HRG

中文摘要人类表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3，HER3）作为表皮生长因子受体家族中的一员，通过与其他受体形成异源二聚体发挥信号转导的功能。头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全球第6大常见癌症，起病隐匿且总体生存率低。HER3在HNSCC中高表达。HER3的表达和激活与HNSCC治疗中靶向其他受体的药物〔例如靶向表皮生长因子受体的单克隆抗体（单抗）西妥昔单抗或程序性死亡受体1阻断剂〕以及某些化学治疗药物的治疗获得性耐药有关。目前，HER3已经成为HNSCC治疗非常有前景的候选靶点。此文综合近年来国内外对靶向HER3治疗在HNSCC中的研究，对HER3参与HNSCC肿瘤进程的机制、HER3与HNSCC当下临床治疗策略的关联，以及包括处于临床试验的11种单抗药物、5种双特异性抗体药物及其他多种类型的靶向HER3的药物在HNSCC治疗中的开发进展进行综述。正文人类表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3，HER3）又称幼红细胞白血病病毒癌基因同源物3（erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3，ErbB3），是人体中经典的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），属于表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族。HER3 具有与家族其他成员不同的独特构型，胞内酪氨酸激酶活性较低，无法直接与三磷酸腺苷相结合，需与其他有酪氨酸激酶活性的EGFR家族成员形成异源二聚体复合物来发挥作用。而由于HER3胞内结构域11个酪氨酸磷酸化位点中有6个磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3k）p85 亚基结合位点，使得HER3胞内区酪氨酸激酶羧基末端活化后与PI3K的p85亚基结合，可以强烈激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt通路作为促进肿瘤细胞增殖的主要信号通路，涉及调控基因表达、细胞代谢和细胞骨架重排。研究显示，对PI3K/Akt途径有直接和间接抑制作用的药物会引起叉头转录因子盒O依赖性HER3转录升高，并通过PI3K-Akt负反馈调节上调和激活HER3的表达，再次激活下游途径，从而出现耐药。另有研究表明，HER3主要配体神经调节蛋白1（neuregulin-1，NRG1）可以通过旁分泌与自分泌途径共同参与HER3信号转导等过程。HER3的主要相关蛋白、信号通路和功能见图1。1项对超过750个不同来源的肿瘤进行的定量逆转录PCR表达谱分析显示，头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）表达的NRG1水平最高。头颈部肿瘤是全球最常见的恶性肿瘤之一，超过95%的病理类型是鳞状细胞癌。HNSCC是指位于鼻旁窦、鼻腔、口腔、咽部和喉部由鳞状细胞引起的组织学癌症，是全球第6大癌症，起病隐匿，且总体生存率不高，中位生存期低于1年。在免疫检查点阻断（immunecheckpoint blockade，ICB）治疗出现之前，全身化学治疗（化疗）被用作标准的一线方案，即将顺铂或卡铂和5-氟尿嘧啶、人鼠嵌合抗EGFR单克隆抗体（单抗）西妥昔单抗联用。ICB疗法的发展为抗癌治疗提供了强有力的支撑，其中程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡受体配体1抑制剂在多项单药或联合用药临床试验中被证实可以有效延长HNSCC患者的生存时间，且较传统治疗方案不良反应发生率更低。然而，治疗获得性耐药在HNSCC患者中很常见，西妥昔单抗和PD-1/程序性死亡受体配体1抑制剂在HNSCC中均疗效有限，仅有＜20%的患者获得了持久的受益。HER3的表达和激活与HNSCC治疗中其他靶向药物和某些化疗药物的治疗获得性耐药有关，同时HER3的促进细胞增殖作用提示靶向HER3治疗具有一定的临床潜力。本文对HER3靶点靶向治疗在HNSCC中的研究现状及相关进展进行综述，总结HER3靶点与HNSCC当下治疗策略的关系，以及几种靶向HER3或与HER3相关的HNSCC治疗策略。1HER3与HNSCC当下临床治疗策略HER3在多种人类癌细胞中表达，其过表达与癌症包括头颈部肿瘤患者的生存率较低有关。在HNSCC中，主要于膜上过表达HER3的肿瘤预后较差。HER3高表达的原发性肿瘤似乎更倾向于发生淋巴结转移，且超过30%的转移淋巴结中存在HER3过表达。此外，与正常组织相比，在异型增生和HNSCC中发现了HER2/HER3、HER3/HER4、EGFR/HER2/HER3以及EGFR/HER2/HER3/HER4共表达。HER3与家族其他成员的这些共表达与生存率低、疾病进展和/或转移显著相关。由于当某个ErbB被阻断时，其他RTK可以补偿被阻断的受体丢失的信号传导，因此HER3表达可作为多种靶向治疗的旁路机制，异常的HER3信号传导导致了患者对多种靶向治疗药物及化疗药物的治疗获得性耐药。由于HER3还可以与HER2、HER4、原癌基因蛋白质c-Met等形成异源二聚体，导致EGFR信号传导的平行信号通路异常激活，因此西妥昔单抗对HER3和HER3相关二聚体的上调是HNSCC中EGFR靶向疗法获得性耐药的一种机制。早期研究表明，HER2/HER3介导的信号传导与头颈癌中的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）吉非替尼治疗获得性耐药相关，在对EGFR/HER2双重TKI拉帕替尼敏感的细胞系中，拉帕替尼的敏感性与强活化的HER3和HER3配体NRG1的升高密切相关。后来也有人提出，自分泌NRG1信号传导上调以及HER2/HER3二聚体的增加，是HNSCC中西妥昔单抗对EGFR抑制的耐药机制。在TKI包括厄洛替尼和吉非替尼治疗获得性耐药患者中，HER2、HER3上调也被认为是耐药机制的一部分。同时，无论是在体外还是体内试验中，靶向抑制HER3都可以使西妥昔单抗耐药的HNSCC细胞对西妥昔单抗重新敏感。在另1项研究中，原癌基因c-met通过增加HER3/P13K信号传导引起吉非替尼和西妥昔单抗耐药，然而由于HNSCC中原癌基因c-met的拷贝数增加很少见（1%~2%TCGA队列），因此该机制只能解释先天耐药病例的一小部分。由于HER3是PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）存活信号传导的重要激活剂，因此它也导致了其他靶向治疗的耐药性。在HNSCC临床前模型中，HER3靶向可以增强PI3Kα选择性抑制剂BYL719的生长抑制作用。此外，另1项研究提出HPV＋HNSCC相较于HPV﹣HNSCC对PI3K抑制剂存在内在耐药性，这种药物敏感性的差异可能归因于PI3K抑制剂治疗HPV﹣HNSCC细胞系后HER3对Akt激酶的再激活。同时，共靶向HER3和PI3K可能是克服HPV﹣HNSCC肿瘤中PI3K抑制剂耐药性的有效治疗策略。在ICB治疗的临床前研究中，抗体介导的靶向HER3阻断通过抑制HER3-PI3K-Akt-mTOR致癌信号传导，可以逆转免疫抑制肿瘤微环境，从而发挥有效的抗肿瘤作用。对HER3抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）U3-1402的1项研究显示，U3-1402靶向HER3发挥其抗肿瘤作用的同时，可以通过免疫激活与PD-1阻断存在潜在的协同作用，使表达HER3的肿瘤对PD-1阻断重新敏感。此外，在1项针对HER3疫苗的研究中，使用编码全长人HER3的重组腺病毒载体Ad-HER3-FL进行免疫，可诱导HER3靶向疫苗激活HER3特异性T细胞并诱导抗HER3特异性抗体，改变肿瘤中的T细胞浸润，并影响对ICB的应答。因此，对于抗PD-1单抗的治疗受益有限群体而言，靶向HER3抑制的治疗策略与PD-1阻断联用，或许可以为HNSCC提供多模式精准免疫治疗方法。2靶向HER3的抗体药物在HNSCC治疗中的开发进展目前，已有11种靶向HER3的单抗产品正在针对HNSCC进行临床前或临床试验。这些靶向HER3的单抗抑制肿瘤的作用机制主要包括：阻断受体与配体的结合、使受体锁定为非活性构象、促进受体的内化与降解以及诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）直接杀死肿瘤细胞。这些靶向HER3的单抗均为IgG抗体，其中IgG1抗体8种，重组IgG1/IgG3抗体（GSK2849330）和IgG2抗体（MM-121）各1种。除单抗外，将适应证瞄准HNSCC的5种双特异性抗体（双抗）和2种ADC也在开发中。此外，正在研发的还有泛抗HER家族单抗混合物、HER3疫苗、嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T 细胞疗法、抗金属蛋白酶抑制剂等。2.1单抗临床开发中与HNSCC相关且靶向HER3的单抗汇总如下。Barecetamab（ISU104）是由韩国ISU ABXIS公司开发的全人源IgG1单抗，与HER3胞外结构域Ⅲ结合，处于早期临床开发阶段。该抗体阻断HER3的激活及与其他HER伴侣的二聚化，并使HER3的下游信号失活。在体内，除HNSCC之外，ISU104同时也在非小细胞肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌的皮下异种移植肿瘤模型中显示出超过70%的肿瘤生长抑制。ISU104在获得性西妥昔单抗耐药异种移植肿瘤模型中也显示出抗肿瘤作用。最近，Hong等报道了ISU104在NRG1表达高或具有NRG1融合或致癌ErbB3突变等遗传改变的模型中的抗肿瘤功效。CDX-3379（KTN3379）是由美国 Celldex 公司开发的人源IgG1λ单抗，与HER3结构域Ⅱ和Ⅲ之间边界的独特表位具有非常高的亲和力，该表位将HER3锁定在其非活性构象中，并抑制配体依赖性和配体非依赖性信号传导。因此，该抗体抑制配体依赖性和配体非依赖性HER3活化。临床前阶段，CDX-3379联合西妥昔单抗或BYL719可增强HNSCC异种移植模型的生长抑制。在近期1项临床前研究中，CDX-3379介导的HER3阻断通过抑制HER3-PI3K-Akt-mTOR致癌信号传导并伴随逆转免疫抑制肿瘤微环境，可以发挥有效的抗肿瘤作用，因此靶向HER3和PD1联合用药可能为PIK3CA野生型HNSCC提供多模式精准免疫治疗方法。在临床试验中，单独使用CDX-3379或与西妥昔单抗联合使用耐受性良好，并可使HNSCC肿瘤消退。Seribantumab（SAR256212，MM-121）是由美国Merrimack公司开发的靶向HER3的全人源IgG2单抗，与NRG1竞争结合HER3，阻止二聚化并诱导HER3内化和降解。该抗体由噬菌体展示的抗原结合片段（Fab）文库产生，被转化为全长人IgG2形式，目的是最大限度地减少免疫原性和免疫效应介导的脱靶不良反应。在HNSCC的临床前模型中，MM-121降低了HER3的磷酸化。此外，在HNSCC的细胞系和动物模型中，MM-121与西妥昔单抗联合用药通过抑制HER3、EGFR、PI3K/Akt和胞外信号调节激酶的活化显示出更有效的细胞和肿瘤生长抑制。同时发现，西妥昔单抗耐药的HNSCC模型中HER3上调，并且在HNSCC中，EGFR和HER3的双重靶向优于单独EGFR靶向。然而在进入临床后，MM-121虽可与几种药物安全联合使用且耐受性良好，但未产生明显的临床获益。Elgemtumab（LJM716）是从Morphosys HuCal Fab噬菌体展示文库中分离的全人源IgG1单抗，由瑞士诺华公司和法国赛诺菲安万特公司开发。LJM716可与位于HER3胞外结构域Ⅱ和Ⅳ之间的界面构象表位结合，将HER3捕获在无活性构象中并抑制配体依赖性和独立的HER3信号传导激活。LJM716在体内异种移植研究中显示出有效的抗肿瘤作用，并且在相关肿瘤模型中证明了与曲妥珠单抗或西妥昔单抗联合使用的肿瘤生长抑制效果。在日本1项对HNSCC、胃癌、HER2过表达乳腺癌患者的临床研究（NCT01911936）中，LJM716表现出良好的耐受性，并且队列中观察到一定程度的肿瘤缩小。该研究推荐扩增剂量为每周1次40 mg/kg QW（NCT01598077）。REGN1400是全人源IgG单抗，由美国再生元公司开发，可抑制HNSCC和乳腺癌细胞系及异种移植物的NRG结合、HER3和Akt的磷酸化以及这些肿瘤细胞系和异种移植物的体外生长。REGN1400联合抗EGFR或抗HER2抗体可更有效地抑制肿瘤生长，同时还会增加HNSCC异种移植模型中抗EGFR治疗的敏感性。REGN1400在Ⅰ期临床试验（NCT01727869）中，作为单药治疗或与厄洛替尼或西妥昔单抗联合使用，表现出良好的安全性和耐受性，该研究还计划在HNSCC和结直肠癌扩大队列。Patritumab（AMG-888，U3-1287）是全人源IgG1单抗，可抑制配体与HER3的结合并诱导受体内化和降解，由日本第一三共公司开发，是目前在临床开发中进展最快的HER3靶向药物。此外，没有检测到针对Patritumab的人抗人抗体，初步结果表明高HER3表达或扩增与临床疗效之间存在相关性趋势。Patritumab在HNSCC细胞和异种移植物中也显示出其作为单药以及与帕尼单抗联合使用的潜力。在HNSCC和肺癌模型中，Patritumab增强了放射敏感性。在2项Ⅰ期临床试验（NCT00730470和JapicCTI-101，262）中，U3-1287治疗耐受性高达20 mg/kg，具有良好的耐受性和良好的药代动力学特征。在另1项已经完成的Ⅰ期临床试验（NCT02350712）中，U3-1287（18 mg/kg负荷剂量，9 mg/kg维持剂量）联合西妥昔单抗和铂类治疗在HNSCC中可耐受且有效。GSK2849330是由英国葛兰素史克公司开发的IgG1/IgG3嵌合、糖工程人源化的单抗，针对HER3胞外结构域Ⅲ，由于分别与人Fc-γ受体（FcyRⅢa）和人补体蛋白C1q具有高结合亲和力，因此可以增强ADCC和CDC，也可以阻断癌细胞中的HER3/NRG1的信号传导，在NRG1融合肿瘤中表现出较好的抗肿瘤活性。GSK2849330在Ⅰ期临床试验（NCT01966445）中表现出良好的耐受性和安全性，每周30 mg/kg未出现剂量限制性毒性，同时观察到的最大血浆浓度为778.47 μg/ml。AV-203（CAN017）是由美国AVEO公司和美国Biogen公司开发的人源化IgG1κ单抗，可以阻断NRG1与受体的结合并诱导HER3降解。AV-203对患者来源的肿瘤异种移植模型（包括HNSCC、非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌等）显示出临床前活性。此外，NRG1表达水平可预测AV-203在临床前人类癌症模型中对HER3抑制的反应。Ⅰ期临床试验（NCT01603979）证实，AV-203在最大剂量（每2周20 mg/kg）以下是安全的且耐受性良好。Lumretuzumab（GE-huMab-HER3，RG7116，RO5479599）是由瑞士罗氏公司开发的糖工程人源化IgG1单抗。该抗体与HER3的结构域Ⅰ结合，通过阻断HER3胞外结构域和NRG结合来抑制HER3信号传导的激活。其Fc区被糖化工程化以增加对免疫效应细胞上FcyRⅢa的亲和力。与非糖工程抗体相比，这种单抗使得ADCC在体内和体外都能得到更有效的激活。由于Lumretuzumab已被证明在体外存在和不存在HRG的情况下都能阻断HER3活化，因此Lumretuzumab不仅在治疗上靶向依赖于活性HER3信号传导的细胞，而且还靶向那些在细胞表面表达非活化HER3的细胞。在与HNSCC相关的临床试验NCT01482377中，RG7116加西妥昔单抗/厄洛替尼的Ⅰb期研究发现NRG是实体瘤患者的潜在生物标志物；此外，队列中有2例高HRG mRNA表达水平的患者获得了出乎意料的受益，其中1例HNSCC患者达到延长的完全缓解，1例卵巢癌患者达到延长的部分缓解。SIBP-A03是由上海生物制品研究所有限责任公司自主研发的IgG1单抗，为国内首家获得临床批件的抗HER3抗体药物。SIBP-A03与HER3的结构域Ⅲ结合，在黑色素瘤（A431细胞系）、胰腺癌（Bxpc3细胞系）的体外试验和小鼠肿瘤模型中，表现出明显的肿瘤生长抑制作用，并且与西妥昔单抗联合使用具有一定的协同作用。Ⅰa期临床试验（NCT05203601）正在进行中，患者队列主要为晚期HNSCC或乳腺癌患者。HMBD-001是由新加坡蜂鸟生物科技公司开发的IgG1抗体，已进入临床阶段。它直接结合并阻断HER3的异二聚化界面，并有可能抑制HER3的配体依赖性和独立激活以及致癌信号传导，通过靶向位于HER3与HER2或EGFR形成异二聚体的界面的关键表位，抑制所有HER3异二聚化的过程。在评估HMBD-001的临床前模型中，观察到HMBD-001与其他现有的抗HER3抗体相比，具有更好的亲和力和更强的肿瘤抑制作用。HMBD-001近期的开发计划或将侧重于4种适应证：NRG1融合驱动型癌症、转移性去势抵抗性前列腺癌、转移性结直肠癌和HNSCC。2.2双抗临床开发中与HNSCC相关且靶向HER3的双抗汇总如下。Duligotuzumab（MEHD7945A，RG7597）是由美国基因泰克公司开发的、靶向EGFR和HER3的全人源IgG1双抗，从噬菌体展示Fab文库中分离出来，包含2个相同的Fab。MEHD7945A在几种临床前模型中强烈抑制肿瘤包括人表皮样癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、HNSCC和肺癌生长，特别是与化疗联合使用时。MEHD7945A单药治疗或与顺铂联合使用，在来自HNSCC和非小细胞肺癌的厄洛替尼和西妥昔单抗的耐药模型中证明了其疗效。值得关注的是，MEHD7945A还能诱导ADCC。然而2项临床试验（NCT01207323、NCT01577173）的结果显示，MEHD7945A的活性与西妥昔单抗相似，但并未展现出优于西妥昔单抗的效果。Zenocutuzumab（Zeno，MCLA-128）是荷兰Merus公司开发的靶向HER2（结构域Ⅰ）和HER3（结构域Ⅲ）的IgG1双抗，可以与HER2对接并阻断与HER3结合的配体，通过HER2-HER3异二聚体抑制致癌信号传导；同时由于IgG1的糖工程修饰还具有增强的ADCC活性。除了在对HER2靶向治疗（曲妥珠单抗和T-DM1）耐药的模型及乳腺癌、胃癌和胰腺癌模型中显示出疗效，该抗体在化疗耐药NRG1融合阳性转移性癌症患者中也显示出疗效，抑制NRG1融合阳性癌症模型的生长，在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中也报告了良好的耐受性和抗肿瘤活性。SI-B001是四川百利天恒药业股份有限公司开发的靶向EGFR和HER3的IgG-单链Fv（ single-chain antibody fragment，scFv）2 四价双抗，由 1 个完整的IgG组成，具有2条重链和2条轻链，以及2个scFv段连接到重链或轻链的C端或N端。SI-B001在结肠癌、HNSCC或食道癌异种移植模型中证明了其疗效，在后两种模型中几乎完全抑制了肿瘤的生长，目前正在进行的国内外临床试验（NCT05022654、NCT05044897、NCT05054439、CTR20211979、CTR20212937）的患者队列选择也多为HNSCC及食管癌。MM-111是由美国Merrimack公司开发的靶向HER2和HER3的双抗，由2种不同的单链抗体组成，分别识别HER2和ErbB3，并融合到重组的人血清白蛋白分子的一侧，以延长体内半衰期。MM-111能够同时结合HER2和HER3形成无活性受体/三聚体复合物，最终导致体外和体内肿瘤细胞生长的抑制。此外，HER3结合scFv后可以阻断NRG与HER3的结合，并且在NRG刺激细胞时增强MM-111的抗增殖作用。然而，MM-111的治疗效果取决于两种受体的同时结合，并且MM-111的相对作用与癌细胞HER2过表达的水平相关。综上所述，研究结果表明MM-111可能对靶向也表达HER3的HER2过表达肿瘤有效。然而Ⅱ期临床试验中，MM-111加用紫杉醇+曲妥珠单抗后未改善无进展生存时间或总生存时间，导致进一步研究被终止。Istiratumab（MM-141）是由美国Merrimack公司开发的靶向ErBB3和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）1 受体（IGF1 receptor，IGF1R）的四价双抗，由抗IGF-1R人IgG1抗体组成，重链羧基末端与两个抗HER3 scFv融合。该抗体的开发是基于仅靶向IGF-1R的抗体由于HER3介导的补偿信号传导而导致有效性低下的假设。MM-141可以在抑制NRG与ErbB3结合的同时抑制IGF-1/IGF-2与IGF1R的结合，并阻断下游PI3K/Akt途径信号传导，被证明可以增强化疗药物和mTOR抑制剂的抗肿瘤活性。在转移性胰腺癌相关的Ⅱ期临床试验（NCT02399137）中，MM-141联用化疗药物未能改善疗效，并且血清高IGF-1水平也被认为不是不良预后因素。然而鉴于其靶向广泛的受体谱，或许需要更多的研究来准确了解其在除转移性胰腺癌之外的人类肿瘤治疗中，相对于单特异性抗ErbB3抗体或双重特异性抗ErbB3-EGFR或抗ErbB3-抗HER2抗体的优越性。2.3ADC日本第一三共公司开发的ADCU3-1402（Patritumab deruxtecan，HER3-Dxd）是由裸抗U3-1287（Patritumab）和含有拓扑异构酶Ⅰ抑制剂依喜替康（exatecan，MAAA-1181a，Dxd）的药物接头共价偶联而成，每个抗体连接有8个Dxd。U3-1402的连接子和小分子药物与当下已获批上市的HER2 ADCDS8201一致，不但可以同其裸抗U3-1287一样通过与癌细胞表面的HER3特异性结合抑制HER3激活的信号传导；同时在被高效内吞到癌细胞内并转移到溶酶体后释放出依喜替康，可以诱导DNA损伤和细胞凋亡，具有一定的旁观者杀伤作用。U3-1402的临床试验已进展到Ⅲ期，但其主要研究方向目前并不在HNSCC，而在非小细胞肺癌和乳腺癌方面。鉴于其裸抗U3-1287在HNSCC中表现出来的治疗潜力，有理由相信这一ADC临床候选药物也能在HNSCC治疗领域展现出更多惊喜。此外，Capone等的基于自研抗HER3抗体EV20研发了多个ADC：EV20-Sap、EV20/MMAF、EV20-sss-vc/MMAF以及EV20/NMS-P945。其中，EV20/NMS-P945所偶联的是DNA小凹槽烷化剂NMS-P528，具有良好的终末半衰期和稳定性，并且耐受性良好，对包括HNSCC、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌的模型都具有一定的治疗活性。2.4其他HER3相关HNSCC治疗策略2.4.1  Pan-HER治疗策略  Sym013由3对协同单抗的混合物组成，分别靶向EGFR、HER2和HER3，目的是防止和抑制任一种EGFR的代偿性激活。Sym013促进受体的降解，诱导ADCC和CDC，在配体存在下起作用并抑制PI3K和胞外信号调节激酶途径的激活。用Sym013在体内和体外针对100多种癌细胞系进行测试，可显著减弱癌细胞增殖并优于参考抗体（西妥昔单抗、曲妥珠单抗和MM-121）的活性。值得一提的是，Sym013可有效抑制化疗和HER靶向治疗耐药模型（例如西妥昔单抗、曲妥珠单抗和T-DM1）的生长。在非小细胞肺癌和HNSCC异种移植物（包括西妥昔单抗耐药模型）中，Sym013与单次或分次放射治疗（放疗）联合使用显示出更好的抗肿瘤作用和延迟再生。临床试验NCT02906670纳入32例既往未接受过EGFR/HER靶向治疗的患者，其中2例HNSCC患者每2周9 mg/kg治疗后病情稳定，1例病情稳定超过20周。但遗憾的是该药物相关的临床试验后因业务原因提前终止。2.4.2  CAR-T治疗策略  LEU-001是由伦敦国王大学开发的T4免疫疗法，包含表达T1E28z的工程自体T细胞，是一种与ErbB家族中包含HER3的几个成员结合的第2代CAR，以及一种嵌合细胞因子受体4αβ。它可将IL-4提供的弱促有丝分裂刺激转化为强而具选择性的生长信号，从而允许T4 T细胞在体外优先扩增和富集。LEU-001在体内对HNSCC细胞系和肿瘤发挥抗肿瘤活性，无明显毒性，目前主要研究方向是用于HNSCC的瘤内治疗。2013年3月，1项开放标签、非随机、剂量递增、单组、安全性的Ⅰ期临床研究（NCT01818323）在英国HNSCC患者中开展。2019年1月在欧盟CAR-T大会上公布的结果显示，15例注射患者中有9例生存率有潜在改善。2.4.3  HER3疫苗治疗策略  目前有2项HER3疫苗的临床试验——NCT0434874和NCT03832855。NCT03832855是名为pING-hHER3FL的研究性癌症疫苗的Ⅰ期临床试验。pING-hHER3FL为环状DNA，可产生全长人HER3，在研究中用作免疫治疗剂靶向已知表达HER3的癌症，包括HNSCC。2.4.4  抗金属蛋白酶制剂治疗策略  人ADAM17抑制抗体D1（A12）是特异性人ADAM17抑制抗体，可在体外和体内抑制EGFR配体和TNFα脱落。ADAM17是金属蛋白酶，也称TNFα转换酶，可将膜结合的TNFα前体释放成可溶形式，可以抑制EGFR、HER2、HER3和HER4多个酪氨酸残基的磷酸化。D1（A12）在体外可显著抑制HNSCC细胞系的增殖，降低了 HNSCC中的促肿瘤信号传导，未来或可作为治疗EGFR TKI耐药HNSCC的有效靶向药物之一。3小结与展望本综述总结了 HNSCC中HER3的作用机制、HER3靶点与HNSCC当下治疗策略的关系，以及靶向HER3或与HER3相关的HNSCC治疗策略。其中大多数与HNSCC中HER3相关的治疗策略都处于临床前开发阶段，同时目前尚无专门针对HER3的治疗方法被批准用于临床。然而，许多上文提及的药物都在针对HNSCC患者的研究中显示出显著的疗效。HER3在治疗获得性耐药和整体HER信号传导中起着至关重要的作用。因此，从HER3作用机制和临床或临床前单一用药的结果而言，同时抑制HER3以及其他RTK（包括EGFR家族成员）可能有助于患者获得更大的临床益处，即单纯的抗HER3单抗治疗策略可以通过与西妥昔单抗、曲妥珠单抗、化疗、放疗、免疫治疗联用，来达到更好的治疗效果。自1986年美国FDA批准第1个治疗性单抗药物以来，靶向药物从适应证探索到技术改进，从临床研究到商业化策略，各个方面日趋成熟。近几年，最令人期待的应当就是ADC。鉴于DS8201在HER2低表达患者中表现出的优异疗效，以及HER3 ADCU3-1402中裸抗U3-1287在HNSCC中表现出的治疗潜力，希望靶向HER3的ADC未来也能在HNSCC治疗中展现出更多的惊喜。目前在HNSCC中的靶向HER3治疗基本都经历了漫长的研发和不断试错的过程，都是来之不易的成果。面向未来，我们还需将研发侧重于：（1）加深对HER3靶点作用机制的认识，如处于研发阶段的抗HER3单抗应尽可能多地尝试与临床一/二线药物联用，或探索治疗获得性耐药的HNSCC难治患者的治疗潜力；（2）探索开发更多革新的技术，如双抗、ADC、使用2种以上不同有效载荷组合的ADC、核素偶联药物等。更大程度扩展可用于治疗HNSCC患者的武器库，有助于实现HNSCC的持久治愈和无复发生存。作者章权综述  瞿爱东审校上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室，上海 200051通信作者：瞿爱东，Email: quaidong1@sinopharm.com引用本文：章权, 瞿爱东. 靶向HER3治疗在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(6): 381-390.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230220-00018识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

中文摘要目的   构建人源化抗人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3，HER3）单克隆抗体（单抗）并对其成药性进行初步评估。方法   通过互补决定区（complementarity-determining region，CDR）移植对鼠抗HER3单抗进行人源化，然后对骨架区一些位点氨基酸进行回复突变以恢复人源化抗体的亲和力。对重组表达的人源化抗体用聚乙二醇沉淀法检测其在不同缓冲液中的溶解度，并通过测定内源荧光评估其高级结构。结果   经CDR移植及回复突变的抗HER3人源化抗体具有与嵌合抗体相当的亲和力，且人源化抗体具有较好的溶解度及典型的抗体内源荧光特性。结论   成功人源化了鼠抗HER3单抗，人源化后的抗体具有开发成临床药物的潜力。正文人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER）3在肿瘤的发生、进展等方面起重要的作用。HER3通常与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）或HER2形成异二聚体而发挥作用，在癌症病理组织中，EGFR、HER2过表达常常伴随着HER3的过表达，并且HER3过表达被认为对EGFR、HER2靶向治疗产生耐药性起到重要作用。目前已有多种靶向HER3的抗体类药物进入临床研究，显示了良好的治疗潜力。HER3与配体神经调节蛋白（heregulin，HRG）结合后构象发生变化，暴露出与EGFR、HER2结合的位点，进而与EGFR、HER2形成异二聚体，激活细胞内信号，促进肿瘤细胞增殖。我们前期筛选出抗HER3鼠单克隆抗体（单抗）1044，发现该单抗可阻断HER3与其配体HRG的结合，从而抑制其与HER家族其他分子形成异二聚体，该抗体可以和肿瘤表面HER3结合，并抑制人表皮鳞状细胞癌A431细胞的增殖，具有治疗多种HER3过表达肿瘤的潜力。由于鼠单抗在临床治疗时会引起人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）反应，因此在临床治疗中受到限制。目前，鼠单抗人源化已成为成熟的技术，可以很大程度地降低鼠单抗的免疫原性，已有很多人源化鼠单抗成功上市。本研究拟对抗HER3鼠单抗1044进行人源化改造，并对人源化后的抗体进行成药性初步评价。1材料与方法1.1菌株、细胞及质粒FreeStyle 293-F细胞及表达培养基购自美国Gibco公司，pSGHV0真核表达质粒由美国约翰霍普金斯大学医学院生物物理系Leahy博士惠赠。1.2主要试剂及设备定点突变试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司；Mabselect Sure亲和介质购自美国GE公司；利妥昔单抗（批号 H0709）、曲妥珠单抗（批号 N3674）购自上海罗氏制药有限公司；HER3胞外区重组蛋白由本研究室制备；羊抗人抗体购自美国Jackson ImmunoResearch 公司；聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI ）25000购自美国Polysciences公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000购自美国西格玛奥德里奇公司；聚山梨酯80购自艾万拓化工产品贸易（上海）有限公司；柠檬酸三钠、氯化钠购自德国默克公司；组氨酸、盐酸组氨酸购自上海协和氨基酸有限公司；α，α-双羧海藻糖购自美国Pfanstiehl公司；聚山梨酯20购自美国J. T. Baker公司；SDS-MW Analysis Kit购自美国贝克曼库尔特公司；SpectraMax M5酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司；7100毛细管电泳系统购自美国安捷伦公司；GLM芯片、ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统购自美国伯乐公司。1.3人源化抗体构建用MaXFlow3.6.4软件对鼠单抗1044可变区进行建模。将鼠单抗1044的互补决定区（complementarity determining region，CDR）移植到人抗体骨架区后，由上海钳尚生物技术有限公司合成人源化抗体可变区基因序列，然后将重链、轻链可变区（VH、VL）基因分别构建到含人IgG1重链恒定区及κ链恒定区的pSGHV0载体上。用定点突变试剂盒对人源化后的抗体骨架区VH38、VH48、VH67、VL64等位点进行回复突变并经测序确认。1044人鼠嵌合抗体及各回复突变人源化抗体在293F细胞中用PEI进行瞬时转染，瞬时转染的细胞培养上清液1 500×g离心后用ProteOn XPR36测定亲和力。最终选择的人源化抗体序列由上海奥浦迈生物科技有限公司进行CHO-K1稳定细胞株的构建，用稳定细胞株表达该人源化抗体，然后经Mabselect Sure Protein A亲和介质纯化得到人源化抗体，浓缩到60 mg/ml。1.4ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统测定抗体亲和力GLM芯片横向6个通道标记羊抗人抗体，将通道旋转90°变成纵向捕获293F细胞表达的嵌合抗体或人源化抗体，通道再转到横向，1一5号通道分别进样20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 nmol/L 的HER3胞外区蛋白，6号通道进样缓冲液，得到5个动力学反应曲线，分别代表不同浓度的抗原与捕获抗体的反应结果，用Langmuir模式计算嵌合抗体及各人源化抗体突变体的亲和力常数（KD）。1.5PEG沉淀法测抗体溶解度配置利妥昔单抗商业化产品制剂缓冲液FB1（90 g氯化钠、73.5 g柠檬酸三钠、7 g聚山梨酯80溶于1 L注射用水中，pH6.5）和曲妥珠单抗商业化产品制剂缓冲液FB2（0.3 g组氨酸、0.5 g盐酸组氨酸、0.08 g聚山梨酯20、18.9 g海藻糖溶于1 L注射用水中，pH6.0）。用去离子水配置2份质量分数40%的PEG 8000，pH分别调至6.5和6.0，然后分别用FB1和FB2稀释至不同的浓度。将60 mg/ml的抗HER3人源化抗体用超滤管分别超滤置换到100倍体积FB1和FB2中，终浓度均为20 mg/ml。然后将利妥昔单抗（FB1）、曲妥珠单抗（FB2）、抗HER3人源化单抗（FB1）、抗HER3人源化单抗（FB2）分别用对应的缓冲液（括号内）稀释至10 mg/ml，各取100 μl抗体与100 μl质量分数5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的PEG 8000在96孔板中混匀，反应10 min。1.6毛细管电泳检测抗体纯度取100 μg样品，加入70 μl样品缓冲液，使最终体积为95 μl，再加入250 mmol/L的碘乙酰胺5 μl混匀，4 500×g离心1 min，65 °C水浴4 min，冷却到室温后，4 500×g离心1 min，取100 μl加入到毛细管电泳进样瓶中进行分析。采用非涂层-熔融石英毛细管（内径50 μm），有效长度为24.5 cm。5 kV反相极性电动进样20 s，分离电压15 kV，分离时间40 min，检测波长220 nm。1.7内源荧光检测抗体结构将样品分别用各自对应缓冲液稀释至1.0 mg/ml，加入比色皿中在SpectraMax M5上进行检测，激发波长295 nm，发射波长从310 nm扫描到450 nm，扫描步进为1 nm。2结果2.1抗体人源化将鼠单抗VH、VL氨基酸序列在人抗体库中进行Blast比对，分别选择与鼠抗体VH、VL相似度较高，同时在人体中分布比例较高，并且可变区无潜在糖基化修饰位点的人抗体种系序列为模板进行CDR移植。除了鼠单抗CDR-H1按照Chothia以结构建立的方法定义外，其他5个CDR区按照Kabat以序列变化性方法进行定义。人IGKV3-20*01氨基酸序列与鼠单抗1044 VL相似度为56.8%，该轻链在人体中分布比例较高，选择作为轻链人源化模板。人IGHV1-69*01氨基酸序列与鼠单抗1044 VH相似度为64.3%，该重链在人体中分布比例较高，选择作为重链人源化模板。将鼠单抗1044轻、重链CDR移植到人模板骨架区，人Jκ1序列替换鼠单抗Jκ区，人JH4序列替换鼠单抗JH区。人源化抗体构建制备流程见图1，鼠单抗及人种系骨架区序列对比见图2，鼠单抗可变区模拟结构见图3。在抗体结构中，VL1位点靠近轻链CDR-L3，可能会影响CDR-L3空间结构；VL2位点位于CDR-L1和CDR-L3之间，可能会对CDR-L1和CDR-L3空间结构产生影响；VH73位点靠近重链CDR-H1和CDR-H2，潜在地影响抗体重链CDR-L1和CDR-L2结构。因此在CDR移植过程中将这3个位点保留原鼠单抗氨基酸，得到人源化抗体Hum1044。CDR移植后的人源化抗体与HER3的KD值约为嵌合抗体的8倍，见表1，说明抗体人源化后与HER3的亲和力较嵌合抗体有所降低。VL64位点在抗体中非常保守，绝大部分抗体该位点为Gly，VL64与VL48、50、51、52位点形成CDR-L2标准结构，由于鼠单抗1044的VL64位点为Ser，为非标准结构，因此将VL64位点氨基酸回复突变为鼠单抗氨基酸。VH38位于VHβ折叠结构之间，可能会影响VH结构稳定性，因此将VH38位点回复突变为鼠单抗氨基酸。VH48、VH67位点靠近CDR-H2区，将这2个位点分别回复突变为鼠单抗氨基酸。VL64位氨基酸由Gly突变回鼠源Ser后，亲和力相比Hum1044有所提高，但比嵌合抗体亲和力依然低1/2，在此基础上对VH38或VH67位点回复突变后人源化抗体亲和力基本接近嵌合抗体，KD值相差在2倍以内，见表2。此外对其他一些位点也进行了回复突变研究，未发现对人源化抗体亲和力有明显提升。VL64、VH38回复突变后的序列作为最终的人源化抗体。2.2人源化抗体在不同缓冲液中的溶解度分析用PEG沉淀法来检测蛋白的溶解度。VL64、VH38回复突变后的人源化抗体在CHO-K1细胞进行重组表达，经Protein A亲和层析后，超滤置换入不同的缓冲体系中。PEG沉淀法结果表明（图4），在FB1中，5%PEG条件下人源化抗体开始出现沉淀，在FB2中，10% PEG条件下人源化抗体开始出现沉淀。相比FB1，在FB2中抗HER3人源化抗体溶解度明显较好。在毛细管电泳中，抗HER3人源化抗体在FB1中超滤置换后明显纯度降低，聚合体增加，而在FB2中超滤置换后纯度未发生明显变化，进一步证实在FB2中抗HER3人源化抗体溶解度较好，见表3。2.3人源化抗体内源荧光分析蛋白分子中的色氨酸、酪氨酸在合适的激发光下会发射荧光，尤其是色氨酸具有强的自发荧光。色氨酸、酪氨酸对蛋白微环境的变化比较敏感，当色氨酸、酪氨酸由蛋白疏水中心暴露于蛋白表面时，荧光图谱会发生红移现象。检测蛋白内源荧光可以判断蛋白结构的稳定性。对抗HER3人源化抗体及曲妥珠、利妥昔单抗的内源荧光检测分析发现，抗HER3人源化单抗最大发射波长（λmax）为335 nm，曲妥珠单抗λmax为337 nm，利妥昔单抗λmax为348 nm，抗HER3人源化抗体与曲妥珠单抗λmax相近，具有较稳定的空间结构，利妥昔单抗λmax较大，结构稳定性稍差（图5）。3讨论抗体人源化中人骨架区的选择通常有2种：已知的成熟抗体和人种系序列。已知的成熟抗体骨架区通常含有体细胞突变位点，可能带来潜在的免疫原性。相比成熟抗体，人种系序列骨架区理论上免疫原性更低，而且结构更灵活，可塑性强，容易移植不同的CDR区。本研究选择了人种系序列骨架区进行人源化。由于人抗体种系基因在人体中的使用频率具有一定的偏向性，选择使用频率高的种系骨架区人源化后的抗体具有免疫原性低、表达量高、结构稳定等优点，因此本研究在人源化时并未选择与鼠源抗体相似度最高的种系序列，而是兼顾相似性及人体使用频率，选择了IGKV3-20*01和IGHV1-69*01两个序列的骨架区进行人源化。最终获得的抗HER3人源化抗体与嵌合抗体具有相近的亲和力，证实选用的骨架区是合适的。CDR移植后的抗体通常会丧失抗原结合能力或者结合力降低，需要对骨架区的一些关键位点进行回复突变以恢复其抗原结合能力。本研究在对抗HER3鼠单抗及人源化序列骨架区的比对中发现VL64位氨基酸在人源化中发生了改变，该位点通常参与CDR-L2标准结构的构成，该位点回复突变后亲和力明显提升，已接近嵌合抗体亲和力。在此基础上经过一些位点的回复突变，最终抗HER3人源化抗体的KD恢复到嵌合抗体KD的2倍以内。一般抗体药物在人体使用的剂量相对较大，抗体具有较高的溶解度才可能具备一定的成药性。溶解度既与抗体的物理化学性质，如等电点、表面疏水性、轻重链之间的结合力等相关，又与抗体所在的缓冲液体系有关。抗HER3人源化抗体在不同的缓冲体系中表现出不同的溶解度，在组氨酸缓冲液中溶解度优于柠檬酸缓冲液，针对抗HER3人源化抗体的制剂缓冲液尚未优化筛选，后续随着制剂缓冲体系的进一步优化，抗HER3人源化抗体可能表现出更优的溶解度。抗体内源荧光λmax可以反映抗体分子中色氨酸、酪氨酸的空间分布情况，抗HER3人源化抗体λmax与曲妥珠单抗相似，抗体中色氨酸、酪氨酸包埋较好，未暴露于溶剂中，证实人源化过程所选的人VH、VL骨架区模板结构稳定，与鼠单抗CDR区适配较好，且VH、VL能较好地配对在一起。本研究对抗HER3鼠单抗成功进行了人源化改造，人源化后的抗体达到与嵌合抗体相近的亲和力，通过对该人源化抗体溶解度及内源荧光的研究初步评价了其成药性，后续仍需对该人源化抗体的稳定性、体内外活性及安全性等进行深入研究，完善其成药性评价，支撑该抗HER3人源化抗体的进一步开发。作者梁红远  李翱翔  张坤明  祝婧烨  张琳  邱建华  赵鑫  宋效飞  瞿爱东上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室，上海  200051通信作者：瞿爱东，Email：quaidong1@sinopharm.com引用本文：梁红远, 李翱翔, 张坤明, 等. 抗HER3单克隆抗体的人源化及成药性初步评价 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 247-252.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230627-00056

摘要嵌合抗原受体-T（Chimeric antigen receptor-T，CAR-T）细胞疗法是一种革命性的过继性细胞疗法，它可以改造T细胞并将其重新定向到特定的肿瘤细胞。自CAR-T细胞疗法于2017 年首次获准用于B细胞衍生恶性肿瘤以来，它在血液肿瘤领域取得了前所未有的进展，近年来，它极大地重塑了癌症治疗的格局。目前，累积的证据表明，CAR-T细胞疗法可以成为实体瘤的可行治疗策略。然而，由于肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用和肿瘤抗原的异质性，CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用需要绕过更多具有挑战性的障碍。乳腺癌具有侵袭性强、恶性程度高、预后差的特征。本综述强调了CAR-T细胞疗法在乳腺癌中的基本靶点，总结了与CAR-T细胞疗法相关的挑战，并提出了应对这些挑战的策略，为乳腺癌治疗提供了一种新方法。引言根据2020年最新的全球癌症统计数据，乳腺癌已超过肺癌，成为最常诊断出的癌症。约有230万新确诊病例和68万死亡病例。乳腺癌因其恶性程度高、预后极差，严重威胁着妇女的健康。根据雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人类乳腺癌受体（human epidermal receptor 2, HER2）的表达水平，乳腺癌可分为以下亚型:基底样乳腺癌、管腔A型乳腺癌、管腔B型乳腺癌、三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）和HER-2扩增亚型。手术、化疗和放疗仍是乳腺癌的主流治疗手段。治疗后乳腺正常组织受损、复发、转移等致命并发症严重制约了乳腺癌的治疗效果。曲妥珠单抗等靶向疗法的不断临床应用使HER2阳性乳腺癌患者预后得到改善，不良反应更少。然而，由于靶向疗法的分子特异性，其总体治疗效果仍然有限，因此迫切需要替代疗法。TME由肿瘤细胞、免疫细胞、间充质细胞、分泌的趋化因子和免疫细胞组成、 免疫细胞、间充质细胞以及分泌的趋化因子和细胞因子组成，共同调节肿瘤细胞的生理过程。近几十年来，TME在肿瘤发生过程中的调控机制已被阐明，肿瘤浸润免疫细胞在TME中发挥着重要作用。基于免疫检查点如程序性死亡-1/程序性死亡配体-1（programmed death-1/programmed death ligand-1，PD-1/PDL1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4）的免疫疗法已广泛应用于多种肿瘤。抑制免疫检查点可以阻断免疫细胞中的免疫抑制信号，激活免疫细胞识别并消灭肿瘤细胞。肿瘤细胞。免疫疗法在肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌中取得了令人满意的临床治疗效果，振兴了癌症治疗领域。CAR-T细胞是人工制备的T细胞，其表面表达一种合成的肿瘤细胞特异性受体。CAR-T细胞的制备过程如图1所示。T 细胞最初从外周血单核细胞中分离外周血单核细胞中分离出来，并用慢病毒转染以表达CAR。经修饰的CAR-T细胞随后在体外扩增，并回输到患者体内。CAR-T细胞可以识别特定的肿瘤抗原抗原，激活免疫反应，最终消除肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法在治疗血液肿瘤方面取得了治疗血液肿瘤取得了令人瞩目的成就。自2017年以来美国食品和药物管理局已批准六种CAR-T细胞用于血液肿瘤治疗。（图2）CAR-T细胞疗法对血液恶性肿瘤的显著效果，促进了它在包括乳腺癌在内的实体瘤中的应用。在这篇综述中，我们介绍了新型CAR-T细胞工程策略，总结了乳腺癌中的潜在靶点和临床试验，并讨论了CAR-T细胞疗法面临的挑战和CAR-T细胞疗法的工程策略。图1 工程化CAR-T细胞制造流程图。首先，从患者身上抽取血液样本。其次，从人血液样本中分离并收集T细胞。然后，将慢病毒转染到患者的T细胞基因组中，促进T细胞表达人工修饰的car。最后，设计的CAR-T细胞在体外大量扩增并注射到肿瘤患者体内。 CAR的构建 CAR 根据其结构和功能分为四个主要部分结构和功能，包括：抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和一个细胞内信号域。具体结构如图3所示。在CAR的开发过程中优化四个结构域可以显著增加在肿瘤治疗中的安全性和有效性。抗原结合域位于CAR-T细胞的细胞外膜上，主要作用是识别肿瘤抗原和将识别到的抗原信号转导到细胞中。抗原结合区是一个单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv），由可变的重链和链接了Gly4Ser肽的轻链抗体组成，是CAR中最常见的连接子。scFv序列通常是源自小鼠或人类的单克隆抗体的一部分。目前，更小的天然的克隆抗体（纳米抗体）也被设计用于scFV序列。该结构域能识别细胞肿瘤特异性抗原并激活T细胞，它与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子无关。它为克服肿瘤细胞中MHC分子下调导致的免疫逃逸提供了一种方法。抗原结合区的识别能力和亲和力直接影响CAR-T细胞的抗肿瘤效果。铰链区负责连接细胞外抗原结合域和细胞膜的跨膜区域。它为抗原结合域提供了灵活性，以应对与肿瘤细胞结合时的空间障碍。使得CAR-T细胞就能更容易地识别肿瘤细胞并与之相互作用。跨膜结构域连接CAR-T细胞的胞内和胞外结构域，将CAR的基本结构固定在细胞膜上。Ⅰ型蛋白是跨膜区的主要成分，如CD3ξ、CD4、CD28或者CD8α。Savoldo等人发现相比于含有CD3ξ的跨膜结构域，含有CD28的跨膜结构域结构更加稳定。细胞内信号结构域是 CAR 的细胞内定位成分，通常由激活结构域和共刺激结构域组成。激活结构域和共刺激结构域。肿瘤抗原的识别信号传递给CAR-T细胞，激活胞内信号结构域，促使T细胞消灭肿瘤细胞。CAR的大多数激活结构域来源于基于酪氨酸活化模体的CD3ξ免疫受体。然而，仅靠CD3ξ传递的激活信号还不足以诱导T细胞产生持久的免疫反应。因此，在CAR的结构中引入了OX40、CD27、CD28、4-1BB或ICOS等共刺激结构。研究发现，激活共刺激结构域可通过产生IL-2等细胞因子，显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤效果和持久性。图2 FDA批准CAR-T细胞用于肿瘤治疗的过程 CAR-T 细胞疗法的发展 随着生物技术的进步，CAR-T细胞已经发展了几代。发展过程如图3所示。图3 CAR-T细胞的基本结构图和从第一代到最新一代CAR-T细胞的发展流程图。CAR-T细胞的基本结构由细胞外肿瘤抗原结合域、铰链域、跨膜域和细胞内信号域组成。第一代CAR-T细胞仅包含CD3z胞内信号域。第二代或第三代CAR-T细胞在上一代CAR-T细胞的基础上增加了一个或多个共刺激分子。下一代CAR-T细胞应用了多种新的工程策略，包括双特异性car、开关、纳米抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9和细胞因子途径第一代CAR-T细胞仅通过CD3z结构域的胞内区域传递激活信号。由于缺乏共刺激信号导致CAR-T细胞死亡较快，它们在临床试验中的疗效有限。在上一代CAR-T 细胞构建的基础上，第二代CAR-T细胞加入了共刺激信号结构域4-1BB或CD28。两种信号共同激活大大提高了CAR-T细胞的肿瘤杀伤效力和持久性。多项临床试验证实，靶向CD19的第二代CAR-T细胞在 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic Leukemia，B-ALL）治疗中取得了显著的临床疗效。此外，为了进一步提高CAR-T细胞的活化能力，第三代CAR-T细胞设计了额外的共刺激信号分子的。这一代CAR-T细胞通常使用 CD27、CD28、ICOS、4-1BB 和 OX40 等成本刺激信号分子，其抗肿瘤疗效优于前代产品。第三代CAR-T细胞已成为构建CAR 结构的主要广泛应用技术。NKG2D带有CD27或4-1BB共刺激信号分子的CAR-T细胞可以在没有 IL-2的情况下促进CAR-T细胞的扩增和自我富集，从而有效提高识别和消除乳腺癌的能力。靶向表皮生长因子受体CAR-T细胞含有CD28、4-1BB和CD3ξ共刺激信号分子对肿瘤有很强的抑制作用。此外，人们还开始采用一些新的策略来寻找治疗效果更好、不良反应最小的 CAR-T 细胞疗法。研究发现，CD28 可促进细胞因子分泌，4-1BB可增加T细胞增殖，CD27可提高T细胞存活率。第四代靶向FRα CAR-T细胞含有共刺激域CD28、4-1BB和CD27，由于这三个共刺激域的综合优势，对乳腺癌具有更优越的疗效。开关结构包括与肿瘤抗原特异性结合的Fab分子和与CAR-T细胞特异性结合的肽表位。CAR-T细胞只与开关的肽表位结合，而不与内源性组织或肿瘤细胞上的抗原结合。因此，识别和激活过程严重依赖于开关的存在。与传统的CAR-T治疗相比，这种开关策略可以通过控制 CAR-T 细胞的活性和细胞因子的释放来减少不良反应的发生。在单链CAR结构中设计两个配体结合域是一种更有效识别肿瘤细胞的策略。CAR可识别两种不同的肿瘤抗原， 其中任何一种都足以激活T细胞。这种激活模式明显提高了识别肿瘤细胞的效率。在Yang等人的研究中，一种二价串联CAR（TanCAR）旨在同时靶向CD70和B7-H3，从而增强了抗肿瘤功能，改善了乳腺癌抗原异质性和变异性问题。信号传输结构域是目前CAR中的新结构域，可能是除共刺激结构域之外激活 CAR-T 细胞功能的另一个重要信号。Kagoya等人设计了新一代CAR-T细胞，与传统CAR- T细胞相比，它增加了一个新的信号分子域。该信号结构域由IL-2受体β链和STAT3结合酪氨酸-X-X-谷氨酰胺（tyrosine-X-X-glutamine，YXXQ）模体构建而成。与传统的CAR-T细胞相比，这些新型CAR-T 细胞能通过激活JAK激酶和STAT3/STAT5转录因子信号通路，提高增殖、抗肿瘤能力和持久性。 CAR-T细胞在乳腺癌中的治疗靶点 在实体瘤中，CAR-T 细胞的构建更为复杂，靶向肿瘤特异性抗原的识别是 CAR-T 细胞疗法面临的重要挑战。多年来，一些肿瘤表面抗原已被确定为乳腺癌 CAR-T 细胞疗法的治疗靶点。在接下来的章节中， 我们将总结CAR-T 细胞治疗乳腺癌靶点的一些最新进展。此外，表1列出了总结的靶点信息。瘤细胞特异性受体。CAR-T 细胞的制备过程如表1所示。 表1 CAR-T疗法治疗乳腺癌的靶点汇总HER2人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是研究最广泛的乳腺癌分子之一，20%-25% 的乳腺癌患者HER表达升高。HER2的过度表达与乳腺癌转移和复发率较高有关。自1998年FDA批准曲妥珠单抗以来，使用单克隆抗体的特异性彻底改变了HER2阳性乳腺癌的主流治疗理念。虽然HER2 靶向疗法已广泛应用于乳腺癌患者，并取得了良好的治疗效果，但耐药性仍限制了其对患者的治疗效果。构建的HER2靶向CAR-T细胞能主动识别肿瘤，并在肉瘤临床试验中取得了更好的疗效和安全性。Gábor等人设计了带有曲妥珠单抗衍生scFv和CD28的共刺激结构域 HER2靶向CAR-T细胞。结果显示，在这些曲妥珠单抗耐药的乳腺癌患者中，只有 7% 的CAR-T细胞在57天内实现了肿瘤完全缓解。细胞由 T 细胞组成。结果证实，少量的 CAR-T 细胞就能对抗肿瘤 HER2 抗体耐药的异种移植物产生强大的抗肿瘤作用。在另一项针对曲妥珠单抗耐药乳腺癌的研究中，以HER2为靶点的CAR-T细胞可渗入肿瘤球的核心区域，显示出肿瘤细胞的细胞毒活性，而抗HER2抗体则无效。此外，CAR-T细胞还能穿透肿瘤基质，根除曲妥珠单抗耐药乳腺癌异种移植物中的肿瘤。这项研究表明，CAR-T细胞可以通过掩蔽肿瘤表位和阻断乳腺癌肿瘤基质，有效克服抗体治疗失败的问题。同时，Saul等人通过正位异种移植模型发现，将HER2靶向CAR-T细胞送入脑部可对脑转移的乳腺癌产生较强的抗肿瘤作用，解决了肿瘤脑转移中药物难以突破血脑屏障的难题。HER3/4作为HER2的异二聚体和信号转导伙伴，HER3/HER4与乳腺癌的致癌信号转导和耐药性有关。Heregulin（HRG）是一种分泌于细胞内的可溶性生长因子，含有表皮生长因子亚域，与HER3/4受体有很高的亲和力。它能通过与特定受体结合，诱导HER酪氨酸激酶受体家族异源二聚化。HRG的这一细胞外结构域被设计用于构建HER3/4靶向的CAR-T细胞。体外实验和移植肿瘤模型发现，这些细胞能特异性识别HER3表达过高的乳腺癌细胞，并对其产生强烈的肿瘤杀伤作用。EGFR表皮生长因子受体（EGFR）是表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族的重要成员之一，在大约一半的TNBC中被发现过表达，在乳腺癌进展和恶性转化中具有重要的调控能力。EGFR激活与表皮生长因子受体结合后，其酪氨酸激酶结构域会发生自身磷酸化，并激活下游的PI3K/AKT 信号通路。EGFR特异性CAR-T 细胞已在肺癌中显示出抗癌潜力，并在胰腺癌Ⅰ期临床试验中显示出更好的安全性和抗肿瘤效果。Xia等人发现，EGFR靶向CAR-T细胞在体外对TNBC具有特异性和较强的肿瘤杀伤能力，这种能力在异种移植小鼠模型中得到了进一步证实。机制研究证实，EGFR靶向CAR-T细胞可激活TNBC细胞中的颗粒酶-穿孔素-PARP和Fas-FADD-caspase信号通路，这可能是提高抗肿瘤效果的重要机制。在另一项研究中，Liu等人设计了两种不同类型的EGFR靶向CAR-T细胞，它们的scFv区域具有不同的DNA序列。这些CAR-T细胞能识别EGFR高表达的TNBC细胞，并能够在体外试验和异种移植小鼠模型中触发TNBC细胞死亡。MSLN间皮素（MSLN）是间充质细胞表面的一种糖蛋白。研 究发现，它的表达在包括乳腺癌在内的各种癌症中上调，这使得MSLN靶向CAR-T细胞成为乳腺癌治疗的一种潜在意。Zhang等人设计了第三代MSLN靶向CAR-T细胞，该细胞含有CD28和4-1BB共刺激结构域。在体外和体内乳腺癌异种移植模型中，MSLN 靶向CAR-T细胞特异性地破坏了MSLN阳性的乳腺癌细胞系，并显著抑制了乳腺癌肿瘤的生长。同时还发现，在CAR- T细胞存在的情况下，T细胞和细胞因子分泌水平显著增加。ICAM1细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM1）是一种细胞表面跨膜糖蛋白受体，属于免疫球蛋白超家族。研究发现，ICAM1 的功能与肿瘤细胞粘附、细胞生长信号通路以及免疫细胞向炎症部位的转运有关。与正常乳腺组织相比，ICAM 在TNBC中的表达水平更高。ICAM1特异性scFv Mg2被选为细胞外抗原结合域。体外肿瘤细胞和TNBC小鼠模型实验显示，ICAM1靶向 CAR-T 细胞具有很强的特异性破坏TNBC细胞的能力，能显著降低TNBC肿瘤的生长，提高小鼠模型的存活率。AXLAXL是一种酪氨酸激酶受体（RTK），最初是在慢性骨髓性白血病患者身上发现的。AXL 在乳腺癌细胞膜中过表达，其过表达与患者生存率降低有关。以往的研究表明，它可能与肿瘤的生理过程有关，包括增殖、凋亡、迁移、炎症和血管生成。此外，它还能激活细胞内的各种下游信号通路，如 NF-kB、MAPK、mTOR、AKT 和PI3K。Wei等人构建了AXL靶向CAR-T细胞，并在体外检测了其对AXL阳性肿瘤的抗原特异性细胞毒性和细胞因子释放能力。实验结果表明， AXL靶向CAR-T细胞在TNBC异种移植模型中具有显著的抗肿瘤能 力和更强的持久性。MUC1MUC1 是一种跨膜粘蛋白，被大量糖基化，通常在大多数腺体上上皮细胞和器官上表达。在90% 以上的乳腺癌患者中发现了的过度表达和异常糖基化。异常糖基化的MUC1（tMUC1）可以是通过合成单克隆抗体特异性识别TAB004用于乳腺癌，但不用于正常结构。Zhou等人利用 TAB004 结构作为抗原结合域设计了MUC28z嵌合抗原受体。这些类型的CAR-T细胞在识别tMUC1后能增强细胞因子和趋化因子（如Granzyme B和IFN-γ）的表达和分泌。tMUC1靶向CAR-T细胞显示出显著的细胞毒性和抗肿瘤作用，并能减少 TNBC 肿瘤在体外和异种移植模型中的增殖和生长。GD2神经节苷脂（GD2）是一种酸性糖磷脂，有两个硅铝酸残基，被确定为乳腺癌干细胞样细胞的标志物。在TNBC 中，GD2 的表达水平上调。Seitz 等人设计了一种新型 GD2靶向CAR-T 细胞，用于识别和破坏 GD2 阳性的肿瘤细胞。该CAR中scFv的构建基于地纽昔单抗beta(dinutuximab beta)，一种单克隆抗体 CH14.18）。这项研究发现，GD2-靶向CAR-T细胞的激活可介导肿瘤细胞死亡，并阻止乳腺癌的恶化和转移。FRα叶酸受体α（FRα）是一种膜结合蛋白，对叶酸具有高亲和力，具有将叶酸转运到细胞内的功能。FRa在乳腺癌细胞表面过度表达，而在正常组织中则没有，因此FRα有望成为乳腺癌的靶向抗原。Luangwattananun等人通过慢病毒系统生成了FRα靶向CAR-T细胞。当这些特异性CAR-T细胞与表达FRα的TNBC细胞共培养时，具有显著的抗肿瘤能力。此外，其细胞毒性作用在FRα表达增加的细胞中更为明显，而在 FRa 阴性的正常乳腺细胞中则没有观察到。同时，CAR-T细胞对FRα阴性的MCF10A正常乳腺细胞不产生这种特异性细胞毒性。PD-L1程序性死亡受体 1（Programmed death receptor 1 ，PD-1、CD279）和程序性死亡配体1（PD-L1）可以激活免疫细胞抑制信号，其表达通常在持续T细胞活化的肿瘤患者中。靶向PD-L1是一个有前途的靶点，在多种肿瘤的临床试验中取得了良好的效果。目前已开发出一种嵌合PD-1（chPD1）受体，可识别乳腺癌中表达的PD- L1。Parriott等人设计了ChPD1-T细胞，通过分泌IL2、IL-17、IL-21、IFN g、TNF和GM-CSF 等炎症因子以及减少炎症抑制细胞因子IL-10来识别和破坏肿瘤细胞。ChPD1-T细胞明显减轻了肿瘤负荷，延长了肿瘤小鼠的无瘤生存期。Bajor等人发现，PD-L1靶向的CAR-T细胞在PD-L1表达较 高的TNBC细胞中表现出强烈的脱颗粒反应和细胞因子产 生。低PD-L1表达的肿瘤细胞与CAR-T细胞共培养可通过 诱导肿瘤细胞上的PD-L1表达而导致肿瘤细胞清除延迟。进一步的研究证实，HER-2靶向CAR-T细胞可提高乳腺癌细胞上PD-L1的表达水平，协同增强PD-L1靶向CAR- T细胞的肿瘤杀伤功能。PTK7蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）是受体酪氨酸激酶（RTKs）家族的重要成员，其胞内结构域可催化非活性酪氨酸激酶。PTK7的表达在乳腺癌中有所增加。我们构建了三种不同类型的PTK7特异性CAR（PTK7- CAR1/2/3），它们都含有人工修饰的PTK7特异性scFv结构域、CD8α分子跨膜结构域、CD3z 细胞内结构域序列和4-1BB 细胞内共刺激结构域。这些CAR-T细胞都能增加细胞因子的产生，并对高表达PTK7的乳腺癌产生细胞毒性，而不会对正常组织造成明显损伤。Trop2滋养层细胞表面抗原2（Trop2）是一种细胞表面糖蛋白，在TNBC中过表达，在肿瘤生长、增殖、迁移和转移 中具有重要功能。Chen等人开发了一种新型 Trop2靶向CAR-T细胞。通过体外实验，这些构建的CAR-T细胞对表达Trop2的乳腺癌细胞具有很强的肿瘤杀伤能力。在Trop2靶向CAR-T细胞中添加CD27可通过提高IL-7Ra的表达和降低PD-1的表达，提高其在肿瘤细胞和肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果。SLC3A2Ansari等人发现，肿瘤相关抗原 SLC3A2（一种细胞表面蛋白）的较高表达量对肿瘤的生长起着重要作用。预示着乳腺癌的预后较差。SLC3A2靶向CAR-T细胞通过同时刺激体外 INF-g和IL-2的产生，显示出对乳腺癌肿瘤细胞的细胞毒性。在体内异种移植模型中，SLC3A2-靶向CAR-T细胞显著提高了总生存率，并减少了皮下异种移植肿瘤的生长和肿瘤负荷，且无体重减轻和细胞因子释放综合征（CRS）。B7-H3B7-H3是一种免疫检查点分子，也被称为 CD276，属于免疫检查点抑制剂 B7 超家族。Chen等人发现，B7-H3在乳腺癌中过表达，B7- H3的上调与乳腺癌的不良预后和临床结果相关，这意味着B7-H3可能是CAR-T疗法 的前瞻性靶点。Lei等人发现，以 B7-H3 为靶点的CAR-T 细胞可以特异性地损伤表达 B7-H3 的实体瘤细胞， 包括乳腺癌。同时，低剂量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA通过增强B7-H3的表达，减少具有免疫抑制功能的CTLA-4和TET2的分泌，显著提高了体外B7-H3靶向CAR-T 细胞的抗肿瘤效果。CD70CD70是坏死因子受体超家族的重要成员，在细胞表面表达，并在多种肿瘤中广泛过表达。Yang等人设计了一种同时靶向CD70和B7-H3分子的二价串联CAR（Tan CAR）。改良后的 CAR-T 细胞能与 CD70 特异性结合，对 CD70 阳性的乳腺癌细胞具有更高的持久性和抗肿瘤能力。与单链特异性CAR-T细胞相比，当Tan CAR-T细胞作 用于同时表达两种靶抗原的乳腺癌细胞时，能提高诱导肿瘤细胞损伤和乳腺癌细胞释放细胞因子的能力。VEGRF2/3血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）在血管生成和淋巴管生成中具有重要的生理功能，而血管生成和淋巴管生成与肿瘤细胞的生长、侵袭、迁移和转移等分子和生物学功能密切相关。阻断或干扰血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体（VEGFR）之间的相互作用已成为一种可能的治疗方法。VEGFR-2和VEGFR-3是血管内皮生长因子受体（VEGFR）家族的重要成员，人们设计了以VEGFR-2或VEGFR-3为靶点的CAR-T细胞，以验证它们在乳腺癌治疗中的潜力。Xing等人发现，这些CAR-T细胞通过上调INF-γ、TNF和IL-2细胞因子的产生能力，对VEGFR-2/3阳性的 乳腺癌细胞表现出很强的细胞毒性。此外，靶向VEGFR-2/3的CAR-T细胞还能显著抑制裸鼠模型中异种移植肿瘤的增殖、侵袭和转移能力，并破坏内皮细胞的管状结构。TEM8肿瘤内皮标志物8（TEM8）是一种具有高度保守整合素的糖蛋白，参与内皮细胞的侵袭和转移，最初被视为肿瘤内皮标志物。TEM8在乳腺癌细胞中表达升高，TEM8的高表达与乳腺癌的高生长、高转移和高复发率有关。TEM8靶向CAR-T细胞可分泌免疫刺激细胞因子，并在TEM8 特异性识别后通过破坏TEM8 过表达的TNBC细胞和肿瘤血管内皮细胞来阻断肿瘤血管生成。这些细胞还能诱导TNBC衍生的异种移植瘤消退，并通过靶向干细胞样乳腺癌细胞对抗乳腺小球的形成。NKG2DLsNKG2D（Natural Killer Group 2，member D）是一种在NK细胞和T细胞中高度表达的受体。NKG2D配体（NKG2DLs）经常在包括乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞中上调。免疫细胞中的 NKG2D与肿瘤细胞上的NKG2DLs 相互结合，在激活免疫细胞的肿瘤杀伤效应方面发挥了重要作用。在体外，以NKG2DLs为靶点的CAR-T细胞能有效识别并清除过表达NKG2DLs的TNBC。此外，带有4-1BB或CD27分子的成本调控域可特异性增强CAR-T细胞的持久性。αvβ6整合素整合素αvβ6是异二聚体细胞表面受体家族的成员，介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的相互作用。avb6整合素在乳腺癌中上调，其过表达与癌症患者的预后有关。整合素αvβ6可激活TGFβ信号通路并促进细胞增殖和迁移、上皮-间质转化以及基质金属蛋白酶活性。通过将融合的CD28 + CD3结构域与源自口蹄疫病毒的A20肽相结合，构建了高度选择性的avb6靶向CAR-T细胞。IL-4 反应性融合基因（4αβ）在CAR-T细胞中共表达，以增加这些细胞的增殖和扩增能力和持久性体内细胞。Whilding 等人发现，αvβ6靶向CAR-T细胞在体内和体外对乳腺癌细胞具有很强的细胞毒性，而对正常 组织的损伤较小。CD32A131R抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是免疫细胞杀死肿瘤细胞的常用方法。肿瘤细胞的识别和溶解过程受抗体的 Fc 片段与免疫效应细胞的FcγR结构域结合亲和力的影响。CD32 是FcγR家族的成员，由三种不同的变体 A、B和C组成，它们对Fc片段具有亲和力。CD32A131R 是根据第131位的精氨酸定义的。Caratelli等人设计了一种低亲和力嵌合受体CD32A131R，通过与西妥昔单抗交联诱导消除表皮生长因子受体过表达的乳腺癌。这些 CAR-T 细胞能有效识别特定的西妥昔单抗结合的肿瘤细胞，并通过西妥昔单抗和CAR-T细胞的结合促进INFγ和TNF的表达和分泌。 CAR-T联合疗法 尽管CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗方面取得了重大进展，但仅靠CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效仍然有限。因此，仍然需要有效的方法来促进CAR-T细胞疗法。多项研究表明，CAR-T细胞的持久性和杀伤肿瘤能力受多种分子或基因表达的影响。我们总结了几种将CAR-T细胞与其他分子相结合以提高疗效的前瞻性方法。HER2靶向CAR-T的联合疗法Il-21是TME中的一种细胞因子，可促进T细胞增殖并驱动T细胞记忆效应，具有防止肿瘤转移或复发的功能。Du等人发现，IL-21能增强分化不良CAR-T细胞的聚集和扩增能力，并通过增加细胞因子，有效提高HER2 靶向CAR-T细胞对HER2-表达细胞的细胞毒性。他们的研究表明，在将HER2靶向CAR-T细胞与曲妥珠单抗耐药的 HCC1954和BT474细胞结合后，IL-21的加入能显著增加对曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞的强细胞毒性，并促进 IFN-γ和IL-2的合成和分泌此外，Li等人还发现，抗PD1抗体可以增强HER2靶 CAR-T细胞的治疗效果。在另一项同源小鼠模型研究中，加入抗PD1抗体后，更多HER2靶向CAR-T细胞驻留在肿瘤基质中，显著提高了识别肿瘤和维持 T 细胞持久性的能力。结果表明，抗PD1抗体可以提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力，并减轻肿瘤负荷。IKZF家族蛋白含有一个锌指结构域，可以识别特定的DNA序列，与其他蛋白结合，并通过重塑染色质和与RNA Pol II转录起始复合物结合来激活或抑制靶基因。在以HER2为靶点的CAR-T 细胞中敲除转录因子IKZF3，可以在不影响CAR细胞活性和功能的情况下， 通过增加 T 细胞的活化和增殖，显著提高杀伤癌细胞的能力。EGFR靶向CAR-T细胞的联合疗法聚胞苷酸（poly I:C）是一种合成的双链RNA（dsRNA）类似物。它能被dsRNA激活的toll样受体3（TLR3）和蛋白激酶（PKR）识别并结合。它可介导免疫功能，并对多种癌症具有广泛的抗肿瘤作用。EGFRVIII 靶向CAR-T细胞与Poly I: C的联合应用显著提高了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，促进了IFN g和IL-2的产生和分泌。它还改善了CAR-T细胞对皮下乳腺癌移植小鼠肿瘤生长和增殖的抑制作用。同时，这种成分还能大幅减少脾脏和外周血中髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的数量，从而降低MDSC在肿瘤免疫过程中的免疫抑制作用。奥拉帕利（Olaparib）是一种口服多聚ADP核糖聚合酶抑制剂，对突变的BRCA阳性转移性乳腺癌有临床疗效。Sun等人发现，奥拉帕利通过抑制MDSC的迁移和聚集以及促进T细胞在TME中的存活和持续，可以显著提高 EGFRVIII 靶向CAR-T细胞的抗肿瘤效果。从机制上讲，奥拉帕利能阻止癌症相关成纤维细胞释放的SDF1α的表达，从而减少MDSC的迁移，从而增强 CAR-T 细胞对肿瘤的免疫效果。CDK7是转录因子TFIIH的关键组成部分，TFIIH被引入PolII附近的转录起始位点，以促进转录的启动。Xia等人发现，表皮生长因子受体靶向CAR-T细胞抗性乳腺癌细胞特别容易受到CDK7抑制剂THZ1的影响。在TNBC肿瘤模型中，THZ1与表皮生长因子受体靶向CAR- T细胞结合使用，与单独使用CAR-T细胞相比，能更好地抑制免疫抵抗，防止肿瘤增殖和转移。ROR1靶向CAR-T细胞的联合疗法受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）是 ROR 家族中的I型跨膜受体，具有细胞外配体结合结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域。Nicholas 等人总结说，ROR1参与抑制细胞凋亡、增强表皮生长因子受体信号通路和诱导肿瘤上皮-间质转化（EMT）。然而，ROR1 靶向CAR-T细胞对乳腺癌的疗效有限。Srivastava等人发现，奥沙利铂能激活肿瘤巨噬细胞并释放T细胞募集趋化因子，从而改善ROR1靶向CAR-T细胞的浸润。此外，奥沙利铂与抗-PD-L1联用可协同改善ROR1靶向CAR-T细胞损伤肿瘤的功能。转化生长因子（TGF）β是一种TGF-β是TME中公认的免疫抑制细胞因子，与ROR1靶向CAR-T细胞的抗肿瘤作用相关。细胞因子的产生和 ROR1 靶向 CAR-T 细胞的增殖功能在TGF-β的存在下明显受损。Tanja等人发现，通过抑制剂SD-208阻断TGF-β受体信号转导可以促进ROR1靶向CAR-T细胞的肿瘤杀伤功能。其他CAR-T细胞的联合疗法白细胞介素-7 受体（IL7R）存在于淋巴祖细胞表面， 对淋巴细胞的正常发育至关重要。研究发现，上调IL7或 IL-7受体可延长免疫细胞的存活时间并增强抗肿瘤效果。Zhao等人发现，激活IL-7受体可通过提高CAR-T 细胞在体外和体内的生长、增殖、活化和细胞毒性能力，增强传统 AX靶向CAR-T细胞的抗肿瘤功能并延长其存活时间。P38通路是一种应激活化蛋白激酶通路，也经常受到破坏，并与人类癌症的存活和迁移有关。通过CRISPR-Cas9筛选和T细胞功能测试发现，干扰P38通路可以增强T细胞的扩增能力，限制其氧化和分化压力。研究发现，P38抑制剂（P38i）能使 CAR-T 细胞更有效地进行T细胞介导的肿瘤特异性溶解，这表明P38i在提高CAR-T细胞抗肿瘤功能方面具有广阔的临床应用前景。CAR-T细胞在TME中的持久能力是阻碍其对实体瘤产生治疗效果的一个重要因素。研究发现，CD8+ T 17（Tc17）细胞和T辅助17（Th17）细胞在TME中更具持久性。一项研究发现，当STING激动剂DMXAA或cGAMP的刺激物与抗PD-1抗体结合时，Th/Tc17细胞产生的CAR-T细胞可以提高CAR-T细胞在TME中的持续能力和 肿瘤抑制作用。单细胞RNA测序表明，DMXAA能促进CAR-T细胞的转运，并通过产生趋化因子调节其在TME中的免疫效应。rAd.sT是一种靶向TGF-β信号的溶瘤腺病毒。Li等人报道，MSLN靶向CAR-T细胞与rAd.sT联合应用于乳腺癌治疗，可增加TME中细胞因子IL-6和IL-12的产生，从而产生更强的肿瘤抑制效果。 乳腺癌临床试验 在几年的乳腺癌研究中，CAR-T细胞的一些前瞻性靶点的人体试验已在世界各地得到证实，验证了该疗法的临床治疗效果和安全性。具体临床试验总结见表2。2017年 一项以c- Met 为靶点的CAR-T细胞I期临床试验（NCT01837602）在转移性乳腺癌患者中开展。在2例患者的血液和4例患者的肿瘤组织中检测到CAR的mRNA，细胞注射耐受性良好，无大于1级的相关不良反应。肿瘤被杀死后，免疫组化分析表明 CAR-T细胞在肿瘤内引起了炎症反应，导致肿瘤大面积坏死。然而，另一项以c-Met CAR-T为靶点的Ⅰ期临床试验（NCT03060356）因资金停止而终止。到目前为止，针对HER 2的CAR-T细胞疗法临床试验在乳腺癌患者中开展得最为广泛。目前共有五项1/2期临床试验。其中两项已撤销（NCT02547961）（NCT02713984），三项正在招募（NCT04650451）（NCT03740256）（NCT04430595）。此外，MUC1靶向CAR-T细胞的Ⅰ期临床研究也在广泛开展。(NCT02587689) (NCT04020575) (NCT04025216)。第1/2阶段针对 CEA的CAR-T细胞治疗CET阳性乳腺癌的临床试验也在进行中（NCT02349724）（NCT04348643）。此外，还有其他一些临床试验靶点，包括 EpCAM（NCT02915445）、NKG2DL （NCT04107142）、ROR1（NCT02706392）、CD70（NCT02830724）、C7R/GD2（NCT03635632）、CD133（NCT02541370）和CD44v6。(NCT04427449)。未来，针对乳腺癌患者的更多 CAR-T细胞临床治疗试验，以获得最佳治疗效果。表2 CAR-T细胞治疗乳腺癌的临床试验汇总 CAR-T细胞疗法面临的挑战 尽管针对实体瘤的 CAR-T 疗法已在实验室和临床中得到广泛研究，并取得了良好进展、其临床疗效仍不令人满意。如图4  所示，严重的不良反应、肿瘤细胞异质性、TME的免疫抑制以CAR-T 细胞的持久性是CAR-T细胞疗法面临的障碍。因此，在未来的研究中应开发出更好的工程策略，以提高CAR-T细胞疗法的临床疗效并减少不良反应。下面，我们将总结CAR-T细胞疗法存在的问题和可能的解决方案。图4 影响CAR-T细胞功能的挑战概要。特异性设计的CAR结构以及INF-g、tnf - α、IL-2、CCL2等促进免疫功能的细胞因子的产生和释放，有效增强了CAR- t细胞的抗肿瘤能力。TME中TAMs、MDSCs、Treg等免疫抑制性细胞的募集，TGFb、VEGF、IL-4、IL-10等免疫抑制性细胞因子的释放，以及PD-1信号的激活均可抑制肿瘤免疫。细胞外基质的异常形成和血管系统的失调也是影响CAR-T细胞的重要因素。具体目标由于CAR-T细胞识别和损伤肿瘤细胞的特定机制和特征，因此识别肿瘤细胞上表达的特定肿瘤靶标非常重要。在肿瘤细胞表面有较高的表达水平。与正常组织相比，肿瘤组织中的特异性靶标分子更多。在上一节中，我们总结了一些潜在的乳腺癌特异性靶标分子。然而，由于肿瘤细胞的异质性，大多数靶点只对特定类型的乳腺癌有效。同时，目标抗原的逃逸（即肿瘤抗原的完全或部分丢失）也是另一个巨大的问题。虽然CAR-T细胞对肿瘤细胞的初始反应率很高，但据报道，相当一部分反复注射CAR-T细胞的患者的反应率显著下降。联合识别多个靶点是克服抗原逃逸的另一种方法。二价串联CAR (Tan CAR）靶向CD70和B7-H3的研究表明，CAR-T细胞能够增强肿瘤识别能力。与此同时，一项结合了HER2、GD2和CD44v6靶点的Ⅰ期临床试验（NCT04430595）正在进行中，它能有效减少抗原逃逸，提高肿瘤细胞的识别率。治疗相关毒性神经毒性和细胞因子释放综合征（Neurotoxicity and cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T细胞疗法最常见的两种严重和不可预测的反应。目前的研究表明，这些不良反应与CAR-T细胞分泌的大量细胞因子有关。神经毒性通常表现为癫痫发作、谵妄、记忆力减退和急性脑水肿，而CRS通常表现为发热、低血压和呼吸功能不全。在一例转移性结肠癌患者中，患者在注射HER2-靶向CAR-T细胞后15分钟内出现呼吸困难，5天后死亡。胸片和血清样本显示肺部有明显的免疫浸润。据推测，大量CAR-T细胞在输注后立即迁移到肺部，并通过识别肺上皮细胞上的低水平HER2引发细胞因子释放。免疫细胞因子（包括 IL-6、TNF-a、IL-10、GM-CSF和IFN-γ）的表达显著增加。CAR-T治疗引起的细胞因子风暴可能导致呼吸窘迫和死亡。尽管这是一份关于HER2靶向CAR-T细胞治疗结肠癌引起严重不良反应的病例报告、有效避免对正常肺组织的损伤仍是一个需要讨论和解决的问题。靶向CAR-T被广泛应用于乳腺癌治疗。因此，我们认为在乳腺癌治疗中也会出现严重的细胞因子风暴。在对CAR-T外泌体的研究中，发现纯化的CAR-T细胞外泌体表达穿孔素、颗粒酶B和细胞膜分子，包括CARs、CD3、CD8和TCRs。应用CAR-T外泌体治疗乳腺癌可有效控制毒性并提高安全性。此外，Sterner等人和Giavridis等人发现，IL-1、IL-6和GM-CSF参与了CRS的调节过程，而敲除细胞因子编码基因或特定的细胞因子抑制剂可显著减少CRS的发生。此外，自杀基因通过小分子介导的活化过程导致细胞死亡的Caspase9蛋白被引入CAR-T细胞，作为避免CAR-T细胞不可预测的治疗 反应的一种新的可能机制。将修饰的Caspase9蛋白融合到人 FK506 结合蛋白（FKBP）中，可有效、特异性地消除表达自杀基因的CAR-T细胞，而不影响正常 CAR-T 细胞的生长和增殖，从而减少对正常组织的损伤。糖皮质激素是一种强效抗炎药物，它能有效缓解患者的脑部炎症和血管源性CAR-T细胞疗法引起的水肿症状。Kloss等人发现，CAR-T细胞识别肿瘤细胞上的不同抗原可有效提高肿瘤识别的特异性，减少对正常细胞的损伤。基于这一 观点，Srivastava 等人设计了逻辑门控ROR1靶向CAR-T细胞。合成的Notch（ynNotch）受体可识别肿瘤上的EpCAM或B7-H3。ROR1 CAR的表达是由synNotch受体激活诱导的。在乳腺癌研究中，这种策略对ROR1+乳腺癌有抗肿瘤作用，而对正常组织无毒性反应。CAR-T细胞的增殖和持久性CAR-T细胞的增殖和持续能力往往与抗肿瘤效果直接相关。CAR-T细胞中某些基因的功能会影响其持久性。如上所述，在CAR的结构中加入共刺激结构域是显著提高CAR-T细胞增殖和持久性的传统方法。Agnes等人发现，集落刺激因子-1（CSF-1）通过与癌细胞中由c-fms基因编码的CSF-受体结合，与免疫细胞增殖有关。c-fms基因通过基因修饰在T细胞中表达。CSF-1的加入刺激了通过分泌IF和IL-2，CAR信号的增殖效应不会影响这些基因修饰细胞的细胞毒性。在另一项研究中，Bouche等人报告说，CD28亚域突变的CAR-T细胞具有更好的存活率和功能。通过对CD28亚域的无效突变，与T细胞耗竭相关的各种基因，如Nfatc1、Nr42a和Pdcd1的表达明显减少。此外，有几种转录因子被认为是T细胞衰竭的诱导因子。Khan等人发现，TOX可通过驱动衰竭T细胞的表观遗传重塑，将具有抗肿瘤功能的效应T细胞转化为无功能的衰竭。TCF-1是另一种可通过介导Eomes和c-Myb的表达来调控衰竭T细胞转化的转录因子。转录因子NR4A的激活与PD-1 TIM3等免疫抑制分子的表达有关。敲除NR4A后，CAR-T细胞显示出更强的肿瘤杀伤活性和更好的持久性。此外，包括干细胞记忆T（TSCM）细胞、幼稚T细胞和中枢记忆T（TCM）细胞在内的分化不良T细胞亚群具有很强的增殖能力。在构建CAR-T细胞时，利用这些细胞设计CAR-T细胞是延长CAR-T细胞在患者体内的增殖和持久性并增强其抗肿瘤活性的有效方法。肿瘤微环境的免疫抑制作用免疫逃避是抗肿瘤免疫疗法面临的一大挑战，它直接决定了肿瘤免疫的有效性。TME中细胞因子和趋化因子的变化是影响免疫逃避的重要因素。抗肿瘤免疫激活过程会释放大量细胞因子。TME中趋化因子的表达模式发生了变化，优先招募和抑制炎症细胞类型，避免招募抗肿瘤免疫细胞。这一生理过程导致了大量免疫抑制细胞的存在。免疫抑制细胞包括MDSCs、TAMs和Treg细胞。包括MDSCs、TAMs和Treg细胞在内的免疫抑制细胞被细胞因子在TME中招募，这是免疫抑制效应的关键原因。此外，Binnewies等人认为趋化因子和TME中的细胞因子，包括IL-4、IL-10、TGFβ和血管内皮生长因子，可直接抑制T细胞效应，改善免疫抑制细胞的聚集。同时，聚集的抑制细胞还会分泌大量免疫抑制细胞因子，通过正反馈过程进一步增强免疫抑制效应。这是一种通过促进免疫增强基因的表达和细胞因子的分泌来增强CAR-T细胞免疫反应的常用方法。Adachi等人发现在小鼠模型中，CAR-T细胞中IL-7和CCL19基因的上调可改善 T细胞或树突状细胞对实体瘤组织的侵袭，促进肿瘤消退。此外，CAR-T 细胞中IL-18和IL-12基因的过度表达可激活内源性免疫细胞，增强抗肿瘤反应。研究表明，INF-g、TNFa和IL-2等细胞因子可增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。TME中T细胞免疫抑制信号的激活是CAR-T细胞疗法一个重要障碍。PD-1/PD-L1是乳腺癌中特征最明显、研究最多的信号之一。以往的研究表明，抑制PD-1信号可对包括乳腺癌在内的各种肿瘤患者产生显著的临床疗效。PD-1信号的激活会诱导CAR-T细胞的耗竭和失活。抗PD1抗体明显改善了靶向 HER2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用。有形障碍癌症相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤组织间质中的基质细胞。它们可以促进肿瘤周围异常细胞外基质（ECM）的沉积，形成致密的纤维化环境，并限制CAR-T细胞向肿瘤组织的运输。CAF诱导的肿瘤免疫抑制效应是促进CAR-T 细胞疗效的一个障碍。TGF-β的激活过程可增强CA分泌ECM 蛋白，从而形成物理网络并限制T细胞的移动。虽然之前的研究证实，与传统抗体药物相比，HER2靶向CAR-T细胞穿透ECM的能力更强，但 TME中ECM的存在仍会阻碍CAR-T细胞识别和杀死肿瘤的能力。NOX4是TGF-β信号转导的下游分子。抑制NOX4不仅能阻TGF-β信号传导，还能阻止CAF分化，从而减少EMC蛋白分泌，促进免疫细胞浸润肿瘤组织。Caruana等人报告说，体外操T细胞后，肝素酶（HPSE）表达不足，这可能是降解和穿透 ECM能力下降的原因。HPSE能降解ECM的主要成分硫酸肝素蛋白多糖。表达HPSE GD2-靶向CAR-T细胞被设计用于增强降解ECM的能力，促进T细胞对肿瘤（包括乳腺癌细胞）的侵袭和抗肿瘤活性。血管系统失调肿瘤的血管系统往往会发生重塑，出现严重的血管异常和功能障碍。免疫细胞从血管到实体瘤的穿透性受损，导致CAR-T细胞的抗肿瘤效果减弱。肿瘤组织中的血管系统失调和内皮能量不足会降低细胞间粘附分子1（ICAM1）和粘附分子 VCAM1 的表达水平，从而限制T细胞在肿瘤组织中的浸润。同时，肿瘤血管系统正常化可增强组织血液灌注，从而改善CAR-T细胞的浸润和存活能力，促进CAR-T细胞的抗肿瘤能力。贝伐单抗是一种针对血管内皮生长因子的人源化单克隆抗体，不仅能抑制新生血管的萌发，还能使血管系统恢复正常。同时，贝伐单抗还能抑制细胞粘附分子的下调过程，提高CAR-T细胞对肿瘤的侵袭能力。Xing等人设计了靶向VEGFR2/3的CAR-T细胞，并在乳腺癌治疗中取得了显著效果，为抗肿瘤形成和抗血管生成提供了新思路。将CAR-T细胞直接注射到肿瘤部位，使其远离血管运输系统，是另一种有效的治疗策略。与静脉注射相比，腹腔注射 CAR-T 细胞治疗间质间皮瘤可获得更好的反应和耐受性，这为 CAR- T 细胞的局部注射治疗提供了新的前景。 未来展望 CAR-T 细胞在血液肿瘤中的成功应用，使其成为实体瘤治疗中一种前景广阔的方法。此外，美国食品和药物管理局批准 CAR-T 细胞用于临床应用，也大大促进了 CAR- T 细胞疗法在实体瘤治疗中的探索。目前已制造出多种以乳腺癌相关抗原为靶点的 CAR-T 细胞，以发挥更好的乳腺癌治疗效果。虽然CAR-T细胞疗法在体外和体内都表现出了显著的抗肿瘤功能，但治疗相关的严重毒性、T细胞持久性较差以及TME中的免疫抑制等问题仍然阻碍着它在乳腺癌和其他实体瘤中的临床应用。此外，值得注意的是，包括单克隆抗体和ADC在内的分子靶向疗法在乳腺癌方面也取得了很好的疗效s。此外，与 CAR-T 细胞疗法相比，这类药物的制备和临床应用更为方便。然而，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等单克隆抗体对 HER2 表达的乳腺癌细胞的杀伤作用仍取决于免疫细胞的活性，表位掩蔽和立体阻碍导致的耐药性仍是需要妥善解决的一大难题。此外，ADC依靠抗体识别肿瘤细胞并携带细胞毒性药物杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞的特异性识别、抗体与药物的脱钩以及耐药性仍然阻碍着ADC药物在乳腺癌中的广泛应用。CAR-T细胞能直接识别和破坏肿瘤细胞，从而有效避免了抗体疗法所面临的困难。因此，在未来CAR T细胞治疗仍是治疗乳腺癌不可或缺的有效方法。END