8.28知识分子The Intellectual 导 读上世纪九十年代，借着分子生物学技术迅猛发展的春风，细胞通路领域的研究迎来井喷的黄金岁月，一条条精妙的信号转导通路被一一揭晓。其中，JAK-STAT通路无疑是其中一颗耀眼的明星——它的发现，首次让人们认识到细胞表面的信号蛋白在被激活后能直接进入细胞核，作为转录因子直接调控基因的转录表达。与此同时，这条通路在免疫系统中的重要作用，引发了相关靶向药物开发的热潮。在JAK-STAT通路的发现和转化应用中，华人科学家傅新元作出了开创性的贡献。当傅新元回忆起30年前参与的这一历史性发现时，他表示：生命科学，在人类基因组计划之前，基本上是通过小科学在推动发展。从孟德尔和摩尔根开始，科学家个人，通过兴趣和自己的智慧，首先提出科学假说（Hypothesis Driven），再通过一个个具体的科学实验，证明或者否定此假说或者概念。以这种方式，逐步发展生命科学。基础研究的成果可以进一步应用于医学和药物发现。 “和大科学不同，一个普通的，在一个小小实验台上工作的科学家 （A Bench Scientist），就有可能在历史的某一个节点，做出重要科学贡献。”在JAK-STAT通路发现30周年之际，《知识分子》特约撰稿，回顾这一历史性过程。 ● ● ● 引 子 1992年2月，纽约西奈山医学院生化系实验室。看着眼前的序列比对，一道灵光在傅新元的脑中忽然闪现。此时的傅新元，已经在自己刚刚建立的实验室连续工作了三个月了。这三个月来，他每天住在实验室，工作至少17小时，想搞清楚他在研究干扰素信号通路时发现的几个新的基因。这天，他终于发现，这几个基因编码的蛋白中，存在着一些相似的序列，而这些序列又都属于同一种名为 “SH2” 的结构域。“SH2” 结构域（Src Homology 2 domain）最初由生物化学家 Tony Pawson 在1986年命名。他最早发现SH2结构域在多个不同蛋白中存在，并且能够专一的和发生酪氨酸磷酸化的蛋白质结合——特别是一部分细胞受体。由此，Tony Pawson 提出，SH2结构域可能是介导信号通路传递的关键点。[1-4]在傅新元发现的这几个基因编码的蛋白p84/p91和p113上，竟然也存在着类似的SH2结构域。“很可能就是这个SH2结构域，将细胞外的干扰素信号从被激活的干扰素受体传导进细胞核！” 这个大胆的猜想令傅新元欣喜若狂。几天后，自己的序列比对结果后，傅新元一面向生化系同事 Ronald Kohanski 请教磷酸化修饰分析的经验，一面跟自己的博士后导师 James Darnell 分享了这则大胆的猜想：“Jim，我终于找到我们发现的蛋白ISGF3传导干扰素信号的机制了！”对这一猜想，James Darnell 半信半疑，而傅新元却信心十足、欣喜如狂，因为，这个发现，正如后来所证明的那样，是开启干扰素信号转导的一把钥匙，为整个领域的爆发奠定了基础。抉 择 01 八十年代中期，随着干扰素基因的克隆，围绕干扰素信号转导机制的研究俨然成为一片富饶的金矿。这个最初于1957年由 Alick Isaacs 和 Jean Lindenmann 两位病毒学家命名的细胞因子，曾作为 “抗病毒的青霉素” 被寄予了厚望，但批量生产的不易限制了它的应用（注1，注2）。[5]而如今，一旦研究者在重组DNA技术的帮助下实现了重组人源干扰素大量生产，这种神奇的细胞因子立刻就在临床实践中大展身手：抗病毒、抗肿瘤、甚至在治疗一种名为多发性硬化症（multiple sclerosis）的神经退行性疾病的战场上都能见到它的身影。[6]可干扰素在临床中大显神威的背后，人们对于其作用机制仍然知之甚少。这里有太多的重要问题等待研究者们去回答。例如，在病毒的刺激下，细胞为何能快速合成分泌出大量的干扰素？哈佛大学的 Tom Maniatis 和日本大阪大学的谷口维昭（Tadatsugu Taniguchi）向着干扰素上游的调控机制分别寻去，各自都有不菲的收获。[7-9]而在信号通路的下游，细胞又是如何对干扰素的刺激作出反应的呢？在这个问题的吸引下，两位学者逐渐从各自熟悉的领域走出，向这一谜题发起挑战。James Darnell 常年在分子生物学领域耕耘，对RNA分子的剪切原理做出过重要的贡献，此时研究的兴趣正向着基因表达调控的方向过渡。他首先尝试通过cDNA文库对肝脏细胞中特异性表达的基因进行分析，但失望地发现凭借当时的技术，肝细胞一旦分离后在体外培养，会很快表现出与生理条件下十分不同的性质。不可避免地，在肝细胞进行基因表达研究陷入了停滞。[10-12]此时，Darnell从前的同事 Pete Knight 所任职的杜邦公司生产出了大量的重组人源干扰素，而Darnell作为公司的科学顾问，恰有获得大量廉价干扰素的便利条件（注3）。因此Darnell的博士后 Andy Larner 就开展了一个差异表达筛选实验。这位勤快的学者，从干扰素处理前后的海拉细胞（或人成纤维细胞）中分别提取、构建cDNA文库，期望用获得的cDNA探针捕捉到海拉细胞受刺激后表达量升高的基因。[13]就在 Andy Larner 将论文投稿到《美国国家科学院院刊》（PNAS）的前一个月，《细胞》收到了一篇研究方法非常类似的投稿。George Stark 指导的研究生 Richard Friedman，构建了一个比 Andy Larner 制备的更大的干扰素应答cDNA文库，发现了更多受到干扰素刺激发生上调的mRNA类别。[14]George Stark 是个地道的生化学家，在开发一个调控DNA核苷酸合成代谢酶的抑制剂PALA时，意外观察到了哺乳动物细胞基因增殖（gene amplification）的现象。1977年，他利用学术休假机会在老朋友Ian Kerr位于英国的实验室进行访问研究，陡然对干扰素的作用机制产生了浓厚的兴趣。他和Kerr当时猜测，一段名为 “2-5A”（2’,5’-oligoadenylates）的寡聚核苷酸链是介导干扰素影响基因表达的第二信使。回到斯坦福后，Stark继续与 Ian Kerr 围绕干扰素展开合作，不久后干脆将实验室搬到了伦敦，与 Ian Kerr 一起探索细胞内信号通路对干扰素刺激做出响应的机理。[15]但干扰素刺激究竟是如何引发下游基因的不同表达呢，其选择性又如何决定？这便是接下来等待他们去回答的科学问题。 02 寻找细胞因子与基因表达之间的联系，突破口之一是从细胞膜表面上的特异性受体入手。克隆出相应的受体，接着尝试从与受体结合的蛋白中寻找线索，这便是一种 “自上而下” 的研究思路。此时人们已经在细胞膜表面鉴定出了能识别干扰素的受体，因此以苏黎世大学 Michel Aguet 和华盛顿大学 Bob Schreiber 为代表的研究者，就计划从干扰素受体的克隆出发向揭示干扰素的作用通路发起挑战（注4）。[16,17]但 George Stark 和 James Darnell 却不约而同地想到了另一种 “自下而上” 解决问题的思路：当时转录因子在基因调控中所发挥关键作用已经得到了人们的广泛认可，因此一种很自然的假说就是干扰素是通过一些未知的转录因子刺激一系列抗病毒基因的转录表达。而通过前期的cDNA差异筛选筛选实验，他们已经发现了一些在干扰素刺激下表达量大幅上升的基因。聪明的读者不难猜出他们的研究计划：既然手中已经掌握了一些受到干扰素刺激表达量会升高基因的信息，那有没有可能将这些DNA序列当作 “鱼饵”，在细胞中钓取、纯化出与之发生结合的转录因子呢？James Darnell 实验室野心勃勃的博士后 David Levy，与充满活力的研究生 Daniel Kessler 组成了一对极为高效的组合，他们从一个命名为ISG-54的基因中克隆出了启动子序列，发现如果将这段启动子序列 “嫁接” 到其他的基因上游，就能让本与干扰素通路无关的基因在干扰素的刺激下大量表达。与此同时，他们从同事那里得到了与ISG-54性质相似的另一个命名为ISG-15的基因。比较ISG-54与ISG-15的启动子序列，他们发现了一段长度为15个碱基对的保守序列，将其命名为 “ISRE”（IFN-responsive element）（注5）。借助分子生物学的突变分析，他们确定ISRE序列对于ISG-54和ISG-15启动子在响应干扰素刺激的能力上至关重要，据此推断这很可能就是干扰素下游转录因子所结合的位置。[18,19]他们向海拉细胞导入包含ISG-54片段的质粒，并对其进行干扰素刺激后，发现提取出的ISG-54在电泳时的移动速率呈现出了三条不同的条带，原因是结合了不同的蛋白复合物——他们将这三条条带结合在ISG-54上的不同蛋白复合物分别称作ISGF-1、ISGF-2和ISGF-3（图1）。[20]首先，他们发现无论是否有干扰素刺激，ISGF-1复合物都会与ISG-54片段结合，因此不太可能是干扰素信号通路的直接效应分子。而ISGF-2和ISGF-3都是在加入干扰素处理后才结合到ISG-54上，因此搞清楚ISGF-2和ISGF-3具体的成分是接下来的核心问题（注6）。与此同时，George Stark 实验室的 Richard Friedman 等人再接再厉，也从cDNA文库中克隆出了6-16、1-8和9-27等基因的启动子序列，鉴定出其具有的ISRE序列，并且也通过DNA片段电泳速度的变化，找到了结合ISRE序列片段的蛋白复合物 “E因子”（E factor，E代表early的意思）。[21-23]那么，ISGF-2、ISGF-3以及 “E因子” 的身份是什么呢？破解这一谜题，一种直截了当的办法就是纯化出足够多的蛋白，对其组分逐一分离，基于氨基酸序列设计PCR引物实现最终的克隆。但这一利用生物化学方法纯化蛋白所需的巨大工作量，让 George Stark 和 James Darnell 的研究者们面面相觑，纷纷望而却步。这时，一位雄心勃勃的生物化学家按响了 James Darnell 的门铃，毛遂自荐去承担这一史诗般的任务。他，就是傅新元，一位来自中国的毛头小伙。1988年初，傅新元正式登上了干扰素研究的历史舞台。图1 图中的B1、B2和B3指的就是ISGF1、ISGF2、ISGF3与ISG54 DNA 片段形成的复合物的电泳条带 | 图源[20]突 破 01 傅新元从小就是个精力充沛、桀骜不驯的人。15岁时对西方思想史的阅读，促使他将 “探索人类思想的主流” 立为自己的人生目标。中学毕业后，傅新元来到江苏淮安的一所公立学校做老师。一次进城逛书店，二手书架上一本内部翻译的《重组DNA》论文集激发了他对于现代生物学的兴趣。1977年高考恢复后，傅新元报考了南京大学的固体物理系，不料淮安地区政府却私自扣除了当时公办老师们的高考准考证，为此他先是在淮安教育局长家 “大闹一场”，接着又在1977年的最后一天坐长途汽车到南京教育局 “告状”，正巧遇到了江苏教育局的厅长在元旦期间值班，最终为自己争取到了上大学的机会，阴差阳错地被南京师范大学生物系录取。本科期间傅新元读了许多英文编写的教科书，还将其中一本介绍遗传分析的教材进行了翻译，寄给了复旦大学的谈家祯教授。谈先生对傅新元展现出的才华十分赏识，同时也告诫他，相比于编译教材，在现有知识的边界大胆探索、开疆拓土才是年轻人应当树立的目标。于是，傅新元报考了谈家祯教授的研究生，并被复旦大学推荐参加第一批CUSBEA项目的考试。谈先生在1979年接待访华科学家时，曾结识了吴健雄的一位同事 Cyrus Levinthal 教授——Levinthal教授接受了系统的物理学训练，之后研究兴趣转向生物学，此时正担任哥伦比亚大学生物系的系主任。在谈先生的大力推荐下，Cyrus Levinthal 教授将傅新元招至麾下。在 Cyrus Levinthal 的实验室，傅新元被安排去做利用突变分析研究膜蛋白结构的课题，这种 “体力活” 让傅新元感到自己只是被Levinthal教授雇佣的 “打工人”，他选择了离开，来到系里的新人教授 James Manley 手下研究RNA分子的剪切机制（注7）。[24-26]在以分子生物学技术为强项的 James Manley 实验室，傅新元在博士研究生阶段却锻炼出了过硬的生物化学功底：他意识到，细胞提取物对于生化学家而言就是一座巨大的宝库，生物化学手段可以成为攻克重大科学问题的一大利器。对于博士后的方向，傅新元希望能在细胞水平研究外源信号如何对基因表达造成影响。在读到 Sidney Pestka 于1987年发表的综述文章后，傅新元对干扰素的作用机制产生了浓厚的兴趣。很快他发现曾在RNA剪切领域大放异彩的同行 James Darnell 此时也开始探索干扰素信号通路。因此，傅新元铁定决心，在1987年底申请加入了Darnell的团队（注8）。此时，ISGF-1、ISGF-2、ISGF-3刚刚显露出踪迹，傅新元的到来正是时候。“傅，我很欣赏你的生化技巧。” James Darnell 在傅新元面试后立刻爽快地开出了offer，并帮助他申请到了一笔丰厚的奖学金（注9）。 02 来到 James Darnell 实验室，傅新元的第一件事就是纯化蛋白。傅新元在冷库中日夜战斗，终于从三千升干扰素处理刺激的海拉细胞中，纯化和提取出近10微克的ISGF-3提取物。aQ图3 傅新元纯化ISGF3的历程 | 图源[27]此时，David Levy 已经离开实验室，到隔壁的纽约大学任教，傅新元就和小兄弟 Daniel Kessler 一起在蛋白分离胶上对ISGF-3进行分析。他们发现ISGF-3中实际包含了4个不同的组分，并根据分子量分别将其命名为p48、p84、p91和p113，其中后三者是在I型干扰素刺激下特异性结合上去的蛋白，最有可能是参与干扰素信号转导的转录因子。[27]要想对这三个蛋白进行测序，他们还需要收集更多的蛋白样品。此时到了1990年，Daniel Kessler 已经毕业前往波士顿做博士后，傅新元一个人精力有限，Darnell就安排一位新加入的博士后 Chris Schindler 帮助傅新元一起完成蛋白纯化的工作。Chris Schindler 刚刚从纽约大学医学院获得内科医生执照，他一边在康奈尔医学中心内分泌科行医，一边在 James Darnell 的实验室做研究。在蛋白组学专家 Ruedi Aebersold 的技术支持下，傅新元和 Chris Schindler 对这三个蛋白进行了克隆，发现，p84和p91实际上是由同一个基因编码，而p113则是另一个基因合成出的产物。James Darnell 决定将两个基因的克隆拆成两篇论文发表，傅新元和 Chris Schindler 各自收获一篇论文的第一作者头衔。[28,29]凭借对ISGF-3克隆的成果，傅新元在1991年底在西奈山医学院获得了助理教授的职位。 03 但克隆出的这两个基因究竟是如何介导干扰素的信号通路呢？换句话说，基因的序列虽然知道了，但功能方面的作用机制还是一团迷雾。傅新元带着这个问题来到了西奈山医学院。随后p84/p91和p113中SH2结构域的发现，促使他提出了一个大胆的猜想：“干扰素激活受体后，受体首先会发生磷酸化，接着由于SH2结构域会与磷酸化受体结合的性质，p84/p91和p113被吸引到干扰素受体附近，进而在受体上的某个激酶的催化下发生磷酸化修饰，由细胞质基质转移进入细胞核，作为转录因子激活下游基因的表达。”巧的是，就在他将这一猜想模型告诉 James Darnell 时，恰好发现酪氨酸激酶抑制剂能够破坏ISGF-3对干扰素刺激的响应能力，实验证据支持傅新元的猜想。但对于模型中 “SH2结构域是引发ISGF-3发生磷酸化进入细胞核的关键” 的观点，Darnell和Schindler当时都不太认同——基于当时的主流研究观点，SH2结构域被认为是蛋白激酶特有的组成，一个具有SH2结构域的蛋白怎么会是转录因子呢？因此Darnell婉拒了傅新元联合署名的邀请，决定与Schindler一起将磷酸化实验的结果投稿到《科学》杂志。1992年的夏天，傅新元和Darnell的论文分别在《细胞》和《科学》发表，都提出磷酸化是ISGF-3在干扰素刺激下被激活的关键机制，所不同的是，傅新元基于序列比对的信息，额外提出了p84/p91和p113这两个ISGF-3组分中所包含的SH2结构域才是介导信号激活的关键。[30,31]然而遗憾的是，虽然他们的论文都明确指出存在一个酪氨酸激酶（当时也称为just another kinase) ，但是没能确定对ISGF-3进行磷酸化的关键激酶。而对于干扰素信号通路中这个发挥承上启下作用的关键激酶的鉴定，恰好就与傅新元的论文发表在了同一期的《细胞》杂志中。图4 傅新元在1992年提出的ISGF-3转录调控模型 | 图源[30] 04 曾几何时，George Stark 与 James Darnell 都观察到了与ISRE序列结合的蛋白复合物。James Darnell 招到了精通生化的傅新元，得以凭借洪荒之力克隆出ISGF-3的各个成分。面对相似的挑战，George Stark 却选择了另一条途径——遗传学手段。Stark实验室的博士后 Sandra Pellegrini 设计出一个精巧的遗传学筛选方法：她将6-16的启动子序列与一个编码GPT酶的基因融合在一起，导入HT1080细胞，然后通过DNA诱变剂ICR191随机地引入移码突变。随后将干扰素处理过的细胞培养于存在化学物质6-TG的培养基中。GPT酶可以将无毒的6-TG转变为剧毒的6-thiol-GMP——因此大多数干扰素信号通路正常的细胞都会由于诱导产生大量的GPT酶而中毒死亡，而干扰素信号转导被诱变剂破坏的细胞则有更大的机会在筛选中存活下来。通过这一方法，Sandra Pellegrini 获得了一系列的 “干扰素通路缺陷” 的突变细胞株。[32]1991年，Sandra Pellegrini 在法国巴斯德研究所得到助理教授职位。她对博士后期间筛选获得的一部分突变细胞株进行分子克隆。结果，她从11,1号突变体中克隆出了一个名为Tyk2的激酶，发现其属于澳大利亚科学家 Andrew Wilks 不久前刚刚克隆出的一类简称 “JAK” 激酶家族。[33-35]真相很快大白，JAK家族的激酶正是傅新元和 James Darnell 论文中提出对ISGF-3进行磷酸化修饰的 “未知激酶”，而ISGF-3也正是凭借SH2结构域才会在干扰素信号的刺激下富集到干扰素受体附近。后来，p84/p91和p113被重新命名为STAT1和STAT2。[36]不久之后，包括 James Darnell 实验室在内，研究者们或通过同源序列的索引，或在利用白细胞介素-6、乳汁分泌等其他体系，陆续发现了更多STAT家族的成员。可以肯定的是，这些成员无一例外地都是在信号刺激下发生磷酸化修饰，进而进入细胞核作为转录因子来调节基因的表达。[37-39]至此，干扰素作用的机制终于找到了——这条被命名为JAK-STAT的信号通路，负责将信息从细胞膜上的干扰素受体准确迅捷地传递到细胞核内。细胞通路的研究历史上，信号转导与转录激活之间第一次被直接建立起了联系，并很快就被发现是在多种信号转导通路中都普遍存在的机制。人们也立刻意识到，JAK-STAT通路在免疫系统在内的众多生理过程的调控中，都发挥了至关重要的作用。一个全新的领域诞生了。后来的故事，我们都知道了，靶向JAK-STAT通路的药物在癌症、风湿、甚至是COVID-19的治疗中都具有良好的表现。[40-44]值得一提的是，傅新元先后两次请 James Darnell 帮忙修改自己作为唯一作者投稿到《细胞》的论文。不过，他论文中并没有涉及将p84/p91和p113的SH2结构域进行删除的实验，没有论证SH2结构域对于ISGF3响应干扰素刺激的必要性。这可能是 James Darnell 和 Chris Schindler 当时不相信傅新元模型的原因。1992年5月，James Darnell 在康奈尔医学院作学术报告，曾有研究者围绕SH2结构域提问，当时 James Darnell 否认了SH2结构域的重要性。Salk研究所的 Tony Hunter 是傅新元论文的审稿人。6月，Hunter告诉到访的Darnell，“傅是对的！”。Darnell当时 “几乎从椅子上差点摔落下来”，他惊讶极了。原来，傅新元告诉他的SH2结构域，让他忽略的有点可惜。幸亏傅新元的坚持，干扰素信号通路中关键的结构域才得以被广泛认可。如今，在成千篇关于STAT的研究论文中，谁又能躲得过他发现的SH2结构域呢！图5 Chris Schindler和James Darnell在1992年提出的ISGF-3转录调控模型 | 图源[31] - 致 谢 -感谢傅新元教授在百忙之中接受采访，感谢常智杰教授对本文提出的宝贵建议。 注释：（上下滑动可浏览）注1：事实上，在Alick Isaacs和Jean Lindenmann之前，东京大学传染病研究所的Yasu-ichi Nagano和Yasuhiko Kojima已经在被流感病毒感染的细胞会分泌出某种抗病毒的因子，于1954年发表。45注2：在被克隆之前，干扰素的物种特异性为批量生产在技术上带来了很大挑战：即小鼠细胞产生的干扰素在人体内缺乏抗病毒活性。注3：I型干扰素包含IFN-α和IFN-β。准确地说，Darnell实验室的IFN-β主要来自杜邦公司，而IFN-α则是来自罗氏公司波兰裔生化学家Sidney Pestka的馈赠。注4：Bob Schreiber一度相信干扰素受体的丝氨酸/苏氨酸磷酸化是激活下游通路的关键，但傅新元基于ISGF-3的数据告诉他酪氨酸更可能是重要的修饰位点，由此帮助Bob Schreiber避免出发表一篇结论错误的论文。注5：海拉细胞受到干扰素刺激后大量合成的两个基因，其蛋白产物分子量分别为54kDa和15kDa。ISG-15由Pete Knight团队克隆，Darnell实验室博后Nancy Reich对其介导干扰素引发的激活反应进行了充分性方面的功能验证。46,47注6：ISGF-2和ISGF-3的区别在于干扰素处理下结合ISG-54速度的差异。在当时很难判断哪个复合物中找到的蛋白更重要。ISGF-3更有希望的一个原因是其较快的反应速度与细胞转录变化对于干扰素的响应速度更贴合。James Darnell的博后Richard Pine解析、克隆了ISGF-2的组分，但很遗憾最终没有找到像JAK-STAT通路那样影响深远的分子。48注7：傅新元在博士临近毕业之际，偶然发现了HEK293与HeLa这两种不同的细胞的提取物具有不同的剪切活性，据此推断HEK293中富含一种独特的剪切因子。基于傅新元建立的这一系统，他的师弟葛辉最终鉴定出了剪切因子ASF。值得一提的是，哈佛大学Tom Maniatis实验室的博后付向东也在同一时期独立鉴定出了另一个关键的剪切因子SC35。从发表时间上看，ASF在前，SC35在后。49,50注8：在Darnell的支持下，傅新元获得了一笔一年42000美元的CSI fellowship。 参考文献：（上下滑动可浏览）1 Stone, J. 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