NBN

撰文 | 魏胜男    责编 | 周叶斌B细胞急性淋巴细胞白血病是一种常见的儿童癌症，并且有越来越多的研究表明该病的发病率与遗传有关。目前发现与白血病发病相关的基因多与淋巴细胞分化、细胞周期和细胞凋亡信号传导有关，DNA损伤则与髓系白血病的发病机制有关。DNA修复基因的变异会导致在DNA双链断开、单链断开或双链间交联过程中的校正失败。因此，DNA修复的失败会带来基因水平上的改变，增加癌症患病的风险。NBN基因的双等位突变是奈梅亨断裂综合征（Nijmegen Breakage Syndrome, NBS）的遗传病因，该综合征与淋巴系统恶性肿瘤发病相关。约90%的NBS患者为NBN基因移码突变的纯合携带者。NBN蛋白作为DNA双链断裂的传感和下游修复信号的适配子，参与细胞周期的调控、DNA修复和凋亡信号的传导。NBS患者表现出特有的表型，包括免疫缺陷、放射敏感性和癌症易发性。NBS患者在儿童时期发生癌症的风险累积高达70%，通常表现为淋巴恶性肿瘤（B或T系亚型）。尽管NBN基因突变杂合携带者在临床上未表现症状，但研究者认为其仍可能具有较高的癌症发病风险。两个大样本的针对癌症患者的研究发现，在携带NBN基因 p.K219fs位点突变的人群中，患乳腺癌、前列腺癌、白血病和淋巴瘤的患者明显增多。尽管在越来越多的癌症患者中检测到NBN变异，但其与B-ALL发病的关联性研究却十分有限。近日，由 Carolin Escherich和Jun J. Yang 团队发表于 Blood 题为 Germline Genetic NBN Variation and Predisposition to B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Children 的文章中，通过对4,325例儿童B-ALL患者进行测序，研究者系统性地分析了NBN变异频率，发现与非癌症患者对照组相比，儿童B-ALL患者中NBN变异的频率显著增高。大多数B-ALL患者中的NBN基因变异为错义突变，并集中出现在NBN蛋白的N端结构域。通过两种功能实验，研究者发现在这25种变异中有14种为严重功能丧失表型，并将其归类为“无功能”或“部分功能”。此外，所有杂合型NBN变异携带者的生存率与野生型（WT）患者无显著差异。为了系统地分析NBN基因变异与B-ALL发病之间的关联性及对该疾病治疗预后的影响，研究者选择美国儿童肿瘤协作组（Children’s Oncology Group）和St Jude儿童研究医院临床试验中的4325名B-ALL儿童患者为主要研究对象。研究者使用靶向测序技术对B-ALL儿童患者进行NBN基因变异筛选分析，在50例B-ALL儿童患者的NBN靶向测序结果中发现25种特有的潜在有害NBN基因变异，其累计发病率为1.2%；相对于gnomAD数据库中的对照数据，在118478例非癌症患者中，发现了472种潜在有害NBN基因变异，其中189种为特有的（累计发病率为0.4%），B-ALL患者中具有害的NBN基因变异的表达显著增加。值得注意的是，在gnomAD数据库里的筛选到的25个NBN相关变异中，有4个是未知的（表1）。在9名患者中发现3个与B-ALL相关NBN变异，这些变异导致了蛋白质截断，包括已知的会导致功能丧失的变异体p.K219fs（图1B和表1）。其余22个变异为错义突变，其中16个主要位于N端的FHA-BRCT重复域（22个变异体中的16个，72.7%；图1B)。每个样本中每个变异的等位基因比例被证实约为50%，与所有潜在有害NBN变异携带者的杂合基因型一致（表1）。表1.B-ALL患者中发现的罕见的和潜在有害的NBN基因变异 图1B.NBN基因蛋白结构域图  Forkhead-associated域（FHA）、乳腺癌C端域（BRCT）I和II、MRE11和ATM相互作用位点（NBS1C）、SP100相互作用位点以及MTOR相互作用位点。上图显示研究中鉴定出的NBN变异发生的氨基酸替换位点。圆圈中的数字表示检测出携带该NBN变异的患者数量。在对变异基因表达蛋白的功能性研究中，研究者发现蛋白功能与蛋白的稳定性相关。除p.K219fs外的另外6种变异均会导致蛋白功能失活。如所预期，3个导致蛋白截断的变异表达的蛋白均失去蛋白功能性。另外有4个发生在氨基酸位点4、40、228和313的无义突变，也导致了蛋白功能丧失。评估试验组中B-ALL儿童患者与NBN基因的变异的关系，研究者发现携带非功能性NBN变异的患者在诱导化疗后的反应与NBN基因未发生变异的患者相似，与已知的NBS患者预后不同。非功能性NBN变异的杂合携带者与NBN未变异的患者在总生存期或无事件生存期方面无显著差异。图2.研究总结：1)在B-ALL儿童中，潜在有害的NBN变异表达显著增高；2）蛋白质不稳定是NBN基因变异导致功能丧失的关键机制。总之，该研究通过对患有B细胞急性淋巴细胞白血病的儿童NBN基因的靶向测序，及其表达蛋白的功能性研究，发现儿童B-ALL患者中NBN变异的频率显著增高，且多为错义突变，并集中出现在NBN蛋白的N端结构域。杂合型NBN变异携带者的生存率与野生型（WT）患者无显著差异。本研究为B-ALL的遗传易感性、NBN变异对蛋白功能的影响研究提供了新思路，而杂合NBN变异携带者也能接受ALL治疗。 撰文  责编  制作排版 | 车洁   校对 | uu*本文由深圳市拾玉儿童公益基金会“儿童肿瘤前沿”团队编译或约稿，文中图表均源引自文献原文。本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。如需转载，请留言或联系shiyu@curekids.cn。本文旨在分享儿童肿瘤科研前沿成果，不是治疗方案推荐。如需获得疾病治疗方案指导，请前往正规医院就诊。▼滑动查看更多▼原文摘要（Abstract）Biallelic mutation in the DNA-damage repair gene NBN is the genetic cause of Nijmegen breakage syndrome, which is associated with predisposition to lymphoid malignancies. Heterozygous carriers of germ line NBN variants may also be at risk for leukemia development, although this is much less characterized. By sequencing 4325 pediatric patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), we systematically examined the frequency of germ line NBN variants and identified 25 unique, putatively damaging NBN coding variants in 50 patients. Compared with the frequency of NBN variants in gnomAD noncancer controls (189 unique, putatively damaging NBN coding variants in 472 of 118 479 individuals), we found significant overrepresentation in pediatric B-ALL (P = .004; odds ratio, 1.8). Most B-ALL-risk variants were missense and cluster within the NBN N-terminal domains. Using 2 functional assays, we verified 14 of 25 variants with severe loss-of-function phenotypes and thus classified these as nonfunctional or partially functional. Finally, we found that germ line NBN variant carriers, all of whom were identified as heterozygous genotypes, showed similar survival outcomes relative to those with wild type status. Taken together, our findings provide novel insights into the genetic predisposition to B-ALL, and the impact of NBN variants on protein function and suggest that heterozygous NBN variant carriers may safely receive B-ALL therapy. These trials were registered at www.clinicaltrials.gov as #NCT01225874, NCT00075725, NCT00103285, NCI-T93-0101D, and NCT00137111.DOI: 10.1182/blood.2023023336👇点击此处，直达原文

Cytiva智荟专线 400-810-9118，2号键 #智荟锦囊 重链抗体的可变结构域 (VHH) 也被称为纳米抗体 (Nanobodies/Nbs) ，是来源于骆驼科动物重链抗体的单体抗原结合结构域。 Nbs具有分子尺寸小、靶向选择性高、高溶解性和高稳定性等显著特点，这些特点都极大促进了高质量的药物开发。同时Nbs很容易在各种表达系统中表达，例如大肠杆菌和酵母等。由于以上这些原因，Nbs成为了蛋白质工程、诊断和疾病治疗的首选抗体片段之一，截止到2023年FDA已经批准了两款基于Nbs的治疗方法。目前有许多正处于临床前和临床研究中的Nbs候选药物，涵盖了广泛的疾病类型，包括癌症、免疫系统疾病、传染病和神经退行性疾病。[1] 01 VHH特点： 分子尺寸小，分子量约15 kDa； 组织穿透力强，可以有效穿透血脑屏障 (blood-brain barrier) ；[2] 较高的稳定性和溶解度，热稳定性强；[3] 免疫原性较低； 半衰期短，易于代谢。[4] 01 MabSelect PrismA Protein A亲和层析填料长期以来一直被用于纯化单克隆抗体 (mAbs) ，被各种规模的生物制药企业广泛应用。Protein A和抗体的结合主要发生在单抗的Fc区，位于CH2和CH3之间。与此同时，Protein A也可以结合抗体Fab区可变重链上的VH3序列。 Cytiva所开发的多款现代Protein A填料，例如MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA等，具有高结合载量以及高耐碱性等特点。 图1：单克隆抗体上不同的结合位点以及现代Protein A填料选择 MabSelect PrismA纯化VHH 在Tricorn 5/50柱子中填充1 mL MabSelect PrismA填料，将150 mL含有0.2 g/L VHH的大肠杆菌粗提物（Load=30 g VHH/L填料）上样到1 mL MabSelect PrismA柱子，保留时间为6分钟。VHH样品在50 mM pH 3.5的醋酸钠溶液中洗脱获得，纯化结果如图2所示。[6] 图2：使用MabSelect PrismA捕获大肠杆菌表达的VHH 对本次纯化中Load和Eluate分别取样进行检测，经过MabSelect PrismA纯化所得的VHH样品和上柱前相比，宿主蛋白的去除率达到4.3 log，而配基脱落仅10 ppm（表1）。 表1：MabSelect PrismA纯化VHH的检测数据对比[6] 将纯化过的VHH样品分别上样到装有不同Protein A填料的1 mL HiTrap预装柱中，分别是HiTrap MabSelect（rprotein A配基）、HiTrap MabSelect SuRe、HiTrap MabSelect PrismA这三种，然后进行酸性pH值洗脱。能够从图3中看到，MabSelect和MabSelect PrismA表现出类似的层析行为，而MabSelect SuRe显示出和VHH仅有较弱的相互作用。 图3：VHH和 (A) MabSelect、(B) MabSelect SuRe、(C) MabSelect PrismA三种不同填料的层析结果[6] 进一步地对VH3序列的关键氨基酸进行点突变，并测试氨基酸点突变后的VHH与上述3种现代Protein A填料的相互作用强弱，表2中的数据表明：在少数特定情况下，MabSelect SuRe填料也可以与VH3区域发生相互作用，而MabSelect和MabSelect PrismA填料对VHH序列变化的敏感性较低，在多数情况下都能和VHH样品结合。 表2：MabSelect、MabSelect SuRe和MabSelect PrismA填料与点突变VHH的相互作用[6] 01 MabSelect VH3 2023年11月Cytiva上市了MabSelect VH3亲和填料，MabSelect VH3采用经过重组改造的protein A配基，该配基只与包含VH3序列家族的重链可变区的人源抗体发生相互作用，VH3配基与传统的protein A配基相比，Fc区相互作用已被敲除，而VH3区相互作用得到增强。VH3序列家族是商业化生物制品中抗体最常见的VH类型。利用这一特性可有效分离双特异性抗体 (bsAb) 和抗体片段，例如抗原结合区片段 (Fab) 、单链可变片段 (scFv) 和重链可变区 (VHH) 。 对包含VH3序列家族的双特异性抗体以及抗体片段具有高结合载量； 在捕获双特异性抗体时，对于产品相关杂质具有良好的分辨率； 耐碱稳定性：使用0.5 M NaOH清洗时保持稳定，可大大降低生物负荷的风险并具有较长的填料使用寿命； 与Fab VH3区域的单一相互作用，比具有双重相互作用（Fab及Fc区）的亲和配基更为有利，因为这种单一作用可更高效地将不需要的错配抗体和片段从目标bsAb中分离； 使用专为MabSelect VH3填料设计的VH3 Ligand ELISA试剂盒（货号29737000）可轻松测量配基脱落。 经过测试，针对VHH样品MabSelect VH3填料的动态结合载量略高于MabSelect PrismA填料大约11%–14%。如图4所示，MabSelect VH3填料与VHH的动态结合载量为36-39 g/L，同时MabSelect VH3填料和VHH的动态结合载量不太受保留时间长短的影响。[7]尤其是在较短的保留时间下，填料和VHH的高结合载量为生物制药提供了强劲的生产优势。 图4：不同保留时间下MabSelect VH3和MabSelect PrismA填料和VHH的动态结合载量对比[7] 高动态结合载量不仅在填料寿命的开始阶段非常重要，同时填料也需要能够承受严苛的清洁再生条件以降低生物污染事件发生的风险，为了实现填料的高利用率，动态结合载量必须在填料整个寿命周期内保持稳定。 将MabSelect VH3填料的初始动态结合载量设定为100%（即第0个周期，填料未使用NaOH处理时），之后每16个CIP循环后用经过纯化的曲妥珠单抗以及VHH样品分别测量填料的动态结合载量。测试结果表明：经过96次循环的0.5M NaOH清洁再生后，MabSelect VH3填料对曲妥珠单抗和VHH的相对剩余结合载量均高达93%（图5）。值得一提的是，在经过多达200次CIP循环后，MabSelect VH3填料对于曲妥珠单抗的相对剩余结合载量仍然有84%。[7] 图5：CIP条件为0.5 M NaOH接触时间15分钟，经过96次CIP循环后MabSelect VH3填料对mAb和VHH的相对剩余结合载量高达93%[7] 小编小结 VHH即纳米抗体由于其分子量小、组织穿透力强、稳定性强、免疫原性低等诸多特点，作为抗体药物的潜力赛道吸引了广泛的关注，在疾病诊断及治疗方面具有广阔的应用前景。Cytiva所开发的现代Protein A填料MabSelect PrismA以及MabSelect VH3在VHH纯化上均有不俗表现，同时具备了高结合载量以及耐碱稳定性。 ✨ 年终限定学习福利来啦 ✨ 每日打卡学习干货， 轻松解锁丰富的品牌纪念品！🎁 本周前10名下载的生命科学行业终端用户 经核实，即可获赠幻想加湿器一个 快来参与，让知识与惊喜相伴！ 相关阅读： ☞ Ä文献｜纳米抗体在前列腺癌诊断及治疗中的研究 参考文献 [1]. Nanobodies: Robust miniprotein binders in biomedicine, J. Yong Joon Kim, Z. Sang, Y. Xiang et al. Advanced Drug Delivery Reviews 195 (2023) 114726 [2]. Transportation of single-domain antibodies through the blood–brain barrier, Ruiz-López E, Schuhmacher AJ. Biomolecules. 2021;11(8):1131. [3]. A structure-based engineering approach to abrogate pre-existing antibody binding to biotherapeutics. Lin J, et al. Lin J, et al. PLoS ONE. 2021;16(7):e0254944. [4]. Nanobody conjugates for targeted cancer therapy and imaging. Kang W, et al. Technol Cancer Res Treat. 2021;20:15330338211010116. [5]. Discovery of nanobodies: a comprehensive review of their applications and potential over the past five years, Alexander and Leong, Journal of Nanobiotechnology (2024) 22:661 [6]. Platform for purification of VHH-type antibody fragments, CY11918-10Sep20-PT [7]. MabSelect VH3 resin Data File, CY36703-31Jul24-DF

摘要：杆状病毒是感染鳞翅目、双翅目和膜翅目不同物种的病毒病原体，具有全球分布。由于它们的生物学特性以及由此产生的生物技术应用，杆状病毒科是自然科学中一个重要的研究和操作对象。随着RNA干扰机制的出现，已经描述了那些不编码蛋白质而是产生类似于微RNA（miRNA）的转录本的杆状病毒基因的存在。这些miRNA与病毒和宿主序列中基因表达的调控功能相关。本文全面回顾了miRNA的生物生成、功能和特性，特别关注那些在杆状病毒中鉴定出的miRNA。此外，它深入探讨了杆状病毒miRNA在调控病毒和宿主基因方面的特定作用，并提出了结构和热力学稳定性研究，这些研究有助于检测具有预测效用的共享特征。本综述旨在扩展我们对杆状病毒miRNA组的理解，有助于改进基于杆状病毒的生物杀虫剂的生产、管理害虫中的抗性现象、增强重组蛋白生产系统，并开发多样化和改进的BacMam载体以满足生物医学需求。 1.杆状病毒生物学 杆状病毒科是研究最广泛的病毒家族之一，尽管它不感染人类或对具有重要社会经济利益的动植物造成感染。相反，它主要感染各种节肢动物幼虫，包括鳞翅目、膜翅目和双翅目，其中许多被认为是农业害虫。这解释了对杆状病毒的相当大的兴趣，因为它们已经被成功地用作生物杀虫剂配方中的主要活性成分，用于控制多种农作物中的昆虫害虫。随着时间的推移，随着我们对杆状病毒的理解的增长，它们的主要生物技术应用已经多样化到其他行业，导致了作为杆状病毒重组蛋白表达载体（Baculovirus Expression Vector Systems，或BEVS）的遗传改良变种的发展。随后，出现了一种新的应用类型，涉及在哺乳动物中有用的工程病毒。尽管这些病毒在脊椎动物中不具有传染性，但它们可以转导哺乳动物细胞并携带感兴趣的重组DNA，促进疫苗和疗法的概念发展（称为BacMam应用，用于哺乳动物中的杆状病毒）。这些属性使其成为腺病毒载体的技术竞争对手，提供类似的好处，但具有更优越的免疫学特性。杆状病毒的核酸是一个大的圆形双链DNA分子，位于一个蛋白质极性核衣壳内。这个家族的名字来源于这种核衣壳的特征形态，它被脂质双层包围。这些结构被称为包涵体衍生病毒（ODVs），嵌入在称为包涵体（OB）的蛋白质副晶态基质中，后者在感染昆虫细胞的细胞核中形成。在已描述的杆状病毒中，已报告了两种主要类型的OBs：具有颗粒形态的颗粒病毒（GVs）和具有多面体形态的核多角体病毒（NPVs）。GVs通常包含一个ODV，而NPVs可以包含多个ODVs。一些NPV分离物甚至有一个脂质包膜中的ODVs含有多个核衣壳。这种形态多样性，加上宿主特异性和其他属性，导致它们被分类为四个属：Alphabaculovirus（感染鳞翅目的NPVs）；Betabaculovirus（感染鳞翅目的GVs）；Deltabaculovirus（感染双翅目的NPVs）；和Gammabaculovirus（感染膜翅目的NPVs）。目前，Baculoviridae是Lefaviridae目中的一个家族，该目还包括Nudiviridae和Hytrosaviridae，在Naldaviricetes类中（包括Nimaviridae）。值得注意的是，还有一种称为芽生病毒（BV）的病毒形态，它在感染过程中产生，至少对于alphabaculoviruses和betabaculoviruses是这样。BVs有助于将感染传播到受影响幼虫的不同组织。BVs是被脂质膜包裹的核衣壳，含有病毒蛋白，与包围ODVs的膜不同。有了这两种类型的病毒，杆状病毒的感染周期通常被分为一个由OBs和ODVs在易感幼虫的中肠细胞中主导的初级过程，以及一个由BVs（如果存在）主导的次级过程，它可以将感染传播到受影响个体的大多数组织。由杆状病毒引起的病理通常是致命的，可能涉及幼虫液化作为一种可能的结果。杆状病毒复杂的感染周期是通过其遗传内容的复杂调控实现的。国际病毒分类委员会（ICTV; https://ictv.global/taxonomy, 最后访问日期为2023年9月20日）提出了基于核心基因之间的遗传距离和其他生物学属性（如病毒形态和宿主影响）的103种杆状病毒。最近的一项研究，考虑了所有可用的杆状病毒基因组数据，仅基于遗传距离标准提出了类似的结果。这项研究探索了序列范围在81,755到178,733碱基对之间，包含89到183个编码蛋白质的基因。杆状病毒拥有自己的转录和复制机制，所有报告的成员至少共享39个同源蛋白基因。有趣的是，尽管杆状病毒基因组中存在大量的蛋白基因内容，但也观察到了非编码RNA基因的存在，包括那些编码微RNA（miRNAs）的基因，甚至转移RNA（tRNAs）。根据报告的研究，有证据表明杆状病毒基因组内存在信息重叠，其中编码蛋白质和非编码RNA分子可能在同一基因座上编码。此外，也可能存在非基因功能，如复制起点。对每个蛋白基因的功能，以及RNA基因的语法和角色的更全面理解，不仅有助于理解宿主与其寄生虫之间的自然相互作用，而且可能对人类应用产生潜在影响，包括使用这些病毒及其自然和工程变体。 2.miRNA生物生成和功能 许多原核生物和真核生物的细胞过程都受到由RNA和蛋白质分子组成的酶复合体的调控。这些复合体，称为核糖核蛋白（RNPs），通常作用于核酸底物。它们发挥各种关键作用，如通过选择性剪接促进转录本成熟，通过选择性降解或抑制转录本的翻译来调节基因表达，以及作为特定核酸酶来消除外来核酸。此外，还有参与核染色质重塑的RNPs，具有重要的表观遗传后果。这些RNPs中的RNA分子具有关键作用，因为它们通常作为指南，将酶机制导向它们的目标核酸。这些RNA分子的生物生成是通过转录通常缺乏蛋白质编码信息的基因发生的。这些RNA基因可以产生，例如，小核RNA（snRNA）、微RNA（miRNAs）或CRISPR（簇状规则间隔短回文重复序列）RNAs（crRNAs），它们参与称为剪接体、RNA诱导的沉默复合体（RISCs）或CRISPR/Cas系统的RNP复合体。长非编码RNA（lncRNAs），在真核生物的调控动态中非常丰富，也形成在基因组的特定位点特异性结合酶的复合体。对于这些例子中的任何一个，与蛋白质基因相比，RNA基因在基因组中的注释通常更具挑战性，因为我们对构成它们的句法元素的知识是有限的。开放阅读框（ORF）的缺失，尽管可能被内含子打断，不再是其完全识别的障碍。因此，细胞中发生的一些过程可能被忽视或没有完全解释，这些RNA分子作为一种“暗物质”，可能有助于更好地理解塑造和支持生物体的许多机制。 RNA干扰（RNAi）机制是大约25年前被认识到的细胞过程，并且在生化上已被成功描述，使得农业和医学的生物技术的设计和发展成为可能。这一在真核生物中高度保守的过程依赖于针对RNA分子的RNPs。该机制是由双链RNA（dsRNA，内源性产生或来自入侵核酸）的存在引发的，这触发了具有核酸酶活性或翻译抑制的RNPs的形成，使细胞能够防御病毒攻击并丰富其基因表达的调控机制。考虑到这一最后的活动，RNAi机制可能作为转录后基因沉默（PTGS）进行干预，为细胞提供了根据它们接收到的动态信号调整其功能的选项。这一保守功能是一个由参与dsRNA处理和RNPs形成的蛋白质编码基因编码的复杂系统，将充当效应核酸酶或翻译阻断剂。此外，它还包括RNA基因，如产生miRNA的miR基因，产生引导RNPs到目标分子的指南。在蛋白质编码基因中，值得一提的是那些编码III型RNases Drosha和Dicer、DGCR8（人类DiGeorge综合征关键区域8）或Pasha（非人类中的Drosha伴侣）以及称为Argonauts（AGO）的H型RNases。自本世纪初以来，已经描述并存储了数千种来自不同生物体的miRNAs，并继续对这些生物分子在生物体生理学和病理学中的作用感兴趣（图1）。 图1. 与miRNA相关的科学出版物和miRBase数据库内容。面板(A)描绘了每年关于miRNA的出版物（原创文章）数量，这些出版物来自不同的实体（除了2023年，那里的结果只是部分的）。数据是通过使用PubMed搜索（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/；最后访问日期为2023年4月3日）以及考虑的实体的对应组合关键词“microRNA”获得的。面板(B)展示了一个条形图，说明了在miRBase数据库（https://www.mirbase.org/；最后访问日期为2023年4月3日）的不同更新中报告的miRNA数量，这些miRNA来自不同的实体（当这些信息可用时）。这个图是原创的，之前没有发表过。 虽然大多数科学工作集中在理解哺乳动物miRNAs上，特别是那些涉及人类过程的miRNAs，但也有关于昆虫和病毒的报告。这些贡献丰富了我们对RNA干扰过程的全球理解，并可能为推进各种生物技术创造新的机会。通常，参与这种沉默功能的蛋白质是组成性表达的，没有显著的调节，而调节分子（如miRNA）提供可诱导的作用。因此，表征miR基因并理解它们的表达动态对于理解沉默过程的发生至关重要。MiR基因通常由RNA聚合酶II启动子和终止信号（尽管可能有其他来源，如其在内含子中的出现）界定，产生大约70-100个核苷酸的初级前体（pri-miRNA）。这种分子通常采用类似发夹的结构，在核中被Drosha/Pasha（微处理器复合体）识别，这是一种将其处理成前体miRNA的蛋白质。随后，处理过的转录本通过Exportin 5/RanGTP导出到细胞质中，在那里它被Dicer在其他RNA结合蛋白（如TRBP，人类的转录激活反应RNA结合蛋白）的支持下切割，导致形成包含成熟miRNA和AGO蛋白的RISC。这种成熟的miRNA，通常长21-25个核苷酸，源自pri-miRNA的双链区域（图2）。 当RISC复合体通过特定相互作用遇到目标转录本（通常是mRNA）时，它开始“沉默”目标。这可能涉及水解或翻译抑制，导致目标基因产物处于“关闭”状态。为了执行这一行动，需要发生RNA-RNA相互作用（miRNA-mRNA），通常涉及位于目标分子30非翻译区（UTR）的特定序列。这个区域，称为miRNA反应元件（MRE），作为基因表达的调控信号。已经观察到，RISC复合体的构象由RNP和目标RNA之间的特定结合决定，涉及A:U和G:C碱基对相互作用，以及G:U对。具体来说，这种相互作用是由位于miRNA 50端大约6到8个核苷酸的序列促进的，称为核心或种子序列。这允许预测基因组中可能被特定miRNA调节的潜在靶基因。 图2. miRNA介导的沉默机制。该图示描绘了内源性miRNA介导的沉默的经典途径。 1.从细胞基因组(gDNA)或病毒核酸(vDNA)转录生成pri-miRNA（通常由RNA聚合酶II执行）。 2,3. 与Drosha和Pasha蛋白（人类中的DGCR8）结合生成前体miRNA。 4.由Exportin5和RanGTP协助转运到细胞质。 5.与DICER和TRBP结合，连同Argonaut 2(AGO2)的存在，完成miRNA成熟并形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。 6.miRISC与目标转录本结合（通常位于mRNA的3' UTR）。 7.目标转录本降解或其翻译抑制；目标RNA分子数量减少和/或编码蛋白产量下降（在mRNA的情况下），导致随后对生物功能的效应。由于“杆状病毒/昆虫”系统中涉及RNA干扰的蛋白质机制来源于宿主基因，因此一些报告了bac-miRs的杆状病毒宿主的鳞翅目昆虫的主要蛋白的GenBank登录号如下：家蚕的NP_001095931.1(Ago1), NP_001036995.2(Ago2), NP_001180543.1(DICER-2), XP_012547603.2(Drosha), XP_037872173.1(Pasha)；斜纹夜蛾的XM_022976077.1(AGO), AHC98010.1(AGO2), XM_022972435.1(DICER), XP_022826597.1(Drosha), XP_022831748.1(Pasha)；草地贪夜蛾的AVK59452.1(AGO1), XP_035453543.1(AGO2), XP_035450082.2(DICER), XP_050556783.1(Drosha), XP_050553060.1(Pasha)。这个图是原创的，之前没有发表过。 3.杆状病毒编码的miRNAs 病毒是寄生实体，利用它们入侵的宿主细胞的细胞资源进行复制并在自然界中维持自己。在宿主和寄生虫之间的这种复杂关系中，发生了旨在终止感染过程或削弱宿主防御机制以促进成功入侵的分子对话。RNAi机制在这些真核生物内的相互作用中发挥着重要作用。因此，能够影响病毒过程的细胞miRNA基因的存在，以及调节自身表达级联以对抗宿主的病毒miRNA基因的出现，成为病毒感染中的显著特征。在这种情况下，杆状病毒也不例外。如前所述，它们的基因组包含miR（bac-miR）基因。全面的文献综述确定了13个有实验证据的报告bac-miRs（表1），从现在开始关注它们。其中，家蚕核多角体病毒（BmNPV；Aplphabaculovirus bomori）中有5个，加州多角体病毒（AcMNPV；Alphabaculovirus aucalifornicae）中有5个，粉纹夜蛾多角体病毒（AgMNPV；Alphabaculovirus angemmatalis）中有1个，斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltNPV；Alphabaculovirus spliturae）中有2个。值得一提的是，所有这些病毒都属于Alphabaculovirus属。这并不一定意味着bac-miR基因的发生是这个类群所独有的，而是由于工具的可用性更大等因素，如现有的易感于这些病毒的昆虫细胞系，因此更多的研究工作已经指向这里。报告的bac-miRs与蛋白质编码区域重叠，其中一些在所有已知的杆状病毒基因组中有同源物（核心基因），包括bmnpv-miR-3、AcMNPV-miR-1、AcMNPV-miR-3、AcMNPV-miR-5、agmnpv-miR-4和Splt-NPV-miR-11698-3p。其余的bac-miRs（除了bmnpv-miR 4）不仅位于alphabaculovirus编码基因内，还位于其他属的编码基因内。它们位于Baculoviridae进化过程中保守的序列内，这一事实可能表明bac-miRs作为杆状病毒基因被低估了。鉴于此，通过进行生物信息学和实验调查来验证这一假设将是有趣的，以确定在其他杆状病毒物种的同源蛋白基因中报告的bac-miRs同源物的存在。 此外，它们的目标RNA分子不仅包括病毒mRNA，还包括宿主的mRNA，从而有助于控制它们自己的基因表达和寄生生物的基因表达。在某些情况下，它们的靶标的实验证据尚未得到证明。与鉴定bac-miRs的位置类似，报告的目标RNA由在Baculoviridae中高度保守的蛋白质编码基因的转录本组成，包括许多核心基因，如DNA聚合酶、p6.9、p40、p95、vlf-1、lef-8、DNA解旋酶、odv-e25、ac95、ac101、ac66和ac98。这进一步表明这些RNA基因可能在整个家族中的重要性，而不仅仅是在它们被描述的物种中。 此外，负责它们产生的转录机制尚未完全阐明，这阻碍了对已鉴定的前体miRNAs的典型启动子基序和下游聚腺苷酸信号的预测（表2）。对于某些bac-miRs，并假设这项工作中假设的基序所构成的限制，pri-miRNA序列可能相对较长，这与其他生物系统中的观察结果一致。 根据我们的文献搜索，这13个bac-miRs共同针对总共18个宿主mRNA分子（尽管只有三个有实验验证）。为了确定这些基因是否与特定的潜在分子途径和功能类别相关，如基因本体（GO），本研究使用ShinyGO服务器（http://bioinformatics.sdstate.edu/go/; 最后访问日期为2023年10月27日；）进行了基因列表富集分析。这使我们能够识别出31个功能丰富的类别，显著性阈值为FDR（假发现率）<0.05（详细描述见补充文件S1）。其中八个类别涉及生物过程，其余的与分子功能相关。这些类别主要涉及代谢和细胞过程，其中三个也参与生物调节（正向调节基因翻译和表达，以及细胞酰胺代谢过程）。具体来说，这些过程包括脂质和有机酸代谢、氮化合物代谢、细胞呼吸、电子传递链代谢过程和有机物质生物合成过程。值得注意的是，所有显著富集的分子功能都与催化活动或与上述生物过程不可或缺的化合物的结合有关。4.描述的细菌miRNAs的共同特征 与蛋白质编码基因中的开放阅读框类似，它们可以揭示与密码子分布相关的组成偏差，有助于预测它们的存在，miR基因也可以表现出有助于预测的组成偏差。因此，鉴定出的细菌miRNAs可以作为训练数据集，以发现循环发生、茎长和稳定性等共同特征。这些参数可以为改进预测算法提供有价值的见解。关于这一点，本研究首次对所描述的细菌miRNA在长度和GC丰富度方面进行了表征（图3）。 图3. Bac-miR常见序列特征。箱形图显示了使用Biopython 实现的专用脚本生成的杆状病毒前体miRNAs和成熟miRNAs的GC百分比(A)和长度(B)。对于这些分析，考虑了描述13个bac-miRs的出版物中报告的序列。这个图是原创的，之前没有发表过。 这份分析揭示了GC含量在前体miRNA及其成熟形式中存在显著的分散性，尽管接近甚至高于50%的值占主导地位，特别是在成熟变体中。值得注意的是，当计算成熟miRNAs中GC含量百分比与包含它们的基因组中GC含量百分比之间的比率（R=% GC miRNA/% GC genome）时，观察到的值为1.51±0.33，表明这一属性具有独特的偏差。另一方面，长度被证明是更加保守的，前体miRNAs的长度在55到138之间（90.5±16.05），miRNAs的长度在20到23之间（21.6±1.03）。这些值与其他生物系统中报告的值一致，它们可能对定义bac-miRs的预测算法有用。 另一个需要解决的问题是，是否在pri-miRNAs的二级结构中存在共同的模式，它们作为Drosha/Pasha以及DICER的底物分子（图4）。对这些特性的分析可以揭示双链区域的长度是否保守以及它们的稳定性。 图4. 杆状病毒前体miRNAs的二级结构。展示了来自AcMNPV、BmNPV、AgMNPV和SpltNPV的实验性前体miRNAs的二级结构及其相应的最小自由能（MFE）值。成熟miRNA序列以橙色突出显示。RNAStructure服务器（https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html；最后访问日期为2023年9月20日），使用299.15开尔文（26°C，可能是杆状病毒感染幼虫的温度）的温度和默认参数，用于生成结构。碱基对概率由碱基的颜色表示。这个图是原创的，之前没有发表过。 这项工作所获得的结果（与之前发表的结果非常相似）显示出潜在的共享结构偏差。为了验证这一点，我们通过评估杆状病毒前体miRNAs的结构保守程度（图5）进一步增强了我们的调查。这使我们能够识别出，在13个杆状病毒前体miRNAs中，有11个可以根据它们共享的结构被归类为两个组，尽管它们来自不同的病毒种类。值得注意的是，第一组中的前体miRNAs具有一个末端环和一个被大内环打断的长茎，而第二组中的那些则显示一个末端环和一个带有四个小内环的茎。 图5. 杆状病毒前体miRNAs二级结构的保守性。在这项工作中，使用了LocARNA-P服务器（http://rna.informatik.uni-freiburg.de/LocARNA/Inputjsp；最后访问日期为2023年9月20日），在26°C的温度设置下，对miRNAs的二级结构进行了比较分析，与实验确定的结构进行对比。生成的指导树包括所有序列(A)，并展示层次聚类以描绘相似的关系，指导结构多重比对。这棵树揭示了两个结构群体的出现，它们表现出不同程度的保守性（第一组和第二组）。在识别出这两个群体之后，分析被重复，仅使用每个群体所属的序列(B,C)，导致识别出符合典型模式的结构保守性。兼容的碱基对通过颜色编码来指示序列保守性（C-G, G-C, A-U, U-A, G-U, 或 U-G）和结构保守性（饱和度）。这个图是原创的，之前没有发表过。 另一个有趣的分析涉及预测来自pri-miRNA（前体miRNA分子）的双链RNA的末端，该末端在5'端具有较低的稳定性。这一特性被认为是决定哪条链将作为乘客链，哪条作为导向链（成熟miRNA）在RISC构象中的关键因素。因此，这些端点的理论热力学稳定性值被计算出来（表3）。 获得的结果揭示了六个bac-miRNAs（bmnpv-miR-1、bmnpv-miR-2、AcMNPV-miR-1、AcMNPV-miR-2、AcMNPV-miR-4和SpltNPV-miR-11684-3p）在成熟miRNA对应的5'端表现出不太稳定的ΔG值，无论是在外环还是在初始堆叠中。与此同时，三个miRNAs仅在第一堆叠中显示出不太稳定或同样稳定的ΔG值（BmNPV-miR-415、AcMNPV-miR-3和SpltNPV-miR-11698-3p）。只有四个分子显示出与预期趋势相矛盾的5'端稳定性特征。尽管在进行这些端点热力学稳定性预测时存在挑战（由于对由导向链和乘客链组成的小双链RNA的身份的不确定性），并且尽管并非所有情况都观察到不太稳定的5'端产生了成熟的miRNA，但检测到了这一属性保持的正向趋势。 5.用于miRNA研究的生物信息学工具 在本研究中对alphabaculoviruses中报告的bac-miRs以及其他先前发表的综合性研究的分析提供了有用的见解，以指导未来在杆状病毒基因组中表达miRNA分子的新型非编码基因的预测。为了进一步增强这一领域的研究，值得注意的是，存在许多数据库和软件工具，它们有助于miRNA的表征和目标搜索。因此，其中一些被呈现（表4）。 将先前建立的属性与报告的bac-miRs有效整合，并审慎使用已展示的工具以及定制设计的计算程序以将它们连接成一个强大的流程，有潜力预测先前未记录的bac-miRs。这代表了对这些假定的非编码基因进行后续实验验证的关键初步步骤。它极大地促进了我们对杆状病毒基因表达调控动态的理解，并进一步丰富了我们对寄生生物与其宿主在感染过程中发生的分子相互作用的理解。 6.结论 考虑到汇编的文献和进行的分析，可以得出结论，13个bac-miR基因位于Baculoviridae中进化保守序列的编码蛋白区域内，其中许多在多个属中具有同源物。它们产生初级转录本，生成大约90个核苷酸的前体miRNA（在大约50到150个核苷酸的范围内），表现出至少两种不同的构象模式（在本研究中称为第一组和第二组），导致产生大约20-23个核苷酸长度的miRNA分子。这些miRNA分子的GC含量高于它们的未处理初级转录本和它们所在基因组的GC含量。目标mRNA包括病毒基因，其中大部分在相同属的所有物种中都有同源物，以及参与细胞和代谢过程的细胞基因。将对报告的bac-miRs进行的这些分析与实验证明整合起来，可以作为预测未检测到的bac-miRs的基础。这一步骤可以作为通过转录组和功能证据确认它们的先导。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。