ALYREF

【导读】 对紫杉醇为基础的化疗产生耐药性是三阴性乳腺癌（TNBC）治疗中的主要障碍。然而，克服紫杉醇耐药性仍是一个未解决的问题。 2月6日，中山大学研究团队在期刊《Clinical And Translational Medicine》上发表了研究论文，题为“RNF31 induces paclitaxel resistance by sustaining ALYREF cytoplasmic–nuclear shuttling in human triple-negative breast cancer”，本研究旨在确定紫杉醇治疗是否会影响 Aly/REF 出口因子（ALYREF）的细胞质 - 细胞核穿梭，其机制以及泛素化 ALYREF 在紫杉醇耐药性中的作用。 数据表明，RNF31 介导的 ALYREF 泛素化可能是逆转三阴性乳腺癌对紫杉醇耐药性的有力靶点。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ctm2.70203 三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌亚型中最具侵袭性的，占所有乳腺癌病例的 15% 至 20%，也被称为“最毒乳腺癌”。鉴于雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 2（HER2/ErbB2）均为阴性，以紫杉烷类药物（如紫杉醇和多西他赛）为基础的化疗仍是早期和转移性 TNBC 的主要治疗策略。不幸的是，尽管最初有反应，但肿瘤不可避免地会对紫杉烷治疗产生耐药性。在早期阶段，约 30% 的 TNBC 患者在五年内病情进展，五年无复发生存率约为 70%，总生存率约为 75%，这远低于 ERBB2+ 或 HR+ 乳腺癌。因此，在临床实践中确定对紫杉醇的耐药机制并尝试克服紫杉醇耐药性至关重要。 紫杉醇通过多种复杂机制发挥抗肿瘤作用。面对紫杉醇施加的各种细胞压力，癌细胞会启动细胞凋亡或使细胞压力转向生存，从而获得紫杉醇耐药性。新出现的证据表明，乳腺癌细胞会发展出多种机制来对抗紫杉醇诱导的压力，例如增加微管动力学、适应氧化应激增加以及上调抗凋亡蛋白。可是，迄今为止，尚未出现逆转紫杉醇耐药性的策略。有证据表明，mRNA 加工和输出参与了对癌症治疗策略的耐药性诱导。然而，mRNA 输出复合物对微管抑制剂耐药性的影响却很少被研究。因此，确定在三阴性乳腺癌（TNBC）中是否存在以及是哪些 mRNA 输出亚基与紫杉醇耐药性相关，这一点非常重要。 蛋白质翻译后修饰（PTM）是调节蛋白质亚细胞分布的关键机制之一，可能在调节应激诱导的运输中发挥作用。RNF31是线性泛素链组装复合物（LUBAC）的核心催化单元。先前的研究表明，RNF31 表达升高会加速肿瘤进展和治疗耐药。然而，RNF31 调节的细胞信号底物及其生物学功能尚不完全清楚。 RNF31 在体外促进了 ALYREF 介导的三阴性乳腺癌对紫杉醇的耐药性 01 为了探究 RNF31 是否参与 ALYREF 介导的三阴性乳腺癌（TNBC）对紫杉醇（PTX）的耐药性，研究人员首先通过qRT-PCR检测了紫杉醇处理后耐药细胞和亲代 MDA-MB-231 细胞中紫杉醇耐药相关因子的 mRNA 丰度。过表达 RNF31 可恢复亲代细胞中紫杉醇耐药相关因子的降低水平，特别是上调了微管蛋白 TUBB3、微管结合蛋白 STMN1 和 TAU 的表达水平。此外，在耐药细胞中，沉默 RNF31 降低了紫杉醇耐药相关因子的表达。由于 TUBB3、STMN1 和 TAU 这三种紫杉醇耐药相关因子在响应外源性 RNF31 表达时其表达变化最为显著，因此选择它们进行进一步研究。 RNF31 在体外促进了 ALYREF 介导的三阴性乳腺癌对紫杉醇的耐药性 与亲代三阴性乳腺癌（TNBC）细胞相比，紫杉醇耐药的 TNBC 细胞中 TUBB3、STMN1 和 TAU 的水平显著升高。同样，在对基于紫杉醇的化疗耐药的 TNBC 患者中也观察到了 TUBB3、STMN1 和 TAU 水平的上调。TNBC 患者中 TUBB3、STMN1 和 TAU 的表达水平与核 ALYREF 水平显著相关。此外，通过核质分离和后续的 qRT-PCR 验证，用 siRNA 或噻唑菌素阻断 RNF31 或沉默 IPO13 均可降低 TUBB3、STMN1 和 TAU 的总 mRNA 水平和细胞质 mRNA 水平。研究人员接下来探究了 RNF31 和 IPO13 对 ALYREF 与 mRNA 结合的影响。抗 ALYREF 抗体介导的 RNA 免疫沉淀（RIP）-PCR 显示，在紫杉醇耐药的 MDA-MB-231 细胞中，阻断 RNF31 和沉默 IPO13 显著降低了 ALYREF 与 TUBB3、STMN1 和 TAU mRNA 的结合水平。相比之下，抑制 RNF31 和沉默 IPO13 促进了 Mtr4 外切体 RNA 解旋酶（MTREX，也称为 hMTR4）对 TUBB3、STMN1 和 TAU mRNA 的结合，MTREX 是细胞核内 mRNA 降解复合物的关键标志物。此外，在紫杉醇耐药的 MDA-MB-231 细胞中，抑制 RNF31 和沉默 IPO13 显著缩短了 TUBB3、STMN1 和 TAU mRNA 的半衰期。另外，在亲代细胞中，紫杉醇处理显著降低了 TUBB3、STMN1 和 TAU 的蛋白水平，而过表达 RNF31 恢复了亲代细胞中 TUBB3、STMN1 和 TAU 的降低水平。同时，抑制 ALYREF 表达消除了外源性 RNF31 表达对亲代细胞在紫杉醇处理时的影响。上述结果表明 RNF31 维持了 ALYREF 的 mRNA 结合和输出功能；因此，研究人员进一步研究了 ALYREF 是否影响亲代细胞在紫杉醇处理时 RNF31 的表达。研究显示，在紫杉醇耐药细胞中，沉默 ALYREF 和 IPO13 降低了 RNF31 mRNA 和蛋白水平，表明 RNF31 和 ALYREF 在紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌细胞中形成正反馈环路。 综上所述，上述结果表明 RNF31 通过上调与紫杉醇耐药相关的因子的表达，促进了 ALYREF 诱导的紫杉醇耐药性。 【参考资料】 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ctm2.70203 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

【导读】 近70%的鼻咽癌(NPC)治疗失败是由于远处转移，但其机制尚不清楚。RNA 5-甲基胞嘧啶(rna5 -methylcytosine, m5C)是一种新兴的调控基因表达的修饰方式，在肿瘤进展中发挥重要作用。然而，关于RNA m5C修饰在鼻咽癌转移中的潜在作用的信息很少。 8月8日，中山大学研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“ALYREF promotes the metastasis of nasopharyngeal carcinoma by increasing the stability of NOTCH1 mRNA”，在这项研究中，研究人员发现m5C阅读器的Aly/REF输出因子(ALYREF)在鼻咽癌中显著上调，其高表达与转移和不良预后相关。体外和体内研究发现，ALYREF过表达促进鼻咽癌细胞的肿瘤转移。机制上，m5c修饰的NOTCH1 mRNA被确定为ALYREF的靶点。另外，研究人员发现ALYREF以m5C修饰依赖的方式通过增强NOTCH1的RNA稳定性来上调其表达，从而促进NOTCH信号通路的激活，促进鼻咽癌的转移。 总之，本研究数据揭示了ALYREF在鼻咽癌转移中的关键作用，并为鼻咽癌提供了一个潜在的治疗靶点。 https://www.nature.com/articles/s41419-024-06959-1 背景知识 01 鼻咽癌(NPC)在中国南部、东南亚和北非尤其流行，具有较高的侵袭和转移率。随着鼻咽癌治疗技术的进步，5年局部控制率已达95%。然而，20 ~ 30%的患者在根治性放化疗后仍会发生远处转移。尽管近期有进展，但一旦发生远处转移，预后仍然较差，中位无进展生存期为9.6 ~ 21.4个月。然而，鼻咽癌的转移机制仍不清楚，了解潜在的分子通路对于改善远处转移的控制具有重要意义。 近年来，表观遗传修饰被证实在多种癌症的发生发展中发挥重要作用。5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine, m5C)于20世纪70年代首次被报道，是真核生物mRNA中常见的一种转录后修饰，在mRNA稳定性、翻译效率和核输出等生物学过程中发挥重要作用。一系列调控因子已被证实参与RNA的m5C修饰，包括m5C甲基转移酶(NSUN1-7、DNMT1-2和DNMT3A-B)和去甲基化酶(TET2)。其中，NSUN2和NSUN6是催化哺乳动物mRNA m5C修饰的两种主要甲基转移酶，通过招募解读蛋白如y盒结合蛋白1 (YBX1)和Aly/REF输出因子(ALYREF)发挥其作用。此外，研究人员发现YBX1与AURKA mRNA结合以提高其在鼻咽癌细胞中的蛋白水平。先前的研究表明，ALYREF在促进m5c修饰的mRNA输出方面具有潜在的功能，并且它可能作为肿瘤生长和转移的正调节因子在癌细胞系中发挥作用。然而，ALYREF在NPC中的具体作用尚不清楚。 进化保守的Notch通路在决定肿瘤细胞命运中发挥重要作用。在NOTCH受体家族的4个成员中，NOTCH1因其在肿瘤中的高突变率而被广泛研究。NOTCH1在细胞凋亡、转移、分化和增殖等重要过程中发挥重要作用。在鼻咽癌中，研究人员提出过表达NOTCH1可增强细胞的侵袭和迁移，但其潜在机制尚不清楚。最近的研究表明，Notch信号通路的激活与mettl3介导的m6A (n6 -甲基腺苷)mRNA修饰有关。然而，其他RNA修饰在Notch信号通路中的作用尚不清楚。 ALYREF促进鼻咽癌转移 02 为了探索ALYREF在鼻咽癌中的功能，研究人员使用siRNA敲低了SUNE1和SUNE2细胞中的ALYREF，之后研究人员进行了RNA测序分析。GSEA结果表明，敲低ALYREF可抑制肿瘤转移相关基因的表达。为了证实这些结果，研究人员在SUNE1和SUNE2细胞中敲低了ALYREF，以及在HK1和hon1细胞中过表达了ALYREF。迁移实验结果显示，敲低ALYREF可显著抑制SUNE1和SUNE2细胞的侵袭和迁移能力。相反，在HK1和hon1细胞中过表达ALYREF可增加其侵袭和迁移能力。另外，研究人员通过CCK-8实验检测ALYREF敲低和过表达对鼻咽癌细胞增殖的影响。数据显示，与相应的对照细胞相比，ALYREF敲低和过表达细胞的细胞活力没有显著改变，表明ALYREF促进鼻咽癌转移不是由于对细胞增殖的影响。除此之外，研究人员利用裸鼠肺转移模型来研究ALYREF在体内的功能。研究人员观察到，与载体对照组相比，ALYREF过表达组的荧光素酶信号更强，转移性肺结节更多，表明ALYREF过表达促进了HONE1细胞的肺转移。综上所述，这些结果揭示了ALYREF在促进鼻咽癌转移中的关键作用。 ALYREF促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移 ALYREF通过激活NOTCH1信号通路发挥其致癌作用 03 为了研究ALYREF促进鼻咽癌转移的分子机制，研究人员对RNA-Seq数据进行了GSEA分析，结果显示ALYREF与Notch信号通路呈正相关。由于NOTCH1先前被发现可以促进鼻咽癌的转移，研究人员假设ALYREF可能通过激活Notch信号通路发挥其作用。然后，研究人员在ALYREF过表达的HONE1细胞和载体对照细胞中进行了Flag-RIP检测。研究人员发现，在hon1细胞中，ALYREF的过表达增加了NOTCH1的蛋白和mRNA水平。相反，敲低ALYREF可抑制SUNE1细胞中NOTCH1蛋白和mRNA的表达。此外，qRT-PCR和蛋白质免疫印迹实验结果显示，ALYREF敲低后，Notch信号通路的下游靶基因HES1和HEY1在SUNE1细胞中被显著抑制。研究人员通过组织学染色验证了转移性肺异种移植的存在，并证实了在ALYREF过表达的荷瘤小鼠中，与对照条件相比，NOTCH1蛋白水平升高。为了确定NOTCH1抑制是否可以逆转ALYREF的表型，研究人员用50 mg/L的新型r-分泌酶抑制剂LY3039478来阻断NOTCH1信号通路。LY3039478处理后，过表达ALYREF的HONE1细胞的侵袭和迁移能力明显减弱。综上所述，这些结果表明，ALYREF通过激活Notch信号通路促进鼻咽癌转移。 研究小结 04 综上所述，本研究结果确定了ALYREF是鼻咽癌中一种新的致癌基因。研究发现，ALYREF的上调与鼻咽癌患者的转移和不良预后有关。在鼻咽癌细胞中，ALYREF通过m5c依赖的方式激活NOTCH1来促进转移。重要的是，本研究结果强调了ALYREF作为使用LY3039478治疗鼻咽癌的潜在生物标志物和治疗靶点。 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s41419-024-06959-1 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 线上｜08月15日 19:00-20:30 ▶ “脑类器官前沿：揭秘遗传机制，重塑神经退行性疾病研究未来”线上研讨会欢迎您的参与！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

引言 RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰是一种保守的转录后修饰，广泛分布在rRNA、tRNA和mRNA上。mRNA上的m5C修饰主要由NSUN2和NSUN6等甲基转移酶催化产生，并且可以被TET家族蛋白和ALKBH1进一步氧化到hm5C，f5C和ca5C【1】。RNA m5C修饰可以被特定的结合蛋白所识别进而参与基因表达调控，如近年来国家生物信息中心杨运桂团队在RNA m5C修饰研究中取得了系列突破性成果，报道了包括ALYREF, YBX1, YBX2和SRSF2在内的多个结合蛋白及其调控功能【2-6】，极大地推动了对于RNA m5C修饰生物学功能的理解。 对于RNA m5C修饰功能的探究依赖于灵敏精准的检测技术。目前RNA m5C修饰检测主要依赖于亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing，BS-seq），在BS-seq中未修饰的胞嘧啶（C）被转变为尿嘧啶（U），而m5C保持不变，因此通过检测未转变C即可实现对于m5C修饰的鉴定。虽然BS-seq操作简单便捷，并且可以实现单碱基分辨率m5C修饰的定量检测，但是其存在三个主要不足之处：1）间接检测m5C，依赖于未修饰C的高效转换，转换不完全可能会导致假阳性；2）反应条件苛刻，导致RNA降解，限制低起始量样本和低丰度RNA的检测；3）C转变为U后序列复杂度降低，影响比对准确度，限制低序列复杂度RNA 上m5C的检测。尽管一系列优化措施如使用ACT三元碱基随机引物提高检测精准度与灵敏度【2】、优化分析流程【7】、利用无修饰RNA文库校正【8】和 Ultrafast BS反应条件提高转换效率【9】等，显著提升了BS-seq的检测精准度，但由于mRNA m5C修饰水平较低（中位数约为20%以下），对于依赖间接检测的BS-seq，低复杂度序列以及低修饰比例位点的灵敏检测仍是挑战。虽然目前已有多种不依赖亚硫酸氢盐的RNA m5C检测方法被报道，但是这些方法各有局限，均无法实现全转录组水平RNA m5C修饰单碱基分辨率无偏检测。 2024年7月12日，浙江大学医学院李笑雨研究员联合北京大学生命科学学院伊成器教授在Molecular Cell发表了题为Base-resolution m5C profiling across the mammalian transcriptome by bisulfite-free enzyme-assisted chemical labeling approach的研究论文，该研究开发了一种不依赖于亚硫酸氢盐的检测新技术，m5C-TAC-seq（m5C detection strategy enabled by TET-assisted chemical labeling），实现了全转录组水平m5C位点单碱基分辨率的精准、灵敏检测。 这项技术的核心原理是将酶促反应与化学标记相结合，利用优化后的TET酶促反应将RNA m5C氧化至f5C，进一步使用叠氮茚二酮（AI）对于氧化产生的f5C进行特异性标记，标记产物不仅可以产生C-to-T的转变，并且还可以通过点击化学反应进行富集，从而实现对于m5C修饰单碱基分辨率的直接检测（图1A）。这一直接检测的特性使其能够灵敏检测修饰比例低至2.5%的位点（图1B）。此外该方法还具有反应条件温和、不影响转录组碱基组成的特点，因此可以应用于低丰度和低序列复杂度的转录本。同时，结合multiplexing文库构建策略，不仅可以减少样品之间的技术误差，并且能够实现m5C修饰的半定量检测。 图1：m5C-TAC-seq可以实现单碱基分辨率m5C位点检测。A. m5C-TAC-seq原理及流程图；B. m5C-TAC-seq计算的C-to-T转化率与m5C修饰比例呈现正相关；C. m5C-TAC-seq可以实现对于rRNA已知位点与未知位点的灵敏检测；D. 未修饰HeLa转录组文库对照分析提示2,499个m5C位点中只有6个位假阳性位点；E. 四元碱基组成大大提高了比对准确度；F. caRNA上m5C修饰位点分布 （Credit: Molecular Cell） 为了评估m5C-TAC-seq的灵敏性和准确性，研究人员首先将其应用于rRNA和tRNA上。在rRNA上，m5C-TAC-seq不仅能够精准检测已知的高m5C修饰位点，并且还鉴定了一个新的低修饰位点m5C3683及其修饰酶（图1C），验证了m5C-TAC-seq的灵敏度。此外，对于具有复杂二级结构且序列复杂度较低的tRNA，m5C-TAC-seq不仅能够鉴定所有已报道位点及其修饰酶，并且由于保留了四元碱基组成使得其可以实现对不同tRNA isodecoder的精准检测。利用m5C-TAC-seq，研究人员绘制了HeLa、HEK293T和mESC的单碱基分辨率m5C修饰图谱，分别鉴定了2499、765和664个m5C位点，并利用无修饰转录组文库进行对照分析验证了这些位点的可靠性（图1D）。更为重要的是，鉴定了绝大多数m5C位点的甲基转移酶，进一步确认了这些位点的准确性。此外，与BS-seq相比，m5C-TAC-seq在低修饰位点的检测上也表现出高精度和高灵敏度，提示其直接检测策略的鲁棒性。 进一步研究发现，除了已知的NSUN2和NSUN6，rRNA甲基转移酶NSUN5也可以作用于mRNA，这一发现与近期中山大学张锐团队开发的高灵敏motif分析工具iMVP在mRNA上鉴定到的NSUN5 motif一致【10】。此外，利用m5C-TAC-seq，研究人员还发现在mESC的分化过程中，大部分mRNA上m5C位点呈现甲基化水平下调趋势，并且富集在细胞周期及细胞分裂相关通路的转录本上，提示了m5C修饰可能参与到mESC分化过程中。得益于温和的反应条件及对碱基组成的保留（图1E），m5C-TAC-seq实现了对含有大量低复杂度序列的chromatin-associated RNA（caRNA）上m5C位点的鉴定（图1F），提示了四元碱基的保留对于低复杂度序列上m5C修饰检测的重要性。 综上所述，该研究开发了直接检测m5C修饰的新技术m5C-TAC-seq，并展示了m5C-TAC-seq技术高灵敏、高精准的检测特性。m5C-TAC-seq不仅可以应用于包括低丰度、低序列复杂度在内的多种类型RNA和低修饰比例m5C位点的检测，并且可以实现在多种生物学过程中m5C修饰的动态检测，将有助于理解和推动RNA m5C修饰生物学功能的探究。 图2：m5C-TAC-seq可以应用于多种类型RNA以及生物学过程中m5C修饰位点的动态检测（Credit: Molecular Cell） 参考文献 1 Chen, Y. S., Yang, W. L., Zhao, Y. L. & Yang, Y. G. Dynamic transcriptomic m(5) C and its regulatory role in RNA processing. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 12, e1639, doi:10.1002/wrna.1639 (2021). 2 Yang, X. et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m(5)C reader. Cell Res. 27, 606-625, doi:10.1038/cr.2017.55 (2017). 3 Chen, X. et al. 5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat. Cell Biol. 21, 978-990, doi:10.1038/s41556-019-0361-y (2019). 4 Yang, Y. et al. RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol. Cell 75, 1188-1202 e1111, doi:10.1016/j.molcel.2019.06.033 (2019). 5 Wang, X. Z. et al. RNA 5-methylcytosine regulates YBX2-dependent liquid-liquid phase separation. Fund Res-China 2, 48-55, doi:10.1016/j.fmre.2021.10.008 (2022). 6 Ma, H. L. et al. SRSF2 plays an unexpected role as reader of m(5)C on mRNA, linking epitranscriptomics to cancer. Mol. Cell 83, 4239-4254 e4210, doi:10.1016/j.molcel.2023.11.003 (2023). 7 Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N. & Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 380-388, doi:10.1038/s41594-019-0218-x (2019). 8 Zhang, Z. et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nat. Methods 18, 1213-1222, doi:10.1038/s41592-021-01280-7 (2021). 9 Dai, Q. et al. Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA. Nat. Biotechnol., doi:10.1038/s41587-023-02034-w (2024). 10 Liu, J. et al. Epitranscriptomic subtyping, visualization, and denoising by global motif visualization. Nat. Commun. 14, 5944, doi:10.1038/s41467-023-41653-4 (2023). https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.06.021 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述