FANCD2

点击蓝字↑，关注我们 药研速览 2025.02.04 Online JMC Research Brief ·2025 近日，中科院上海药物所熊兵、刘同超、贺金雪等研究人员在药物化学国际顶级期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为《发现和优化一系列新型含吗啉的USP1抑制剂》的研究论文。该研究基于KSQ-4279的结构，通过开环和环化策略设计了一系列新型含有吗啉骨架的USP1抑制剂，并成功优化出具有显著酶活性和细胞抑制活性的化合物38-P2。该化合物不仅表现出良好的药代动力学特性和安全性，还在BRCA1缺陷型癌症模型中显示出显著的抗肿瘤效果，且能够增强奥拉帕尼耐药细胞对奥拉帕尼的敏感性。此外，38-P2与穿心莲内酯在BRCA1正常的癌细胞中表现出协同抗肿瘤作用。这项研究为开发新型USP1抑制剂提供了重要的先导化合物，并为克服PARP抑制剂耐药性提供了新的治疗策略。 图片来源：ACS 01 Background 研究背景 USP1在DNA损伤修复中的作用 USP1通过与辅助因子UAF1结合形成复合物，参与调节Fanconi贫血（FA）和跨损伤合成（TLS）途径，这些途径与同源重组（HR）途径相互关联。USP1-UAF1复合物通过去泛素化作用负向调节FANCD2、FANCI和PCNA的活性，以确保基因组稳定性。在DNA损伤响应中，USP1的抑制可导致PCNA单泛素化水平升高，激活DDR通路。 USP1作为抗癌靶点的研究背景 USP1在多种癌症中异常激活或过表达，因此作为治疗靶点受到越来越多的关注。基于合成致死原理开发的PARP抑制剂已获批用于治疗BRCA1/2突变肿瘤，但耐药性问题日益突出。USP1抑制剂与PARP抑制剂的联合使用可能成为克服PARP抑制剂耐药的新策略。此外，USP1在逆转化疗耐药中也发挥重要作用，因此开发USP1抑制剂对于癌症治疗具有重要意义。 USP1抑制剂的研究进展 目前已有多个USP1抑制剂进入临床研究阶段，如KSQ-4279（RO7623066）和TNG-348等。KSQ-4279显示出良好的单药治疗潜力和与PARP抑制剂的联合治疗潜力，但其临床疗效有限。为了克服现有抑制剂的局限性，研究者们致力于探索新的化合物骨架，以开发更有效的USP1抑制剂。 图片来源：ACS 02 Drug Design 药物设计与评价 ①采用新型骨架设计USP1抑制剂 为了开发具有新骨架的高效USP1抑制剂，开展了基于结构的药物设计研究。Walden团队通过X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM）技术对USP1-UAF1复合物的结构进行了深入研究，这些结构信息为针对USP1的基于结构的药物设计提供了宝贵的基础。最近，他们利用冷冻电镜技术解析了KSQ-4279与USP1结合的共晶结构（PDB代码：9FCI）。冷冻电镜分析显示，KSQ-4279占据了USP1的疏水通道，并破坏了蛋白质的结构。因此，KSQ-4279通过别构方式结合到USP1-UAF1的隐秘口袋中，从而抑制其活性。KSQ-4279的4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基团位于由Leu96、Tyr100、Leu152和Val156包围的疏水口袋中，可能与USP1蛋白形成疏水相互作用。咪唑基团的N原子通过一个关键的氢键与Gln160相互作用，而4-（三氟甲基）-1H-咪唑-2-基团则位于另一个疏水口袋中。显然，1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶核心的吡唑部分朝向溶剂区域，与USP1没有潜在的相互作用，而连接核心和苯基的亚甲基部分有足够的空间进行进一步的结构修饰。基于对共晶结构的这些分析，对1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶进行了环开环策略，并对亚甲基连接部分进行了进一步的环化策略，以设计具有新骨架的USP1抑制剂。 图片来源：ACS ②吗啉被鉴定为有望成为USP1抑制剂的骨架 为了寻找有效的USP1抑制剂骨架，作者首先合成了多种不同环状结构的化合物，并以KSQ-4279作为阳性对照进行活性测试。这些化合物由于环化反应均含有一个手性碳原子，但在初步筛选阶段未进行手性分离。测试结果显示，形成五元四氢吡咯环的化合物7对USP1/UAF1表现出较弱的抑制活性（10 μM时抑制率为63.4%）；而含有哌啶环的化合物8显示出中等活性，但对NCI-H1299细胞的抗增殖活性较弱。将哌啶环替换为哌嗪环后得到的化合物9活性显著下降，进一步引入甲基（化合物10）或异丙基（化合物11）修饰哌嗪环也未能改善活性。然而，当哌啶环被替换为吗啉环时，得到的化合物12展现出较好的酶活性和细胞活性，其IC50值分别为68.9 nM和241.5 nM，尽管其活性仍弱于KSQ-4279，但这一结果初步证实了这种环化模式在开发更有效的USP1抑制剂方面具有潜力。因此，作者在后续的优化工作中保留了吗啉环结构。 图片来源：ACS ③嘧啶部分取代基的构效关系 (SAR) 作者以化合物12为基础，系统地研究了吡啶环上取代基（R1和R2）对USP1抑制剂活性的影响。研究发现，取代基的类型和位置对抑制剂的活性有显著影响。例如，当R1位置的氟原子被甲基取代时（化合物16），抑制剂的活性显著增强，其对USP1/UAF1的IC50值为68.9 nM，对NCI-H1299细胞的IC50值低至0.8 nM，远低于KSQ-4279。然而，将甲基替换为乙基（化合物17）或引入其他取代基如三氟甲基、三氟乙基、羟基等均导致活性减弱。甲氧基取代（化合物21）的活性略低于化合物16，但对NCI-H1299细胞的抑制活性与化合物16相当。进一步调整取代基大小，如将甲氧基替换为乙氧基、2,2-二氟乙氧基、乙酰胺或N-甲基乙酰胺，均显著降低对USP1/UAF1的抑制活性，且细胞活性也依次下降。其他R1位置的取代基，如甲硫基、硝基、羧酰胺和甲酸甲酯，在10 μM浓度下对USP1/UAF1的抑制活性相当。对于R2位置的取代，单独的甲基或甲氧基取代均未表现出明显的抑制活性，而双取代的化合物则显示出弱至中等的抑制活性。这些结果表明，取代基的类型和位置对活性至关重要，特别是R1位置的甲基和甲氧基取代基对活性的贡献最为显著，为后续的结构优化提供了重要的指导。 图片来源：ACS ④末端部分的SAR研究 在确定了含有吗啉环和呋喃并[3,2-d]嘧啶核心的化合物38作为潜在的优化方向后，作者以化合物38为基准，系统地研究了终端基团对USP1/UAF1抑制活性的影响。研究发现，终端基团的结构和性质对抑制剂的活性有显著影响。例如，将化合物38中的异丙基替换为甲基（化合物44）会导致酶活性和细胞活性分别降低约7倍和10倍。将咪唑环替换为吡唑环（化合物45）也会显著降低活性。此外，将二取代的嘧啶环替换为其他结构，如2-环丙基苯基（化合物46）或2-异丙基苯基（化合物47），均显著降低了对USP1/UAF1的抑制活性。将嘧啶环替换为2-异丙基吡啶-3-基（化合物48）略微增强了对USP1/UAF1的抑制活性，但对细胞活性不利。而4-氯-1-异丙基-1H-吡唑-5-基（化合物49）虽然对USP1/UAF1表现出高活性，但细胞活性降低了约100倍。这些结果表明，终端基团的结构对抑制剂的活性至关重要，特别是二取代嘧啶系统的保留对于维持高活性非常关键。 图片来源：ACS ⑤化合物38的两种对映体的比较 为了深入理解化合物38的两个对映异构体（38-P1和38-P2）的活性差异，作者通过超临界流体色谱（SFC）分离得到了这两个纯对映异构体，并对它们进行了全面的生物学评估。实验结果显示，38-P2在抑制USP1-UAF1酶活性方面表现出显著优于38-P1的活性，其IC50值为3.8 nM，而38-P1的IC50值为110.0 nM，表明38-P2的酶抑制活性是38-P1的约28.9倍。在细胞水平上，38-P2对NCI-H1299细胞的抑制活性也远高于38-P1，其IC50值为0.5 nM，而38-P1的IC50值为141.5 nM，活性差异达到283倍。此外，38-P2对BRCA1缺陷的MDA-MB-436细胞表现出极高的抑制活性，IC50值低于0.03 nM，而38-P1的活性则显著较低。值得注意的是，这两个对映异构体在正常细胞系HL-7702和IM-9中的活性均较低，IC50值均大于10 μM，显示出良好的选择性。 分子对接研究进一步揭示了38-P2（R-对映体）与USP1蛋白结合的优越性。对接结果显示，R-对映体能够更好地适应USP1的结合口袋，尤其是在4-（三氟甲基）-1H-咪唑-2-基片段周围。因此，38-P2被确定为R-对映体，并被选为进一步研究的主要化合物。这些结果表明，38-P2不仅在酶活性和细胞活性方面显著优于38-P1，还具有良好的选择性和较低的毒性，使其成为一种极具潜力的USP1抑制剂候选化合物。 图片来源：ACS 03 In vitro 体外评价 ①38-P2显示出对USP1-UAF1的强效和选择性抑制 作者详细研究了化合物38-P2对USP1-UAF1的抑制活性、选择性、可逆性和抑制机制，并探讨了其在细胞水平上的生物学效应。研究发现，38-P2对USP1-UAF1表现出显著的抑制活性，其IC50值为3.8 nM，远低于KSQ-4279（21.3 nM），显示出更高的效力。同时，38-P2对USP1-UAF1的抑制作用具有高度的选择性，对其他USP家族成员（如USP4、USP7、USP8、USP9X、USP15和USP25）的抑制作用可以忽略不计。实验表明，38-P2主要通过可逆的方式抑制USP1-UAF1，且为非竞争性抑制机制。在细胞水平上，38-P2处理显著增加了单泛素化PCNA（Ub-PCNA）水平，激活了DNA损伤响应通路，并导致细胞周期在S期阻滞，同时显著增加了细胞凋亡的比例。此外，38-P2显著抑制了MDA-MB-436和NCI-H1299细胞的克隆形成能力，显示出对癌细胞生存能力的显著抑制作用。这些结果表明，38-P2作为一种新型的USP1-UAF1抑制剂，不仅具有高效的抑制活性和高度的选择性，还能通过激活DNA损伤响应通路和诱导细胞凋亡来抑制癌细胞的生存能力，使其成为一种极具潜力的抗癌药物候选化合物。 图片来源：ACS ②38-P2增强耐药细胞对奥拉帕尼的敏感性 化合物38-P2能够显著增强奥拉帕利耐药的MDA-MB-436/OP细胞对奥拉帕利的敏感性。实验中，38-P2单独处理耐药细胞时，能够显著增加单泛素化PCNA（Ub-PCNA）水平并激活DNA损伤响应通路，表现为γH2AX、磷酸化Chk1（p-Chk1）和磷酸化RPA32（p-RPA32）蛋白水平的升高。在克隆形成实验中，38-P2单独处理耐药细胞时，克隆形成能力显著降低（63%的抑制率），而奥拉帕利单独处理则没有显著的细胞毒性。然而，当38-P2与奥拉帕利联合使用时，耐药细胞的克隆形成能力进一步降低至79%。此外，38-P2单独处理耐药细胞24小时后，细胞周期在G2/M期发生阻滞，而与奥拉帕利联合处理时，细胞在S期和G2/M期的积累进一步增加。这些结果表明，38-P2不仅能够单独抑制耐药细胞的增殖，还能通过增强DNA损伤响应通路的激活，显著提高耐药细胞对奥拉帕利的敏感性，为克服PARP抑制剂耐药提供了潜在的治疗策略。 图片来源：ACS ③穿心莲内酯增加癌细胞对38-P2的敏感性 研究发现，穿心莲内酯能够显著增强38-P2对癌细胞的抑制作用。通过药物组合筛选，作者发现穿心莲内酯与38-P2在BRCA基因野生型的OVCAR-8和SKOV3卵巢癌细胞系中表现出显著的协同作用。Bliss协同分析显示，这种组合在不同浓度下均能显著抑制肿瘤细胞的增殖。此外，克隆形成实验也证实了穿心莲内酯与38-P2联合处理能够显著增强对肿瘤细胞的细胞毒性效应。这些结果表明，穿心莲内酯与38-P2的联合使用可能为BRCA基因野生型癌症的治疗提供一种新的策略，具有潜在的临床应用价值。 图片来源：ACS ④肝微粒体体外代谢稳定性、细胞色素 P450 (CYP450) 和hERG抑制 作者对化合物38-P2在不同物种肝微粒体中的代谢稳定性、对CYP450酶系的抑制作用以及对hERG通道的抑制作用进行了综合评估。结果显示，38-P2在小鼠、大鼠、狗、猴和人的肝微粒体中均展现出良好的代谢稳定性，其中在大鼠肝微粒体中的半衰期超过120分钟，表明其代谢过程较为缓慢。对于CYP450酶系的抑制作用，38-P2对大多数CYP450同工酶的抑制作用较弱，仅对CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19表现出一定的抑制活性，但抑制强度仍在可接受范围内。此外，38-P2对hERG通道的抑制作用较弱，其IC50值大于10 μM，这表明该化合物具有良好的心脏安全性。综合来看，38-P2在体外表现出的代谢稳定性和较低的药物相互作用风险，以及对hERG通道的低抑制活性，使其成为具有潜力的药物候选物，为后续的药物开发提供了有力支持。 图片来源：ACS 04 In Vivo 体内活性评价 ①ICR小鼠体内药代动力学评估 化合物38-P2在ICR小鼠体内的药代动力学特性表现出良好的口服吸收特性。具体而言，小鼠口服给药10 mg/kg后，38-P2的血浆浓度迅速上升，达到最大血药浓度（Cmax）为3510 ng/mL，显示出较高的药物暴露量。其药时曲线下面积（AUC0‑inf）为14200 h·ng/mL，表明药物在体内的吸收和分布较为广泛。此外，38-P2的半衰期（T1/2）为1.92小时，这一较短的半衰期意味着药物在体内的消除速度较快，但同时也提示可能需要较频繁的给药以维持有效的血药浓度。 图片来源：ACS ②38-P2的体内活性 化合物38-P2在MDA-MB-436（BRCA1缺陷型）乳腺癌细胞异种移植模型中表现出显著的剂量依赖性抗肿瘤效果。小鼠分别口服给予38-P2（75 mg/kg和150 mg/kg）或KSQ-4279（100 mg/kg）作为阳性对照，治疗持续21天。结果显示，38-P2在两个剂量下均显著抑制了肿瘤的生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为45%和66%。这一效果与KSQ-4279相当（TGI为50%）。在治疗期间，所有接受药物处理的小鼠体重未出现明显下降，且耐受性良好，表明38-P2具有良好的体内安全性和耐受性。此外，通过Western blot分析肿瘤组织中Ub-PCNA蛋白水平，发现38-P2处理的肿瘤组织中Ub-PCNA水平显著增加，这进一步证实了USP1抑制剂在体内通过增加PCNA单泛素化来发挥抗肿瘤作用的机制。这些结果表明，38-P2不仅在体外表现出良好的活性和药物特性，其体内抗肿瘤效果也得到了验证，显示出作为潜在抗癌药物的开发前景。 图片来源：ACS 总结 在本研究中，作者基于临床化合物KSQ-4279，通过环开环和环化策略设计并合成了一系列具有吗啉骨架的新型USP1抑制剂。经过详细的构效关系（SAR）研究，优化得到了化合物38-P2，其在酶活性和细胞活性方面均显示出比KSQ-4279更强的抑制能力。进一步的机制研究表明，化合物38-P2是一种选择性、可逆且非竞争性的USP1-UAF1抑制剂，能够激活DNA损伤反应通路，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，并显著抑制细胞存活。此外，38-P2还能增强对奥拉帕利耐药的MDA-MB-436/OP细胞对奥拉帕利的敏感性，并与穿心莲内酯在BRCA野生型癌细胞中表现出协同抗肿瘤效应。化合物38-P2在体外表现出良好的代谢稳定性，对大多数CYP450同工酶和hERG通道无明显抑制作用，显示出良好的药物安全性。在体内药代动力学研究中，38-P2显示出良好的口服吸收特性，具有较高的Cmax（3510 ng/mL）和较大的AUC（14200 h·ng/mL），半衰期为1.92小时。在MDA-MB-436乳腺癌异种移植模型中，38-P2以剂量依赖性方式显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别达到45%和66%。总体而言，38-P2作为一种新型的USP1抑制剂，具有良好的药物开发潜力，有望成为治疗HRD缺陷型癌症的候选药物。 参考来源： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02792 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 DNA复制是维持生物体遗传信息稳定性的关键过程。然而，DNA复制过程中难免会遇到各种障碍，导致DNA发生损伤，其中DNA双链交叉连接 (ICLs) 是一种严重的毒性损伤。ICLs 会阻断DNA复制和转录，并引发细胞凋亡或癌变。因此，及时修复ICLs对于维持细胞功能和基因组稳定性至关重要。范可尼贫血症 (Fanconi Anaemia) 途径是一种重要的DNA修复途径，负责修复ICLs。该途径的关键组分是FANCD2-FANCI (D2-I)蛋白复合物，它能够识别ICLs并启动修复过程【1】。D2-I 复合物由FANCD2和FANCI两个亚基组成，其中FANCD2 主要负责结合DNA，而FANCI则参与D2-I复合物的组装和功能调控。除了在 ICLs 修复中发挥作用外，D2-I复合物还与其他类型的DNA修复过程密切相关。例如，它在人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染 、CRISPR介导的DNA 修复以及DNA复制压力等过程中，都扮演着保护停滞复制叉的角色【2-3】。停滞复制叉是指 DNA 复制叉停滞在 DNA 损伤处，无法继续前进的状态。停滞复制叉的存在会导致 DNA 损伤积累，并引发基因组不稳定。然而，D2-I复合物的结构和功能机制，尤其是它如何识别ICLs和停滞复制叉，以及它在DNA修复中的作用，仍然是一个未解之谜。 近日，来自英国剑桥大学MRC分子生物实验室的Lori A. Passmore研究团队和帝国理工学院的David S. Rueda研究团队合作在Nature杂志上发表题为FANCD2–FANCI surveys DNA and recognizes double- to single-stranded junctions的研究论文，在该研究中研究人员通过单分子成像和冷冻电镜技术，直接可视化 D2-I 与 DNA 的相互作用，并探究其识别和修复 DNA 损伤的机制。 为了研究D2–I与DNA的结合，研究人员首先制备了荧光标记的D2–I复合物，并使用光镊、共聚焦显微镜和微流体系统将λ噬菌体DNA捕获成哑铃状。结果显示，D2–I能够在DNA上滑动，这与之前观察到的D2–I与圆形或末端封闭DNA的解离速率较慢的结论一致。进一步分析发现，D2–I在DNA上以双向扩散的方式运动，其扩散系数和速度与Cdc45-MCM-GINS复制解旋酶相当，但低于PCNA和XRCC4-XLF。D2–I在DNA上的停留时间较长，可以覆盖几乎整个λ DNA的长度。此外，D2–I的初始加载受到DNA张力和盐浓度的影响，表明其与DNA的结合主要依赖于离子相互作用。与D2–I相比，FANCI单独结合DNA的亲和力相当，而FANCD2则无法结合DNA。这表明D2–I的滑动特性与其构象状态有关，并可能有助于识别DNA损伤。然而，磷酸化和单泛素化似乎不是D2–I在体外进行一维DNA扫描的主要调节因素。 研究人员进一步测试了D2–I在遇到障碍物时的行为，以了解它可能如何响应DNA损伤后的不同情况。实验发现，当滑动复合物遇到DNA末端时，它们会反弹并沿相反方向继续扩散，这与冷冻电镜结构中D2–I围绕双链DNA螺旋的观察结果一致。此外，当D2–I遇到含有Holliday接头的线性双链DNA时，它会停滞在Holliday接头的中心区域，并从一半的Holliday接头DNA上滑动。这表明DNA环状结构对D2–I的滑动构成了物理障碍，并且非特异性障碍物会限制D2–I对DNA的扫描。 进一步的研究发现，D2-I 沿着双链 DNA 滑动，但在遇到单链-双链 (ss-ds) DNA 交联结构时会停滞。冷冻电镜结构显示，停滞的D2-I与ss-dsDNA交联的相互作用与滑动时不同。因此，D2-I 可以识别 ssDNA 漏缝，并将其锁定在ss-dsDNA交联上。由于ss-dsDNA交联在停滞的复制叉中存在，D2-I可以识别DNA损伤位点。 最后的冷冻电镜结构分析表明，D2-I 滑动clamp在DNA上的滑动和停滞具有不同的分子机制。当 D2-I 滑动在双链 DNA 上时，FANCI蛋白的C端结构域与DNA发生静电相互作用，推动 D2-I 沿着 DNA 双螺旋滑动。而当D2-I停滞在单链-双链DNA交界处时，FANCD2蛋白的 KR结构域与DNA发生直接相互作用，将D2-I锁定在交界处，防止其进一步滑动。这种停滞机制对DNA损伤修复至关重要，因为停滞的D2-I可以识别 DNA 损伤部位并保护停滞的复制叉。此外，FANCD2的泛素化可以促进D2-I定位于DNA交联部位，并是DNA 交联修复所必需的。而KR 结构域突变会导致D2-I 的 DNA 结合效率和交联修复能力下降，这表明 KR 结构域在DNA损伤修复中起着重要作用。 总之，这项研究揭示了D2-I在DNA修复中的重要作用，并为理解范可尼贫血症途径以及其他类型DNA修复的分子机制提供了重要的见解。D2-I的发现为开发新的DNA损伤修复治疗方法提供了新的思路，并有望为治疗与 DNA 损伤相关的疾病提供新的策略。 参考文献 1. Semlow, D. R. & Walter, J. C. Mechanisms of vertebrate DNA interstrand cross-link repair. Annu. Rev. Biochem. 90, 107–135 (2021)。 2. Richardson, C. D. et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway. Nat. Genet. 50, 1132–1139 (2018). 3. Wang, L. C., Stone, S., Hoatlin, M. E. & Gautier, J. Fanconi anemia proteins stabilize replication forks. DNA Repair 7, 1973–1981 (2008). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07770-w 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

这项新的研究表明因DNA交联而停滞的复制叉内的DNA 结构（而不是交联 DNA 本身）触发了D2-I复合物停止滑动并夹紧DNA以启动修复。 在一项新的研究中，来自伦敦医学科学实验室和剑桥分子生物学实验室等研究机构的研究人员合作解开了一个数十年之久的谜团，为今后更好地治疗癌症铺平了道路。他们揭示了科学界多年来一直无法理解的一种重要的DNA修复系统——20 多年前发现的范可尼贫血症（Fanconi Anemia, FA）途径，是如何识别DNA损伤并启动修复的基本机制。他们利用最先进的成像技术观察这些DNA修复蛋白如何在单个DNA分子上移动，并利用电子显微镜来捕捉它们如何“锁定”特定的DNA结构，从而为更有效地治疗癌症开辟了道路。 相关研究结果于2024年7月31日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“FANCD2–FANCI surveys DNA and recognizes double- to single-stranded junctions”。论文通讯作者为伦敦医学科学实验室的David Rueda教授和剑桥分子生物学实验室的Lori Passmore博士。 DNA 在人的一生中不断受到环境因素的损害，包括阳光中的紫外线、酗酒、吸烟、污染和化学物暴露。DNA 受损的一种方式是发生“交联”，从而使它无法正常复制和表达基因。为了进行自我复制以及读取和表达基因，DNA 双螺旋的两条链首先必须解链形成单链。当 DNA 发生交联时，两条链上的“核苷酸”就会粘在一起，从而阻止解链。DNA 损伤（包括交联）的累积可导致癌症。FA途径在人的一生中都很活跃，它能识别这些损伤，并不断对其进行修复。 基因突变使得这一途径不那么有效的个体更容易患癌症。虽然参与FA途径的蛋白在很久以前就被发现了，但它们如何识别交联的DNA并启动DNA修复过程仍然是个谜。 研究者此前已发现FANCD2-FANCI（D2-I）蛋白复合物在FA途径的第一步中起作用，它能夹住DNA，从而启动交联DNA的修复过程。然而，关键问题依然存在：D2-I 如何识别交联 DNA，为什么 D2-I 复合物也与其他类型的 DNA 损伤有关？ 这项新的研究综合运用了多种前沿的科学技术，证实D2-I复合物沿着双链DNA滑动，监测它的完整性，还优雅地可视化观察了它如何识别在哪里停止，让DNA修复蛋白移动并在发生交联的位点上结合，从而启动DNA修复。 研究者利用一种称为“相关光学镊子和荧光成像（correlated optical tweezers and fluorescence imaging）”的先进显微镜技术，探索D2-I复合物如何沿着双链DNA分子滑动。利用光学镊子，他们可以捕获两个珠子之间的单个DNA分子，这使他们能够精确地操纵DNA并将其与选定的蛋白孵育。 利用荧光标记的D2-I和单分子成像技术，他们观察到单个D2-I复合物如何与DNA结合并沿着DNA滑动，从而实现对DNA双螺旋进行扫描。他们发现D2-I复合物不是直接识别DNA两条链之间的交联，而是在到达DNA单链间隙（一条DNA链发生缺失的区域）时停止滑动。 利用在分子水平上可视化观察蛋白的低温电镜技术，研究者接下来解析出 D2-I 复合物在单链-双链 DNA交叉点滑动和停滞时的结构。他们发现D2-I 与单链-双链 DNA交叉点的接触与它单独与双链 DNA 的接触截然不同。 D2-I复合物在DNA上滑动的单分子成像 图片来自Nature, 2024, doi:10.1038/s41586-024-07770-w 这使他们能够确定 FANCD2 蛋白的一个特定部分（称为“KR螺旋”），他们在单分子成像实验中发现这个部分对于识别DNA单链间隙和在单链 DNA 间隙停滞至关重要。 研究者进一步证实了 D2-I 复合物利用 KR 螺旋在这些交叉点上停滞的能力对于通过 FA 途径修复 DNA 至关重要。 当 DNA 在我们的细胞中正常复制时，它会让两条 DNA 链解链和复制每一条单链。这就形成了一个“复制叉”，在这个复制叉上，初始的DNA 链被解开，新的双链 DNA 在每条链上形成。但是，当这个复制叉到达 DNA 交联处时，DNA 链就无法解开，从而使通常的 DNA 复制过程停滞。 因此，这个停滞的复制叉包含暴露在外的单链DNA间隙，在这些间隙中，DNA 已经被解开，但却没有被复制。这项新的研究表明D2-I 蛋白复合物紧紧地附着在停滞的复制叉上单链和双链 DNA 之间的这些交叉点上。 这不仅能让 D2-I 复合物将FA 途径中的其他蛋白带到 DNA 交联处启动修复，还能锚定剩余的双链 DNA，保护停滞的复制叉，从而防止细胞中的酶切割 DNA 链的暴露端而进一步损坏 DNA。 这项新的研究表明因DNA交联而停滞的复制叉内的DNA 结构（而不是交联 DNA 本身）触发了D2-I复合物停止滑动并夹紧DNA以启动修复。这些停滞的复制叉出现在许多类型的 DNA 损伤中，这就解释了 D2-I 复合物通过 FA 途径在其他形式的 DNA 修复中发挥着广泛作用。 DNA 损伤是导致多种疾病的关键因素，因此了解 DNA 修复过程，尤其是了解这种修复失败的原因，具有极其重要的意义。至关重要的是，许多抗癌药物（如顺铂）会对癌细胞造成严重的细胞损伤，使其停止分裂并死亡。 在这种情况下，DNA 修复途径——这一在正常生命中至关重要的生理过程，可能会被癌细胞劫持，后者利用这些途径抵抗化疗药物的作用。了解了DNA修复途径第一步的机理基础，也许就能找到使患者敏感的方法，从而使抗癌药物在未来更加有效。（生物谷Bioon.com） 参考资料： Pablo Alcón et al. FANCD2–FANCI surveys DNA and recognizes double- to single-stranded junctions. Nature, 2024, doi:10.1038/s41586-024-07770-w.