DDX46

本研究为理解剪接体的早期组装过程以及分支位点的识别和选择机制提供了重要的结构信息，同时也为与癌症相关的SF3B1突变的致病机制提供了新的见解。 西湖大学施一公团队在《自然结构与分子生物学》（Nature Structural and Molecular Biology）在线发表了题为“Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome”的最新研究论文，报道了人源17S U2 snRNP复合物和剪接体pre-A复合物的高分辨率结构，并结合生化和功能实验，揭示了剪接体进行分支位点选择、校正的分子机理。

U2小核核糖核蛋白(snRNP)对pre-mRNA分支位点(BS)的选择对于剪接前体 (A complex)的组装至关重要。RNA解旋酶PRP5校对BS选择，但其潜在机制尚不清楚。2024年1月9日，西湖大学施一公及中国科学技术大学张晓峰共同通讯在Nature Structural & Molecular Biology 在线发表题为“Structural insights into branch site proofreading by human spliceosome”的研究论文，该研究报告了导致前质体组装的两个顺序复合物的原子结构:人类17S U2 snRNP和跨外显子pre-A复合物。PRP5主要通过酸性环占领SF3B1的RNA通路锚定在17S U2 snRNP上；PRP5的解旋酶结构域与U2 snRNA结合；U2 snRNA与BS相互作用的茎环(BSL)被TAT-SF1屏蔽，无法与BS接合。在pre-A配合物中，形成初始的U2-BS双相;PRP5的易位解旋酶结构域停留在U2 snRNA上，酸性环仍然占据RNA路径。pre-A构象被剪接因子SF1、DNAJC8和SF3A2特别稳定。癌症衍生的SF3B1突变破坏了其与PRP5的关联，损害了BS校对。总之，这些发现揭示了PRP5对剪接前体组装和BS选择或校对的关键见解。另外，2024年1月2日，上海科技大学刘如娟、西湖大学施一公及圣裘德儿童医院Xu Beisi等团队合作在Nucleic Acids Research 在线发表题为“THUMPD2 catalyzes the N2-methylation of U6 snRNA of the spliceosome catalytic center and regulates pre-mRNA splicing and retinal degeneration ”的研究论文，该研究发现一种RNA修饰-N2 -甲基鸟苷(m2G)沉积在U6 snRNA的G72上(剪接体的催化中心)，促进了人类细胞中有效的pre-mRNA剪接活性。这种修饰在脊椎动物中被证实是保守的。通过明确识别U6特异性序列和结构元件，THUMPD2被证明是负责U6 m2G72的甲基转移酶。敲除THUMPD2消除了U6 m2G72，破坏了pre-mRNA剪接活性，导致人类细胞中内源性pre-mRNA的数千个可选剪接事件发生变化。值得注意的是，异常剪接的pre-mRNA群体引发了无义介导的mRNA衰变途径。进一步表明，THUMPD2与年龄相关性黄斑变性和视网膜功能有关。因此，该研究证明了主要剪接体的RNA表观遗传修饰如何调节全局前mRNA剪接并影响生理和疾病。Pre-mRNA的剪接由剪接体执行，这是一种动态的超分子机器。剪接体通过识别内含子的保守元件:5 ' -剪接位点(5 'SS)、BS、聚嘧啶束(PPT)和3 ' -剪接位点(3 'SS)，组装在pre-mRNA上。首先，U1 snRNP、SF1、U2AF2和U2AF1分别识别5'SS、BS、PPT和3'SS，形成E complex。然后，U2 snRNP取代SF1，使U2 snRNA与BS之间形成双工，从而形成A complex。在高等真核生物中，大多数基因通过选择不同的剪接位点进行选择性剪接。因此，选择BS的A complex的形成是剪接调节的焦点。遗憾的是，人们对E-to-A转换背后的步骤知之甚少。RNA解旋酶PRP5(也称为DDX46)在A complex的组装过程中起关键作用。在人类17S U2 snRNP中，U2 snRNA无法与BS配对，因为U2 snRNA的相关序列形成双链BSL。ATP被PRP5水解导致BSL解绕，从而促进U2-BS双相的形成。在酵母中，Prp5可能校对U2-BS双工，因为Prp5突变允许使用隐性BS和3'SS。然而，PRP5调控剪接保真度的机制尚不清楚。17S人U2 snRNP和人pre-A剪接体的冷冻电镜结构（图源自Nature Structural & Molecular Biology ）大多数已知的癌症衍生的RNA剪接失调突变影响SF3B1的HEAT重复序列中的残基。这些突变大部分聚集在SF3B1的RNA通路上。Hsh155基因中的部分相应突变改变了Prp5相互作用和BS选择。尽管有这些诱人的线索，但这些癌症突变如何干扰正常剪接仍然是一个谜。该研究报道了人类17S U2 snRNP的高分辨率冷冻电镜(cryo-EM)结构和剪接抑制剂捕获的交叉外显子pre-A complex。结合结构导向的生化分析，该研究提出了一个校对BS选择和A complex组装的工作模型。总的来说，该研究为理解剪接体的早期组装过程以及分支位点的识别和选择机制提供了重要的结构信息，同时也为与癌症相关的SF3B1突变的致病机制提供了新的见解。参考文献：Zhang X, Zhan X, Bian T, Yang F, et al. Structural insights into branch site proofreading by human spliceosome. Nat Struct Mol Biol. 2024 Jan 9. doi: 10.1038/s41594-023-01188-0. Epub ahead of print. PMID: 38196034.责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观王晓红教授团队：绘制单次冷冻囊胚移植成功的女性植入期外周血microRNA动态表达谱，开拓领域创新研究热文维生素B12在细胞重编程与组织再生中发挥关键作用！热文不孕症治疗新方向！又一导致女性不孕的关键因素被发现热文Let-7家族miRNA或为癌症潜在免疫治疗靶点热文一项最新发现或可用于阿尔茨海默病药物开发点击“阅读原文”，了解更多~

北京时间2024年1月9日，西湖大学施一公团队在《自然结构与分子生物学》（Nature Structural and Molecular Biology）在线发表了题为“Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome”的最新研究论文，报道了人源17S U2 snRNP复合物和剪接体pre-A复合物的高分辨率结构，并结合生化和功能实验，揭示了剪接体进行分支位点选择、校正的分子机理。mRNA剪接是真核生物基因表达的关键步骤，由剪接体催化完成。剪接体是一个巨大且高度动态的分子机器，其核心组成元件为5种核内小核糖核蛋白复合物（snRNP），分别为U1，U2，U4，U5和U6 snRNP。剪接体通过识别pre-mRNA上保守的剪接位点完成早期的组装。首先，U1 snRNP识别5'剪接位点，剪接因子SF1识别分支位点（branch site, BS），形成E complex。随后，U2 snRNP替换SF1，识别分支位点，并且U2 snRNA与分支位点形成RNA双螺旋，完成A complex的组装1。在高等真核生物中，大部分基因都会发生可变剪接，这个过程需要剪接体选择不同的剪接位点。因此，研究这些早期复合物对于理解剪接反应的保真性和调控机制至关重要。近些年，随着冷冻电镜技术的突破，一系列人源和酵母的剪接体复合物结构获得解析，极大地促进了人们对mRNA剪接分子机制的认识2-5。但由于剪接反应早期的复合物具有高度的动态性和不稳定性，其结构研究进展缓慢。研究人员首先通过PRP5上引入的FLAG标签纯化出内源的17S U2 snRNP并解析了整体分辨率达到2.5 Å的电镜结构。随后通过使用exon-definition的pre-mRNA底物和小分子抑制剂spliceostatin A (SSA)，成功捕获了一个介于E和A complex之间的中间反应状态，命名为pre-A复合物。Pre-A复合物主要包含两个区域：U2 snRNP区域和U1 snRNP区域。其中U1 snRNP非常柔性，未能解析到较高的分辨率，而U2 snRNP区域整体分辨率达到3Å，可以搭建原子模型（图1）。图1: 17S U2 snRNP和pre-A复合物的电镜结构在17S U2 snRNP中PRP5主要通过其N端锚定在SF3B1外围，其中acidic loop占据了SF3B1的RNA通道，而它的解旋酶结构域则结合在U2 snRNA附近。剪接因子TAT-SF1通过其Linker domain将U2 snRNA的BS-interacting stem loop （BSL）包裹起来，从而避免BSL过早打开以及结合pre-mRNA。在pre-A复合物中，SF3B1仍然处于开放状态，PRP5的acidic loop依然结合在SF3B1的RNA通道中，但其解旋酶结构域发生了显著的构象变化。与之相应的，TAT-SF1从复合物中解离，并且U2 snRNA和pre-mRNA通过部分的互补配对，形成了一个初始的双链结构（initial U2/BS duplex）。剪接因子SF1和DNAJC8稳定了局部的构象。同先前报道的剪接反应抑制剂E7107一样6， SSA也结合在SF3B1和PHF5A形成的铰链口袋（hinged pocket）中。不同的是，SSA与PHF5A第26位的半胱氨酸形成了共价键。由于SSA的结合，导致分支位点腺苷（BS-A）无法进入铰链口袋而游离在外面。与此同时，分支位点下游的多聚嘧啶区（polypyrimidine tract）也没有替换PRP5的acidic loop结合到SF3B1的RNA通道path中。据此，研究人员推测，BS-A进入铰链口袋是诱发SF3B1从开放到关闭构象变化的初始条件，而伴随着SF3B1的构象变化，PRP5、SF1以及DNAJC8会发生解离，SF3B1紧紧包裹住pre-mRNA，从而完成U2 snRNP对分支位点的选择，形成A complex（图2）。在这个过程中， PRP5的acidic loop与PPT竞争结合SF3B1的RNA通道是PRP5行使其校正功能的关键。图2: 17S U2 snRNP到A complex过程中的结构变化以及PRP5校正U2/BS duplex的模型图值得关注的是，研究人员发现PRP5的acidic loop与SF3B1的结合界面上，分布着大量与癌症相关的突变位点。结合先前对PRP5功能7和癌症患者中剪接异常现象8的研究，研究人员推测这些突变可能是通过削弱PRR5的结合，影响其对分支位点的校正功能，进而引发剪接异常，导致疾病的发生。研究人员的生化和RNA-seq数据支持了这种观点。总的来说，本研究为理解剪接体的早期组装过程以及分支位点的识别和选择机制提供了重要的结构信息，同时也为与癌症相关的SF3B1突变的致病机制提供了新的见解。文章链接：https://www.nature.com/articles/s41594-023-01188-0本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！