AGFG1

2021 年 1 月 29 号，Barney Graham 在推特饱含深情地写下这样一段话：明天就是 McLellan 四十岁生日。2017 年，在西班牙马拉加街头酷似病毒的圣诞装饰灯下，我们和故去的挚友 Jose Melero 拍下了这张照片。早在成功解析新冠 Spike 蛋白结构之前，我们三人就共同致力于破解 RSV F 蛋白结构。于是，我跑去查找 Jose Melero 逝世的确切时间点。结果看到，2018 年 3 月 5 号凌晨，McLellan 怀着无限感伤发推文：Jose Melero 于昨日逝世，他是一位伟大的病毒学家，在肺病毒领域，特别是 RSV，做出过开创性贡献。他是一个慷慨而又合群的人，一个绝佳的同行者。José，你将会被许多人缅怀。朋友们，如果你翻阅 RSV F 蛋白结构的解析历程，从粗糙的二级结构预测，到解析融合后构象，再到固定融合前构象，很难不被三人二十多年来不断的努力和最终的成就所打动，也更加能体会到他们对老友逝去的感伤。正道是，天之涯，地之角，知交半零落...图片来源：Barney Graham X 平台1956 年，人们从患有上呼吸道疾病的黑猩猩中分离出一种病毒，将其命名为黑猩猩鼻病毒。1957 年，研究者在患有呼吸道疾病的儿童中分离到相同的病毒，并且发现这种病毒极易感染婴幼儿。后来，该病毒被划归到副粘病毒科肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)肺炎病毒属(Pneumovirus)，称为呼吸道合胞病毒 (RSV)。RSV 是一种有包膜的负链 RNA 病毒，病毒基因组长度为 15.2 kb，包含 10 个开放阅读框，编码 8 个结构蛋白和 3 个非结构蛋白。RSV 在多种病毒株和细胞系中呈丝状。病毒丝长度为 0.5 至 12um，平均丝直径约为 130nm。1966 年，在美国，有婴儿和儿童参与到福尔马林灭活 RSV 疫苗 (FIRSV)临床试验中。那些在接种疫苗前病毒血清呈阴性的儿童回到社区后，感染 RSV 的概率和感染后疾病的严重程度显著增加。这种 RSV 疾病的增强形式表现为发烧、喘息和支气管肺炎，并导致频繁住院。在一项研究中，FIRSV 接种者中感染 RSV 的儿童比例为 80%，而未接种疫苗的对照组仅有 5%的儿童感染 RSV。更为严重的是，两名免疫婴儿在幼儿时期就因随后感染 RSV 而死亡。这一事件使得 RSV 疫苗研发事业遭遇重创，更是成为疫苗安全性的警示牌。1   选择 F 蛋白作为 RSV 疫苗抗原RSV 病毒粒子表面有 2 种非常重要的糖蛋白：附着蛋白（G）与融合蛋白（F）。G 蛋白介导病毒与宿主细胞表面受体结合，而 F 蛋白促进病毒与宿主细胞膜融合。F 蛋白还可促进病毒感染细胞与临近细胞膜融合，从而形成典型的合胞体（syncytia）。此外，在病毒感染细胞表面还会大量表达一种小的疏水性糖蛋白，称为 SH，但是，这种蛋白只会插入到极小比例的病毒粒子表面。HRSV F 蛋白一直是疫苗和抗病毒药物开发的主要靶标，因为它介导病毒入侵宿主细胞，具有高度保守的序列和结构、强大的免疫原性以及在病毒粒子中的暴露位置。而且，相比其他副黏病毒，RSV F 蛋白还有一个独特之处：在没有附着 G 糖蛋白的情况下，RSV F 蛋白自身就足以介导膜融合和病毒感染。相比之下，G 蛋白在不同 HRSV 毒株之间差异很大 ，并且已发现 SH 蛋白在病毒生长中是可有可无的 。2   F 蛋白二级结构1998 年，Jose Melero 在Journal of Virology发表文章：Antigenic Structure of Human Respiratory Syncytial Virus Fusion Glycoprotein，在 F 蛋白特异性单抗存在下，他制备了一系列 RSV 突变体。然后，根据突变体所选择的序列鉴定出中和抗体识别的两个主要抗原区域位于 F1 上，一个位于半胱氨酸富集区前面，称为 siteⅡ，一个靠近半胱氨酸富集区的 C 端，包括 site Ⅳ,site Ⅴ,site Ⅵ。此外，在半胱氨酸富集区中部，还存在一个可被中和性抗体微弱识别的 Site I。基于这些抗原表位，Jose Melero 绘制出 RSV F 蛋白（Long 毒株）的粗略二级结构。RSV F 蛋白以无活性的前体 F0（574 氨基酸）合成，随后转运至内质网，形成三聚体，同时，发生 N-糖基化。进入高尔基体后，F0 前体在两个 Furin 位点处发生切割，变为 F1 和 F2 两条链，F1 和 F2 之间通过 2 个二硫键连接，同时释放出 27 个氨基酸的肽段 pep27。F 蛋白上存在 3 段疏水性序列：第 1 段是信号肽，位于 F2 的 N 端（1-22 氨基酸），将会从成熟的糖蛋白上移除；第 2 段是融合肽（Fusion peptide），位于 F1 N 端（1-19 氨基酸）；第 3 段靠近 F1 C 端（389-414），也就是膜锚定区。从大的分类上来讲，RSV F 蛋白属于 I 型病毒融合蛋白，此类蛋白还包括冠状病毒 Spike 蛋白(最大的 I 型病毒融合蛋白)、HIV 包膜糖蛋白（Env）、hMPV(人偏肺病毒)及 PIV3/5(人副流感病毒)。I 型病毒融合蛋白具有相似的结构特征（融合肽、HRA、HRB 及跨膜区）与融合机制，但是，序列相似性极其有限。所有这些蛋白初始合成时均为单链、无活性的前体 F0。它们需要在关键的酶切位点切割才能转变为活性形式。有些蛋白仅有一个酶切位点，而有些蛋白则有两个酶切位点，例如，RSV 或者冠状病毒。3   F 蛋白锥形杆柄与棒棒糖杆柄2000 年，Jose Melero 在Virology发表文章：Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies。为探索 HRSV F 蛋白结构与免疫原性之间的关系， Jose Melero 设计出两种 F 蛋白序列，一种为全长 F 蛋白 FWT，另外一种是截掉 C 端 50 个氨基酸的无锚定突变体 FTM-。采用重组痘苗病毒（ vaccinia viruses）作为表达载体，感染 HEp-2 细胞，表达靶标蛋白。正如预期，FWT 表达于宿主细胞表面，无锚定突变体 FTM-分泌至培养基中。采用亲和层析和蔗糖密度梯度离心纯化分离 F 蛋白，然后，在负染电镜下，发现 FWT 和 FTM-呈现完全不同的形态结构：1. 当存在去污剂（Detergent）时，FWT 沉降条带集中分布于蔗糖梯度顶部附近，表面蛋白呈现均一性。当不存在去污剂时，FWT 会沿着蔗糖密度梯度连续沉降至底部，说明蛋白存在聚集体（aggregates）。在没有去污剂的情况下，FWT 负染电镜下呈现玫瑰花结形态（rosettes）。在玫瑰花结中，包含两种形态的杆柄：一种为圆锥形杆柄（cone-shaped rods），占到 70%，另一种为棒棒糖形杆柄(lollipop-shaped rods)，占到 30%。2. 无论是否存在去污剂，无锚定突变体 FTM-在蔗糖梯度中均沉降至相似位置，仅在底部观察到存在极小比例聚集体。在没有去污剂的情况下，无锚定突变体 FTM-在负染电镜下主要呈现单个的圆锥形杆柄，彼此之间不发生交联。有意思的是，在一些样品中，FTM-也可形成玫瑰花结。然而，与全长 FWT 形成鲜明对比的是，90%的 FTM 玫瑰花结杆柄的形状为棒棒糖状。此外，当无锚定突变体 FTM-在 4℃存储时间延长，融合肽暴露，引发玫瑰花结聚集体数量增加，杆柄也从圆锥状变为棒棒糖状。也就是说，FTM-一旦形成玫瑰花结，杆柄将由圆锥形变为棒棒糖状。3. 无锚定突变体 FTM-或者全长 FWT 均呈现三聚体。Jose Melero 推测圆锥形杆柄为激活前 F 蛋白结构，而棒棒糖杆柄为激活后 F 蛋白结构，也就是说 F 蛋白的两种杆柄形态可能代表的是该分子在膜融合过程中采用的不同结构形式。4   F 蛋白完全切割是膜融合必需的2001 年，Jose Melero 在 PNAS 发表文章：Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion，他通过对 F 蛋白中间体的 N 端测序，确定了 F 蛋白前体（F0）可在两个位点发生切割：位于 109 氨基酸之后的 Site I 与位于 136 氨基酸之后的 SiteII。这两个位点均有弗林蛋白酶识别位点，并且两个酶切位点之间是独立切割的。突变酶切位点 Site I 会降低酶切位点 SiteII 的切割效率，从而减少无锚定 F 蛋白的聚集比例。然而，突变 SiteII 会完全消除无锚定 F 蛋白的聚集，即便 Site I 仍旧高效切割。这说明 SiteII 位点的切割对于无锚定蛋白 F 的形态和聚集是必不可少的，而 Site I 的切割可提升 SiteII 位点的切割效率。重组牛痘-F 蛋白感染细胞后表达的无锚定 F 蛋白并非发生完全切割，而是存在一定比例的前体 F0 和切割中间体 F△1-109。一旦加入胰蛋白酶，随着酶量增加，F0/F△1-109 逐渐被完全切割成为 F1。在蔗糖密度梯度离心中，用胰蛋白酶处理的无锚定 F 蛋白，只会检测到 F1 条带，并且，相比胰蛋白酶处理之前，F1 沉降条带朝着梯度中部迁移。在电镜下， 胰蛋白酶处理后，无锚定蛋白形态由未聚集的圆锥形杆柄（cones）转变为棒棒糖杆柄（lollipops）聚集而成的玫瑰花结。此外，抑制无锚定 F 蛋白任意一个 Furin 酶切位点，都会消除 F 蛋白促进膜融合的能力。5   无锚定 F 蛋白玫瑰花结与融合肽暴露胰蛋白酶完全切割无锚定 FTM-蛋白，引发蛋白聚集，形成玫瑰花结。为搞清楚这种聚集是否由单体蛋白上的疏水性融合肽之间的相互作用引发，人们将融合肽前面的 10 个氨基酸删除，形成 FTM-(Δ137-146)。在蛋白印记胶图上，纯化得到的无锚定 FTM-蛋白存在一条主条带 F1，还存在未切割的前体 F0、仅在 site I 发生切割的 FΔ1-109 以及仅在 siteⅡ发生切割的 F2。纯化得到的 FTM-(Δ137-146)突变体也存在类似的酶切中间体，但是，这些中间体条带相对于主条带 F1 的比例与无锚定 F 蛋白又是不相同的，这说明删除融合肽前面的氨基酸会对 Furin 切割效率产生影响。无锚定 FTM-和 FTM-(Δ137-146)突变体经过胰蛋白酶处理后，FΔ1-109 和 F2 剩余位点发生切割。在蔗糖密度梯度离心中，无锚定 F 蛋白经过胰蛋白酶处理，沉降条带将会向更高密度梯度迁移。在电镜下，无锚定蛋白 FTM-以未聚集的圆锥杆存在，但是，胰蛋白酶处理后的无锚定 FTM-蛋白将会聚集成棒棒糖杆状的玫瑰花结。与此形成鲜明对比的是，胰蛋白酶切割前后的 FTM-(Δ137-146)在蔗糖密度梯度离心中的沉降位置始终未发生变化，同时，在电镜下，胰蛋白酶切割前后的 FTM-(Δ137-146)突变体均处于未聚集的单体。正是基于以上数据，2004 年，Jose Melero 在 Journal of General Virology 发表文章：Thermostability of the human respiratory syncytial virus fusion protein before and after activation: implications for the membrane-fusion mechanism，他们认为 F 蛋白激活后发生的一个关键事件便是融合肽的暴露，无锚定 FTM-蛋白的未切割和切割形式可能代表着 RSV F 蛋白的融合前和融合后构象。在 RSV 病毒入侵靶细胞表面时，F 蛋白发生最后的酶切位点切割，触发膜融合和感染。2005 年，有研究者在 PNAS 发表文章：Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein，研究人员采用杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中表达切除跨膜锚定区、未发生切割的副粘病毒、人副流感病毒 PVI3 solF0 蛋白（I 型病毒融合蛋白）。解析未发生切割的 solF0 蛋白结构，发现其由三部分组成：一个球形的、含有β 折叠片组成的头部结构域，由β折叠片和α螺旋组成的颈部（neck），α螺旋占主导的茎部构成（stalk）。切除跨膜锚定区、未发生切割的分泌型 hPIV3 F 蛋白最为典型的特征是存在由 HRA 和 HRB 形成的 6HB 结构，这代表着该蛋白处于融合后构象，同时，说明跨膜锚定区对于蛋白实现融合前亚稳态构象极其重要。6   F 蛋白构象转变与膜融合2006 年，有学者在 Nature 发表文章：Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable, prefusion conformation，通过在副流感病毒 PIV5 F 蛋白羧基末端添加三聚化结构域，稳定其融合前构象，完成 PIV5 F 蛋白晶体结构的解析。在 PIV5 sF-GCNt 三聚体中，HRB 形成的 3 个α螺旋卷曲螺旋附着于一个大球状头部。GCNt 三聚体结构域位于茎部的 C 末端，使得 PIV5 sF 头部远离病毒膜。F-GCNt 每个亚基的头部区域包含 3 个结构域（DI-DIII），它们围绕三聚体轴延伸，形成广泛的亚基间接触。头部底部有一个大空腔，由 DII 形成的侧面和 DI 形成的底部组成。在头部区域存在 3 个突出的尖峰，每个尖峰由两对环构成（残基 60-65 和 残基 178-185），这些环从每个亚基的球状结构域向上突出。DIII（残基 42-278）覆盖腔体顶部，包括突出的尖峰、HRA 和融合肽。融合肽采用部分延伸、部分β折叠和部分α螺旋构象，夹在其自身亚基的 DIII 和另一个亚基的 DII 之间。PIV5 sF 蛋白处于一种非常特殊的、明显的 pretriggered 构象，表明 sF 蛋白 C 端结构域对于维系此融合前构象是至关重要的。此外，热激可触发 PIV5 sF 蛋白融合前构象发生改变。通过比较 PIV5 F-GCNt 融合前构象与 PIV3 solF0 融合后构象，研究者提出了 F 蛋白介导的膜融合与其构象变化相互偶联的模型：HRB 螺旋融化，破坏底部相互作用，使得 F 蛋白从预融合构象转变为“开茎”构象。接着，DIII 重新折叠形成预发夹中间体，促进 HRA 形成卷曲螺旋并将融合肽插入靶细胞膜。牵拉病毒膜与宿主细胞膜，F 蛋白 6HB 组装完成，转变为融合后构象，完成膜融合。通过 PIV5 与 PIV3 F 蛋白结构的解析， 我们可以看出，副粘病毒融合糖蛋白 F 以亚稳态（metastable）、预触发(pretriggered)形式锚定于病毒粒子膜上。一经触发，F 蛋白经历剧烈的构象延伸，将其疏水融合肽插入到靶细胞膜，自身回折，将两种膜拉在一起，启动膜融合。7   首次表达融合前 RSV F 蛋白2011 年 4 月 15 号，Mark E. Peeples 在 Journal of Virology 发表文章：Soluble Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in the Fully Cleaved, Pretriggered State Is Triggered by Exposure to Low-Molarity Buffer，为研究 RSV F 蛋白触发机制，他使用 6His tag 标签替换跨膜区和胞质区，生成一种可溶性的 F 蛋白（sF）。sF 蛋白可从 293T 细胞中以未切割形式，高效释放。这种 sF 蛋白可被中和抗体识别，在电镜下呈现球形，且未聚集，这些特征说明与天然的、未触发的三聚体相一致。F 蛋白在 Ni +2 柱上纯化并用含有 500mM NaCl 和 250mM 咪唑的 50mM 磷酸盐缓冲液洗脱。透析至 10 mM 缓冲液中，将会触发 sF 蛋白构象改变，形成“帽针”（hat pin-shaped）状分子，聚集成玫瑰花结，这是典型的触发后特征。触发效率与缓冲液摩尔浓度降低息息相关。稀释缓冲液摩尔浓度导致融合肽暴露，与脂质体融合，证实 sF 蛋白已被触发。突变紧邻融合肽的 furin 切割位点会阻止脂质体融合，更进一步证实膜融合需要融合肽。Jose Melero 对 RSV F 蛋白结构的一系列相关研究，一直采用的是 Long 毒株 F 蛋白，而 Mark E. Peeples 采用的是存在 6 个氨基酸差异的 D53 毒株 F 蛋白。因此，Mark E. Peeples 认为 Jose Melero 观察到的 RSV F 蛋白电镜下的形态结构均处于融合后构象。因为 Jose Melero 推测认定的融合前（未切割）和融合后（已切割）的无锚定 F 蛋白具有非常相似的外形：一个小而圆的头，连着相对较长的茎。关键 Bug 在于，这两种形式的 F 蛋白均表现出非常耐热，在温度达到约 90°C 之前均没有显示出构象变化。极端热稳定性并不是亚稳态蛋白 F 蛋白的典型特征，相反，极度热稳定是触发后、处于 6HB 形式的 F 蛋白特征。Mark E. Peeples 还认为 Jose Melero 观察到的融合构象的 F 蛋白换可能是由于纯化处理过程触发的。Mark E. Peeples 发现 10 mM 磷酸盐、100 mM NaCl 缓冲液可将大部分 sF 蛋白转化为触发后形式的玫瑰花结。此外，分离和储存过程中的差异也可能触发 F 蛋白构象的转变。冷冻和解冻会触发 F 蛋白构象改变。如果将融合前、预触发形式的 F 蛋白在 4°C 条件下储存在 50 mM 磷酸盐 （pH 8.0）、500 mM NaCl、250 mM 咪唑缓冲液，那么直到三周后才会转变为触发后形式。Mark E. Peeples 构建的 RSV sF 蛋白可被完全切割，但是，依然表达产生融合前构象的 F 蛋白，这说明 Furin 位点的完全切割并不会触发 F 蛋白形成融合后构象。在解析其他副粘病毒 F 蛋白晶体结构时，为避免触发构象变化，研究者均采用突变 F 蛋白切割位点，该突变 F 蛋白不能被弗林蛋白酶切割。然而，令人惊讶的是，未切割的 PIV3 sF 蛋白/新城疫病毒 F 蛋白均处于融合后构象。胰蛋白酶处理已触发的 PIV3 sF 蛋白，引发 Furin 位点切割，形成玫瑰花结。显然，玫瑰花结的形成是融合肽暴露的结果，而不是触发蛋白构象改变的结果，因为 PIV3 sF 蛋白在胰蛋白酶处理之前已经处于触发后形式。F 蛋白 Furin 位点的完全切割显然不能像 Jose Melero 提出的那样作为 F 蛋白构象改变的触发机制 。移除 PIV3 F 蛋白的膜锚定区会触发构象改变。为避免这种情况，研究者将来自外源蛋白 GCNt 的三聚体化结构域融合到 PIV5 sF 蛋白的 C 末端。在电镜下，这种携带三聚体化结构域 PIV5 sF 蛋白表现为一个球体，其短茎由其 HRB 和 GCNt α螺旋延伸组成，处于融合前构象。GCNt-PIV5 sF 蛋白 F1 与 F2 之间的 Furin 位点是完全切割的，但是，并没有触发构象变化，依然处于融合前构象，再次证实酶切位点的切割并不是 F 蛋白构象变化的触发因素。加热后的 PIV5 sF 蛋白具有更小的头部和更长的茎，类似于 PIV3 sF 蛋白触发后的 6-HB 形式，形成玫瑰花结，说明加热可触发 PIV5 sF 蛋白从融合前构象转变为融合后构象。总的来说，对于 RSV F 蛋白来说，膜锚定区和三聚化结构域均不是维系其融合前构象所必需的。Mark E. Peeples 首次制备了完全切割的、分泌型的、融合前构象的 RSV F 蛋白，并且，无需添加外源三聚体化结构域。8   首次解析 RSV F 蛋白融合后构象RSV F 的融合前和融合后形式作为疫苗抗原均具有潜在的缺点。在负染电镜下，棒棒糖形的融合前 F 三聚体和拐杖形（Crutch）融合后 F 三聚体之间存在明显的结构差异，这表明融合前和融合后 F 三聚体可能具有不同的抗原属性。为了防止病毒进入，在病毒包膜与细胞膜融合之前，F 特异性中和抗体可能必须结合病毒粒子上 F 的融合前构象。因此，研究人员推测 RSV F 必须以融合前构象存在才能有效引发中和抗体。关键的问题是，融合前 F 是一种“亚稳态”结构，处于较高的能级，很容易重新排列成较低能量的融合后状态，加上疏水性融合肽的暴露而聚集。2011 年 5 月 17，诺华公司研发团队在PNAS发表文章：Structural basis for immunization with postfusion respiratory syncytial virus fusion F glycoprotein (RSV F) to elicit high neutralizing antibody titers，他们删除融合肽、跨膜区和胞质结构域，保留 Furin 切割位点，构建表达稳定的、非聚集的 RSV F 蛋白。在电镜下，这种无锚定的 F 蛋白突变体形成非聚集的均质拐杖状分子（nonaggregated, homogeneous crutch-shaped molecules），与融合后的 F 三聚体一致。用两剂 5 μg 剂量的明矾吸附 RSV F 可保护棉鼠免受鼻内 RSV 攻击，触发高水平的中和抗体滴度。他们解析了融合后构象 F 蛋白的晶体结构，发现融合后 RSV F 的总体结构与融合后副流感病毒 F 糖蛋白总体相同。糖蛋白由三个紧密缠绕的亚基组成，形成球状头和细长的茎。每个亚基包含三个结构域，分别指定为 I、II 和 III。结构域 I 和 II 位于三聚体头部的顶部，形成三角形冠。域 III 形成头部的基部。长螺旋 HRA 从结构域 III 延伸并在茎的中心形成三聚体卷曲线圈。HRB 螺旋与结构域 II 相连，向下到达茎的头部远端，在那里它与 HRA 内部卷曲线圈形成六螺旋束的外部线圈。在全长 F 中，疏水性融合肽（HRA 的 N 端）和跨膜区（HRB 的 C 端）将并置在茎的底部并插入靶细胞膜中。融合前和融合后 RSV F 中 A 和 C 位点的保留合理地解释了融合后 RSV F 抗原在免疫动物中引发高效价中和抗体的能力。与这一假设一致，竞争 ELISA 表明，用明矾吸附的融合后 RSV F 抗原免疫的小鼠的混合血清（而非未免疫小鼠的血清）抑制帕利珠单抗结合。RSV F 融合后三聚体的晶体结构表明，帕利珠单抗/莫他珠单抗表位（位点 A）在融合后三聚体结构上暴露且可接近，因此，用 RSV F 融合后三聚体免疫的小鼠血清竞争性抑制帕利珠单抗竞争性与 F 蛋白的结合。位点 C（被中和抗体（如 101F）识别的另一个重要中和表位）也很好地暴露在融合后 RSV F 上三聚体。因此，融合后 RSV F 三聚体的晶体结构表明，关键的中和结合位点均可暴露出来，为引发高效价中和抗体提供了基础。2008 年，McLellan 进入位于美国国立卫生研究院（NIH）疫苗研究中心四楼的 Peter Kwong 实验室，接受博士后期间的训练。由于实验室空间紧张，McLellan 在疫苗研究中心二楼毗邻病毒学大佬 Barney Graham 房间的位置办公学习。没过多久，Barney Graham 邀请 McLellan 共同从事 RSV 疫苗相关的研究，自此开启两人长达多年的友情。McLellan 为得到 RSV F 蛋白晶体结构，最初将跨膜结构域删除，构建无锚定突变 RSV F ΔTM（1-513 氨基酸）。该突变体蛋白在 HEK293F 细胞中表达良好，可高效切割为 F1/F2。但是，由于融合肽暴露，该无锚定突变体 F 蛋白会聚集成为玫瑰花结。后来，McLellan 借鉴 Jose Melero 2004 年发表的文章，又将融合肽前 9 个氨基酸（137 至 146 氨基酸）删除，构建 RSV F ΔFP，可避免形成聚集体，形成的是分散的、单个的、融合后三聚体，从而能够进行结晶并确定其结构。2011 年 8 月，McLellan 在 Journal of Virology 发表文章：Structure of Respiratory Syncytial Virus Fusion Glycoprotein in the Postfusion Conformation Reveals Preservation of Neutralizing Epitopes。在电镜下，观察到 RSV F ΔFP 呈现锥形杆状形态，具有典型的 6 螺旋束，证实其处于融合后构象。莫维珠单抗和 101F 表位（位点 II 和 IV）暴露于溶剂中，其构象与抗体结合肽结构中观察到的相似。此外，Pro389 位于 F 蛋白顶部环的顶端，其突变会导致靶向靶向抗原位点 I 的抗体失去结合能力。这三个抗原位点的位置、暴露、构象以及表面等离子表明融合后 F 蛋白与靶向三种不同中和表位的抗体发生紧密结合。9   融合后 RSV F 蛋白疫苗相继失利自从融合后 RSV F 蛋白结构被解析出来，并且，有研究团队在绵鼠中验证了其免疫原性，以 Novavax 和 Medlmmune 为代表的多家公司开始以融合后 F 蛋白为抗原进行开发 RSV 疫苗。然而，不幸的是，融合后 F 蛋白 RSV 疫苗均在临床试验期间遭遇失败。此后，McLellan将目光转向融合前F蛋白，即将迎来自己的高光时刻...识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

中文摘要目的   对狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测（direct immunofluorescence assay，DFA）进行优化及验证，使其更好地应用于规模化生产中的质量控制。方法   采用不同的病毒培养温度（35、37 ℃）、培养时间（24、48 h）、接种细胞（Vero细胞、BSR细胞）以及稀释倍数（3、5、10倍）对狂犬病病毒滴度进行DFA，并对病毒滴度结果进行统计学分析。对优化方法进行重复性和中间精密度验证，并对多个批次样品采用小鼠颅内滴定法和DFA进行滴度检测，分析其相关性。结果   优化的条件为37 °C培养24 h、接种BSR细胞、5倍系列稀释病毒。DFA重复性和中间精密度变异系数均小于2%。16份样品的小鼠颅内滴定法与DFA滴度显著相关，相关系数为0.952，且P值小于0.000 1。结论   优化后的DFA快速、准确，且与小鼠颅内滴定法一致性较好，能够替代后者作为狂犬病疫苗规模化生产的质量控制方法。正文狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一种人畜共患、急性、高度致死性的传染病，疫苗是预防狂犬病最主要的手段。在人用狂犬病疫苗生产中，RABV滴度是衡量毒种及其收获液质量的重要指标。在我国目前RABV滴度的检定方法为小鼠颅内滴定法，该方法试验周期长，操作繁琐，且受试验动物个体差异以及试验人员操作差异等影响，试验重复性较差。因此，建立一种快速有效、重复性良好、简便易行的检测方法，对于规模化生产十分必要。20 世纪 50 年代末，Goldwasser和Kissling证明了荧光抗体技术在检测狂犬病动物中枢神经系统中的RABV抗原方面的实用性，其基本原理是使抗原与异硫氰酸荧光素结合的抗RABV抗体特异性结合。随后，RABV滴度的直接免疫荧光检测（direct immunofluorescence assay，DFA）得到了广泛应用。该方法快速、稳定、准确，且易于标准化。目前国外已广泛使用DFA进行RABV滴定检测，国内也有相关研究证明DFA替代小鼠颅内滴定法的可行性。本研究旨在对DFA进行方法学确认，进一步证明其替代小鼠颅内滴定法的可行性，并对该方法进行进一步优化。1材料与方法1.1病毒及细胞RABV CTN-1株与BSR细胞、Vero细胞均由武汉生物制品研究所有限责任公司狂犬病疫苗室保存。1.2实验动物无特定病原体级昆明小鼠（无性别要求），11~13 g，由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供，动物许可证号为SCXK（鄂）2021-0026。1.3主要仪器及试剂异硫氰酸荧光素标记的小鼠抗RABV核蛋白单克隆抗体，购自美国Millipore公司；S6UNIV荧光化学发光分析仪购自美国CTL公司。1.4DFA检测RABV滴度方法的建立在96孔微量培养板中5倍系列稀释病毒样品，即100 μl细胞培养液中加入25 μl样品，每个样品设置1个复孔，随后每孔加入BSR单细胞悬液，每孔106细胞，同时设细胞对照（只加培养液的BSR细胞），混匀后置37 °C、5% CO2孵箱中培养24 h。弃培养液，PBS洗板孔1次，晾干后加入80%冷丙酮固定10 min后，弃丙酮，晾干，加入工作浓度的抗RABV荧光抗体50 μl/孔，37 °C孵育1 h，PBS洗板孔3次，使用荧光化学发光分析仪观察结果并计数每孔中荧光灶数。病毒滴度（荧光灶单位/ml）=（最高稀释倍数孔荧光灶个数的均值×稀释倍数+相邻较低稀释倍数孔荧光灶个数的均值）÷2×相邻较低稀释倍数×10。1.5方法优化1.5.1  孵育温度    取1份病毒样品分别于2个96孔板上进行5倍梯度稀释，每板各重复3次试验，每孔加入1×106细胞，其中1个96孔板在37 ℃培养24 h，另1个在35 ℃培养24 h，丙酮固定，抗体孵育后读取荧光灶数，对比结果，具体操作同1.4。1.5.2  孵育时间    取1份病毒样品分别于2个96孔板上进行5倍梯度稀释，每板各重复3次试验，每孔加入1×106细胞，均放入37 ℃培养，其中1个96孔板培养24 h，另1个培养48 h，对比结果。1.5.3  稀释倍数    分别设置3、5、10倍梯度稀释，3、5倍梯度稀释组分别为100 μl培养液中加入50、25 μl样品，10倍梯度稀释组为180 μl培养液中加入20 μl样品（最终每孔弃去80 μl）。每个稀释度重复3次试验，放入37 ℃培养24 h，对比结果。1.5.4  接种细胞    在2个96孔板上，分别将同一样品进行3次稀释（每次设置复孔），每孔加入1×106 BSR细胞或Vero细胞，均放入37 ℃培养24 h，对比结果。1.6方法学验证1.6.1  重复性    由1名检测人员采用优化后的方法对同一样品重复进行6次检测，计算6次结果的x̅±s、变异系数（coefficient of variation， CV）。1.6.2  中间精密度    由2名检测人员采用优化后的方法对同一样品分别进行3次检测，计算2名检测人员6次结果的 x̅±s、CV。1.7与小鼠颅内滴定法对比选取16个病毒样品，分别使用优化后的DFA和小鼠颅内滴定法进行检测。颅内滴定法：将样品进行10倍梯度稀释，每个稀释度脑内接种至少6只小鼠，每只脑内接种0.03 ml。连续观察14 d，记录小鼠发病和死亡情况。根据小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死剂量。1.8统计学分析使用SPSS 21.0软件，分别对不同孵育温度、不同孵育时间、不同稀释度、不同接种细胞检测数据进行独立样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1孵育温度对结果的影响试验结果显示，35 ℃培养的病毒滴度结果虽略高于37 ℃，但二者间差异无统计学意义（t=-1.98，P=0.118），见表1。由图1可见，荧光明亮，边缘清晰，二者亮度及形态无明显差异，可认为35 ℃或37 ℃培养对病毒滴度的结果无影响。由于37 ℃更适合BSR细胞生长，因此选择37 ℃作为优化后的孵育温度。2.2孵育时间对结果的影响试验结果显示，24 h病毒滴度检测结果显著高于 48 h（t=3.14，P=0.035），见表2。由图2可见，二者亮度及形态无明显差异，后续选择24 h作为优化后的孵育时间。2.3接种细胞对结果的影响试验结果显示，接种BSR细胞的病毒滴度略高于Vero细胞，但差异无统计学意义（t=1.44，P=0.222），见表3。由图3可见，由于Vero细胞相较于BSR细胞，荧光亮度稍暗，且边缘较不清晰，因此选择BSR细胞作为接种细胞。2.4不同病毒稀释度对结果的影响将同一份病毒样本分别进行3、5、10倍梯度稀释，结果如表4所示，对3组结果进行单因素方差分析，组间F值为0.55，P值为0.602，3组结果差异无统计学意义。但通过组内CV值对比，3倍与5倍梯度稀释的CV值分别为0.6%和0.4%，远小于10倍梯度稀释的CV值（2.6%），说明10倍梯度稀释的误差较大。由于3倍需要设置较多梯度，而5倍稀释与3倍稀释结果差异较小且操作简便，因此选择5倍稀释为优化后的稀释度。2.5方法学验证2.5.1  重复性    同一检测人员6次检测的滴度分别为6.50、6.70、6.47、6.52、6.45、6.47 IgFFU/ml，均值为6.56 lgFFU/ml，标准差小于0.5 lgFFU/ml，CV值为1.9%，显示较好的重复性。2.5.2  中间精密度    2名检测人员在不同试验日期分别检测3次，结果如表5所示，6次试验结果的CV值为1.7%，2名检测人员之间进行t检验，t=0.32，P值为0.763，差异无统计学意义，显示较好的中间精密度。2.6与小鼠颅内滴定法结果对比选取16个病毒样品，分别使用DFA和小鼠颅内滴定法进行检测，二者滴度结果见图4。经Pearson相关性分析可知，DFA与小鼠颅内滴定法滴度结果相关系数为0.952，且P值小于0.000 1，表明小鼠颅内滴定法与DFA存在极显著的强正相关关系。3讨论已有相关研究使用DFA与小鼠颅内滴定法对大量样本进行检测结果分析对比，结果证明二者趋势基本一致，存在一定的数量关系，且成正相关，可用DFA替代颅内滴定法检测RABV滴度。另外，有研究用DFA、细胞病变感染技术、噬斑法以及小鼠颅内滴定法等方法检测不同毒株的滴度，结果发现DFA显示出最高的灵敏度。本实验对病毒培养时间的优化结果表明，24 h优于48 h，而王梦舒等的研究在病毒培养6~96 h过程中进行检测分析，结果显示48 h检测的滴度达到高峰，直到96 h稳定在较高水平。这一差异可能与细胞接种密度有关。本研究中接种的细胞密度为1×106，37 ℃下24 h能长满单层细胞，48 h可能存在局部细胞脱落现象而导致荧光灶减少。因此本研究采用24 h培养既能节约时间亦能满足实验需求。在病毒培养温度的研究中，35 °C比37 °C培养的滴度结果略高但差异无统计学意义，王梦舒等对34 ℃与37 ℃的对比结果相似，34 ℃比37 ℃的结果略高但差异无统计学意义。对于DFA中不同稀释度对结果的影响，10倍梯度稀释组内差异明显大于3倍与5倍梯度稀释，其他相关研究中也多采用3倍或5倍梯度稀释。另外，李幸乐等亦在快速荧光灶抑制试验中对不同稀释倍数的结果进行研究，结果显示5倍梯度稀释更能反映个体实际免疫水平，有利于指导临床样本RABV特异性中和抗体检测。本研究对不同细胞的滴定结果对比显示，BSR细胞滴度略高于Vero细胞，而除了本研究的CTN株外，其他RABV株也显示出BSR细胞较Vero细胞更为敏感，但病毒滴度结果差异不明显。另外，有研究证明BHK-21细胞可替代BSR细胞应用于快速荧光灶抑制试验检测体系，二者表现出良好的相关性和一致性。还有研究利用MRC-5细胞进行DFA检测RABV滴度的方法学验证，亦表现出良好的重复性，且与小鼠颅内滴定法检测结果一致性较好。除此以外，对DFA的优化还有稀释液特性、细胞接种方式等方面的研究。DFA利用荧光素标记的已知抗体与RABV特异性结合，具有重复性好、操作简便快捷、检测周期短等优势，适用于疫苗生产大量病毒收获液样本的检测。目前，DFA在国内亦逐渐得到应用，应用DFA替代动物实验检测RABV滴度前景可观。作者李榆杨  彭小欢   张爽   庞德钦   梁婧武汉生物制品研究所有限责任公司狂犬病疫苗室，武汉  430207通信作者：梁婧，Email：952949903@qq.com引用本文：李榆杨, 彭小欢, 张爽, 等. 狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测的优化及验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 258-262.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230104-00003识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

天津科技大学樊振川实验室在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为：RABL2 Promotes the Outward Transition Zone Passage of Signaling 作为突起于真核生物细胞表面的一类拥有特化膜结构的细胞器，纤毛是细胞的信号天线。纤毛膜上锚定着不同类型的G蛋白偶联受体和离子通道等纤毛信号蛋白，使得纤毛可以感受光、声、味、机械力和各类化学分子如激素和神经介质等胞外信号，并将这些胞外信号传导到胞内进行应答。纤毛信号蛋白与分子马达蛋白驱动的鞭毛内运输（Intraflagellar transport，IFT）火车相偶联，得以沿纤毛微管轴突在细胞膜和纤毛膜之间动态运输，从而维持其纤毛稳态，保证其正常生理功能发挥。在这一稳态维持过程中，多蛋白复合物BBSome在纤毛信号蛋白货物和IFT火车之间充当连接体。 因此，BBSome组分缺失、组装缺陷或纤毛定位异常的基因突变均可引发信号蛋白纤毛稳态失衡，导致巴德-毕德氏综合症（Bardet-Biedl syndrome，BBS），其病症包括早发性肥胖，视网膜褪变、男性不育、心智发育迟缓和多趾等，少数患者还具有糖尿病、先天性心脏病和肾囊肿等症状。 天津科技大学樊振川实验室前期研究发现BBSome纤毛稳态维持调控主要落于5处过程，分别为：1）BBSome招募进入细胞基体过程；2）BBSome顺向跨越纤毛过渡区输入纤毛过程；3）BBSome在纤毛顶部重塑过程；4）BBSome在纤毛顶部转向过程；以及5）BBSome逆向跨越纤毛过渡区输出纤毛过程等。所有这些调控步骤中，小G蛋白均为关键调控因子。过去三年樊实验室的研究已经厘清：1）小G蛋白RABL5/IFT22和ARL6/BBS3协同招募BBSome定位于基体【1】；2）类转录因子LZTFL1和小G蛋白RABL4/IFT27协同调控BBSome纤毛顶部重塑【2】；3）小G蛋白ARL6/BBS3和ARL13协同调控BBSome纤毛顶部转向【3、4】；4）小G蛋白ARL3调控BBSome逆向扩散跨越纤毛过渡区输出纤毛【5】等。樊实验室在这些研究过程中发现：同一小G蛋白可在纤毛的不同部位参与对BBSome纤毛稳态的调控，甚至可在纤毛的同一部位调控不同信号蛋白进出纤毛。 ARL3是Ras超家族Arf亚家族小G蛋白，在具纤毛生物中高度保守。早期研究表明ARL3介导信号蛋白输入纤毛。ARL3与其纤毛近端效应物PDE6D和UNC119A/B结合可诱导其效应物脂化蛋白货物锚定于纤毛膜。此过程中，ARL3利用RP2和ARL13b为其GTP酶激活蛋白和鸟嘌呤核苷酸交换因子，维持其核苷酸循环。目前人们普遍认为ARL13b-RP2-ARL3框的基因突变破坏了脂化蛋白纤毛膜锚定从而导致朱伯特综合征（Joubert syndrome，JBTS）。 有意思的是，樊实验室近期发现ARL3亦可介导BBSome依赖的信号蛋白纤毛输出。具体而言，ARL3利用纤毛近端与脱离IFT的BBSome为效应物，招募BBSome逆向扩散跨越纤毛过渡区以输出纤毛，从而维持纤毛信号分子磷酸酯酶D（PLD）的纤毛稳态【5】。类比到人类细胞中，ARL3可通过调控BBSome逆向扩散穿越纤毛过渡区来维持刺猬信号通路纤毛稳态。据此，某些特定的ARL3基因突变可能只破坏ARL3介导的脂化信号蛋白输入纤毛途径导致朱伯特综合征，只影响ARL3介导的BBSome依赖的刺猬信号蛋白输出纤毛途径而引发巴德-毕德氏综合症，或者是同时破坏了这两条途径。这也许就是某些ARL3基因突变病患同时具有巴德-毕德氏综合症和朱伯特综合征两种疾病症状背后的遗传因素。中科院分子细胞科学卓越创新中心朱学良课题组于2022年报道了小鼠Rabl2调控BBSome依赖的刺猬信号蛋白逆向跨越纤毛过渡区以输出纤毛【6】。这些研究表明ARL3和RABL2可能在BBSome逆向扩散穿越纤毛过渡区输出纤毛这一过程中串话，但具体的分子机制未被阐明。 2023年8月14日，天津科技大学樊振川实验室在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为：RABL2 Promotes the Outward Transition Zone Passage of Signaling Proteins in Cilia via ARL3 的研究论文。 该研究利用进行纤毛生物学研究的经典模式生物莱茵衣藻，通过分子、细胞、遗传、生化和活细胞成像的方法，发现：1）RABL2在胞体利用IFT火车IFT-B1复合物为其效应物，在结合GTP时（RABL2GTP）招募IFT-B1定位细胞基体；2）RABL2GTP作为IFT-B1的货物蛋白以IFT方式运输进入纤毛并在纤毛内循环；3）当RABL2GTP从逆行IFT火车转运至纤毛过渡区上方时，RABL2GTP与IFT-B1分离使得RABL2GTP得以从逆行IFT火车脱落，之后水解GTP转化为RABL2GDP；4）RABL2GDP作为ARL3的鸟嘌呤核苷酸交换因子激活ARL3GDP，使其转变为ARL3GTP从而与纤毛膜分离进入纤毛基质；5）ARL3GTP招募搭载了PLD的BBSome为其效应物以扩散的方式跨越纤毛过渡区输出纤毛；以及6）RABL2GDP本身作为BBSome的货运蛋白结合ARL3GTP/BBSome复合体输出纤毛，完成其在纤毛循环过程（见图1和图3）。此外，该研究还利用这一衣藻系统对引发类似巴德-毕德氏综合症的两个小鼠Rabl2突变进行了分子水平的功能缺陷鉴定（图2）。 图1: RABL2GDP激活ARL3促进装载有PLD的BBSome扩散输出纤毛过渡区 信号蛋白PLD通过RABL2-ARL3-BBSome框介导的逆向扩散输出纤毛过渡区这一机制的发现，解释了为何Rabl2基因突变小鼠发展为类似于巴德-毕德氏综合症而非朱伯特综合征的症状【6】。如果这一机制的确在人类细胞中存在，该发现则可很好地解释为什么某些ARL3基因突变可以引发巴德-毕德氏综合症和朱伯特综合征共享的临床症状，这一发现亦可为针对巴德-毕德氏综合症和朱伯特综合征致病基因进行分子诊断时的基因分型提供理论依据，并为日后针对巴德-毕德氏综合症和朱伯特综合征的精准医疗药物开发提供指导。 图2: RABL2突变破坏RABL2-ARL3-BBSome框介导信号蛋白输出纤毛的分子机制鉴定 图3: RABL2激活ARL3促进装载有PLD的BBSome扩散输出纤毛过渡区模式 天津科技大学樊振川教授为该论文的通讯作者，博士研究生张瑞凯和孙维越为论文的共同第一作者，天津科技大学刘雁霞副教授和美国亚利桑那州汉密尔顿高中的Emma Y. Zhang参与了本文的研究工作。该研究得到了国家自然科学基金和中国博士后科学基金的支持。 樊振川教授硕博士均获自Auburn University生物医学专业，后曾在Texas A&M University和The University of Texas Health Science Center at Houston进行博士后研究。2013年引进天津科技大学并组建校-市-国家三级大健康生物技术国际科技合作平台，任创始所长（主任）。曾出任政府间国际组织-国际遗传工程和生物技术中心（ICGEB）科学顾问委员会委员（2017-19）；担任国务院牵头组织国际大科学计划和大科学工程规划领域战略研究资深编纂专家组（农业组）专家成员（2018-20）；并应邀出席第二届世界顶尖科学家论坛（WLF，2019）。樊教授目前担任Frontiers Cell Dev. Biol.等三种国际期刊副主编/编委，长期为包括 Science、Nature、Cell、PNAS、 JCB、Dev. Cell、EMBO J 和 EMBO Reports 等在内的知名期刊把关稿件。 樊教授长期从事纤毛生物学及纤毛信号转导分子机制研究，其相关研究成果系列化发表于 PNAS、JCB 和 eLife 等国际著名学术期刊，系统全面地解析了信号蛋白依赖IFT/BBS体系维持纤毛稳态的全景分子机制，截止到目前已发现了5个缺陷导致巴德-毕得氏和朱伯特综合征的纤毛信号通路调节点，鉴定了6个关键纤毛小G蛋白调节器/成药靶点及它们之间的串话关系，其原创科研成果极大地推动了人们对纤毛信号转导的认知和纤毛病致病分子机制的理解，为该领域全球最前沿位置的科学家之一。