HLA x KIR family x Kir channels

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注癌症是一种高度复杂的疾病，其特点不仅在于恶性细胞的过度生长，还包括免疫反应的改变。在肿瘤的发生和发展中，免疫系统的抑制和重新编程起着关键作用。免疫治疗的目的是重新激活抗肿瘤免疫细胞，克服肿瘤的免疫逃逸机制。有证据表明，多种免疫治疗方法的结合可能是提高治疗效果的途径之一。然而，肿瘤免疫治疗的总体临床反应率仍有待提高，这需要开发新的治疗方法和生物标志物。从过去临床和基础研究的成功和失败中学习，对于未来研究的合理设计至关重要。今天分享一篇发表在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）的综述文章。这篇综述描述了免疫系统对抗癌症的机制，并讨论了可以促进抗肿瘤免疫反应的治疗靶点和细胞类型。目 录一.  研究背景二．T细胞上的免疫抑制分子（ICs）三．T细胞上的免疫刺激分子（ICs）四．NK细胞上的免疫刺激分子（ICs）五．细胞免疫治疗六．来自ICB和CAR-T细胞的免疫治疗生物标志物七．其他类型的免疫疗法八．靶向抑制性的肿瘤微环境九．结论和展望-01-研究背景肿瘤免疫治疗的历史可以追溯到1974年，当时白细胞介素-2（IL-2）被发现在T细胞分化和生长中发挥关键作用。T细胞的激活是抗病毒和抗肿瘤适应性免疫中的关键事件，主要通过双信号途径完成。第一个信号是抗原特异性信号，包括T细胞受体（TCR）与抗原肽-主要组织细胞复合体（MHC）的特异性结合。第二个信号是由T细胞与抗原提呈细胞（APC）表面的刺激分子（CMs）的交流介导的。1986年，科学家发现了CD28，这是一个在活化T细胞上表达的分子，对T细胞的激活至关重要。随后，CTLA-4被发现，与CD28结构相似，被认为是一种潜在的T细胞抑制分子。1994年底，Allison团队发现了阻断CTLA-4可以增加T细胞的抗肿瘤活性和抑制肿瘤生长的突破性发现。这证明了抑制负性免疫调节剂可以抑制肿瘤发展，这种方法后来被称为免疫检查点阻断（ICB）。2011年，第一个针对CTLA-4的抗体ipilimumab被批准用于黑色素瘤治疗，成为第一个免疫检查点（IC）抑制剂。20多年前，京都大学Tasuku Honjo的研究小组发现了PD-1。PD-1基因敲除导致小鼠出现自身免疫性疾病和异常激活的免疫细胞，表明其具有免疫抑制作用。2000年，B7-H1被确定为PD-1的配体，也被称为PD-L1。这些发现表明，PD-1是另一种IC。总的来说，针对CTLA-4和PD-1的抗体以及CAR-T细胞疗法代表了有希望的方法，在这些方法中，免疫系统的某些成分可以被操纵，以扭转抑制并针对肿瘤。然而，并非所有患者对这些疗法都有反应，这表明肿瘤引起的免疫改变具有复杂性。Robert Schreiber博士提出了“癌症免疫编辑”的概念，描述了恶性细胞如何对最初的免疫识别做出反应，随后发展出逃逸机制，甚至“重塑”免疫系统，成为致癌物质。这样的免疫编辑过程几乎在体内或全身免疫细胞存在时都会发生，从而形成高度抑制的肿瘤微环境（TME）。因此，寻找激活抗肿瘤T细胞反应和针对抑制性TME的协同方法一直是肿瘤免疫治疗的主要研究重点。图1. 癌症免疫疗法发展的历史性里程碑-02-T细胞上的免疫抑制分子（ICs）ICs是一类免疫抑制分子，它们在免疫细胞上表达，并能够抑制免疫细胞的激活，因此在预防自身免疫中发挥关键作用（见图2）。然而，ICs的过度表达会抑制免疫功能，促进肿瘤的发生。因此，ICB疗法通过阻断ICs并增强抗肿瘤T细胞的活性来抑制肿瘤生长。ICB的发展始于针对PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/2这两个IC通路的靶向阻断，对它们的阻断已经取得了显著的临床进展。迄今为止，已经发现了T细胞上其他几个通过不同机制介导抑制性信号的IC分子，并有可能将它们作为癌症免疫治疗的靶点加以利用。图2. 免疫检查点抑制剂及其受体列表1. PD-1研究表明PD-1在调节自身免疫反应中具有重要作用，因为它能够抑制T淋巴细胞的功能。在多种类型的肿瘤中，PD-L1（最初被标识为B7-H1）的高表达使其能够与PD-1结合，从而促进肿瘤的免疫逃逸。因此，通过抑制PD-1可以重新激活T细胞的功能。需要注意的是，PD-1不仅在T细胞上表达，而且在NK细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）上也有表达。这表明PD-1可能在重塑肿瘤免疫微环境甚至全身性抗肿瘤免疫中发挥着非常有效的作用。PD-1抑制剂能够特异性地结合PD-1，减弱对T淋巴细胞的免疫抑制调节，使得T淋巴细胞能够参与肿瘤细胞的杀伤。（图3）图3. PD-1抗体工作机制示意图2. CTLA-4CTLA-4，也称为CD152，是一种跨膜蛋白，在活化的CD4+和CD8+T细胞中表达。CTLA-4通过与CD80/CD86结合来抑制T细胞的激活信号，从而防止自身免疫性疾病的发生。阻断CTLA-4可以直接作用于效应性T细胞的抑制信号，减少调节性T细胞（Tregs）的抑制作用，从而有效提高T细胞的抗肿瘤效应。尽管CTLA-4和PD-1都是代表性的免疫检查点分子，但它们以不同的方式调节T细胞功能（见图4）。CTLA-4的抑制信号消极地调节T细胞的启动阶段，而PD-1主要介导已经启动的T细胞的抑制和增殖。在肿瘤治疗方面，研究发现针对PD-1的免疫检查点阻断通常会导致现有抗肿瘤T细胞的扩增和招募，而抗CTLA-4治疗则可能产生新的T细胞克隆。这些结果表明，CTLA-4和PD-1可以同时作为治疗靶点，发挥协同的抗肿瘤作用。图4. CTLA-4和PD-1的图解3. Tim-3T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域-3（Tim-3，CD366）是一种T细胞表面抑制性分子，主要表达在CD4+T辅助细胞1（Th1）和CD8+CTL细胞，以及具有强化抑制功能的Treg细胞亚群上。后来发现，Tim-3，也被称为HAVCR2，也表达在一些先天性免疫细胞上，包括树突状细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。4. LAG-3在抗原刺激下，淋巴细胞诱导分子-3（LAG-3）可以在CD4+和CD8+T细胞上被诱导。长期感染病毒、细菌和寄生虫导致持续暴露于抗原，从而导致LAG-3的高水平和持续表达，随后细胞因子释放、细胞溶解活性和增殖潜力减少。在一些小鼠肿瘤模型中观察到LAG-3和PD-1在瘤内T细胞上的共同表达，当结合这两种分子的阻断抗体时，观察到对肿瘤生长的协同抑制作用。因此，LAG-3成为癌症免疫治疗中最关键的新靶点之一。Relatlimab是第一个进入临床的LAG-3抑制剂，它能够阻断LAG-3与MHC II的相互作用。纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）是LAG-3的配体。研究发现，它与LAG-3结合形成一个新的PD-1/PD-L1独立的免疫检查点途径，导致T细胞衰竭、功能障碍，以及肿瘤细胞逃避免疫监视。在抗PD-L1的基础上阻断FGL1可能成为临床实践中的另一种新型ICB策略，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向治疗方面。5. NR2F6核受体亚家族2群F成员6（NR2F6）最近被报道为细胞内免疫检查点分子，是淋巴细胞固有的核受体。作为转录因子，NR2F6调节与肿瘤抗原特异性T细胞反应相关的细胞的激活、募集、增殖和内稳态。在非小细胞肺癌组织的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中检测到NR2F6的高表达，NR2F6表达上调与细胞因子（IL-2、TNF-α和IFN-γ）的产生受损相关，提示TILs上的NR2F6有助于肿瘤免疫抑制。此外，NR2F6的破坏导致肿瘤抑制，并增强PD-L1阻断剂在肿瘤治疗中的作用，提示NR2F6抑制剂可能成为一种新的免疫疗法，可以克服对现有ICB治疗的耐药性。6. TIGITT细胞免疫球蛋白和ITIM域蛋白（TIGIT）是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族（IgSF）。TIGIT在T细胞、调节性T细胞、记忆性T细胞和NK细胞上表达。通过与表达在抗原呈递细胞（APC）上的配体CD155和CD112相互作用，TIGIT介导对NK细胞和T细胞激活的抑制作用。在人类肿瘤中，发现TIGIT与多个免疫检查点分子共表达，包括PD-1、TIM-3和LAG-3。TIGIT、TIM-3和PD-1的共同表达与患者的生存率低有关。同时阻断TIGIT和PD-1信号通路可以增加肿瘤特异性CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达，支持抗TIGIT治疗的发展。7. VISTAV-集免疫调节受体（VISTA），也被称为PD-1H或DD1α，是近年来发现的一种免疫调节蛋白。它主要表达于淋巴器官和骨髓细胞，其结构与PD-L1相似。研究表明，表达VISTA的抗原呈递细胞（APC）对CD4 +和CD8 + T细胞有抑制作用；当这种分子被阻断时，由T细胞介导的免疫功能得到了挽救，说明VISTA是一种抑制T细胞反应的免疫检查点（IC）分子。在T细胞中，VISTA和PD-1的抑制作用是相互独立的，在肿瘤小鼠模型中的研究也验证了同时应用抗PD-1和抗VISTA抗体可以抑制肿瘤生长，延长生存期。8. BTLAB和T淋巴细胞衰减剂（BTLA）属于免疫球蛋白超家族。它在T细胞、静止的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞上表达，其结构和功能与PD-1和CTLA-4相似。BTLA的配体是疱疹病毒进入介质（HVEM）。当BTLA与HVEM结合时，它产生抑制性信号并抑制T细胞的激活。抗BTLA治疗可促进T细胞增殖，BTLA基因敲除的小鼠显示出更高的免疫活性。-03-T细胞上的免疫刺激分子（ICs）1. OX40OX40，也被称为CD134，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族的成员，在T细胞激活后24-72小时表达。它的配体OX40L，也被称为CD252，主要表达在活化的APC表面。OX40和OX40L的相互作用可以启动T细胞激活信号，促进细胞周期蛋白A、Bcl-2抗凋亡分子、细胞因子以及细胞因子受体的表达。在小鼠模型中，刺激OX40的特异性抗体可以减少Tregs的数量，从而保持效应T细胞的功能，并表现出高抗肿瘤活性。目前已有许多针对OX40-OX40L途径的临床研究，包括对激发OX40的特异性抗体的单药应用或与化疗、放疗、手术、小分子靶向治疗、细胞因子或其他免疫检查点阻断药物的组合治疗。2. ICOS诱导共刺激分子（ICOS），又称CD278，是免疫球蛋白超家族的一员。ICOS在活化的T细胞表面表达，调节T细胞增殖和功能。ICOS的激活依赖于其配体ICOS-L，主要在B细胞和抗原呈递细胞（APCs）中表达。ICOS已被证明是免疫检查点阻断疗效的一个重要标志。在治疗恶性黑色素瘤时，发现ICOS+CD4+T细胞的丰度与较好的治疗效果相关。在小鼠模型中，单独使用ICOS激动剂很难引起足够的抗黑色素瘤反应；但ICOS激动剂与抗CLTA-4药物存在协同效应；此外，ICOS敲除小鼠对抗CLTA-4治疗的反应较差。3. 4-1BB4-1BB，也称为CD137，是TNFR家族的一员。对于调节性T细胞上4-1BB的作用存在一些复杂性，研究结果有时相互矛盾。但重要的是，4-1BB基因敲除小鼠会出现自身免疫性疾病的症状，这表明其在免疫平衡中发挥着重要作用，并且有可能成为靶向治疗的对象，以引发肿瘤特异性免疫识别。4. CD27与TNFR家族的其他成员不同，CD27只在淋巧细胞表面表达，包括新生和活化的CD4+和CD8+T细胞。当CD27与其配体CD70相互作用时，它能够诱导效应性和记忆性T细胞的增殖和分化，并增强B细胞和NK细胞的激活。小鼠模型的研究表明，通过诱导CD27信号通路可以抑制肿瘤的生长，显示了CD27/CD70信号通路在抗肿瘤免疫中的重要作用。Varlilumab是一种针对CD27的人源化单克隆抗体，可促进细胞因子的产生和T细胞的激活。在I期临床研究中，Varlilumab在晚期实体瘤患者中的耐受性良好，并显示出初步的安全性结果。除了单药治疗外，Varlilumab还可以与抗PD-L1抗体联合使用。-04-NK细胞上的免疫刺激分子（ICs）在人体内，NK细胞主要以CD3- CD56+淋巴细胞群为特征，而CD16+ CD56dim亚型主要存在于血液中。NK细胞作为自然免疫系统的重要组成部分，在清除衰老细胞和致病微生物方面发挥着重要作用。与T细胞不同，NK细胞不需要通过特定的受体识别靶细胞；它们通过种系基因表达的受体来识别细胞。NK细胞的负调控因子包括KIR（免疫球蛋白样受体）、CD94-NKG2和MHC-I。在肿瘤免疫学的背景下，肿瘤细胞通过下调MHC的表达来逃避获得性免疫，从而更容易受到NK细胞的细胞毒性作用。此外，在抗体治疗中，NK细胞在介导抗体诱导的细胞毒性（ADCC）中发挥着重要作用。NK细胞还可以通过分泌细胞因子或招募树突状细胞、巨噬细胞和T细胞等免疫细胞参与清除肿瘤细胞的过程，直接发挥抗肿瘤作用，使其成为癌症免疫治疗的诱人靶点。1. KIR杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）家族是一类高度多态性的分子，主要表达在一些NK细胞和T细胞的表面，可分为多个亚型。其中，KIR2DL1-3和KIR3DL1通过结合MHC分子（HLA-C/HLA-B）发挥抑制作用。由于基因多态性高的特点，多个KIR基因及其配体的结合可引起多种疾病，包括自身免疫性疾病。特别是部分KIR基因与特异性配体的结合，可增加癌症的风险。在小鼠模型中，针对活化的NK细胞表面受体KIR2DS2的治疗显示出比针对传统共刺激分子更明显的抗肿瘤活性。2. NKG2ANK细胞凝集素样受体亚家族C成员1 (NKG2A)是NKG2家族的“抑制性”成员，主要在CD56 hi NK细胞、NKT细胞和CD8+αβ T细胞亚群中表达。它与CD94形成异二聚体受体，并与其配体结合，非经典的MHC I分子HLA-E，在大多数正常组织中表达。NKG2A/CD94与HLA-E的相互作用可抑制NK细胞和T细胞的激活，表明其作为免疫检查点分子的靶向性。Monalizumab (IPH2201)是一种NKG2A单克隆抗体，可阻断NKG2A与HLA-E之间的相互作用。已经在白血病小鼠模型中显示了其治疗效果。3. CD96CD96是免疫球蛋白超家族的一员，在NK细胞表面表达，并能够识别其配体CD155。研究表明，在肿瘤浸润的NK细胞中，CD96的表达水平高于周围组织中的NK细胞。特别是在肝细胞癌样本中，高水平的NK细胞CD96表达与较差的预后相关。-05-细胞免疫治疗具有细胞毒性潜能的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞，能够识别并清除感染或受损的细胞。T细胞的细胞毒性作用不同于其他细胞，因为它具有抗原特异性。细胞免疫疗法，也称为过继细胞移植（adoptive cell transfer，ACT），利用这些类型的免疫细胞的杀伤能力来治疗癌症。在此，作者讨论已经取得重大研究和临床进展的四种主要ACT类型：CAR-T细胞治疗、TIL治疗、工程TCR治疗和NK细胞治疗。1. TIL 治疗TILs是可以从肿瘤组织中识别和纯化的异质性淋巴细胞，它们的丰富程度已被发现与较好的预后相关。TILs是第一批被用于ACT的细胞之一。这些细胞可以从肿瘤中分离出来，在实验室环境中进行体外扩增，并大量重新注射到癌症患者体内以消除肿瘤细胞。TIL疗法已经在临床研究中进行了严格的测试，作者总结了TIL疗法针对不同类型肿瘤的最新进展，包括黑素瘤、肺癌、宫颈癌、转移性乳腺癌、骨肉瘤和卵巢癌。2. 工程TCR治疗 TCRs是T细胞表面的特异性受体，通过识别和结合MHC呈递的抗原来激活T细胞的分裂和分化。然而，并非所有患者都拥有可以识别肿瘤的T细胞。因此，TCR-T疗法从患者身上提取T细胞，并将这些细胞扩大，使患者拥有能够识别特定癌症抗原的新的TCR。工程TCRs的设计高度依赖于特异性肿瘤抗原的识别。一些抗原，如NY-ESO-1，在肿瘤组织中广泛表达，可用于开发TCRs治疗不同类型的肿瘤。然而，TCR可以以患者特异性的方式进行识别和合成。TIL治疗利用了瘤内淋巴细胞与全身淋巴细胞之间的差异，对患者肿瘤中特定突变的识别指导了TCRs的生成和应用，从而有效地靶向这些突变。然后，这些TCRs可以被分离、克隆并在T细胞上表达，然后这些工程T细胞在体外扩增并重新注入患者体内。这是一种高度个性化的治疗方法，增强了治疗的特异性。TCR疗法在黑色素瘤的治疗上取得了突破性进展，在肝癌、乳腺癌和卵巢癌的治疗上也取得了一定成效。然而，肿瘤细胞通过降低MHC的表达来逃避T细胞的杀伤，这对于TCR的抗原识别构成了挑战。3. CAR-T细胞治疗CAR-T细胞治疗是另一种ACT策略。与TCR-T疗法的原理相似，患者的T细胞“装备”了合成的CAR，然后这些细胞在体外扩增并重新注入患者体内，以产生肿瘤特异性免疫反应。CAR被设计用于识别肿瘤相关抗原(TAAs)，其独立于MHC呈递，因此使T细胞能够以MHC不受限制的方式识别癌细胞。图5. CAR-T细胞的结构① CAR-T细胞治疗的原理和成果：CAR-T细胞是通过在T细胞的质膜上表达肿瘤特异性CARs而产生的。CARs的结构通常包括三个部分：细胞外抗原结合域、连接体/跨膜域和细胞内信号传导域。细胞外抗原结合区是利用抗体、配体和肽的序列设计的，以便与TAAs特异性结合。跨膜结构域负责连接细胞外结合结构域和细胞内信号结构域并将其固定在细胞膜上。细胞内信号区，包括CD3-zeta结构域和共刺激结构域，将抗原识别的信号转发给细胞，介导T细胞的激活。CAR-T细胞治疗涉及合成生物学（CAR设计）、病毒技术（CAR转导）和细胞制造（CAR-T细胞扩增）的整合。CAR的引入在工程T细胞中产生了肿瘤特异性激活潜力，而体外培养和扩增允许绕过肿瘤引起的免疫抑制。因此，大量的肿瘤特异性细胞被输回病人体内。CAR-T细胞疗法对几种类型的癌症显示出有希望的临床结果。图6. CAR-T治疗的工作流程② CAR-T细胞治疗的挑战：CAR-T细胞治疗的更广泛应用仍然面临着来自不同方面的挑战。首先，当CAR-T细胞攻击肿瘤细胞时，可能会引起严重的副作用和毒性，可能是致命的。其次，一些CAR-T细胞的细胞毒性不是高度肿瘤特异性的，可能会对正常组织造成损伤。第三，大多数CAR-T细胞产品的制造过程是耗时的，这可能会导致一些患者的肿瘤在细胞生产窗口期进一步恶化。此外，CAR-T治疗血癌的长期疗效仍需长期随访观察，CAR-T细胞治疗实体瘤的应用有待进一步研究。这些挑战将决定未来整个T细胞工程领域的发展。细胞因子释放综合征(CRS)，也被称为“细胞因子风暴”，是CAR-T治疗最常见的不良反应。大多数CAR-T细胞的临床研究表明，长期疗效不确定，因为癌细胞表达的各种免疫逃逸因子导致T细胞衰老和衰竭。针对实体瘤的CAR-T细胞面临的挑战包括阻断T细胞浸润的血管疾病，有限的TAA选择和肿瘤异质性，这导致了抗原逃逸。CAR-T细胞在实体瘤中的应用需要进一步探索。③ CAR-T细胞改良的策略：利用特异性和广泛的靶向性：CAR-T细胞的长期抗肿瘤功能因输注后肿瘤复发而复杂化。考虑到CAR-T治疗后抗原逃逸的风险，设计针对多个TAAs的双特异性CAR-T是可以采用的。提高CAR-T细胞的适应度，包括活化潜能、增殖能力和生存能力，延长CAR-T细胞在患者体内的生存时间，是提高临床疗效的关键方向之一。降低制造成本：所有批准的CAR-T细胞疗法都使用自体T细胞来产生治疗产品。生产这种高度个性化的疗法需要很高的成本。除了高成本外，CAR-T细胞疗法的质量和稳定性一直是人们关注的主要问题。自体T细胞在质量和数量上不一致，特别是在接受过大量放疗和化疗的患者中。毒性控制：CAR-T细胞治疗显示的毒性和副作用表明需要制定一些控制程序来调节CARs的活性。大量的方法已经被用来控制CAR-T细胞的安全性; 其中包括通过安装自杀开关快速清除注入的细胞，这种开关可以由小分子或抗体控制。常用的自杀开关包括诱导型caspase-9 (iCasp9)、单纯疱疹病毒中的胸苷激酶(HSV-TK)和自杀表位。然而，这样的自杀开关清除了所有的治疗CAR-T细胞，从而降低了抗肿瘤反应。因此，不清除CAR-T细胞的非细胞毒性可逆系统正在开发中，并具有保持细胞毒性和控制毒性反应之间平衡的潜力。 (表1)4. NK细胞治疗 NK细胞可以介导直接细胞毒性。从机制上讲，NK细胞在对抗癌症的第一道防线上发挥着关键作用，通过两种途径介导抗肿瘤作用：通过释放穿孔素和颗粒酶或死亡受体的直接细胞毒性，以及通过分泌激活APCs和T细胞的细胞因子和趋化因子的调节作用。因此，除了本文前面讨论的以NK细胞上的ICs为靶点的药物外，利用NK细胞的ACT也在快速发展中。与T细胞类似，NK细胞也可以转导表达CARs。CAR-NK细胞的发展紧随CAR-T细胞治疗的演变，CAR-NK细胞往往直接采用CAR-T细胞的设计。许多临床前研究已经证实了CAR-NK细胞针对其他类型肿瘤的抗肿瘤活性。由于NK的细胞毒性是由 "缺失自我"的识别引发的，因此NK细胞尤其具有杀死MHC下调的肿瘤细胞的能力。NK细胞对病毒感染的细胞也有特殊的杀伤能力，因此特别适合于治疗HPV或EBV相关的肿瘤。NK细胞毒性可受多种免疫抑制机制的影响，包括IL-10，吲哚胺2,3-双加氧酶，前列腺素E2，转化生长因子β (TGF-β)和缺氧。增强NK细胞的细胞毒性和在体内的持久性被认为是推进NK治疗的主要方向。支持NK细胞维持的细胞因子：IL-15已被确定为增强NK细胞活性的关键细胞因子。在黑色素瘤、结直肠癌、淋巴瘤和肺癌等癌症的同基因小鼠模型中，IL-15的注射具有良好的耐受性，并促进NK细胞的扩增。随着对NK细胞活化和维持的研究越来越深入，未来的治疗方法不仅必须产生肿瘤特异性NK细胞，还必须增加其在体内的持久性，以增强其治疗效力。5. CRISPR技术促进了细胞免疫治疗近年来，CRISPR/Cas9技术极大地提高了我们对肿瘤基因组学的认识，并为癌症免疫治疗做出了贡献。使用该基因组编辑系统，可以进一步改造治疗性免疫细胞，以增强肿瘤识别并减少衰竭。CRISPR/Cas9技术使研究人员能够有针对性地编辑T细胞或NK细胞中的基因，从而调节细胞的免疫活性和抗肿瘤功能。通过CRISPR/Cas9技术，可以实现对免疫细胞中与抗肿瘤功能相关的基因的精确编辑，例如增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别能力、提高细胞毒性效应、增强细胞的存活能力和增殖能力等。此外，CRISPR/Cas9技术还可以用于研究免疫逃逸机制、抗原识别和免疫调节等方面的基础研究，为癌症免疫治疗的进一步优化提供了重要的工具和理论基础。图7. 基于CRISPR技术的免疫治疗工作流程-06-来自ICB和CAR-T细胞的免疫治疗生物标志物1. ICB的生物标志物PD-L1被作为抗PD-1治疗的第一个生物标志物，已经被纳入pembrolizumab的处方指南中。目前，与免疫疗法疗效相关的常见或潜在的生物标志物主要分为以下几类，根据其获取途径和类型不同：(i) 表面标志物，包括PD-L1和其他一些抑制性受体，可以通过免疫组化检查肿瘤组织获得。(ii) 基因生物标志物，如肿瘤突变负荷（TMB）、错配修复系统缺陷（dMMR）、高微卫星不稳定性（MSI-H）、新抗原和抗原呈递途径的突变等，需要进行肿瘤基因组分析来获取。(iii) 循环肿瘤DNA（ctDNA），可以通过外周血样本分析获得。这些生物标志物中的一些已经通过III期临床试验验证，并在临床实践中得到广泛应用。2. CAR-T细胞治疗的生物标志物    生物标志物对于癌症临床治疗具有重要意义，它们可以用来确定适合CAR-T治疗的患者、预后、治疗反应预测和监测疾病进展。CAR-T治疗的第一个生物标志物是CD19，一种主要在恶性B细胞上表达的B细胞表面蛋白。      目前，正在根据免疫治疗的阶段寻找不同的生物标志物，包括确定患者基线状态的生物标志物、CAR-T细胞功能、CAR-T细胞耗竭、CAR-T细胞毒性的生物标志物以及癌症预后、反应和复发的生物标志物。基线生物标记物包括细胞因子，如IL-2、IL-5、IL-7、TNF-α等；乳酸脱氢酶（LDH）和CD9细胞已被广泛应用。     对于CAR-T细胞功能，提出了以下生物标志物：CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD25、CD127、CD57和CD137。目前，还没有成熟的生物标志物可用于评估患者输注后的CAR-T细胞耗竭。一些间接参数可能有助于实现这一目的，如PD-1、LAG-3、TIM-3等抑制性受体的高水平表达。      尽管CAR-T治疗取得了重大进展，但仍有必要继续探索不同癌细胞类型特异性的生物标志物，以开发更特异的治疗方法。到目前为止，尚未有生物标志物被用于指导患者的治疗，但一些CAR-T细胞的内在和外在因素显示出与治疗反应相关的趋势。肿瘤抗原的表达是其中最为关键的因素。作为一种靶向治疗，CAR-T细胞需要在肿瘤细胞上表达靶向抗原以诱导T细胞的活性。由于肿瘤抗原逃逸是CAR-T细胞治疗后肿瘤复发的主要机制，一些研究发现，虽然下调了靶向抗原的表达，但并未完全丧失，而是抑制了CAR-T细胞的功能。尽管CAR-T细胞可以被设计成增加其对低水平靶向抗原的敏感性，但靶向抗原的表达密度可能成为一种预测性的生物标志物。-07-其他类型的免疫疗法肿瘤疫苗：预防性肿瘤疫苗可预防某些癌症的发展，如HPV疫苗预防宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和尖锐湿疣，以及HBV疫苗预防肝癌。治疗性肿瘤疫苗以肿瘤抗原的形式注射自由肽或载体到APC上，以激活免疫细胞，恢复其自主抗肿瘤能力。在临床前模型中，治疗性肿瘤疫苗已被证实可以防止癌症的生长和转移，并减少终止其他类型治疗后的复发。肿瘤疫苗主要分为四种类型：肿瘤全细胞疫苗、基因工程疫苗、蛋白肽疫苗和树突状细胞疫苗。新抗原和免疫疗法：新抗原是存在于癌细胞上的蛋白质片段，提供了一种实现癌细胞特异性靶向的新方法。新抗原疫苗是根据患者的特定肿瘤情况定制的。生产新抗原疫苗的一般步骤包括：（1）肿瘤活检，即从患者身上提取肿瘤样本进行基因组纯化；（2）对肿瘤细胞和正常细胞的全外显子组测序，使研究人员能够寻找肿瘤细胞中独特的突变；（3）特异性新抗原的预测和筛选；（4）开发个性化疫苗，这是基于预测的新抗原，可以通过多种方法实现，包括多肽、mRNA和树突状细胞。最关键和最具挑战性的一步是患者特异性新抗原的鉴定。溶瘤病毒：有额外病毒感染的癌症患者通常病情恶化。然而，病毒也可以被修改为专门针对癌细胞。这些“溶瘤病毒”通过基因组编辑和大规模筛选产生，其解读包括对癌细胞的裂解能力，同时保留正常细胞。由此产生的溶瘤病毒抗原可以复制并随后溶解肿瘤细胞，向肿瘤部位释放更多的病毒颗粒。因此，小剂量的病毒可以在体内扩增。溶瘤病毒具有介导肿瘤抗原扩散的能力，可导致浸润肿瘤的淋巴细胞增多，增强了ICB治疗的抗肿瘤疗效。另一种方法是使用溶瘤病毒作为载体，结合细胞免疫治疗。通过额外的基因工程，病毒的细胞溶解功能可以被抑制，同时允许合成分子的表达。-08-靶向抑制性的肿瘤微环境巨噬细胞：作为先天免疫系统的“士兵”，清除了受损、衰老和危险的细胞。然而，在癌症中，巨噬细胞促进了肿瘤的免疫逃逸，已成为药物开发的一个重要领域。巨噬细胞具有多种功能，包括清除细胞碎片和病原体，以及调节炎症反应。它们也是高度可塑性的细胞，可以根据微环境刺激和信号从一种表型转换到另一种表型。巨噬细胞的激活状态通常分为两类：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。某些M2型巨噬细胞亚群参与促进肿瘤进展和介导免疫抑制。从机制上讲，已发现肿瘤将单核细胞和巨噬细胞招募到肿瘤微环境（TME），并将它们极化为M2型表型。巨噬细胞靶向癌症治疗的中心目标是将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）重编程为促炎（抗肿瘤）亚型。图8. M1和M2巨噬细胞的特性TAMs上的抑制和刺激分子：对TAMs的最成熟的干预方法之一是阻断集落刺激因子-1（CSF-1，也称为M-CSF）/CSF1R轴。这种干预可以减少TAMs的数量，也可能导致TAMs向M1型表型的再极化。另一个影响TAMs致瘤功能的分子是TGF-β，它是一种抗炎分子，通常在损伤修复过程中由巨噬细胞表达。在小鼠模型中，阻断TGF-β并同时使用STING激动剂治疗可以通过上调I型干扰素的表达来导致肿瘤的消退。Toll样受体（TLRs）参与先天免疫感应。TLR激动剂可以增加单核细胞的招募/浸润，并促使巨噬细胞向促炎性表型转化。此外，TAMs也表达CD40，而CD40激动剂的使用可以防止肿瘤的生长并减弱其抗药性。这些抑制性（CSF1R、TGF-β）和刺激性（TLRs、CD40）分子都可以用来恢复TAMs的促炎性功能。CD47，又称整合素相关蛋白，属于免疫球蛋白超家族。它通过与巨噬细胞或树突状细胞表面的信号调节蛋白α（SIRPα）结合，调节细胞的增殖、迁移和凋亡。在大多数肿瘤细胞表面，CD47被过度表达。阻断CD47/SIRPα通路可以诱导巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，这一点已在小鼠异种移植模型中得到证实。工程巨噬细胞：巨噬细胞治疗的发展需要增加靶向激活受体和更持久的M1巨噬细胞极化方法。利用基因修饰增强巨噬细胞的抗肿瘤能力逐渐引起了人们的关注。一个直接的策略是通过耗尽抑制信号，如SIRPα来增强巨噬细胞的功能。研究表明，SIRPα缺失的巨噬细胞在联合放疗中具有抗肿瘤作用。另一种方法是设计巨噬细胞表达CARs（CAR-Ms）。CAR-Ms能够诱导周围肿瘤微环境的促炎特征。值得注意的是，即使存在M2型巨噬细胞，CAR-Ms的肿瘤杀伤能力也不受影响，这突显了其对肿瘤微环境免疫抑制的抵抗力。此外，CAR-Ms还表现出更强的T细胞刺激能力，能够在吞噬肿瘤细胞后向T细胞呈递抗原，从而招募静止和激活的T细胞到肿瘤部位。图9. CAR-M治疗的多效抗肿瘤机制靶向骨髓来源抑制细胞（MDSCs）：MDSCs起源于造血干细胞（HSCs），是骨髓造血功能改变的结果。这种短暂的骨髓增生在刺激物被移除后会终止，骨髓细胞的平衡也会随之恢复。然而，在慢性炎症、癌症和自身免疫性疾病中，持续的骨髓造血可能发生，以防止宿主广泛的组织损伤，不断产生IMCs。这些细胞具有明显的特征，如不成熟的表型和形态，相对较弱的吞噬功能，以及抗炎和免疫抑制功能。异常的骨髓细胞对其他免疫细胞有抑制作用。因此，人们采用表面标志物Gr-1和CD11b来定义这些免疫抑制性骨髓细胞。在人类中，这些骨髓细胞的表型特征是CD34、CD14和CD15的表达，功能特征是它们能够抑制T细胞的激活。MDSCs可大致分为粒细胞（G-MDSCs或PMN-MDSCs）和单细胞（M-MDSCs）亚型。MDSCs的存在是肿瘤进展的基本特征之一。MDSCs发挥多种功能，影响T细胞、Treg细胞、DC细胞和NK细胞。目前，MDSC靶向治疗大致可分为五种类型：(i) 抑制MDSCs扩张和招募的疗法；(ii) 恢复正常骨髓分化的疗法；(iii) 针对MDSCs上IC分子的疗法；(iv) 阻断MDSCs分泌的抑制性分子的疗法；(v) 直接耗尽MDSCs的疗法。图10. MDSCs的功能靶向B细胞：肿瘤相关B细胞（TABs）在肿瘤环境中具有促炎和抗炎功能，其丰度与黑色素瘤对免疫检查点抑制剂（ICB）治疗的耐药性相关。TABs富集于肿瘤组织的第三淋巴组织结构（TLSs）中，可被激活以识别癌细胞。在肺癌（NSCLC）患者中，肿瘤中TABs水平较高的患者更可能对免疫治疗产生积极反应。色氨酸代谢酶IDO过度表达于多种肿瘤中，其作用是将色氨酸转化为犬尿氨酸。肿瘤抑制基因BIN1对IDO的表达有负向调节作用。在小鼠模型中，BIN1的耗尽已被证实可诱导IDO的表达并抑制免疫反应。IDO可增强癌细胞的迁移能力，抑制肿瘤被T细胞的识别和清除。IDO的靶向药物在临床前模型中单药治疗显示出疗效，但与靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1的ICB联合使用可能更有效。目前，正在进行临床研究的主要IDO抑制剂包括indoximod、navoximod、epacadostat和BMS-986205。图.肿瘤产生色氨酸代谢酶或是新免疫治疗靶点IL-41可增强肿瘤的侵袭性，抑制抗肿瘤免疫。因此，靶向IL-41可能是一种新的免疫治疗途径。腺苷是RNA合成的重要组成部分，但也被证明可以抑制T细胞在肿瘤微环境中的功能。CD39是一种参与细胞外腺苷产生的酶，在多种人类肿瘤中高度表达。TME中CD39的表达水平升高，包括血管内皮细胞、成纤维细胞和一些免疫细胞。CD39在多种免疫细胞中发挥重要作用。因此，CD39联合ICB可能成为一种新的肿瘤免疫治疗方式。-09-结论和展望这篇文章系统性地回顾了肿瘤免疫治疗的历史，并深入探讨了癌症免疫治疗的各种策略，包括免疫检查点抑制剂和刺激性分子的靶向药物、细胞免疫治疗以及抑制性肿瘤微环境的靶向策略。此外，作者还讨论了与免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞治疗相关的临床疗效所涉及的生物标志物。总的来说，肿瘤免疫学的研究结合了先进的免疫细胞技术，为未来癌症免疫治疗的发展指明了方向。这需要更多临床和基础研究项目的整合，以全面分析未满足的临床需求，并指导未来的研究方向。参考资料：[1]Wang DR, Wu XL, Sun YL. Therapeutic targets and biomarkers of tumor immunotherapy: response versus non-response. Signal Transduct Target Ther. 2022 Sep 19;7(1):331. doi: 10.1038/s41392-022-01136-2. PMID: 36123348; PMCID: PMC9485144.文章信息源于公众号医世象，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

中文摘要近年来，过继性细胞免疫疗法在肿瘤治疗方面展现出了显著的临床效果。T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞是临床常用的过继性免疫细胞，并且在淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗中已经取得了良好的效果。通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）催生了CAR-T和CAR-NK细胞疗法。CAR-T和CAR-NK细胞可高效识别肿瘤抗原且肿瘤细胞杀伤效果较好，在多种癌症研究中均有满意的结果，已经成为一个炙手可热的领域。此文对基于CAR修饰的免疫细胞疗法的发展与应用进行概述，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。正文1细胞免疫治疗肿瘤生物治疗是一种新兴肿瘤治疗模式，主要包括肿瘤免疫治疗、溶瘤病毒治疗、干扰小RNA技术疗法等。肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤，比传统的肿瘤治疗方法更加安全并且具有特异性，对晚期肿瘤具有显著的疗效。肿瘤免疫治疗包括4大类：过继性细胞免疫疗法、肿瘤疫苗、非特异性免疫刺激以及免疫检查点单克隆抗体。其中过继性细胞免疫疗法是目前研发热点，也是肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之一，其具体过程是通过对自体或异体免疫细胞进行体外激活或基因修饰，扩增出足够的具有抗肿瘤活性的免疫细胞后回输给患者。过继性免疫细胞主要包括T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、肿瘤浸润淋巴（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）细胞、淋巴因子激活的杀伤（lymphokine-activated killer，LAK）细胞、细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）等几大类。将免疫细胞的杀伤活性与抗体的特异性相结合，通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）使其靶向表达特定抗原的肿瘤细胞，推动了CAR-T和CAR-NK细胞疗法的发展。CAR是CAR-细胞的核心部分，它使细胞能够不依赖于HLA而通过CAR结构识别更广泛的肿瘤靶抗原。CAR基本结构包括肿瘤相关抗原结合域、通常来自单克隆抗体的抗原结合区域的单链抗体（single chain variable fragment，scFv）、胞外铰链域、跨膜域和胞内信号域。scFv可以与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原紧密结合，这决定了 CAR结构的特异性。铰链域是细胞外区和跨膜域之间的连接序列，它给予CAR充分的定向性和灵活性来与肿瘤抗原结合，会影响CAR-细胞的活性。跨膜域位于铰链和胞内信号域之间，包括CD3 HLA-A2或CD28。胞内信号域的结构决定了CAR-细胞激活信号的强度，其中包含免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。目前最经典的胞内结构域是CD3 ITAM的激活区。为了提高CAR修饰的效应细胞的增殖和细胞毒作用，可在胞浆尾部加入共刺激蛋白受体，如CD28、4-1BB、CD134、ICOS等。针对CAR结构的研究除了选取合适的靶向位点scFv，很多研究专注于作为CAR-细胞功能关键区域的胞内信号域，目前已经发展了4代。第1代CAR介导的细胞激活仅通过CD3ζ链完成，抗肿瘤活性有限。第2代CAR在胞内结构域中增加了1个新的共刺激信号，包括1条CD3ζ链和1个共刺激分子对CD3ζ链的信号进行放大，并与其具有相同的抗原特异性，增加了细胞增殖、细胞因子分泌和抗凋亡蛋白的分泌。广泛使用的共刺激分子有 CD28、4-1BB和 CD134（OX40）等。第3代CAR包括1条CD3ζ链和2个或2个以上不同的共刺激分子，使其抗肿瘤效应进一步提高。第4代CAR则通过基因修饰分泌特定的细胞因子或表达额外的共刺激配体增强CAR-细胞的疗效，同时引入了自杀基因系统控制CAR-细胞活性，必要时激活使CAR-细胞凋亡，防止对自体造成损害。CAR结构在免疫细胞中的广泛应用，引导免疫细胞特异性靶向识别肿瘤抗原并介导免疫细胞的激活，从而提高了过继性免疫疗法的适用性和有效性。CAR-细胞对血液肿瘤的治疗具有良好的效果，在实体肿瘤的治疗上也取得了一定的进展，表1中列出了近期CAR-细胞治疗的临床研究。本文对CAR-细胞疗法发展与现阶段应用进行概述，并对不同种类的CAR-细胞治疗的特点及优势进行总结，分别介绍了各自的潜力及应用，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。2CAR修饰的T细胞2.1CAR-T细胞概述T细胞在细胞介导的免疫应答中起着关键作用，参与监测和杀死肿瘤细胞或潜在的恶性细胞。基于T细胞的过继免疫疗法治疗恶性肿瘤，特别是血液病癌症效果显著。这种新出现的治疗包括3个模型：TIL、T 细胞受体（T cell receptor，TCR）修饰的T细胞（TCR-T）和CAR-T。与CAR-T疗法相比，前两种技术并没有对T细胞本身进行大的修饰，疗效并不显著，较低的成功率以及对疫苗的依赖也限制了它们的发展。作为一种很有前途的过继免疫治疗方案，CAR-T细胞疗法已接受了超过25年的时间考验，能够识别和消除特定的癌细胞，独立于 MHC。现阶段全球范围已开展的临床试验以第2代CAR-T为主，以CD28或CD137共刺激域构成。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持得更久。此外，由于CAR-T细胞常常无法进入肿瘤内部，因此主要用于治疗血液系统肿瘤，在实体瘤的治疗中还未见显著的成效。第4代CAR-T细胞在CAR的设计中添加了细胞因子或者趋化因子的受体结构，从而增加T细胞在肿瘤组织中的浸润，以达到增强杀伤实体瘤的效果。2.2CAR-T细胞在抗肿瘤治疗中的应用美国FDA共批准了 5款CAR-T细胞产品上市，分别是瑞士诺华公司的Kymriah用于治疗急性B 淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）、美国吉利德公司的Yescarta用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）以及Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、美国百时美施贵宝公司的Breyanzi用于治疗复发或难治性（ralapsed/refractory，R/R）大 B 细胞淋巴瘤（R/R large B cell lymphoma，R/R LBCL）、美国百时美施贵宝公司和Bluebird Bio公司共同研发的Abecma用于治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。中国有2款CAR-T细胞产品获批上市，分别为上海复星凯特生物科技有限公司的阿基仑赛注射液用于治疗成人R/R LBCL、上海药明巨诺生物科技有限公司的瑞基仑赛注射液用于DLBCL。上述产品中除Abecma为APRIL靶点外，其余都是CD19靶点。随着大量临床研究的开展，针对不同靶点的CAR-T细胞还有望应用于急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）、MM及实体瘤等。目前治疗ALL，特别是高病死率的R/R B-ALL最适合的方法就是CAR-T细胞治疗，其中最有效的是抗CD19抗体CAR，CD19是B细胞的重要生物标志物，在B-ALL中有较高的表达。尽管CD19是CAR-T细胞治疗ALL的理想靶点，但研究发现“抗原逃逸”是免疫疗法发展的潜在障碍，当务之急是进行优化，包括识别其他靶点。CD22是CAR-T细胞的另一个潜在靶点，2种不同的抗CD22药物已经在临床试验中用于治疗B-ALL，以弥补抗CD19治疗的不足。由于CLL发病机制导致早期免疫缺陷，因此CAR-T细胞治疗的疗效受到来自CLL患者的T细胞体外扩增困难及体内增殖反应的限制。Ibrutinib是一种不可逆的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，它不仅可以避免对T细胞的负面影响，还可以提高其抗肿瘤能力。有研究表明，5个周期的Ibrutinib治疗增强了靶向CD19的第2代CAR-T细胞（CTL019）的扩增，并降低了程序性细胞死亡蛋白1在T细胞上的表达；同时增加了 B细胞中CD200的表达，而CD200/CD200受体在调节抗肿瘤免疫方面发挥重要作用。CAR-T细胞是治疗R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）的最新免疫疗法，除抗CD19 CAR-T细胞外，4次跨膜蛋白CD20出现在90%以上的BCL中，是公认的NHL治疗靶点。目前，第1代抗CD20 CAR-T细胞治疗已经在一些研究中使用。CD30是TNF受体（TNF receptor，TNFR）超家族的成员，也可以作为淋巴瘤治疗的潜在靶点。在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）中，它是Ki-1抗体的抗原，与里德-斯德伯格细胞结合。CD30阳性淋巴细胞主要分布在淋巴组织的滤泡区周围，而在生发中心不常见。对于淋巴瘤，CD30在经典的HL、间变性大细胞淋巴瘤、DLBCL、原发性纵隔BCL和外周T细胞淋巴瘤中表达。有研究报道，靶向CD30的CAR-T细胞在经高强度淋巴清除预处理后的R/R HL患者中表现出显著的抗肿瘤活性和较低的毒性。MM是一种骨髓来源的难治性恶性肿瘤，由于骨髓瘤的异质细胞遗传学和分子异常原因，这种疾病仍然无法治愈。膜蛋白CD138属于硫酸肝素蛋白聚糖的Syndecan家族，在恶性和分化的浆细胞表达，也存在于肿瘤、成熟的上皮细胞和其他正常组织中。由于CD138在几乎所有MM患者中都有表达，因此被用作主要诊断标志物。临床试验结果显示，使用第2代抗CD138 CAR-T细胞治疗5例难治性MM患者后，4例病情稳定，1例晚期浆细胞白血病患者外周血骨髓瘤细胞减少，这表明CAR-T细胞已经进入骨髓。由此可见，抗CD138 CAR-T细胞治疗MM具有良好的耐受性和潜在的抗肿瘤免疫效果。2.3CAR-T细胞面临的挑战CAR-T细胞治疗面临的主要问题是如何提高过继性细胞的有效性和持久性，以及减少治疗的不良反应。为了增强治疗效果，可以通过添加新的共刺激域或CAR部分来提高CAR-T细胞的有效性和持久性。糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR）即CD357和4-1BB都是核因子-κB诱导的TNFR超家族成员，而GITR是组成性表达于T细胞的共刺激分子，添加该结构域或结合CD28和4-1BB可以进一步增强T细胞的作用。对于淋巴瘤、MM和其他类型的恶性肿瘤中存在的抗原逃逸或多种肿瘤抗原共存现象，重建CAR部分是一种新的方法。双特异性CAR-T细胞是很有前途的治疗方法，它包括2种形式：（1）1个CAR由2个不同的scFv组成（TanCAR），或者2个不同的CAR在1个T细胞上连接不同的scFv（双信号CAR）；（2）依次或同时注入不同类型的CAR-T细胞池。此外，使用带有趋化因子基因的溶瘤病毒招募CAR-T细胞，可延长它们的持久性并直接攻击肿瘤细胞。这是一种很有前景的方法，可用于血液系统恶性肿瘤的检测。溶瘤病毒可以感染宿主，复制并破坏某些肿瘤细胞，而不伤害正常细胞。有证据表明，肿瘤细胞可以通过MHCⅠ在其细胞质中整合呈递新病毒蛋白，被CD8+ T细胞识别和摧毁。使用黏液瘤病毒、5型腺病毒和柯萨奇病毒A组21型等病毒杀灭这种类型的肿瘤细胞的应用已在MM中报道。在CAR-T细胞治疗过程中，避免失控的T细胞增殖、细胞因子风暴或靶向/非靶向肿瘤效应至关重要，可以激活自杀基因（也称为消除基因）系统来破坏注入的CAR-T细胞，调节CAR-T细胞的扩增并限制毒性。目前，单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因治疗在同种异体造血干细胞背景下已经显示了其安全性和有效性；其他非免疫原性自杀系统，如经过修饰的内在凋亡途径中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9，Cas9）也已经被开发出来。然而，这种自杀策略是通过彻底消除CAR-T细胞来缩短治疗时间。“可转换的”CAR-T细胞弥补了这个缺陷，通过在scFv和T细胞表面之间插入一个小的分子复合物来启动细胞功能并通过停止添加它来关闭细胞功能。另一种切换细胞开启和关闭的方法是设计可溶性细胞间分子，包含肿瘤抗原特异性抗体，通过改变中间分子的浓度来改变细胞功能。CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病，特别是ALL、CLL和淋巴瘤取得了很大的进展，而有效性、细胞持久性和不良反应成为广泛应用的瓶颈，需要更加创新的实验室研究来加强该疗法的有效性。3CAR修饰的NK细胞3.1CAR-NK细胞概述NK细胞是机体内天然免疫系统的核心细胞。与T细胞不同，NK细胞对靶细胞的识别不依赖于MHC的表达，而是依赖于其表面杀伤细胞激活受体和杀伤细胞抑制受体（killer inhibitory receptor，KIR）间的动态平衡。当NK细胞表面的KIR识别出自身MHCⅠ的时候，NK细胞会主动失活，保护宿主细胞不受误攻击；在MHCⅠ改变、缺失或表达较低的肿瘤细胞中，KIR介导的抑制作用减弱，NK细胞以“缺失自我标记”为靶点对肿瘤细胞造成杀伤。NK细胞的杀伤作用主要体现在，NK细胞可以直接释放穿孔素和颗粒酶B，执行诱导靶细胞凋亡的作用；同时，NK细胞可以分泌大量细胞因子，如TNF-a、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN-γ、IL-3等，对靶细胞起到直接作用，或激活其他种类的免疫细胞对靶细胞进行攻击；NK细胞还能表达Fas配体和TNF相关调亡诱导配体，使靶细胞进入程序性凋亡；最后，NK细胞通过其表面CD16与靶细胞表面的抗原决定簇特异性结合从而发挥抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）作用。除了具有强大的杀伤功能外，NK细胞还具有很强的免疫调节功能，分泌多种共刺激分子，募集和激活其他免疫细胞，如DC和巨噬细胞，间接帮助消灭靶细胞，从而调节机体的免疫状态和免疫功能。目前NK细胞所用CAR结构大多沿用自CAR-T细胞。大多数CAR-NK细胞使用CD3-ITAM作为信号转导区域进行信号转导，并利用CD3-ITAM启动NK细胞杀伤。CD3ζ二聚体可以传递来自CD16的信号，从而有助于ADCC作用。除单一的CD3型ζ链之外，胞内信号区还包括共刺激结构域，如CD28、CD137（4-1BB）或CD244（2B4）等分子，具有很好的信号转导效应，有助于CAR-NK细胞的杀伤作用。不同的共刺激分子对NK细胞的作用也不同，如在ALL异种移植小鼠模型中，CD244对CAR-NK92细胞的刺激作用强于CD137，可以募集并激活酪氨酸激酶启动激活信号，可能更适合作为CAR-NK细胞的胞内信号域。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有多种优势。首先，NK细胞易分离，寿命较短，体内转移的CAR-NK细胞不易过度增殖，导致移植物抗宿主病（graft versus-host disease， GVHD）的风险低。其次，NK细胞分泌的细胞因子主要包括IFN-γ和GM-CSF，比活化CAR-T细胞释放的细胞因子如TNF-а、IL-6、IL-2、IL-8 等更加安全，这些由CAR-T细胞产生的促炎细胞因子可能导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性。除了以CAR依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞外，CAR-NK细胞还能以CAR非依赖的方式消除癌细胞，发挥自身天然的杀伤肿瘤细胞的活性，如通过激活NK细胞受体NCR、NKG2D、共刺激受体DNAM-1（CD226）和某些激活的KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4 ）等上调被激活。其次，CAR-NK细胞可以通过表面的CD16介导ADCC作用清除肿瘤细胞。CAR-NK细胞拥有CAR依赖和NK细胞受体依赖的双重杀伤机制，可以有效根除一些不表达CAR所靶向抗原的异种肿瘤。最后，NK细胞可从PBMC、NK细胞系和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等中直接获取，价格更加便宜。CAR-NK细胞中的NK细胞可以从多种来源大规模生产，包括NK-92细胞系、外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）、脐带血（umbilical cord blood，UCB）、CD34+ 造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）和iPSC。目前大多数CAR-NK细胞的临床试验使用的NK92细胞系在体外具有无限的增殖能力，对反复冻存、解冻的敏感性降低，使生产时间更短，成本更低。然而，NK92细胞系为肿瘤细胞系，具有潜在致瘤风险，缺乏CD16和NKp44的表达，且在输注前需要辐照而失去体内扩增潜力。PBMC是NK细胞的重要来源，GVHD风险低，可以从健康捐赠者PBMC中分离出足够数量的NK细胞，其中90%是成熟表型的CD56dimCD16+ NK细胞，细胞毒作用更强但增殖能力下降，且这种来源的CAR-NK细胞无需辐照处理。同样的方法也适用于从UCB分离NK细胞。UCB的优势是可以选择具有特定HLA类型和特定NK细胞受体特征的供者。然而，UCB单位体积有限，NK细胞数量较少、表型不成熟，黏附分子CD16、穿孔素和颗粒酶B的表达减少，NKG2A等抑制受体表达增加，使获取足够数量的临床级NK细胞成为挑战。同时，PBMC和UCB来源的CAR-NK细胞由不同供者提供，使产品很难标准化。从CD34+ HPC中分化NK细胞是获得大量临床级成熟NK细胞的另一种途径。CD34+HPC可以从骨髓、胚胎干细胞或UCB中分离，在培养系统中扩增和分化为成熟的NK细胞。除上述来源外，iPSC由于可以更有效地设计以稳定表达CAR而成为新兴的CAR-NK细胞来源，从单个CAR-iPSC细胞出发就足以分化为大量高度同源的CAR-NK细胞产品用于临床，为CAR-NK细胞提供了一种可再生的来源。然而，与UCB NK细胞类似，iPSC来源的NK细胞通常表型不成熟。3.2CAR-NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用使用非CAR工程化的NK细胞进行免疫治疗已显示出良好的效果，而用基因工程化的CAR-NK细胞可以提高临床疗效。在恶性淋巴肿瘤的临床研究中，CD33和CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的靶点。Tang等首次将CAR-NK-92细胞应用于临床试验。他们构建了包含CD28和4-1BB共刺激分子在内的第3代慢病毒载体，并在CD33的scFv和CD28之间插入Fc片段来检测转导的CAR-NK细胞。用上述构建的CD33-CAR载体转导经改造的能够表达IL-2的NK-92-MI细胞，并确认转导效率达90%以上。经过符合GMP级生产要求的细胞转导与培养后，CD33-CAR-NK-92细胞在体外对人早幼粒白血病细胞系HL-60展现了良好的杀伤作用。接着，他们对3例R/R急性髓系白血病（acute myloid lymphoma，AML）患者进行挽救化疗，没有观察到明显的不良反应，证明以5×109个CD33-CAR-NK-92细胞剂量进行输注并辐照是安全的。输注后，患者的血液中能够检测到CAR-NK-92细胞。Liu等对11例R/R NHL或CLL患者进行了UCB来源的HLA不相合的抗CD19-CAR-NK细胞治疗。将携带抗CD19、CD28跨膜区和CD28ζ信号内域的scFv的逆转录病毒载体与人IL-15基因和可诱导的Cas9自杀基因结合，导入UCB来源的NK细胞。体外扩增CAR-NK细胞，并在淋巴清除化疗后对患者进行一次性输注，未观察到明显的GVHD和CSF。在接受治疗的11例患者中，8例恶性肿瘤有一定程度的缓解，其中7例得到完全缓解。输注后的CAR-NK细胞可以扩增并维持一定水平至少12个月。这些已应用于临床的CAR-NK细胞治疗方案展现了 CAR-NK细胞对B细胞系恶性肿瘤的抗癌作用是有效且安全的，且疗效均强于非CAR-NK细胞治疗。临床前研究表明CAR-NK细胞具有很强的抗肿瘤功能，但在实体瘤中的临床应用尚处于起步阶段。目前有多项临床前试验研究CAR-NK细胞疗法治疗多发性实体瘤的疗效，如神经母细胞瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等。Liu等用表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为治疗三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的靶点，研究了EGFR-CAR-NK细胞在体内外对TNBC细胞的杀伤作用。将抗EGFR scFv的DNA片段克隆至带有CD8较链、CD28跨膜区域、4-1BB和CD3ζ胞内信号域的第3代CAR慢病毒载体中，并转导NK细胞。结果表明，EGFR-CAR-NK细胞可以被表达上调的TNBC细胞激活，并在体外特异性地触发TNBC细胞的裂解，并对小鼠体内乳腺癌细胞来源的异种移植和患者来源的异种移植肿瘤均有抑制作用。除此之外，EGFR-CAR-NK细胞可通过同时触发TNBC细胞凋亡来提高疗效，表明EGFR-CAR-NK细胞对治疗TNBC是有潜力的治疗策略。Cao等也以间皮素（mesothelin，MSLN）作为治疗胃癌的靶点，将抗MSLN 的 scFv （NKG2D跨膜区，结合 2B4-CD3 胞内信号结构域）克隆到慢病毒载体中，并转导NK-92细胞得到MSLN-CAR-NK细胞。结果表明，MSLN-CAR-NK细胞在体外对MSLN阳性的胃癌细胞具有特异性杀伤作用。此外，与非CAR工程化的NK-92细胞和CD19-CAR-NK细胞相比，MSLN-CAR-NK细胞可分泌更强的细胞因子，并可以有效清除小鼠体内皮下和腹膜肿瘤模型的胃癌细胞，对异种移植的胃癌具有较强的抗肿瘤和NK细胞浸润能力，显著延长了小鼠的存活时间，证明针对胃癌的MSLN靶点是非常具有潜力的。CAR-NK细胞具有很大的临床应用潜力，进一步的研究正在将CAR-NK细胞治疗的临床前结果转化至临床。3.3CAR-NK细胞面临的挑战CAR-NK细胞疗法是近年来发展起来的一种治疗肿瘤的免疫治疗方法，尽管在临床前研究中取得了不错的进展，但CAR-NK疗法的临床应用仍处于起步阶段，并面临着一些挑战。我们希望通过对当前挑战进行阐述，并讨论未来的改进方法，以改善临床环境下的CAR-NK的治疗结果。NK细胞的扩增是CAR-NK细胞生产的重要步骤之一，需要大量的CAR-NK细胞才能达到最佳的临床疗效，因此产生足够数量的NK细胞仍然是CAR-NK疗法的主要挑战。多种细胞因子，如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18等已被用于体外扩增原代NK细胞，但效果有限，而在开发出合适的人造APC（artificial APC，aAPC）后可以特异性并大量扩增NK细胞。Shah等使用以K562为基质表达膜结合型IL-21的aAPC在14 d的NK细胞共培养中，使UCB NK细胞的平均扩增倍数达到了2 389倍，而仅添加IL-2的NK细胞在14 d的培养中平均扩增倍数只有20倍，表明aAPC在NK细胞扩增中具有显著的促进作用。而在Denman等的研究中，膜结合型IL-21的K562还可以延缓NK细胞的端粒缩短，而端粒缩短情况也被认为是限制NK细胞分裂能力的重要因素之一。为获得足够数量的NK细胞用于CAR转导，需要开发更多、更有效的临床级别体外扩增方法。除了扩增的挑战外，CAR-NK细胞的CAR结构以及转导过程仍面临诸多问题，同时也有很多研究正在努力解决这些挑战。由于CAR结构最先用于T细胞，而针对NK细胞的CAR最优结构的设计尚未被系统地研究。CAR结合表位的位置及其与NK细胞表面的距离可能影响与抗原的结合、免疫突触的最佳形成和CAR-NK细胞的激活，同时不同来源的NK细胞对共刺激信号要求也不尽相同。Li等通过表达特制的CAR结构，能促进由iPSC分化的NK细胞的激活，这种含跨膜NKG2D和胞内2B4结构域的构建体比CAR-T构建体性能更好。因此，针对NK细胞独特的激活受体和信号激活蛋白而定制的基于NK细胞的CAR结构潜力巨大。除此之外，目前所开发的CAR大多针对癌细胞上差异表达的非突变自身抗原，导致CAR可能与正常组织上表达的抗原非特异性结合，对健康组织也造成损害。针对这一问题，可以导入自杀基因，如诱导型Cаs9，控制CAR活性剂量；也有研究指出，如果2个单独的结构或2个胞外结构域以串联形式结合，产生双特异性CAR，细胞毒性会有效降低；split CAR构造，使用小分子的二聚化以形成功能单元。而在转导过程中，目前主流的导入CAR的方式为逆转录病毒转染。但这种方法依赖宿主细胞的分裂，NK细胞在未激活时转导效率会下降。同时，逆转录病毒转染后可能存在遗传毒性，并可能触发相关机制使NK细胞凋亡。针对这一问题，有研究指出可以使用RNA工程，NK细胞的存活率和转染效率会更高。CAR-NK细胞治疗作为一种新的过继免疫治疗手段具有巨大的潜力和可行性，但仍存在许多问题需要解决。如果这些问题得到解决，CAR-NK细胞疗法将成为对抗肿瘤的强大手段。4以iPSC为平台生产CAR-T/NK细胞4.1iPSC概述2006年，山中伸弥团队在小鼠胚胎和成人成纤维细胞中诱导多能性的4个转录因子一Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc，实现了体细胞向多能干细胞的重编程。iPSC可在体外无限扩增，并且理论上可分化成任何细胞类型，在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，同时避开了伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，是细胞疗法的理想细胞来源。iPSC体外培养时如果通过构建合适的环境，模拟体内发育过程，理论上可分化成任何细胞类型，包括T细胞和NK细胞。iPSC衍生的T/NK细胞能够为临床治疗提供同质且基因明确的细胞群体，消除了使用外周血或UCB来源的T/NK细胞时供者间的差异。此外，通过使用各种基因编辑技术，如病毒载体、转座子或成簇规律间隔短回文重复序列Cas9系统，可以对未分化的iPSC进行遗传操作以产生均一的目标细胞群细胞如CAR-T/NK细胞，这些优势使iPSC衍生的细胞成为“现货型”细胞疗法的理想细胞群。4.2iPSC衍生的CAR-T/NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用2013年，Sadelaint团队用编码二代抗CD19-CAR的慢病毒载体转导外周血淋巴细胞来源的iPSC，收获的iPSC-CAR-T细胞表现出与CAR-TCR-γẟ外周血淋巴细胞类似的抗肿瘤活性。Kanfman团队用iPSC生产的NK细胞表达的激活和抑制受体与外周血NK细胞相似，并且在体外和体内都表现出强大的抗肿瘤和抗病毒活性。为了提高CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，2018年，Kanfman团队构建了具有NK细胞特异性激活域（NKG2D-2B4ζ）的CAR-NK细胞并以PiggyBac转座子为载体将其编码基因整合至iPSC，所收获的NK-CAR（NKG2D-2B4ζ）-iPSC-NK 细胞显示出与外周血NK细胞和未修饰的iPSC-NK细胞相似的表型，并且比 T-CAR（CD28-41BBζ）-iPSC-NK细胞表现出更高的抗肿瘤活性。美国Fate Therapeutic公司以iPSC为平台生产的CAR-NK细胞和CAR-T细胞产品均已进入Ⅰ期临床研究。FT596是由iPSC衍生的CAR-NK细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT596还表达高亲和力且不可清除的CD16受体以增强ADCC，及IL-15受体融合蛋白以增加CAR-NK细胞的体内存活时间。目前公布的Ⅰ期临床试验结果显示，在接受FT596治疗的14例R/R BCL患者中，10例（71%）患者获得客观缓解，其中7例（50%）获得完全缓解。安全性方面，数据显示FT596疗法耐受性良好，未观察到神经毒性综合征、GVHD等。除了FT596外，该公司的FT500、FT516、FT538和FT576均为由iPSC衍生的NK细胞产品且都已进入Ⅰ期临床研究。FT819是首个由iPSC衍生的CAR-T细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT538完全消除了内源性TCR的表达以及GVHD。临床数据显示，FT819在体内对表达CD19的白血病和淋巴瘤细胞系具有抗原特异性的细胞毒性，与健康的供体来源的CAR-T细胞相当；骨髓评估显示，FT819能够在体内持续存在并继续表现出肿瘤清除能力。iPSC细胞系作为一种可再生细胞来源，能够大规模生产高质量的同种异体CAR-T/NK细胞，具有更高的产品一致性、现货供应和更广泛的患者可及性，有望成为未来细胞疗法领域的重要方向。4.3iPSC衍生的CAR-T/NK细胞面临的挑战iPSC衍生的NK细胞和T细胞在近几年发展迅速，提供了可以即取即用的产品，能够极大降低肿瘤免疫治疗的成本，形成一种可以提前生产、储备，具有可预期疗效的免疫细胞治疗产品。iPSC衍生的细胞治疗产品从科研端走向临床仍面临着诸多新的挑战。其中，能够在临床应用需要克服的重要挑战之一是确立符合临床使用要求的有效细胞分化策略。虽然在基础科学研究中，已经有多项实验报道可以将iPSC成功分化为T细胞和NK细胞，然而很多分化方案仍然使用了血清和滋养层细胞，存在外源因子污染的安全性风险，不符合各国药典规则。iPSC的分化策略直接影响到最后生成的T细胞或者NK细胞的表型是否与人体中自然产生的细胞相同，不同企业或机构最后生产出的细胞产品性状很可能大不相同。此外，iPSC具有无限增殖的潜力，如果未分化的iPSC被输入到患者体内，可能具有产生肿瘤的潜力。因此，需要设定安全检查或者基因工程改造策略，将这一风险最小化。目前，对iPSC衍生的细胞治疗的功能陈述还没有建立统一的标准，如何规范基于iPSC衍生的细胞治疗产品工艺的稳定性也是目前亟需解决的问题。5CAR修饰的其他免疫细胞由于肿瘤微环境（tumor micro-environment，TME）和缺乏特异性靶向肿瘤抗原，CAR-T细胞在实体瘤中的应用仍然受到严重限制，除了 NK细胞，目前针对许多实体瘤的新策略是将CAR应用到巨噬细胞、DC和CIK细胞中。巨噬细胞M1表型具有促炎和抗肿瘤活性，在2类实体瘤异种移植小鼠模型中，CAR-巨噬细胞靶向MSLN或人表皮生长因子受体2，在人红白血病细胞中表现出抗肿瘤吞噬活性，降低了肿瘤负荷，并延长了总生存期；TME中的另一个关键作用细胞是起APC作用的DC，它可以启动幼稚T细胞并重新激活记忆应答，并与细胞毒性CD8+细胞交叉呈递，促进更强的抗肿瘤应答，Suh等用4-1BB抗CD33的CAR转导了 DC，在AML模型中对其进行了测试，经CAR-T/CAR-DC治疗的小鼠AML的负担明显减少，存活率也随之增加；CIK细胞也是备受关注的一类效应细胞，其具有经典NK细胞以及CD4+和CD8+ T细胞的共同特征，可以通过多种受体识别病原体，人表皮生长因子2-CAR-CIK细胞可完全消除人肺泡横纹肌肉瘤，而野生型CIK细胞仅能实现部分肿瘤生长抑制，而且使用CAR-CIK细胞没有严重CRS或GVHD的迹象。癌症的免疫编辑和耐药性在抗癌免疫疗法中十分常见，许多癌症通过失去MHCⅠ抗原呈递机制来逃避免疫控制，高达50%的ALL和LBCL患者中都发现CD19丢失引发的免疫逃逸，这些患者在抗CD19 CAR-T细胞治疗后复发。与自体CAR-T细胞产品中的主要细胞类型αβ T细胞不同，γẟ T细胞具有先天和适应性免疫系统的特性，它们可以以不依赖MHC的方式发挥作用，具有多种杀伤机制，并将抗原交叉呈递给αβ T细胞，靶向二唾液酸神经节苷脂2（ disialoganglioside 2，GD2）的γẟ CAR-T细胞能够向肿瘤细胞迁移和抗原交叉呈递，并增强了GD2在癌细胞系中的特异性杀伤，在另一项研究中，Rozenbaum等证明γẟ CAR-T细胞能够靶向那些失去C19（即抗原阴性）的CD19白血病细胞。记忆性T细胞和Treg作为免疫细胞，因其不会引起GVHD，也被CAR修饰后用于免疫治疗。Fernandez等构建表达NKG2D的CAR-记忆性T细胞，可以靶向清除表达NKG2D配件的骨肉瘤细胞，也是一种很有前途的骨肉瘤免疫治疗方法；Treg是一种能抑制传统T细胞和其他免疫细胞功能的T细胞亚群，针对其免疫抑制特性，目前也已开发CAR-Treg疗法治疗移植排斥以及一系列自身免疫性疾病。6展望过继性细胞免疫治疗是近年来发展迅速的一种个性化免疫治疗方法。而通过基因工程改造的方式对过继性免疫细胞进行CAR修饰，进一步提高了其识别肿瘤抗原的能力和对肿瘤细胞的杀伤效果。其中CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病特别是ALL、CLL和淋巴瘤方面取得了很大的进展，但有效性、细胞持久性和不良反应成为这种方法广泛应用的瓶颈。因此很多研究尝试用CAR修饰其他免疫细胞来代替T细胞，从而提高对实体瘤的治疗效果，同时减轻不良反应。其中，CAR-NK细胞由于杀伤能力强，导致移植物抗宿主病的风险低，同时只会引起较轻的细胞因子风暴和神经毒性不良反应，是除CAR-T细胞外研究最多的CAR修饰的免疫细胞。其他相关技术如以iPSC为平台生产T/NK细胞，CAR修饰应用到巨噬细胞、DC细胞和CIK细胞中以治疗实体瘤等方面均取得了较大突破。CAR修饰的免疫细胞治疗研发具有广泛的应用前景，但有很多问题需要解决才能用于临床治疗，需要进行更多的创新工作研究。作者徐瑞升  陈玉莹  李奇林  谭文松  蔡海波华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237通信作者：蔡海波，Email：caihaibo@ecust.edu.cn引用本文：徐瑞升，陈玉莹，李奇林，等.  基于嵌合抗原受体修饰的免疫细胞疗法发展与应用的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 273-282.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221125-00081识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注癌症是高度复杂的疾病，其特点是不仅有恶性细胞的过度生长，而且有免疫反应的改变。免疫系统的抑制和重新编程在肿瘤的发生和发展中起着关键作用，免疫治疗的目的是重新激活抗肿瘤免疫细胞，克服肿瘤的免疫逃逸机制。有证据表明，多种免疫治疗方法的结合可能是提高治疗效果的途径之一。然而，肿瘤免疫治疗的总体临床反应率仍有待提高，这就需要开发新的治疗方法和生物标志物。从过去临床和基础研究的成功和失败中学习，对于未来研究的合理设计至关重要。今天分享一篇今年九月份发表在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）的综述文章。这篇综述描述了免疫系统对抗癌症的机制，并讨论了可以促进抗肿瘤免疫反应的治疗靶点和细胞类型。01研究背景肿瘤免疫治疗的历史：1974年，白细胞介素（IL）-2被发现在T细胞分化和生长中起着至关重要的作用。T细胞的激活是抗病毒和抗肿瘤适应性免疫中的一个关键事件，它主要是通过双信号途径完成的。第一个信号是抗原特异性信号，包括T细胞表面受体（TCR）与抗原肽-主要组织细胞复合体（MHC）的特异性结合。第二个信号是由T细胞与抗原提呈细胞（APC）表面的刺激分子（CMs）的交流介导的。在确定了负责抗原识别的T细胞受体（TCRs）后，1986年，科学家们发现了在活化T细胞上表达的分子CD28。随后，人们发现T细胞的激活需要来自TCR和CD28的信号，此后CD28被命名为 "共刺激分子"。Pierre Golstain的团队发现了一种与CD28结构相似的蛋白质；它被命名为细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4），并被假设为一种潜在的T细胞激活分子。1994年底，Allison团队报告了阻断CTLA-4可以增加T细胞的抗肿瘤活性和抑制肿瘤生长的突破性发现。因此，第一次证明了抑制一种负性免疫调节剂可以抑制肿瘤的发展；这种方法后来被Allison命名为 "免疫检查点阻断"（ICB）。2011年，第一个针对CTLA-4的抗体ipilimumab被批准用于黑色素瘤治疗，成为第一个免疫检查点（IC）抑制剂。20多年前，京都大学Tasuku Honjo的研究小组发现了程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）。PD-1基因敲除导致小鼠出现自身免疫性疾病和异常激活的免疫细胞，表明其具有免疫抑制作用。2000年，B7-H1被确定为PD-1的配体，因此获得了它的第二个名字PD-L1。这些发现表明，PD-1是另一种IC。文章总结了癌症免疫疗法在一段时间内的主要里程碑式的突破（图1）。针对CTLA-4和PD-1的抗体以及CAR-T细胞疗法代表了有希望的方法，在这些方法中，免疫系统的某些成分可以被操纵，以扭转抑制并针对肿瘤。然而并非所有患者都对这些疗法有反应，这表明肿瘤引起的免疫改变的复杂性。Robert Schreiber博士提出了 "癌症免疫编辑 "的概念，描述了恶性细胞如何对最初的免疫识别做出反应，随后发展出逃避机制，甚至 "重塑 "免疫系统，成为致癌物质。这样的免疫编辑过程几乎在体内或全身免疫细胞存在时都会发生，从而形成高度抑制的肿瘤微环境（TME）。寻找激活抗肿瘤T细胞反应和针对抑制性TME的协同方法一直是肿瘤免疫治疗的主要研究重点。图1. 癌症免疫疗法发展的历史性里程碑02T细胞上的免疫抑制分子（ICs）ICs是一类免疫抑制分子，在免疫细胞上表达，可以抑制免疫细胞的激活，因此在预防自身免疫中起着关键作用（图2）。相反，ICs的过度表达会抑制免疫功能，促进肿瘤的发生。因此，ICB疗法通过阻断ICs和增强抗肿瘤T细胞活性来抑制肿瘤生长。ICB的发展是通过靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/2这两条IC通路开始的，对它们的阻断已经取得了显著的临床进展。迄今为止，T细胞上其他几个通过不同机制介导抑制性信号的IC分子已被发现，并有可能被作为癌症免疫治疗的靶点加以利用。图2. 免疫检查点抑制剂及其受体列表1. PD-1研究发现PD-1能抑制T淋巴细胞的功能，这对控制自身免疫反应至关重要。PD-L1（最初被确定为B7-H1），在多种类型的肿瘤上高度表达，可与PD-1结合并介导肿瘤的免疫逃逸。因此，对PD-1的抑制可以重新激活T细胞功能。PD-1不仅在T细胞上表达，而且还在NK细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）上表达，表明PD-1可能在重塑肿瘤免疫微环境甚至全身性抗肿瘤免疫中发挥非常有效的作用。PD-1抑制剂可以特异性地与PD-1结合，从而减弱对T淋巴细胞的免疫抑制调节，使T淋巴细胞能够参与杀伤肿瘤细胞（图3）。 图3. PD-1抗体工作机制示意图2. CTLA-4CTLA-4也被称为CD152，是一种跨膜蛋白，在活化的CD4+和CD8+T细胞中表达。CTLA-4和CD80/CD86的结合可以抑制T细胞的激活信号，防止自身免疫性疾病。阻断CTLA-4可以直接针对效应性T细胞的抑制信号，减少Tregs的抑制作用，从而有效提高T细胞的抗肿瘤作用。尽管两者都是有代表性的IC分子，CTLA-4和PD-1以不同的方式调节T细胞功能（图4）。CTLA-4的抑制性信号消极地调节T细胞的启动，而PD-1主要介导启动后的T细胞的激活和增殖。在肿瘤方面，人们发现针对PD-1的ICB通常会导致现有抗肿瘤T细胞的扩增和招募，而抗CTLA-4治疗会产生新的T细胞克隆。这些结果表明，CTLA-4和PD-1可以同时作为靶点，发挥协同抗肿瘤作用。图4. CTLA-4和PD-1的图解3. Tim-3T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域-3（Tim-3，CD366）是一种T细胞表面抑制性分子，主要表达在CD4 + T辅助细胞1（Th1）和CD8 + CTL细胞以及具有强化抑制功能的Treg细胞亚群上。后来发现Tim-3，也被称为HAVCR2，也表达在一些先天性免疫细胞上，包括树突状细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。4. LAG-3在抗原刺激下，LAG-3可以在CD4 +和CD8 + T细胞上被诱导。长期感染病毒、细菌和寄生虫导致持续暴露于抗原，这导致LAG-3的高水平和持续表达，随后细胞因子释放、细胞溶解活性和增殖潜力减少。在一些小鼠肿瘤模型中观察到LAG-3和PD-1在瘤内T细胞上的共同表达，当结合这两种分子的阻断抗体时，观察到对肿瘤生长的协同抑制作用。LAG-3因此成为癌症免疫治疗最关键的新靶点之一。Relatlimab是第一个进入临床的LAG-3的抑制剂，它能阻断LAG-3与MHC II的相互作用。纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）是Lag-3的配体。发现它与Lag-3结合形成一个新的PD-1/PD-L1独立的免疫检查点途径，导致T细胞衰竭、功能障碍，以及肿瘤细胞逃避免疫监视。在抗PD-L1的基础上阻断FGL1，有可能成为临床实践中的另一种新型ICB策略，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向治疗方面。5. NR2F6核受体亚家族2群F成员6 (NR2F6)最近被报道为细胞内IC分子，是淋巴细胞固有的核受体。NR2F6作为转录因子调节与肿瘤抗原特异性T细胞反应相关的细胞的激活、募集、增殖和内稳态。在非小细胞肺癌组织的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中检测到NR2F6的高表达，NR2F6表达上调与细胞因子(IL-2、TNF-α和IFN-γ)的产生受损相关，提示TILs上的NR2F6有助于肿瘤免疫抑制。此外，NR2F6的破坏导致肿瘤抑制，并增强PD-L1阻断剂在肿瘤治疗中的作用，提示NR2F6抑制剂可能成为一种新的免疫疗法，可以克服对现有ICB治疗的耐药性。6. TIGITT细胞免疫球蛋白和ITIM域蛋白（TIGIT）是一种I型跨膜蛋白。TIGIT属于免疫球蛋白超家族（IgSF），可以在T细胞、调节性T细胞、记忆性T细胞和NK细胞上表达。TIGIT通过与表达在抗原呈递细胞（APC）上的配体CD155和CD112相互作用，介导对NK细胞和T细胞激活的抑制作用。在人类肿瘤中，TIGIT被发现与多个IC分子共表达，包括PD-1、TIM-3和LAG-3。TIGIT、TIM-3和PD-1的共同表达与患者的生存率低有关。同时阻断TIGIT和PD-1信号通路可以增加肿瘤特异性CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达，支持抗TIGIT治疗的发展。7. VISTAV-集免疫调节受体（VISTA），也被称为PD-1H或DD1α，是近年来发现的一种免疫调节蛋白。它主要表达于淋巴器官和骨髓细胞，其结构与PD-L1相似。研究表明，表达VISTA的APC对CD4 +和CD8 + T细胞有抑制作用；当这种分子被阻断时，由T细胞介导的免疫功能得到了挽救，说明VISTA是一种抑制T细胞反应的IC分子。在T细胞中，VISTA和PD-1的抑制作用是相互独立的，在肿瘤小鼠模型中的研究也验证了同时应用抗PD-1和抗VISTA抗体可以抑制肿瘤生长，延长生存期。8. BTLAB和T淋巴细胞衰减剂（BTLA）属于免疫球蛋白超家族。它在T细胞、静止的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞上表达，其结构和功能与PD-1和CTLA-4相似。BTLA的配体是疱疹病毒进入介质（HVEM）。当BTLA与HVEM结合时，它产生抑制性信号并抑制T细胞的激活。抗BTLA治疗可促进T细胞增殖，BTLA基因敲除的小鼠显示出更高的免疫活性。03 T细胞上的免疫刺激分子（ICs）1. OX40OX40，也被称为CD134，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族的成员，在T细胞激活后24-72小时表达。它的配体OX40L，也被称为CD252，主要表达在活化的APC表面。OX40-OX40L的相互作用可以启动T细胞激活信号以及细胞周期蛋白A、Bcl-2抗凋亡分子、细胞因子和细胞因子受体的表达。小鼠模型显示，刺激OX40的特异性抗体可以减少Tregs的数量，从而保持效应T细胞的功能，并显示出高抗肿瘤活性有许多针对OX40-OX40L途径的临床研究，包括对激发OX40的特异性抗体的单药应用或与化疗、放疗、手术、小分子靶向治疗、细胞因子或其他ICB药物的组合。2. ICOS诱导共刺激分子(ICOS)，又称CD278，是免疫球蛋白超家族的一员。ICOS在活化的T细胞表面表达，调节T细胞增殖和功能。ICOS的激活依赖于其配体ICOS- l，主要在B细胞和APCs中表达。ICOS已被证明是ICB疗效的一个重要标志。当anti-CLTA-4治疗恶性黑色素瘤时，发现ICOS + CD4 + T细胞的丰度与较好的疗效相关。在小鼠模型中，单独使用ICOS激动剂很难引起足够的抗黑色素瘤反应;但ICOS与anti-CLTA-4之间存在协同效应; 此外，ICOS敲除小鼠对anti-CLTA-4治疗反应较差。3. 4-1BB4-1BB，也被称为CD137，是TNFR家族的一员。4-1BB在调节性T细胞上的作用是复杂的，研究结果相互矛盾。但重要的是，4-1BB基因敲除小鼠发生自身免疫性疾病，提示其在免疫平衡中发挥重要作用，有可能被靶向引发肿瘤特异性免疫识别。4. CD27与TNFR家族的其他成员不同，CD27只在淋巴细胞表面表达，包括新生和活化的CD4+和CD8+T细胞。当它与其配体CD70相互作用时，CD27诱导效应性和记忆性T细胞的增殖和分化，并增强B细胞和NK细胞的激活。小鼠模型表明，诱导CD27信号通路可以抑制肿瘤的生长。CD27/CD70信号通路的抗肿瘤免疫作用。Varlilumab是一种针对CD27的人源化单克隆抗体，可促进细胞因子的产生和T细胞的激活。在I期临床研究中，Varlilumab在晚期实体瘤患者中的耐受性良好，并显示出初步的安全性结果。除了单药治疗外，varlilumab还与抗PD-L1抗体联合使用。04 NK细胞上的免疫刺激分子（ICs）在人体内，NK细胞主要以CD3- CD56 +淋巴细胞群为特征，而CD16 + CD56dim亚型主要存在于血液中。NK细胞作为自然免疫系统的重要组成部分，在去除衰老细胞和致病微生物方面发挥着重要作用。NK细胞不像TCRs那样通过特定的受体识别靶细胞;它们通过种系基因表达的受体识别细胞。NK细胞的负调控因子包括KIRs(免疫球蛋白样受体)、CD94-NKG2和MHC-I。在肿瘤免疫学的背景下，肿瘤细胞通过下调MHC的表达来逃避获得性免疫，从而更容易受到NK细胞的细胞毒性作用。此外，在抗体治疗中，NK细胞在介导抗体诱导的细胞毒性(ADCC)中发挥着重要作用。NK细胞还可以通过分泌细胞因子或招募树突状细胞、巨噬细胞和T细胞等免疫细胞参与清除肿瘤细胞的过程，直接发挥抗肿瘤作用238，使其成为癌症免疫治疗的诱人靶点。1. KIR杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族是一类高度多态性的分子，主要表达在一些NK细胞和T细胞的表面，可分为多个亚型。其中，KIR2DTl1-3和KIR3DL1通过结合MHC分子(HLA-C/HLAB)发挥抑制作用。由于基因多态性高的特点，多个KIR基因及其配体的结合可引起多种疾病，包括自身免疫性疾病，特别是部分KIR基因与特异性配体的结合，可增加癌症的风险。在小鼠模型中，靶向活化的NK细胞表面受体KIR2DS2的治疗显示出明显优于靶向传统共刺激分子的抗肿瘤活性。2. NKG2ANK细胞凝集素样受体亚家族C成员1 (NKG2A)是NKG2家族的“抑制性”成员，主要在CD56 hi NK细胞、NKT细胞和CD8 + αβ t细胞亚群中表达。它与CD94形成异二聚体受体，并与它的配体结合，非经典的MHC I分子HLA-E，在大多数正常组织中表达。NKG2A/CD94与HLA-E的相互作用可抑制NK细胞和T细胞的激活，表明其作为IC分子的靶向性。Monalizumab (IPH2201)是一种NKG2A单克隆拮抗抗体，可阻断NKG2A与HLA-E之间的相互作用，已在白血病小鼠模型中显示治疗效果。3. CD96CD96是NK细胞上表达的免疫球蛋白超家族的一员，可识别配体CD155。CD96在肿瘤浸润NK细胞上的表达高于周围组织NK细胞。肝细胞癌样本中NK细胞CD96表达水平较高预示预后较差。05 细胞免疫治疗具有细胞毒性潜能的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞，能够识别并清除感染或受损的细胞。T细胞的细胞毒性作用不同于其他细胞，因为它具有抗原特异性。细胞免疫疗法，也称为过继细胞转移(adoptive cell transfer，ACT)，利用这些类型的免疫细胞的杀伤能力来治疗癌症。在此，作者讨论已经取得重大研究和临床进展的四种主要ACT类型:CAR - T细胞治疗、TIL治疗、工程TCR治疗和NK细胞治疗。1. TIL 治疗 (TIL therapy)TILs是可以从肿瘤组织中识别和纯化的异质性淋巴细胞，它们的丰富程度已被发现与较好的预后相关。TILs是第一批被用于ACT的细胞之一。这些细胞可以从肿瘤中分离出来，在实验室环境中进行体外扩增，并大量重新注射到癌症患者体内以消除肿瘤细胞。TIL疗法已经在临床研究中进行了严格的测试，作者总结了TIL疗法针对不同类型肿瘤的最新进展，包括：黑素瘤、肺癌、宫颈癌、转移性乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌。2. 工程TCR治疗 (Engineered TCR T therapy)TCRs是T细胞表面的特异性受体。通过识别和结合MHC呈递的抗原，激活T细胞的分裂和分化。然而，并不是所有病人都有能识别肿瘤的T细胞。因此，TCR-T疗法从患者身上提取T细胞，并将这些细胞扩大，使患者拥有能够识别特定癌症抗原的新的TCR。用于TCR-T治疗的工程TCRs的设计高度依赖于特异性肿瘤抗原的识别。一些抗原，如NY-ESO-1，在肿瘤组织中广泛表达，可用于开发TCRs治疗不同类型的肿瘤。然而，TCR可以以患者特异性的方式进行识别和合成。TIL治疗利用了瘤内淋巴细胞与全身淋巴细胞之间的差异，对患者肿瘤中特定突变的识别指导了TCRs的生成和应用，从而有效地靶向这些突变。然后，这些TCRs可以被分离、克隆并在T细胞上表达，然后这些工程T细胞在体外扩增并重新注入患者体内。这是一种高度个性化的治疗方法，增强了治疗的特异性。TCR疗法在黑色素瘤的治疗上取得了突破性进展，在肝癌、乳腺癌、卵巢癌的治疗上也取得了一定成效。然而，TCR对肿瘤抗原的识别需要MHC分子的抗原表达，肿瘤细胞会通过降低MHC的表达来逃避T细胞的杀伤。3. CAR - T细胞治疗 (CAR-T cell therapy)CAR-T细胞治疗是另一种ACT策略。与TCR T疗法的原理相似，患者的T细胞“配备”了合成的CAR，扩展并重新注入患者体内，以产生肿瘤特异性免疫反应(图5)。CAR被设计用于识别肿瘤相关抗原(TAAs)，其独立于MHC呈递，因此使T细胞能够以MHC不受限制的方式识别癌细胞。图5. CAR-T细胞的结构① CAR-T细胞治疗的原理和成果：CAR-T细胞是通过在T细胞的质膜上表达肿瘤特异性CARs而产生的。 CARs的结构通常包括三个部分：细胞外抗原结合域、连接体/跨膜域、和细胞内信号传导域。细胞外抗原结合区是利用抗体、配体和肽的序列设计的，以便与TAAs特异性结合。跨膜结构域负责连接细胞外结合结构域和细胞内信号结构域并将其固定在细胞膜上。细胞内信号区，包括CD3-zeta结构域和共刺激结构域，将抗原识别的信号转发给细胞，介导T细胞的激活。CAR-T细胞治疗涉及合成生物学（CAR设计）、病毒技术（CAR转导）和细胞制造（CAR-T细胞扩增）的整合（图6）。CAR的引入在工程T细胞中产生了肿瘤特异性激活潜力，而体外培养和扩增允许绕过肿瘤引起的免疫抑制。因此，大量的肿瘤特异性细胞被输回病人体内。CAR-T细胞疗法对几种类型的癌症显示出有希望的临床结果。图6. CAR-T治疗的工作流程② CAR-T细胞治疗的挑战：CAR-T细胞治疗的更广泛应用仍然面临着来自不同方面的挑战。首先，当CAR-T细胞攻击肿瘤细胞时，可能会引起严重的副作用和毒性，可能是致命的。其次，一些CAR-T细胞的细胞毒性不是高度肿瘤特异性的，可能会对正常组织造成损伤。第三，大多数CAR-T细胞产品的制造过程是耗时的，这可能会导致一些患者的肿瘤在细胞生产窗口期进一步恶化。此外，CAR-T治疗血癌的长期疗效仍需长期随访观察，CAR-T细胞治疗实体瘤的应用有待进一步研究。这些挑战将决定未来整个T细胞工程领域的发展。细胞因子释放综合征(CRS)，也被称为“细胞因子风暴”，是CAR-T治疗最常见的不良反应。大多数CAR-T细胞的临床研究表明，长期疗效不确定，因为癌细胞表达的各种免疫逃逸因子导致T细胞衰老和衰竭。针对实体瘤的CAR-T细胞面临的挑战包括阻断T细胞浸润的血管疾病，有限的TAA选择和肿瘤异质性，这导致了抗原逃逸。CAR-T细胞在实体瘤中的应用需要进一步探索。③ CAR-T细胞改良的策略：利用特异性和广泛的靶向性: CAR-T细胞的长期抗肿瘤功能因输注后肿瘤复发而复杂化。考虑到CAR-T治疗后抗原逃逸的风险，设计针对多个TAAs的双特异性CAR-T是可以采用的。提高CAR-T细胞的适应度，包括活化潜能、增殖能力和生存能力，延长CAR-T细胞在患者体内的生存时间，是提高临床疗效的关键方向之一。降低制造成本: 到目前为止，所有批准的CAR-T细胞疗法都使用自体T细胞来产生治疗产品。生产这种高度个性化的疗法需要很高的成本。除了高成本外，CAR-T细胞疗法的质量和稳定性一直是人们关注的主要问题。自体T细胞在质量和数量上不一致，特别是在接受过大量放疗和化疗的患者中。 毒性控制: CAR-T细胞治疗显示的毒性和副作用表明需要制定一些控制程序来调节CARs的活性。大量的方法已经被用来控制CAR-T细胞的安全性; 其中包括通过安装自杀开关快速清除注入的细胞，这种开关可以由小分子或抗体控制。常用的自杀开关包括诱导型caspase-9 (iCasp9)、单纯疱疹病毒中的胸苷激酶(HSV-TK)和自杀表位。然而，这样的自杀开关清除了所有的治疗CAR-T细胞，从而降低了抗肿瘤反应。因此，不清除CAR-T细胞的非细胞毒性可逆系统正在开发中，并具有保持细胞毒性和控制毒性反应之间平衡的潜力 (表1)。4. NK细胞治疗 (NK cell therapy)NK细胞是另一种重要的免疫细胞类型，可以介导直接细胞毒性。从机制上讲，NK细胞在对抗癌症的第一道防线上发挥着关键作用，通过两种途径介导抗肿瘤作用: 通过释放穿孔后蛋白和颗粒酶或死亡受体的直接细胞毒性，以及通过分泌激活APCs和T细胞的细胞因子和趋化因子的调节作用。因此，除了本文前面讨论的以NK细胞上的ICs为靶点的药物外，利用NK细胞的ACT也在快速发展中。与T细胞类似，NK细胞也可以转导表达CARs。CAR-NK细胞的发展紧随CAR-T细胞治疗的演变，CAR-NK细胞往往直接采用CAR-T细胞的设计。许多临床前研究已经证实了CAR-NK细胞针对其他类型肿瘤的抗肿瘤活性。由于NK的细胞毒性是由 "缺失自我 "的识别引发的，因此NK细胞尤其具有杀死MHC下调的肿瘤细胞的能力。NK细胞对病毒感染的细胞也有特殊的杀伤能力，因此特别适合于治疗HPV或EBV相关的肿瘤。NK细胞毒性可受多种免疫抑制机制的影响，包括IL-10，吲哚胺2,3-双加氧酶，前列腺素E2，转化生长因子β (TGF-β)和缺氧。增强NK细胞的细胞毒性和在体内的持久性被认为是推进NK治疗的主要方向。支持NK细胞维持的细胞因子:IL-15已被确定为增强NK细胞活性的关键细胞因子。在黑色素瘤、结直肠癌、淋巴瘤和肺癌等癌症的同基因小鼠模型中，IL-15的注射具有良好的耐受性，并促进NK细胞的扩增。随着对NK细胞活化和维持的研究越来越深入，未来的治疗方法不仅必须产生肿瘤特异性NK细胞，还必须增加其在体内的持久性，以增强其治疗效力。5. CRISPR技术促进了细胞免疫治疗近年来，CRISPR/Cas9技术极大地提高了我们对肿瘤基因组学的认识，并为癌症免疫治疗做出了贡献。使用该基因组编辑系统，可进一步改造治疗性免疫细胞，以增强肿瘤识别并减少衰竭(图7)。图7. 基于CRISPR技术的免疫治疗工作流程06来自ICB和CAR-T细胞的免疫治疗生物标志物1. ICB的生物标志物PD-L1被作为抗PD-1治疗的第一个生物标志物，被列入pembrolizumab的处方指南中。目前，与免疫疗法疗效相关的常见或潜在的生物标志物，根据其可及性，主要有以下几类：(i) 表面标志物，包括PD-L1和其他一些抑制性受体，可以通过肿瘤组织的免疫组化检查。(ii)基因生物标志物，如肿瘤突变负荷（TMB）、错配修复系统缺陷（dMMR）、高微卫星不稳定性（MSI-H）、新抗原和抗原呈递途径的突变，这些都需要对肿瘤进行基因组分析；以及 (iii) 循环肿瘤DNA（ctDNA），可通过分析外周血获得。这些生物标志物中的一些已经被III期临床试验所验证，并在临床上广泛使用（表2）。2. CAR-T细胞治疗的生物标志物到目前为止，没有生物标记物被用于指导患者，但一些CAR-T细胞的内在和外在因素显示出与治疗反应有趣的相关性。肿瘤抗原的表达。CAR-T细胞作为一种靶向治疗，需要在肿瘤细胞上表达TAA来诱导T细胞活性，这确实是CAR-T细胞疗效最关键的生物标志物。由于肿瘤抗原逃逸是CAR-T细胞治疗后肿瘤复发的主要机制，也有研究发现，下调TAA不是完全丢失，而是抑制CAR-T细胞功能。虽然CAR-T细胞可以被设计成增加其对低水平TAA的敏感性，但TAA的表达密度可能成为一种预测性的生物标志物。07其他类型的免疫疗法肿瘤疫苗：预防性肿瘤疫苗可以预防某些癌症的发展，包括预防宫颈癌的HPV疫苗、阴道癌、外阴癌、肛门癌和尖锐湿疣以及预防肝癌的HBV疫苗。治疗性肿瘤疫苗包括以自由肽或载于APC上的肽的形式注射肿瘤抗原，以激活免疫细胞，恢复其自主抗肿瘤能力。在临床前模型中，治疗性肿瘤疫苗已被证实可以防止癌症生长和转移，并减少终止其他类型治疗后的复发。肿瘤疫苗主要分为以下四种:肿瘤全细胞疫苗、基因工程疫苗、蛋白肽疫苗和树突状细胞疫苗。新抗原和免疫疗法：新抗原是存在于癌细胞上的蛋白质片段，提供了一种实现癌细胞特异性靶向的新方法。新抗原疫苗是根据患者的特定肿瘤情况定制的。生产新抗原疫苗的一般步骤包括(1)肿瘤活检，即从患者身上提取肿瘤样本进行基因组纯化; (2)对肿瘤细胞和正常细胞的全外显子组测序，使研究人员能够寻找肿瘤细胞中独特的突变;(3)特异性新抗原的预测和筛选; (4)开发个性化疫苗，这是基于预测的新抗原，可以通过多种方法实现，包括多肽、mRNA和DC。最关键和最具挑战性的一步是患者特异性新抗原的鉴定。溶肿瘤病毒：有额外病毒感染的癌症患者通常病情恶化。然而，病毒也可以被修改为专门针对癌细胞。这些“溶瘤病毒”是通过基因组编辑和大规模筛选产生的，其解读包括对癌细胞的裂解能力，同时保留正常细胞。由此产生的溶瘤病毒抗原可以复制并随后溶解肿瘤细胞，从而向肿瘤部位释放更多的病毒颗粒。因此，小剂量的病毒可以在体内扩增。溶瘤病毒具有介导肿瘤抗原扩散的能力，可导致浸润肿瘤的淋巴细胞增多，增强了ICB治疗的抗肿瘤疗效。另一种方法是使用溶瘤病毒作为载体，结合细胞免疫治疗。通过额外的基因工程，病毒的细胞溶解功能可以被抑制，同时允许合成分子的表达。08靶向抑制性的肿瘤微环境巨噬细胞：这些先天免疫系统的“士兵”清除了受损、衰老和危险的细胞，但在癌症中，巨噬细胞促进了它们的免疫逃逸，已成为药物开发的一个重要领域。巨噬细胞有多种功能，包括清除细胞碎片和病原体，调节炎症反应。巨噬细胞也是高度可塑性的细胞，可以根据微环境刺激和信号从一种表型转换到另一种表型。巨噬细胞的激活状态通常分为两类:M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞(图8)。某些M2巨噬细胞亚群参与促进肿瘤进展和介导免疫抑制。从机制上讲，已发现肿瘤将单核细胞和巨噬细胞招募到TME，并将它们极化为M2样表型。巨噬细胞靶向癌症治疗的中心目标是将肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)重编程为促炎(抗肿瘤)亚型。图8. M1和M2巨噬细胞的特性TAMs上的抑制和刺激分子：最成熟的针对TAMs的方法是阻断集落刺激因子-1（CSF-1，也称为M-CSF）/CSF1R轴。这种方法减少了TAMs的数量，这也可能与TAMs向M1表型的再极化有关。TAMs的致瘤功能也可以由TGF-β介导，TGF-β是一种抗炎分子，通常在损伤修复过程中由巨噬细胞表达。在一个小鼠模型中，阻断TGF-β并同时用STING激动剂治疗，通过上调I型干扰素的表达而导致肿瘤的消退。Toll样受体（TLRs）参与先天免疫感应。TLR激动剂可以增加单核细胞的招募/浸润，并诱导巨噬细胞向促炎症表型重新极化。TAMs也表达CD40，CD40激动剂可以防止肿瘤生长和减弱抗药性。这些抑制性（CSF1R、TGF-β）和刺激性（TLRs、CD40）分子都可以用来恢复TAMs的促炎症功能。CD47又称整合素相关蛋白，属于免疫球蛋白超家族，通过与巨噬细胞或树突状细胞表面的信号调节蛋白α (SIRPα)结合，调节细胞增殖、迁移和凋亡。CD47在大多数肿瘤细胞表面过表达。阻断CD47/SIRPα通路可诱导巨噬细胞靶向肿瘤的吞噬功能，这在小鼠异种移植模型中得到证实。工程巨噬细胞：巨噬细胞治疗的发展需要增加靶向激活受体和更持久的M1巨噬细胞极化方法。利用基因修饰增强巨噬细胞的抗肿瘤能力逐渐引起了人们的关注。一个直接的策略是耗尽抑制信号，如SIRPα。SIRPα缺失的巨噬细胞在联合放疗中具有抗肿瘤作用。另一种方法是设计巨噬细胞表达CARs (CAR-Ms)(图9)。CAR-Ms还诱导周围TME的促炎特征。M2巨噬细胞的存在不影响CAR-M细胞的肿瘤杀伤能力，突出了其对TME免疫抑制的抵抗力。此外，CAR-Ms表现出更强的T细胞刺激能力，能够在吞噬后向T细胞呈递抗原，招募静止和激活的T细胞到肿瘤。图9. CAR-M治疗的多效抗肿瘤机制靶向骨髓来源抑制细胞(MDSCs)：MDSCs起源于造血干细胞（HSCs），是骨髓造血功能改变的结果。这种短暂的骨髓增生在刺激物被移除后会终止，骨髓细胞的平衡也会随之恢复。然而，在慢性炎症、癌症和自身免疫性疾病中，持续的骨髓造血可能发生，以防止宿主广泛的组织损伤，不断产生IMCs。这些细胞具有明显的特征，如不成熟的表型和形态，相对较弱的吞噬功能，以及抗炎和免疫抑制功能。异常的骨髓细胞对其他免疫细胞有抑制作用。此后，人们采用表面标志物Gr-1和CD11b来定义这些免疫抑制性骨髓细胞。在人类中，这些骨髓细胞的表型特征是CD34、CD14和CD15的表达，功能特征是它们能够抑制T细胞的激活。MDSCs是指一组异质细胞，可大致分为粒细胞（G-MDSCs或PMN-MDSCs）和单细胞（M-MDSCs）亚型。MDSCs的存在是肿瘤进展的基本特征之一。MDSCs发挥多种功能，影响T细胞、Treg细胞、DC细胞和NK细胞（图10）。目前，MDSC靶向治疗大致可分为五种类型：(i) 抑制MDSCs扩张和招募的疗法；(ii) 恢复正常骨髓分化的疗法；(iii) 针对MDSCs上IC分子的疗法；(iv) 阻断MDSCs分泌的抑制性分子的疗法；(v) 直接耗尽MDSCs的疗法。图10. MDSCs的功能靶向B细胞：肿瘤相关B细胞(TABs)。肿瘤环境中的B细胞(命名为TABs)同时具有促炎和抗炎功能，抗炎B细胞的丰富程度与黑色素瘤对ICB治疗的耐药性相关。TAB在肿瘤组织中的第三淋巴组织结构(TLSs)中富集，在那里它们可以被激活来识别癌细胞。肿瘤中TLSs中B细胞水平高的NSCLC患者更有可能对免疫治疗产生良好反应。IDO是一种色氨酸代谢酶，可将色氨酸转化为犬尿氨酸，并在多种类型的肿瘤中过度表达。肿瘤抑制基因BIN1对IDO的表达有负向调节作用。在小鼠模型中，BIN1的耗尽已被证实能诱导IDO的表达和对肿瘤的免疫抑制。IDO可以增强癌细胞的运动能力，抑制肿瘤靶向T细胞的增殖和功能。IDO靶向药物在临床前模型中作为单药显示出疗效，但与靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1的ICB联合使用可以更有效。目前主要有四种针对IDO的小分子抑制剂正在进行临床研究：indoximod、navoximod、epacadostat和BMS-986205。IL-41可增强肿瘤的侵袭性，抑制抗肿瘤免疫。靶向IL-41可能是一种新的免疫治疗途径。腺苷(Adenosine)是RNA合成的重要组成部分。然而，腺苷也被证明可以抑制T细胞在TME中的功能。CD39是一种参与细胞外腺苷产生的酶，在各种人类肿瘤中高度表达。此外，TME中CD39表达水平升高的多种细胞类型包括血管内皮细胞、成纤维细胞和一些免疫细胞。CD39已被发现在多种免疫细胞中发挥重要作用。因此，CD39联合ICB可能成为一种新的肿瘤免疫治疗方式。09结论和展望这篇文章介绍了肿瘤免疫治疗的历史，深入探讨了癌症免疫治疗的不同策略，包括IC和刺激性分子靶向药物、细胞免疫治疗和抑制性TME靶向策略。此外，作者还讨论了与ICB和CAR-T治疗的临床疗效相关的生物标志物。总之，肿瘤免疫学研究与免疫细胞的先进技术相结合，将为癌症免疫治疗的未来发展指明方向。癌症免疫治疗的发展需要更多的临床和基础研究项目的整合，从而能够全面分析未满足的临床需求，进而指导研究方向。参考文献：Wang DR, Wu XL, Sun YL. Therapeutic targets and biomarkers of tumor immunotherapy: response versus non-response. Signal Transduct Target Ther. 2022 Sep 19;7(1):331. doi: 10.1038/s41392-022-01136-2. PMID: 36123348; PMCID: PMC9485144.文章信息源于公众号医药速览登，载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读