求推荐 如果你想在此显示您的广告信息，请联系我们。 与万千同行共同关注类器官！ 关注我们  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官与干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承干细胞与类器官创新计划组织(ISCO)愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 广告赞助 欢迎找到组织 类器官创新计划组织 类器官创新计划组织（Innovations in organoids organization）是由来自中国科学院、北京大学、清华大学和复旦大学等多个顶级研究机构的头部研究团队组织发起的，完全公益的学术与研究技术交流合作组织，成员主要由来自类器官行业内的企业高管、技术经理、高级PI等构成。加入“类器官创新计划”后，您将以极低的成本实现类器官资源的互换与共享，基于肠道类器官和类器官创新计划组织微信公众号平台，您将获得来自全行业的赋能与指导，进行标准化的类器官制备与检测，保证您的研究顺利且高质量开展。我们会将你纳入本组织“技术研发”、“开源公益”和“产品服务”等多个微信群，这样您能够与所有参与计划的成员及时沟通，您所有的类器官问题都能最及时的得到解答和帮助，互换类器官品系和干细胞研究工具资源，解决技术难题，获得技术支持。我们已有上万个来自全国顶级类器官研究机构、大学和企业的注册认证会员，大家一起为类器官事业发展点燃星星之火，推动类器官产业发展壮大。我们还建立了AI知识问答和开源类器官分析工具等多个公益项目为类器官研究提供帮助，构建开放包容的领域生态。在这里,我们敢为人先，始终积极寻求更新类器官更优的解决方案，勇于突破经验与预想的界限，致力打造科学卓越的行业新标准。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn 组织愿景 1.共建开放协作生态：搭建行业资源共享平台，促进技术互通与经验共享，降低类器官研究门槛。 2.引领标准与规范：推动制定行业与国家工程标准，实现类器官培养与应用的规范化、全流程标准化。 3.打造国际级资源枢纽：推动建设全球认可的类器官库与智库平台，加速技术向精准医学与药物研发转化。 4.驱动技术融合创新：推动整合生物材料、智能装备等工程技术创新，突破类器官规模化制备与功能重建瓶颈。 5.强化技术自主可控：推进国产化试剂、仪器研发与技术体系替代，保障核心研发链安全与战略主动权。 加入交流       ISCO面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本公益组织目前已有8000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位例如“李四-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 欢迎您找到组织！~ 扫描二维码添加发起人微信以进群交流 专业收费资源 面向专业科普需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 开源公益  类器官能模拟人体器官功能与结构，为疾病研究、药物研发提供有力模型。但分析类器官数据困难复杂，开源算法项目汇聚前沿科学家智慧，让科研人员共享代码，优化数据处理与分析，加速成果转化，推动类器官研究迈向新高度。我们的管理团队和多个科研团队合作，依托类器官创新计划组织，率先开源基于大模型的类器官AI算法工具，未来类器官创新计划组织将不断提供开源免费的类器官分析与报告工具，助力行业快速发展。 #公益知识问答项目Organoid Agent, 采用最新的AI智能体技术，提供超越博士级类器官研究水平和教授级实验技术知识储备。 https://www.coze.cn/store/agent/7376069505418280970?bot_id=true&bid=6fck970447g1k 您还以直接在公众号对话框与它对话，获取帮助。 #开源AI图形算法项目地址 https://github.com/zjdevo/ISCO https://gitee.com/zjdevo/ISCO 开源项目自发起以来，持续受到企业公益赞助,我们感谢以下企业的支持： 上海捷方凯瑞生物科技有限公司  吉诺生命健康控股集团有限公司  如您有意通过赞助公益项目，实现品牌推广与发展，欢迎与我们联系。 扫描二维码添加微信以咨询赞助政策 注册会员      注册会员是面向所有人的公益身份识别项目。如需以组织会员身份获取各种资源与免费福利。您只需访问www.organoid.ac.cn注册会员，并补充个人真实有效身份信息，经人工审核后，即可获得注册会员认证。通过“类器官创新计划组织”和“肠道类器官公众号”的“身份认证”菜单就能找到查询入口。也可以下载专属的身份二维码用于各种需要出示本组织身份的场合如学术会议、合作商提供的免费产品申请。由PI或课题组长及以上级别提供实名信息可注册为“注册会员”，加入“注册认证会员群”优先享受本组织提供的学术界与产业界资源。特别的，您所有的信息仅用于身份识别，不会被进行任何形式的商业用途，     欢迎监督举报（邮箱：isco@organoid.ac.cn）。未进行注册的，不被认为是我组织正式会员，合作方有权拒绝提供任何服务和或产品。 具体注册方式点击下列文章了解： 如何注册成为注册会员？ 扫描二维码快速进入 身份认证系统

背景 自20世纪中期以来，非传染性疾病已逐步取代传染性疾病成为全球早逝的主要原因，其中癌症正蓄势待发，有望在本世纪超越心血管疾病成为头号原因。癌症治疗已从传统的手术、放疗和化疗，发展到靶向治疗和免疫治疗，后者通过逆转癌症患者的免疫抑制微环境并激活针对癌细胞的免疫反应来控制和消除癌症。 癌症免疫治疗主要包括免疫检查点抑制剂（ICIs）、细胞治疗、肿瘤疫苗、治疗性阻断抗体、小分子抑制剂和免疫系统调节剂等，其中ICIs构成免疫治疗的核心。细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）是首个被证实可调节T细胞反应的免疫检查点分子，开创了ICIs治疗的先河。ICIs通过阻断T细胞上的抑制性通路（如PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80-CD86相互作用），释放T细胞抑制，恢复免疫监视。过继免疫治疗也在近年来对血液恶性肿瘤的治疗取得重大突破。 癌症免疫治疗的核心原理在于重启和维持癌症-免疫循环，该循环包含一系列关键步骤：肿瘤抗原的释放、肿瘤抗原呈递、效应T细胞的激活与增殖、T细胞向肿瘤部位的迁移、T细胞浸润至肿瘤组织，最终识别并清除癌细胞。这些过程受到正负因子的严格调控。癌症-免疫循环中任何阶段的破坏都可能成为限速因素，阻碍免疫系统控制癌症进展的能力，并显著限制癌症免疫治疗的疗效。 尽管癌症免疫治疗取得了显著进展，但其临床疗效仍不一致，且存在重大挑战。治疗抵抗的多面性是更广泛成功的主要障碍，其中失调的致癌信号通路在促进肿瘤发展和免疫逃逸中起着关键作用。 癌症免疫治疗的发展与挑战 癌症免疫治疗的发展历程悠久，早在20世纪50年代，研究人员就通过将肝癌细胞移植到眼前房进行了开创性实验。70年代，研究人员探讨了自然杀伤（NK）细胞和T细胞等在癌症抑制中的功能。自20世纪末以来，广泛的研究和临床试验检验了包括ICIs和CAR-T细胞疗法在内的癌症免疫疗法。 分子克隆技术使得大规模生产纯化细胞因子成为可能，从而催生了首个获美国FDA批准的用于治疗毛细胞白血病的细胞因子疗法。例如，高剂量阿地白介素（白细胞介素-2, IL-2）可增强T细胞和NK细胞的细胞毒性活性，同时促进T细胞分化和存活，从而增强机体的抗肿瘤能力。 ICIs目前是临床上最有效的癌症免疫治疗形式。免疫检查点构成组成性表达的调节通路，通过防止过度激活和自身免疫来维持免疫稳态。ICIs作为单克隆抗体，阻断T细胞上的抑制性通路，从而重新激活机体的抗肿瘤免疫反应。在肿瘤微环境（TME）中，恶性细胞劫持这些检查点分子以逃避免疫监视。继2011年FDA批准伊匹木单抗作为先驱ICI之后，过去十年见证了ICIs疗法的临床涌现。 此外，细胞治疗是免疫治疗中另一个快速发展的方法，主要包括CAR-T细胞疗法、TCR工程化T细胞疗法、过继性肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法和NK细胞疗法。细胞治疗是一种精准医疗策略，涉及修饰或利用免疫细胞或肿瘤细胞来特异性识别和消除肿瘤。迄今为止，FDA已批准多个CAR-T细胞产品，其中CD19仍是这些生物制剂的主要治疗靶点。从机制上讲，患者来源的T细胞经过基因改造表达CAR，其胞外单链可变片段（scFv）赋予特异性CD19抗原识别能力，从而能够靶向消除CD19+恶性细胞。 除了淋巴细胞修饰，科学家们还设计了溶瘤病毒（OV），使其能够在肿瘤组织中选择性复制，同时保持减毒毒力。这些病毒裂解肿瘤细胞，释放肿瘤相关抗原（TAAs）、损伤相关分子模式（DAMPs）、病原体相关分子模式（PAMPs）、细胞因子和趋化因子。这些成分协同作用，强力激活机体免疫系统，引发强大而靶向的抗肿瘤免疫反应。此外，肿瘤疫苗是另一种有前景的免疫治疗形式，通过激活患者自身的免疫系统来识别和消除肿瘤细胞。它们大致分为预防性疫苗和治疗性疫苗。 尽管癌症免疫治疗取得了显著进展，并在PD-1/PD-L1抑制剂、CAR-T细胞疗法和个性化疫苗等领域显示出突破性疗效，但它仍面临若干局限性。首要问题是不同癌症类型的治疗反应性存在差异，这在很大程度上取决于宿主的免疫能力。例如，细胞疗法难以渗透实体瘤的肿瘤微环境，导致其疗效显著低于血液癌症。黑色素瘤、膀胱癌和非小细胞肺癌（NSCLC）等癌症通常对免疫治疗更敏感。相反，胰腺癌（PC）和前列腺癌的肿瘤微环境以富含免疫抑制细胞和因子为特征，导致免疫治疗效果较差。此外，肿瘤细胞采用多种免疫逃逸机制来规避免疫监视并产生免疫治疗抵抗，这是治疗效果不佳和治疗获益短暂的主要决定因素。 其机制主要涉及以下方面：（1）获得性β2-微球蛋白（B2M）纯合缺失导致癌细胞表面人类白细胞抗原（HLA）I类分子表达下降，导致肿瘤抗原呈递和TCR功能受损。（2）癌症进展过程中新抗原编辑受损和拷贝数丢失直接导致免疫逃逸。（3）免疫治疗期间，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）的浸润增加，或抑制性细胞因子的释放增加，共同促进肿瘤免疫逃逸和T细胞功能障碍。（4）免疫检查点分子表达升高。（5）失调的信号通路损害T细胞效应功能。 鉴于细胞信号通路在肿瘤生物学和治疗抵抗中复杂而广泛的作用，加之癌症免疫治疗的变革潜力，本综述探讨了失调的信号通路如何调节免疫治疗反应。 失调的致癌信号通路促进肿瘤发展并抑制抗肿瘤免疫反应 癌症相关致癌信号通路包含调节生长、增殖和存活的细胞内分子级联。这些通路对于维持生理条件下的细胞稳态至关重要。然而，由基因突变、表观遗传修饰或微环境变化驱动的其持续激活或失活，可促进恶性转化。这种异常状态以失调的增殖、抗凋亡和转移潜能增强为特征。 致癌信号通路积极塑造免疫抑制微环境。具体而言，Wnt/β-catenin激活损害树突状细胞（DCs）的募集和成熟，从而削弱肿瘤抗原呈递。转化生长因子β1（TGF-β）信号通路通过促进Treg细胞分化和功能、抑制效应T细胞活性和促进肿瘤免疫逃逸，在Treg细胞生物学中发挥核心作用。此外，MYC原癌基因驱动的谷氨酰胺代谢与T细胞功能所需的营养底物竞争，直接导致T细胞耗竭。此外，大量研究报道致癌信号通路调节免疫相关因子和免疫检查点分子的表达，帮助肿瘤逃避T细胞介导的杀伤。 迄今为止，靶向致癌信号通路的抑制剂已取得临床成功。然而，突变激活或旁路信号可能有助于耐药性的出现。研究致癌信号通路的作用是连接基础机制和临床转化的关键环节。信号通路网络的分析为克服免疫治疗抵抗和设计整合靶向治疗与免疫治疗的联合策略提供了理论基础，代表了转化医学研究的前沿。 主要致癌通路对癌症免疫治疗效果的影响 各种致癌信号通路的异常激活显著调节癌症免疫治疗的疗效。本节探讨关键通路的影响，包括Wnt/β-catenin、Notch、JAK/STAT、p53功能丧失、PTEN功能丧失和其他相关信号通路对免疫调节和治疗结局的影响。 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号通路是一个进化上保守的通路，在胚胎发育、组织稳态和成人生理过程中起关键作用。此外，β-catenin通路关键地调节免疫治疗反应。Wnt/β-catenin信号对TME最明确且最重要的影响是促进免疫荒漠表型。T细胞浸润水平是癌症免疫治疗疗效的关键预测指标。T细胞浸润减少会损害ICIs反应性，损害CAR-T细胞疗法功能，并削弱肿瘤疫苗介导的T细胞激活，所有这些都会显著影响患者治疗结局和生存预后。 因此，理解Wnt/β-catenin信号如何抑制T细胞浸润并开发相应的干预措施，将有助于建立T细胞炎症表型并增强对免疫治疗的反应性。DCs对于启动抗原特异性CD8+ T细胞至关重要。研究表明，具有过度活跃β-catenin信号的小鼠肿瘤表现出CD103+ DCs的缺陷。此外，β-catenin信号通路抑制DC招募趋化因子，特别是在多种癌症类型中抑制C-C motif趋化因子配体4（CCL4）和C-C motif趋化因子配体5（CCL5）。实验研究表明，在小鼠中通过水动力学尾静脉递送CCL5可恢复免疫监视，尽管β-catenin通路激活。此外，β-catenin信号激活本身在肝细胞癌（HCC）中赋予了对抗PD-1疗法的抵抗性。 此外，Wnt/β-catenin通路通过促进免疫抑制细胞的募集和持续存在来损害ICIs有效性。具体而言，在结直肠癌（CRC）中，过度激活的Wnt/β-catenin信号募集MDSCs以建立免疫抑制微环境。在肺腺癌（LUAD）中，Wnt/β-catenin信号有助于维持TAMs的M2表型和免疫抑制功能。靶向TAM介导的免疫抑制通过增强CD8+ T细胞活性和抑制MDSCs浸润，显著增强ICIs疗效。 除了直接或间接调节CD8+ T细胞浸润和功能外，β-catenin还受到CD8+ T细胞通过反馈机制的相互调节，从而影响癌细胞中的信号活性。 临床上，一部分免疫治疗难治性患者尽管显示出显著升高的CD8+ T细胞浸润和干扰素-γ（IFN-γ）表达水平，但 paradoxically 表现出加速的肿瘤进展——称为ICIs介导的超进展疾病（HPD）。机制研究揭示了IFN-γ诱导的肿瘤细胞中成纤维细胞生长因子2（FGF2）上调驱动致癌代谢串扰，增强β-catenin乙酰化并促进干性重编程。靶向IFN-γ-FGF2-β-catenin信号轴在临床前模型中显示出抑制肿瘤进展的疗效。 临床和临床前证据表明，β-catenin通路关键地调节肿瘤免疫逃逸和TME重塑，表明靶向其关键组分可能为癌症免疫治疗带来显著益处。 Notch信号通路 Notch基因编码一个高度保守的跨膜受体家族，由胞外和跨膜亚基组成。当与相邻细胞配体结合时，Notch发生蛋白水解切割，释放Notch细胞内结构域（NICD），后者易位至细胞核调节转录。Notch信号对免疫治疗疗效的影响高度依赖于背景。它既可以促进免疫逃逸，也可以增强抗肿瘤免疫反应，这取决于特定的生物学和微环境条件。 在分子水平上，基质细胞接合触发慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中PD-L1的表达。一个涉及Notch、c-MYC和zeste同源物2增强子（EZH2）的信号轴介导了这种效应。治疗性破坏这种协同通路可能有助于开发新的CLL靶向免疫疗法。此外，在抗PD-1耐药的CRC模型中观察到Notch和TGF-β通路同时激活，伴随免疫细胞（包括T细胞和NK细胞）浸润减少。基于局部mRNA的免疫治疗成功恢复了这些耐药肿瘤对PD-1治疗的敏感性。临床证据表明，Notch1/2/3突变与接受ICIs治疗的NSCLC患者的持续治疗反应相关，显示出改善的客观缓解率、延长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。 从机制上讲，Notch信号主要通过影响巨噬细胞极化来建立免疫抑制生态位。耐药晚期LUAD样本表现出高Jagged1/Notch1表达，这促进了肿瘤M2样TAM的侵袭。在基底样乳腺癌（BLBC）中，Notch信号调节促炎细胞因子IL1β和C-C motif趋化因子配体2（CCL2）的表达以招募TAMs。相反，在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，Notch1敲除也通过CCL2/C-C趋化因子受体2型（CCR2）轴诱导T细胞耗竭和巨噬细胞的M2样分化。此外，巨噬细胞中Notch通路激活直接调节其分化。重组信号结合蛋白用于免疫球蛋白kappa J区（RBPJ）构成Notch信号通路的主要转录调节因子。RBPJ的缺失消除了炎症单核细胞向TAMs的分化。此外，Notch信号通路关键地控制MDSCs的扩增和分化，从而在免疫治疗期间调节抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。 尽管Notch信号的作用因癌症类型而异，但研究证实，持续的Notch通路活性对于建立、激活和维持T细胞的最佳抗肿瘤免疫能力至关重要。条件性基因敲除小鼠模型表明，Notch1/2信号增强CD8+ T细胞增殖和IFN-γ分泌，而NICD1的条件性过表达增强CD8+ T细胞细胞毒性和颗粒酶B产生。最近的进展凸显了Notch信号在T细胞免疫治疗中的治疗潜力。PD-1阻断的疗效依赖于CD28共刺激，而这在耗竭T细胞中常常缺陷。然而，研究表明，来那度胺介导的Notch信号激活上调hes家族bHLH转录因子1（HES1）、髓鞘蛋白零样2（MPZL2）和T-box 21（TBX21）的表达。这种机制有效地恢复了CD28缺陷小鼠模型中对PD-1抑制的抗肿瘤反应。 此外，工程化CARs能够实现靶向T细胞抗肿瘤反应，但面临肿瘤特异性抗原稀缺和内源性免疫弱的限制。合成Notch受体通过实现定制化细胞因子分泌、指导T细胞分化和递送新型治疗载荷来克服这些限制。这种方法通过交叉诱导抗原特异性受体表达实现精准治疗。总之，Notch信号的治疗性靶向结合TCR和CAR基础的免疫疗法对推进癌症免疫治疗具有重大前景，值得未来大量的研究努力。 JAK/STAT信号通路 JAK和STAT蛋白是关键的细胞内信号分子，调节多种生物过程，包括细胞增殖、存活、分化和免疫反应。JAK/STAT信号通路在多种癌症类型中普遍激活。值得注意的是，对80例HCC病例的甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）和微卫星分析显示，所有检查的肿瘤标本中均有JAK/STAT通路的组成性激活。对20例伴有肉芽肿反应的经典霍奇金淋巴瘤病例的全面临床病理分析表明，50%的肉芽肿病变显示pSTAT3阳性，可能与PD-L1细胞表达模式相关。多种细胞因子和生长因子触发JAK/STAT信号通路，该通路在调节TME中起关键作用，从而影响肿瘤免疫抑制和免疫治疗疗效。一项评估JAK抑制剂和抗PD-1抗体联合疗法治疗霍奇金淋巴瘤患者的I期临床试验报告了有希望的疗效，最佳总缓解率达到53%。类似地，抗PD-1治疗后辅助使用JAK1抑制剂可显著增强转移性NSCLC患者的抗肿瘤免疫力。 JAK/STAT通路主要通过响应T细胞衍生的IFN-γ并上调PD-L1来促进免疫治疗抵抗。这个级联构成IFN-γ诱导的转录免疫抑制的核心机制。例如，肾细胞癌（RCC）中过度的IFN-γ激活塑造了一个独特的TME，以显著的淋巴细胞浸润为特征，同时伴有JAK1/STAT1/PD-L1介导的免疫抑制机制。此外，该信号级联受到细胞因子信号抑制因子（SOCS）家族的负调控，SOCS家族是通过反馈抑制减弱细胞因子信号转导的细胞内调节蛋白。在RCC中，EH结构域结合蛋白1样蛋白1（EHBP1L1）在SOCS1相互作用位点竞争性结合JAK1，从而阻断JAK1的蛋白酶体降解。 在黑色素瘤和CRC中，转录调节因子SRY-box转录因子2（SOX2）和类固醇受体共激活因子-1（SRC-1）抑制SOCS1/3表达，同时激活JAK/STAT信号，最终导致PD-L1上调。因此，SRC-1活性的药理学抑制或SOX2表达的限制可能增强PD-L1靶向免疫治疗的疗效。此外，JAK/STAT信号通路在IFN-γ介导的抗肿瘤免疫反应中起着关键但双重的作用。这种功能双重性主要源于STAT蛋白，特别是STAT1和STAT3，被IFN-γ差异激活。这种差异激活最终导致细胞因子转录激活的不同模式。 此外，除了IFN-γ之外，多种细胞因子和生长因子调节JAK/STAT信号通路。（1）研究表明，IL-3刺激可以恢复携带RUNX家族转录因子1（RUNX1）缺失突变的人原代造血细胞的增殖和竞争能力。这些突变选择性增强IL-3受体表达，同时抑制JAK/STAT信号，最终导致某些白血病亚型的不良结局。RUNX1突变驱动的对IL-3/JAK/STAT轴依赖的识别为开发靶向治疗策略提供了宝贵见解。（2）粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为抗肿瘤治疗中的免疫刺激剂受到关注。然而，新出现的证据表明，它可能通过激活JAK2/STAT5/PD-L1信号轴，在淋巴瘤中 paradoxically 促进免疫逃逸。（3）此外，JAK/STAT信号通路在调节NK细胞和T淋巴细胞的增殖能力和终末分化过程中起关键作用。例如，IL-15通过JAK/STAT信号调节CAR19/IL-15 NK细胞针对各种癌细胞系的扩增能力和细胞毒性活性。CAR-T细胞疗法通过靶向细胞因子受体调节精确调节JAK/STAT信号，维持治疗持久性并发挥强大的抗肿瘤作用。总之，JAK/STAT信号通路的靶向调节在多种癌症免疫治疗模式中具有显著的治疗潜力，包括ICIs、细胞因子基础治疗和CAR-T细胞疗法。 TP53功能丧失 TP53是人类恶性肿瘤中最重要的肿瘤抑制基因之一，TP53的基因突变或功能失活在各种癌症类型中频繁观察到。例如，TP53在SCLC中近乎普遍的失活揭示了这种特别侵袭性恶性肿瘤的关键生物学过程。此外，全面的基因组分析显示，TP53突变在几种侵袭性癌症类型中发生频率特别高（>50%的病例），包括ESCC、TNBC和HNSCC。TP53突变通常作为肿瘤发生的起始事件，并与肿瘤侵袭性、临床结局和治疗敏感性密切相关。同时，这些突变通过多种分子机制调节抗肿瘤免疫反应。一个临床相关例子表明，携带TP53突变的HCC患者通常对ICIs单药治疗反应有限。然而，将这些治疗与针对TP53失活下游介导物的靶向药物联合可显著增强治疗结局。 TCGA和METABRIC数据集的整合分析，结合临床标本评估，显示p53特征评分和新辅助化疗反应模式共同预测TNBC的长期结局。这种联合方法评估总预后、5年无乳腺癌生存率以及对免疫治疗反应的可能性。HCC中的p53失活触发癌症干细胞中白细胞介素-34（IL-34）分泌升高，随后促进CD36依赖性脂肪酸氧化并有利于TAMs的M2极化。治疗性靶向IL-34-CD36代谢轴可能潜在地克服抵抗并与HCC治疗中的抗PD-1免疫治疗协同作用。 分子研究表明，功能获得性TP53突变直接抑制PH结构域和富含亮氨酸重复序列蛋白磷酸酶2（PHLPP2）转录。这种抑制导致蛋白激酶B/真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）/真核翻译 initiation 因子4E（eIF4E）信号级联的过度激活，最终通过转录后机制增强PD-L1蛋白翻译。全面的免疫学分析揭示，TP53缺陷，无论是独立还是与MYC基因组扩增结合，对T细胞的肿瘤浸润能力和功能激活状态施加直接调节作用。 此外，研究表明p53缺失通过干扰素调节因子1（IRF1）/SRY-box转录因子10（SOX10）轴调节PD-L1表达。此外，其他干扰素调节因子（IRF）家族成员，如干扰素调节因子5（IRF5）和干扰素调节因子9（IRF9），以及包括CCL2和Fas细胞表面死亡受体（FAS）在内的因子，已被认为是p53在免疫微环境调节中的下游效应器。尽管需要进一步的干预研究来证实这些观察结果，这些分子仍然是潜在的有希望的治疗靶点。 鉴于p53缺陷在TME中引起的广泛免疫抑制效应，科学家们探索了多种恢复正常p53功能的方法。鼠双微体2（MDM2）是p53的关键负调节因子，控制其稳定性和转录活性。作为一种E3泛素连接酶，MDM2结合p53并促进其泛素化，导致该肿瘤抑制因子的蛋白酶体降解。此外，p53转录激活MDM2表达，建立了一个自动调节负反馈环，维持p53蛋白稳态并防止过度的细胞反应。MDM2-p53反馈环现在是癌症药物开发的主要焦点。药理学抑制MDM2以重新激活肿瘤免疫监视代表了一种特别有希望的治疗策略。一个临床相关例子是ALRN-6924，一种MDM2拮抗剂，在黑色素瘤中显示出治疗疗效。它激活病毒模拟通路，上调促炎肿瘤特征基因，并刺激p53依赖性干扰素反应。这些机制共同提供了一种克服ICIs抵抗和增强抗肿瘤免疫浸润的策略性方法。MDM2抑制剂显著增强急性髓系白血病（AML）细胞中MHC I/II类分子的表达，同时促进CD8+ T细胞募集和激活，从而增强其AML靶向的细胞毒性作用。相应地，各种靶向p53通路的药理学制剂在临床前研究中显示出强大的抗白血病活性。 此外，将p53 mRNA或p53蛋白局部递送至肿瘤是一种有前景的癌症免疫治疗策略，旨在通过恢复或增强p53功能来抑制肿瘤免疫逃逸。p53 mRNA递送方法涉及将TP53基因转录物直接引入恶性细胞以驱动功能性p53蛋白的内源性产生。与常规基因治疗相比，基于mRNA的递送系统消除了持续转基因表达的需要，同时避免了与病毒载体相关的免疫反应。此外，免疫治疗方法仅需要短暂的局部p53激活，从而避免了与传统肿瘤杀伤疗法相关的全身毒性。p53蛋白递送方法涉及合成p53多肽的直接细胞内运输，绕过了与内源性转录和翻译机制相关的潜在限制。例如，TNBC模型的临床前研究表明，Pos3Aa-p53蛋白晶体可以恢复肿瘤抑制功能。该治疗还诱导免疫原性细胞死亡，上调PD-L1，并激活I型干扰素（IFN-I）通路。这些效应共同增强T细胞浸润和激活，从而增强抗PD-1治疗反应。p53信号通路的调节和p53 mRNA/蛋白的局部递送可能在不同的临床场景中表现出协同治疗效果，有望在肿瘤学应用中产生增强的治疗结局。 PTEN功能丧失 PTEN缺失是跨越多种恶性肿瘤中最普遍的致癌改变之一，作为PI3K/AKT/mTOR通路过度激活的关键抑制因子。作为首个被鉴定具有双重特异性磷酸酶活性的癌症抑制基因，PTEN通过脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性负调节PI3K/AKT/mTOR信号通路。PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路的基因组畸变发生在超过25%的NSCLC病例中。这些改变与PD-L1和PD-L2表达升高显著相关。此外，一例晚期低分化甲状腺癌（PDTC）的临床病例报告显示，一名PTEN突变患者在联合免疫治疗期间疾病进展，而随后加入mTOR抑制剂治疗实现了6个月的疾病稳定。这些发现表明，靶向AKT通路抑制可能克服PTEN缺陷肿瘤的免疫治疗抵抗。在黑色素瘤模型中，PTEN缺陷组成性激活PI3K信号并上调免疫抑制细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-6（IL-6）和血管内皮生长因子（VEGF）。这些变化共同抑制T细胞浸润和克隆扩增，从而降低PD-1阻断的疗效。FYVE、RhoGEF和PH结构域包含蛋白1（FGD1）与PTEN物理相互作用以抑制其磷酸酶活性，从而增强PTEN介导的PD-L1上调，并 consequently 调节骨肉瘤中ICIs的治疗反应。此外，在PTEN缺陷的背景下，PI3Kβ信号的药理学阻断有效抑制STAT3激活，同时上调免疫刺激分子，从而增强抗肿瘤免疫力。这种干预与免疫治疗协同作用，使对联合治疗完全反应的小鼠表现出免疫记忆。 此外，PTEN在TME内发挥深远的免疫调节作用。通过跨膜emp24结构域包含蛋白10（TMED10）通道分泌的细胞外PTEN与巨噬细胞上的plexin结构域包含蛋白2（PLXDC2）受体结合。这种相互作用抑制JAK2/STAT1信号并