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摘要:真核生物转录的早期阶段包括两个主要事件：新合成mRNA的加帽，以及RNA聚合酶II从启动前复合物到生产性延伸状态的转变。加帽检查点模型意味着这些事件是紧密耦合的，这对于确保新合成mRNA的正确加帽是必要的。最近的发现还表明，加帽机制对转录和整个基因表达过程具有更广泛的影响。这些现象的分子基础将在本文中被讨论。1.引文真核生物mRNA的一个特征是5’端存在帽状结构。该结构由倒置的7-甲基鸟苷组成，其与新合成的转录子的第一个转录核苷酸相连，随后被帽结合蛋白复合物（CBC）结合。帽状结构的主要功能是通过保护mRNA免于5’核酸外切酶降解，以此来稳定新生的转录子。此外，帽状结构有助于聚集用于拼接、3’端加工、导出和翻译所需的因子。mRNA 加帽机制具有三种基本活性：RNA 5’三磷酸酶（RT）、鸟苷酸转移酶（GT）和RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶（RNMT）。在酵母中，有3种独立的酶负责这些活动。RNA 5’三磷酸酶（RT）和鸟苷酸转移酶（GT）在酿酒酵母中结合在一个功能复合物起作用，但在粟酒裂殖酵母中分别发挥作用。在后生动物中，前两种活性由相同的加帽酶（CE）进行，而甲基转移酶（RNMT）活性存在于 RNMT-RAM 复合物中，其中RNMT是催化亚基，RAM 是激活RNMT活性的活化亚基。此外，加帽机制包括帽子特异性mRNA-甲基转移酶 CMTR1和CMTR2（CMTr），以及最近描述的腺苷N6-甲基转移酶（CAPAM）。真核生物的mRNA加帽过程并不总是进行至完成。在哺乳动物中，DXO/Dom3Z和XRN家族蛋白在5’端加帽质量控制中用作监测蛋白质。特别是，脱帽外切核糖核酸酶DXO会降解加帽但未甲基化的早期mRNA。在酿酒酵母中，RNA加帽质量控制存在部分冗余机制：Rai1-Rat1和Ydr370C/Dxo1。当加帽和转录机制紧密耦合时，加帽发生。下面，我们描述了关于加帽过程和转录事件之间联系的观点。表1显示了在不同物种中参与建立这种联系的因素列表。2.加帽检查点模型RNA聚合酶II（Pol II）依赖型转录是一个由多种因素和信号调节的复杂过程，其中涉及多个检查点，以确保正确的mRNA合成和mRNA-蛋白质复合物的组装。主要检查点包括正确的mRNA加帽、剪接和3’端形成。真核生物转录发生在以下基本阶段：起始前复合物的组装、起始、延伸和终止。起始到延伸的转变进一步分为“早期延伸”和“生产性延伸”。这两个子阶段由RNA聚合酶II的暂停进行区分：在大约20-60个核苷酸转录后，RNA聚合酶II停止合成，直到特定信号出现。对hsp模型基因这一现象的早期研究表明，停顿与mRNA帽状结构的形成有关。加帽检查点模型表明RNA聚合酶II在启动子近端区域暂停，以确保在生产性延伸开始之前mRNA加帽。早期延伸的停止确保了加帽酶的聚集，这反过来又吸引了其他因素来取消早期延伸的停止。随着RNA聚合酶II穿过暂停区域，加帽逐渐发生：最近的暂停RNA大部分没有加帽，而更远端的完全加帽。在此上下文中，加帽意味着添加鸟苷，而其在转录过程中甲基化的时间点尚未确定。这就是为什么“加帽”在下文中指的是添加鸟苷的事件，并特别指出了其甲基化的情况。即使在暂停阶段，有几个因素可以确保进行适当的转变。转录起始后，DRB敏感型诱导因子（DSIF）结合RNA聚合酶II，并将负延伸因子（NELF）聚集到染色质。后者导致转录暂停，在此期间加帽机器聚集。在早期延伸过程中，RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）在第5个丝氨酸残基处被细胞周期蛋白依赖型激酶7（Cdk7）磷酸化，其是TFIIH的一个亚基。磷酸化的RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）和DRB敏感型诱导因子（DSIF）的Spt5亚基聚集加帽机器。加帽酶的聚集可以缓解负延伸因子（NELF）的作用，并为正转录延伸因子（P-TEFb）加载提供平台。后者使RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）、DRB敏感型诱导因子（DSIF）和负延伸因子（NELF）的第2个丝氨酸残基磷酸化。结果，磷酸化的负延伸因子解离，暂停的RNA聚合酶II被释放到生产性延伸中（图1）。3.加帽机器的功能取决于转录mRNA加帽装置和早期伸长因子在细胞核中显示出紧密的联系。连接这些机器的核心参与者是RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）和Spt5。事实上，带有截断CTD的RNA聚合酶II显示了加帽缺陷。RNA聚合酶II C末端结构域具有特定的磷酸化模式，这取决于转录过程的阶段，而加帽酶（CE）的聚集和功能取决于该模式。正是磷酸化的CTD将转录与加帽耦合。更准确地说，它在第5个丝氨酸残基处的磷酸化（而不是在Ser2处）激活了加帽活性。启动子上的第5个丝氨酸残基磷酸化提供了正确的早期mRNA加工。第5个丝氨酸残基磷酸化的RNA聚合酶II已被证明可与加帽机器和TFIIH激酶共纯化。最近的研究表明，Ser7磷酸化对于加帽也很重要：鸟苷酸转移酶 Ceg1与酵母中的RNA聚合酶II相关联是必要的。裂变酵母中的Ser5磷酸化RNA聚合酶II C末端结构域和Spt5与鸟苷酸转移酶 Pce1和三磷酸酶Pct1相互作用。在芽殖酵母中，RNA鸟苷酸转移酶 Ceg1与Ser5磷酸化CTD结合，并将Cet1三磷酸酶聚集到RNA聚合酶II，并且还表明Ceg1和Abd1直接独立地与磷酸CTD结合。Ser5磷酸化对于RNGTT结合及其在哺乳动物中的活性也很重要。人类RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶（RNMT）募集还依赖于Ser5磷酸化[46]，RNMT与加帽酶和RNA聚合酶II的伸长形式形成三元复合物。小鼠加帽酶Mce1的鸟苷酸转移酶结构域与磷酸化的CTD结合。此外，哺乳动物鸟苷酸转移酶通过与Ser5磷酸化CTD结合以变构方式激活。因此，加帽机器与Ser5磷酸化Pol II CTD的连接是一个保守的特征。然而，哺乳动物加帽酶中CTD结合位点的位置和组成与酵母加帽酶中的位置和组成不同，后者识别相同的CTD一级结构。在芽殖酵母中，所有3个加帽酶被聚集到转录基因的5’端需要Kin28。这是负责Ser5磷酸化的主要激酶（后生动物中TFIIH的Cdk7亚基的同源物）。抑制人Cdk7活性导致加帽酶聚集减少，从而减少mRNA加帽，并增加RNA聚合酶II启动子-近端暂停。正如预期的那样，在生产性延伸期间，起作用的Pol II CTD磷酸酶拮抗CE结合。因此，磷酸酶FCP1对于哺乳动物中CE与Pol II CTD的解离是必要的。然而，单独磷酸化的Pol II CTD不足以实现高效加帽。有一种CTD独立但Pol II介导的机制，与CTD依赖性过程并行工作，以确保最佳的加帽。酵母中的mRNA加帽酶需要两个界面才能与Pol II相互作用：Ser5磷酸化CTD和Rpb1的多螺旋足域。后者有助于CE与Pol II相互作用的特异性。足部结构域或其相关因子的突变导致Ser5磷酸化增加。在酿酒酵母中，Cet1和Ceg1以异四聚体Cet12Ceg12形式与Pol II相互作用。Ceg1与磷酸化的Pol II CTD之间的相互作用已得到充分研究，但Cet1也与CTD外部转录的Pol II复合物形成广泛的相互作用。Ceg1似乎是可移动的，并且在转录复合体中采用多种构象。还观察到Ceg1与Pol II亚基Rpb7的接触。因此，CTD非依赖性和CTD依赖性网络共享机制的组合在激活共转录加帽。另一个有助于加帽机器募集的转录因子是Spt5蛋白，它是早期Pol II伸长因子DSIF的亚基。Spt5携带CTD，其作用类似于Pol II CTD。Spt5和Pol IICTD对于CE的招募很重要。在裂变酵母中，三磷酸酶Pct1和GT Pce1独立地与伸长因子Spt5结合。在芽殖酵母中，Spt5有助于mRNA加帽酶 Cet1、Ceg1和Abd1的稳定募集。有实验证据表明“Spt5 CTD代码”的概念，类似于Pol II CTD的概念。根据这一概念，Spt5 CTD在结构上是灵活的，可以采用由特定细胞Spt5CT受体蛋白模板化的不同构象；此外，Spt5CTD 重复的苏氨酸磷酸化刻有一个二元开关，由不同的CTD受体读取，每个受体都有自己独特的方式。与Pol II CTD不同，P-TEFb磷酸化Spt5 CTD阻断了Spt5-Pce1相互作用。值得注意的是，CE招募的方式可能是物种特异性的。在芽殖酵母中，帽甲基转移酶Abd1直接与磷酸化的丝氨酸5 CTD Pol II相互作用，而裂变酵母中的帽甲基转移酶Pcm1在与Cdk9/Pch1（P-TEFb）的复合物中募集，Cdk9/Pch1显然将加帽装置靶向转录复合物。一个以上的一般转录因子参与适当的加帽。这是TFIIB尖端区域，这是丝氨酸5 CTD Pol II磷酸化和mRNA加帽的适当水平所必需的。在哺乳动物中，第一和第二转录的核苷酸也可以被CMTR1和CMTR2酶O-2甲基化。这种修饰在翻译启始和转录本识别为先天免疫中的“自我”方面具有作用。在转录早期将CMTR1招募到Ser5磷酸化的Pol II CTD中。最近，发现了一种新的甲基转移酶CAPAM。它催化第一个转录的腺苷N6-甲基化。CAPAM被鉴定为Ser5磷酸化CTD相互作用因子1（PCIF1）。虽然最初发现CAPAM对模型基因的RNA聚合酶II依赖性转录有负面影响[68]，但后来的全转录组分析显示其对转录有基因特异性影响。因此，CE与Pol II和Spt5之间存在许多相互作用。这些互动对于CE的招募和功能至关重要。加帽机器与转录装置之间的连接是双峰的。一方面，Pol II CTD可以作为将mRNA 5’端和CE结合在一起的支架，从而提高加帽效率；另一方面，转录因子可以变构地增强加帽机器的活性。4.加帽装置对转录的影响加帽酶（CEs）与转录机制之间的关系是相互的。加帽酶与CTD Pol II的相互作用增强了加帽，但加帽酶也会影响转录。如初始所示，Cet1抑制转录再启动，并降低RNA聚合酶II在启动子-近端区域的积累，该区域独立于mRNA加帽活性。Ceg1刺激早期伸长，其突变体在此过程中存在缺陷。最新发现表明，Cet1-Ceg1复合物和DSIF刺激Pol II启动子逃逸并转移到伸长。酵母甲基转移酶Abd1对启动子的Pol II募集具有基因特异性刺激作用。Abd1对转录的刺激发生在甲基化缺陷突变体中，因此与加帽本身无关。Abd1中的条件突变体在某些基因上与启动子结合的Pol II以及在其他基因的启动子清除或早期伸长方面存在缺陷。Abd1 耗竭导致 CTD Ser5的高磷酸化。裂变酵母加帽-甲基转移酶Pcm1将P-TEFb招募到染色质中。当这种连接被破坏时，Cdk9没有被正确招募，Pol II延伸受到严重影响。Cdk9与RNA三磷酸酶Pct1的相互作用也在粟酒裂殖酵母中进行了描述。加帽酶沿基因的分布意味着它们会影响转录的后期阶段。在酵母中，Cet1和Ceg1的全基因组占用仅限于转录起始位点，而Abd1的占用率在下游110 bp处达到峰值，CBC的占用率随后升高。据推测，Ceg1-Cet1加帽装置与转录复合物解离，因为Ser5磷酸化在延伸过程中减少，而酵母Abd1帽甲基转移酶延长了与Pol II CTD的相互作用。人类加帽酶存在于5‘末端和整个基因中，甚至包括poly（A）位点下游超过千碱基的3侧翼区域。因此，加帽因子会影响转录延伸、终止、和mRNA 3’端加工。酿酒酵母Cet1 N端结构域（NTD）促进染色质转录（FACT）的募集或促进染色质转录（FACT），从而增强在Pol II参与活性基因的转录延伸，独立与mRNA加帽活性。Cet1 N端结构域的缺失会损害染色质转录的靶向，从而降低Pol II在转录伸长中的参与度，从而导致Pol II的启动子近端积累。在哺乳动物中，CE在NELF的帮助下抵消转录抑制[28，82]。哺乳动物RNMT-RAM也促进Pol II依赖性转录。RNMT-RAM对转录的影响是直接的并且独立于mRNA加帽、稳定性和翻译。RNMT-RAM结合早期mRNA的整个长度并招募与转录相关的蛋白质。因此，已经发现加帽酶调控转录，并且该调控独立于其酶活性。这种效应的机制似乎是基因和物种特异性的。加帽-转录相互作用的另一个重要参与者是CBC。它与早期转录活动也具有互惠关系。CBC参与转录因子的招募和转录的调节过程。CBC与酵母中的CTD激酶相互作用，其消耗影响CTD Ser2和Ser5的磷酸化水平。在哺乳动物中，CBC通过NELF和P-TEFb的募集刺激转录延伸，并且对CTD Ser2磷酸化很重要。在酿酒酵母中，CBC招募Ctk2或Bur2（P-TEFb的直系对照）。Abd1和CBC对于激酶Ctk1和Bur1的募集很重要，这两者促进了延伸和CE释放。mRNA CBC还通过其与酿酒酵母体内Mot1p的相互作用刺激启动子处的预启动复合物的形成。Mot1p是一种转录调控子，可积极或消极地以一种基因特异性方式调节Pol II转录基因表达。CBC通过阻碍终止因子Pcf11p和Rna15p（裂解因子CFIA的亚基）的募集来抑制弱终止子。因此，CBC在转录过程中具有多重功能。最近，聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2被描述为CBC的一种新型伴侣。这些蛋白在转录的早期延伸共同作用，它们的消耗会影响果蝇中的Ser5 CTD Pol II磷酸化。5.加帽作为基因表达的调控步骤近年来，已经出现了一些例子说明mRNA帽状结构形成受到不同信号的调节。这些信号调节mRNA帽状结构形成的速率和程度，导致基因表达的变化。第一个被描述的调节加帽的例子是c-myc依赖性活化。c-Myc调节许多转录子的帽状结构形成。c-Myc增加了催化活性CE向Pol II及其靶基因的募集。此外，c-myc导致帽状结构甲基化增加，这对c-myc依赖性基因调控做出了重大贡献，并且增加的帽状结构甲基化与TFIIH和P-TEFb活性的c-myc依赖性增强有关。由于7-甲基鸟苷帽状结构是有效翻译所必需的，因此增强的甲基化帽状结构形成也将蛋白质产量从c-myc响应基因水平的提高到超过转录诱导的水平。因此，无论转录增强本身如何，加帽的调节都是增强蛋白质合成的一种方式。另一个例子是E2F1转录因子，它通过依赖于Pol II磷酸化的机制促进帽状结构的形成。加帽由信号通路调节。例如，RNMT在细胞周期中被CDK1-细胞周期蛋白B1磷酸化并激活。这导致帽状结构甲基转移酶活性升高，同时转录在有丝分裂后G1期开始时重新开始。这是协调mRNA加帽与转录爆发的方法。在酵母中，营养饥饿导致帽状结构甲基化普遍减少。据报道，输入蛋白α刺激一般帽状结构甲基化。相反，CE mRNA-cap通过调节果蝇中的PKA活性来正向调节Hh信号活性。因此，mRNA加帽的调控因子，加上加帽质量控制机制，也许提供了另一层基因表达的调控。6.结论和前景上述加帽检查点模型已在许多研究中得到证实。然而，目前的加帽/转录相互作用模型尚未完成。有一些问题需要进一步调查。未来一个重要的挑战是澄清将加帽与转录暂停和延伸联系起来的因果关系。加帽蛋白和转录机器之间的广泛相互作用网络尚不清楚。因此，对新生mRNA进行CBC募集的机制知之甚少，监测去帽机器的募集也是如此。物种和基因特异性相互作用特别令人感兴趣。加帽和转录机器具有一些物种特异性特征，例如存在相当数量的后生动物特异性因子和种内副群（表1）。此外，高等真核生物CE的非催化调控域具有高度的多样性，即使在密切相关的物种中。这些事实可能意味着，在与转录装置的特定相互作用中，这些因子和结构域都有参与。上面一些例子提到了物种特异性连接，包括哺乳动物/酵母CE与磷酸-CTD Pol II相互作用的不同位点，芽殖/裂变酵母中GT-RT与Pol II相互作用的不同方式，哺乳动物中存在NELF-CE相互作用，以及转录机制中Abd1 / Pcm1的不同靶标。加帽机制功能中的基因特异性已经在一些例子中进行了描述，例如前面提到的c-myc和E2F1依赖性加帽调节。其他基因特异性转录因子也可以以类似的方式起作用并调节局部加帽。加帽因子也可能是基因特异性信号通路的靶标，例如RNMT的NTD，其携带多个修饰位点。加帽步骤并不总是进行至完成。一个重要的尚未解决的问题是，这是否仅仅是加帽过程固有的低效率的结果，还是调节早期mRNA加工的调控活动。如果后者是正确的，那么所涉及的成分是什么，以及如何做出决策：哪些早期mRNA应该加帽？先前的加帽模型表明，加帽通过阻止mRNA降解，在调控因表达方面起着“被动”作用。现在很明显，加帽可以被修改为“主动”调节mRNA或选定的子集的命运。目前尚不清楚哪组基因和转录因子参与调节加帽。需要更多的研究来更深入地了解信号通路对加帽的影响以及加帽调控在整个基因表达中的作用。原文来源：Interplay of mRNA capping and transcription machineries.

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注转录失调（dysregulation of transcription）是肿瘤发生发展的重要基础。与细胞周期调节类似，RNA聚合酶II驱动的转录调节是一个单向的多步骤过程。细胞内有数千个独特的转录周期（transcription cycles），每个周期包括募集、起始、暂停、延长、终止和循环。这些阶段受到转录周期依赖性激酶及其同源周期蛋白的协同作用、转录磷酸酶的负向调节所严格调控。致癌性转录失调会导致基因表达的缺陷。因为细胞对转录机制依赖，所以具有“转录成瘾”（transcriptionally addicted）的肿瘤对转录干扰敏感。靶向转录周期蛋白依赖性激酶和相关的小分子蛋白有望用于治疗肿瘤，并有助于合理设计肿瘤的联合治疗疗法。近期来自澳洲墨尔本大学彼得麦卡勒姆癌症中心的Ricky Johnstone教授团队，在Nature Review（IF：60.714）上发表长篇综述：Targeting transcription cycles in cancer (doi: 10.1038/s41568-021-00411-8)。该团队聚焦前沿，从“转录周期”概念入手，阐明了基因表达失调是如何驱动肿瘤发生发展的。并从转化医学角度探索如何从全局或选择性转录干扰中产生治疗效果。从基础和临床医学水平构建理论体系，对靶向肿瘤转录治疗提供有力的依据。Ricky Johnstone教授（图片来源于网络）在恶性肿瘤中，基因组和表观遗传学改变所引起的转录失调被称为“转录成瘾”。这种状态会促进肿瘤的发生发展。“转录成瘾”会过度依赖肿瘤细胞转录过程中的各种成分，所以肿瘤细胞对干扰转录的多个过程都非常敏感。这为开发针对核心转录成分的小分子抑制剂提供了分子学依据，比如转录周期蛋白依赖性激酶（tCDK）、溴多巴胺和末端外（BET）结构域蛋白。目前，许多抑制剂正在进行实体和血液肿瘤的临床前/临床试验。Ricky Johnstone教授认为在生理环境下严格调控转录至关重要，针对这一过程的治疗在肿瘤学中具有开阔的临床前景。墨尔本彼得麦卡勒姆癌症中心（图片来源于网络）肿瘤中的转录失调及其对小分子抑制剂的开发会影响RNA聚合酶II（Pol II）依赖性的基因转录，该过程由精细调节的动态网络控制。在单个基因水平上，Pol II驱动的单向、多步骤转录过程由tCDKs及其同源细胞周期蛋白的协同作用控制。这类似于CDK-细胞周期蛋白的细胞周期调节，因此被称为“转录周期”。转录周期由预启动、启动、暂停、延长、终止和循环等阶段组成，每个阶段都由检查点（check point）控制，这些检查点强化了质量控制以保证Pol II进入下一阶段前准确完成了每一步（和细胞周期检查点类似）（图1）。Pol II复合物中的RPB1亚基的羧基末端结构域（CTD）内的多个残基的动态磷酸化是控制Pol II驱动的转录的核心（图2）。这种磷酸化由tCDKs–细胞周期蛋白和磷酸酶的相反作用所介导（后者可以使其去磷酸化）。有些蛋白质能够特异性识别翻译后修饰的CTD残基，调节转录和共转录活动。另外，tCDK介导的转录调控不仅局限于Pol II CTD磷酸化，还扩展到Pol II辅助因子和Pol II核心亚单位额外残基的磷酸化依赖性调节。在考虑肿瘤的转录周期失调的影响时，需要考虑现有转录周期模型之外的其他复杂因素，例如细胞内和细胞间的转录周期异质性。细胞内转录周期异质性表现为：大量的转录周期可以在单个细胞的基因组中同时发生。具体分为：1.发生在单个基因水平上，当多个Pol II分子同时通过单个转录单元时，几个转录周期同时运行；2.跨越不同的基因，其中基因内在特性决定了每个转录周期阶段的持续时间和速率（图1B）。此外，在不同的细胞类型之间，特定基因的转录周期参数也是不一样的，这导致不同组织和肿瘤之间的转录周期也存在异质性。因此，肿瘤中转录周期的失调可能发生在特定细胞类型的特定基因上，也可能存在于不同细胞群体的全基因组水平。不同的基因选择性转录周期（gene-selective transcription cycles）可能使特定基因转录失调，或者可能使特定的癌基因对核心转录成分的治疗靶向选择性敏感。不同的基因选择性转录周期可能使特定基因发生肿瘤相关的转录失调，可能使特定的致癌基因对靶向治疗的核心转录成分敏感。这篇综述讨论了一个更新的转录周期模型，为我们理解肿瘤中转录失调及其如何影响治疗的靶向性提供了框架。图 1在了解背景知识后，我们正式进入文章正文的学习，该综述主要分为四部分：转录周期的正常调控、转录周期的失调、靶向转录周期以及展望。文章结构清楚，内容详实，信息量巨大，请小伙伴们抓紧时间学习这篇宝藏文章！一、图难于其易，为大于其细。转录周期和细胞周期的概念非常类似，他们都由一系列精确调控的事件组成，后者由被称为细胞周期时钟的机制所调控。在探究转录周期所引起的细胞恶性转化之前，我们有必要先来学习转录周期是如何进行正常调控的。转录周期的第一步涉及起始前复合物的形成（图2），该复合物由Pol II、TFIID和其他一般转录因子组成，与启动子区域的26-亚基中介体复合物（Mediator complex）相关。TFIIH复合体，包括CDK7、细胞周期蛋白H和其他亚基（如MAT1和XPB），随后被招募到中介体-起始前复合物，其中CDK7对Pol II CTD（Ser5）的磷酸化促进了转录启动。CDK7控制着mRNA帽结构的招募，导致5’帽子的增加（图2）。通过与MED12和MED13亚基的相互作用，CDK8和CDK19调节中介体复合体的形成和启动子的招募，以及中介体和POL II的相互作用（图3）。然而，它们在调控POL II转录周期中的主要作用与各种转录因子的磷酸化有关，这些转录因子促进不同基因的激活或抑制，包括E2F1、STAT1和SMAD等靶基因。在启动后，POL II复合体在转录起始点附近暂停，这一过程称为转录暂停。暂停受到DRB敏感性诱导因子（DSIF）、四亚基负延长因子（NELF）复合体和POL II复合体中阻止新生RNA13伸长的构象变化的相互作用的调节（图3）。为了消除暂停、释放检查点并进入生产延长（productive elongation），POL II需要招募CDK9和细胞周期蛋白T1复合体（P-TEFb）。CDK9作用于Pol II转录周期，超过暂停-释放检查点，包括调节转录终止。最近的研究表明，在暂停释放后，Pol II的加工性和延伸率由高度同源的CDK12和CDK13控制，这两个蛋白都与细胞周期蛋白K相互作用。CDK12和CDK13会以部分冗余的方式调节Pol II CTD磷酸化（Ser2）（图2）。通过抑制内含子和选择性多聚腺苷来调节全长mRNA转录本的合成。图 2CDK-Cyclin并不是在转录周期内各自独立起作用，转录周期也不是与其他细胞过程相互分割。CDK7作为由细胞周期蛋白H和MAT1组成的CDK激活激酶复合体的一部分，控制着参与转录调节和细胞周期进程的其他CDK的激活。例如，CDK7通过磷酸化CDK1、CDK2、CDK4和CDK6来调节细胞周期进程，因此CDK7的抑制可能诱导细胞周期表型。与CDK7类似，CDK11-Cyclin L复合体也在转录调控和细胞周期控制之间发挥着作用。CDK11的p58亚型可以在有丝分裂阶段调节细胞周期，而全长p110亚型被证明可以调节复制依赖的组蛋白基因的表达，并促进Pol II CTD在Ser2位置的磷酸化。因此，在不同的细胞周期阶段，转录周期和细胞周期似乎已经共同进化来调控转录，这表明这两个过程在CDK介导的控制方面的相似之处不仅仅是类比。与细胞周期CDKs类似，tCDKs在转录周期中与细胞周期磷酸酶在功能上相反（图2）。二、负阴而抱阳，冲气以为和。当转录过程出现调节失衡时，细胞就会出现异常状态。许多肿瘤细胞存在一个或多个检查点失活，使积累了突变基因和异常核型的细胞获得生长优势。成千上万的转录周期无时无刻不在进行（包括单细胞和不同细胞类型中）（图3）。在恶性肿瘤中，转录周期失调是致癌表型异常转录状态的基础。导致肿瘤异常转录的分子事件非常多，发生在不同肿瘤类型中的基因缺陷在功能上都汇聚于转录周期。致癌转录失调可通过影响直接控制POL II转录的分子机制的表达和/或功能的遗传异常而直接发生（即直接调节因素）。转录失调也可以通过突变间接发生。这些突变会改变转录因子、表观遗传调节因子或中间体，不同程度地促进或拮抗信号级联反应中的活性（即间接调节）。这些遗传事件干扰肿瘤细胞转录的范围是多种多样的，从对细胞特性至关重要的少数基因的高度选择性变化到几乎所有转录周期的失调。这种选择性的原因可能有：①基因的内在属性，如暂停状态或基因长度；②基因外在因素，如与tCDK或tCDK功能相互作用的转录组或基因组的改变；③共转录和转录后过程，包括前mRNA剪接、mRNA输出，这些过程控制稳定的mRNA水平，从而通过反馈机制影响转录周期的活动（图3&图4）。 图 3目前，有关编码POL II转录循环机制通用成员的基因与肿瘤相关突变的研究是非常有限的（见原文表1）。例子有：在脑膜瘤中编码Pol II中最大RPB1亚单位的POLR2A基因中，反复出现Q403K错义和L438_H439缺失突变；转移性前列腺癌中含有POL2RA基因的染色体17p区域的杂合性缺失。除了CDK12和较小程度的CDK8，编码tCDKs的基因突变是罕见的，并且没有被报道是肿瘤中发生转录周期直接失调的机制。另一种解除转录周期调控的方式是通过破坏调节tCDK活性的蛋白质。例如，MYC扩增或基因重排产生混合性白血病（MLL）融合嵌合体，它异常地将超延长复合体（SEC）招募到MLL靶基因（图2）。这在肿瘤中发生的概率较高，并促进致癌转录失调（图3A）。虽然这些蛋白的活性变化都会干扰依赖POL II的转录周期，但与整体转录相比，一些基因座的转录周期表现会出过度失调。CDK8是转录因子活性的调节器和Pol II中介复合体相互作用的调节因子，被证明具有致癌和抑癌的作用。据报道，在47-60%的结直肠癌中，与CDK8相关的13q12.13基因组区域的扩增导致CDK8表达增加。CDK8-中介复合体在POL II转录周期的起始时起作用，但CDK8表达或活性的改变对整体基因表达和mRNA合成速率的影响很小。但也有研究表明：CDK8会选择性地影响由特定转录因子或超级增强子区域控制的基因转录周期。CDK8在结直肠癌中的扩增与整体转录失调无关，而是与典型的Wnt-β-catenin靶基因（如MYC和AXIN2）通过抑制E2F1转录因子的磷酸化而激活转录循环有关。CDK8在肿瘤组织中的过表达也与更大的核β-catenin定位和WNT通路激活有关。此外，CDK8磷酸化STAT1，与依赖STAT1的转录程序的激活有关，以响应JAK-STAT途径（该通路是骨髓增殖性肿瘤和JAK突变的急性髓系白血病增殖的关键驱动因素）。与CDK8过表达驱动肿瘤生长的作用相反，CDK8也被发现具有肿瘤抑制作用。CDK8缺失可以加速APCmin小鼠肠癌模型的肿瘤形成。在人类肿瘤中，CDK8相关的肿瘤抑制功能最常见的是与它在介体复合体中的作用有关。在子宫肌瘤中报告了编码中介复合体亚单位MED12基因的体细胞突变，而在前列腺癌和结肠癌中发现这一突变属于罕见事件。MED12是CDK8-CCnC-MED12-MED13介体蛋白激酶模块的一个组成部分，对CDK8依赖的POL II启动子招募至关重要。MED12的突变降低了CDK8介导的激酶功能，导致转录因子（如STAT1和SMAD）的下调，并上调了干扰素γ反应和上皮-间充质转化相关基因，进而促进了肿瘤的进展。编码CDK7或CDK9的基因发生突变会改变它们的表达量或激酶活性。在最近的一项泛癌研究中，作者报告了不同上皮性肿瘤的非纯合子CDK7拷贝数缺失。然而，这些事件对CDK7激酶活性和POL II转录的功能影响及其对致癌表型的贡献尚未确定。CDK7和CDK9的活性通常是通过各种机制共同作用的，以在不同的肿瘤环境中异常增强POL II的转录起始和延伸（图3A）。值得注意的是，虽然CDK7和CDK9在转录周期的早期阶段对POL II的进展是必不可少的，但也显示出了特异性：在肿瘤细胞中致癌转录因子和融合嵌合体控制的基因以及与肿瘤特异性超级增强子元件相关的基因对CDK7或CDK9的抑制敏感。CDK9-细胞周期蛋白T1复合体P-TEFb的异常募集常常通过与转录激活因子的相互作用而发生。在肿瘤中，依赖于CDK9的转录周期失调通常是由于P-TEFb对致癌转录因子MYC61的靶基因的招募增加而引起的（图3A)。这是通过MYC和P-TEFb之间的物理相互作用来促进的，其中MYC直接招募P-TEFb到转录起始部位近端区域以促进POL II从停顿到延长的转变。依赖于MYC的一系列转录辅助激活因子和染色质重塑因子对其靶基因的招募也间接控制P-TEFb的募集，以促进这些位点上POL II停顿的释放。MYC是所有人类肿瘤中最常见的扩增基因之一，通过一系列遗传和表观遗传机制发生使其基因的表达量升高。MYC表达上调通过多种机制发生，包括：①染色体易位将MYC编码区置于非MYC超增强子元件（例如Burkitt淋巴瘤中的免疫球蛋白重链（IGH）增强子区域）下游；②反复发生扩增事件和MYC相关增强子区域的高乙酰化；③EB病毒衍生增强子RNAS75激活MYC转录。MYC占据了大多数开放启动子和活跃转录基因，MYC表达水平升高的肿瘤表现出整体转录放大，这与MYC结合增加、P-TEFb募集和Pol II的释放有关，从而导致全基因组转录延长的激活。所有MYC靶基因的转录循环是否作为MYC扩增的CON序列受到同等程度的失调尚有争议。MYC驱动的肿瘤转录失调可能有新的转录周期的产生。CDK9活性可以选择性地被扩增，这作为MLL基因（MLL1）的染色体易位事件的结果（图3A）。MLL1重排通常导致与含P-TEFb的SEC成员的融合嵌合体，包括AF4、AF9、ENL和AF10。MLL1重排在婴幼儿血液系统恶性肿瘤中很常见，并与5-10%的成人髓系白血病有关。MLL1融合嵌合体包含MLL1的染色质靶向N末端结构域，推动P-TEFb增强招募到调节造血干细胞识别和自我更新的MLL1靶基因，例如HOXA基因簇（图3A）。因此，MLL1重排的恶性肿瘤表现出明显的CDK9依赖的基因表达程序，具有造血祖细胞的特征。MLL1融合嵌合体也能够通过促进染色质修饰因子，如DOT1L组蛋白甲基转移酶和BET溴域蛋白（bromodomain）BRD4的招募，促进MLL1靶基因的转录。虽然MLL1融合嵌合体驱动的转录周期主要由MLL1结构域的靶基因识别所定义，但这些恶性肿瘤可以精确地依赖于编码肿瘤细胞生长和生存关键调节因子的基因的持续表达，包括MYC、BCL2、MCL1和CDK6。在髓系和淋巴系恶性肿瘤中都报告了MYC基因上SEC和P-TEFb的高结合。这说明促进生长、存活基因之间的转录循环可能因影响P-TEFb招募的基因组改变而失控。在许多肿瘤中都会出现体细胞的CDK12失活突变，包括高级别浆液性卵巢癌、转移性前列腺癌、三阴乳腺癌、胃癌、肠癌和肺癌，因此CDK12被认为是肿瘤抑制基因。CDK12突变包括阻止活性CDK12-CCNK复合体形成的错义突变，以及导致截短和框架外CDK12蛋白的染色体重排、无义和Indel突变。尽管CDK12在调节所有转录周期中的延伸检查点方面发挥作用，但在肿瘤中CDK12活性或表达受损可导致高度选择性的转录异常。CDK12基因失活突变的肿瘤通常表现为“BRCAness”表型，即DNA损伤反应（DDR）和同源重组基因表达减少，以及以全基因组焦点串联复制为特征的基因组不稳定。有趣的是，在CDK12突变的肿瘤细胞中，长基因的转录周期被不成比例地失调（图3B）。有大量的Pol II复合体在这些长基因体中活跃地伸长，从而使长基因的转录周期更容易受到CDK12活性的干扰（图3B）。这与紫外线对长基因诱导的DNA损伤的脆弱性相当，紫外线扰乱了Pol II的加工性和延伸性，导致剩余的Pol II中短转录本的表达增加。CDK12和CDK13之间存在广泛的冗余，用于全局控制Pol II的伸长，这可能解释了为什么CDK12失活突变不会导致跨转录周期的整体伸长缺陷。肿瘤相关的CDK13突变导致转录失调的证据有限。但是有研究报道，CDK13基因被RNA脱氨酶ADAR1过度编辑，导致富含脯氨酸的N末端基序（PRM）附近的氨基酸替换（K96R，Q103R），与肝癌的预后不良相关。CDK13失活突变已在少数人类黑色素瘤样本中被报道，斑马鱼模型中的遗传方法将这些突变与抑制过早转录终止联系在了一起。与肿瘤相关的基因组改变可以间接地使转录周期失调。这些突变总是驱动高度特异基因集转录周期的下游失调，例如控制造血分化和/或增殖的基因（图4）。这种特异性是如何实现的呢？可能有一系列机制起作用。例如：不同蛋白激酶对底物的磷酸化可能定义哪些基因将在响应激活的致癌信号通路时表现出变化（图4）。此外，不同转录因子和表观遗传修饰物的催化功能、蛋白质相互作用结构域和DNA结合域，与它们的表达水平无关，这将影响特定基因的表达（图4）。在不同肿瘤类型中表现出转录周期改变的基因的身份也可能由肿瘤特异性超级增强子的存在来确定。这些顺式元件可以放大核心转录机制的招募，从而促进致癌表型关键基因的表达。这些间接改变在多水平上作用于致癌信号通路下游以及表观遗传调节因子的上游，指导着调节Pol II招募、转录启动，并抑制染色质状态（图2C）。致癌转录因子也可以影响其他转录因子的功能和/或表达，从而扩大在某些恶性肿瘤中不受调控的转录周期谱系。例如，造血转录因子TAL1和RUNX1的活性通常与T细胞和髓系恶性肿瘤的发生和发展有关。这些转录因子作为核心调控网络的一部分，调节严格控制造血分化的基因表达程序。由于染色体重排或体细胞突变，TAL1和RUNX1的表达和/或活性增加，启动了白血病发生中的事件，并从根本上增强了TAL1和RUNX1靶基因的转录周期。T(8；21)染色体重排白血病中的RUNX1-ETO融合嵌合体和急性早幼粒细胞白血病中的PML-RARα融合嵌合体促进造血系基因转录循环的转录因子PU.1、GATA1、GATA2和C/EBPα的异常表达。此外，RUNX1-ETO或PML-RARα招募表观遗传修饰因子，其促进转录激活（p300，PrMT1）和/或抑制（NCoR，SMRT，组蛋白脱乙酰酶）。因此，在特定的恶性肿瘤中，单一的基因变化就可以释放一连串的转录事件，影响不同的但有选择性的转录周期，导致细胞转化。图 4三、其进愈难，而其见愈奇。一直以来，有关肿瘤预防与治疗的研究进展比较缓慢。分子肿瘤学家们一直致力于新的肿瘤药物研发。而如何能够有效靶向转录周期来治疗肿瘤呢？tCDKs小分子抑制剂是这条探索大道上的一种尝试。在单个细胞中有许多活跃的转录周期，每个转录周期都容易受到干扰，恶性表型通常依赖于关键位点的选择性转录失调。重要的是，这种复杂性与盲目地将转录作为抗癌策略的方法相矛盾。因此我们需要仔细考虑如何才能最好地应用靶向转录周期的药物。有效的“转录靶向”需要详细了解单个肿瘤细胞内和不同肿瘤内细胞群体之间转录周期的差异。研究者们利用许多天然化合物靶向转录循环治疗肿瘤。虽然有些药物已经用于临床治疗，但它们作为化疗药物的有效性与其干扰Pol II依赖的转录周期的能力之间的关系尚不清楚。早期的tCDK抑制剂，如SNS-032，DRB，Roscovitine和Huang opiridol等化合物，在探索各种临床前肿瘤模型中的tCDK功能发挥了重要作用。然而这些药物被推广到临床应用时，我们发现它们的治疗窗口其实很窄。随着遗传学方法的进步，tCDKs的小分子抑制剂可以通过去磷酸化Pol II及其相关因子来直接抑制转录周期，阻止转录周期进程和基因转录。tCDK抑制剂可以直接调节致癌转录因子的活性，从而选择性地干扰细胞转录周期。接下来我们将讨论tCDK抑制剂的临床前研究进展。【CDK8和CDK19抑制剂】CDK8可以作为癌基因和肿瘤抑制因子发挥作用，CDK8和CDK19抑制剂用于治疗肿瘤具有高度的上下依赖性。与CDK8和/或CDK19作为Pol II转录基因中介体复合体一部分的分子作用一致，靶向CDK8和/或CDK19会导致中介体控制的转录过程的中断。在AML细胞系中，用皮质抑素A抑制CDK8和CDK19增加了编码IRF1和IRF8等肿瘤抑制基因的超级增强子相关基因的表达（图5A）。在人类结直肠癌异种移植模型中也发现了类似的结果，在该模型中，CDK8和CDK19抑制剂CCT251545和CCT251921导致MED1标记的超级增强子相关基因的抑制。图 5【CDK7抑制剂】基因对CDK7激酶活性的选择性依赖对CDK7抑制剂在肿瘤中的治疗效果至关重要。可能是CDK7在肿瘤特异性超增强元件上的占有率和活性增加（图5A）。CDK7抑制剂具有程序特异性效应，例如干扰乳腺癌中ER依赖的癌基因转录因子的活性。旨在降低雌激素水平或拮抗ER活性的激素疗法已成为ER阳性乳腺癌的一线疗法。在人类乳腺癌异种移植模型中，CDK7抑制剂SY-5609和XL-102与基于激素的一线治疗方案有协同作用，支持将这种组合用于ER阳性乳腺癌（图5B）。ICEC0942、SY-5609和XL-102已经进入晚期实体肿瘤的I-II期临床试验，包括与FULVESTRANT联合用于乳腺癌患者。CDK2、CDK4和CDK6-视网膜母细胞瘤（RB）轴调节E2F活性，E2F活性通过RB和/或CDK抑制剂（如CDKN2A）的缺失而失调。由于CDK2、CDK4和CDK6减弱RB对E2F的抑制作用，抑制CDK1、CDK2、CDK4和CDK6的上游激活剂CDK7就会抑制E2F活性。用共价剂YKL-5-124选择性抑制CDK7，能够降低CDK2的磷酸化以及细胞周期相关和E2F相关基因在慢性粒细胞白血病和小细胞肺癌中的表达。【tCDK9抑制剂】CDK9抑制剂非常适合治疗因MYC扩增或MLL1重排而导致转录失调的肿瘤。CDK9抑制剂KB-0742已经进入晚期实体癌和非霍奇金淋巴瘤的临床试验。【CDK12和CDK13抑制剂】与THZ1联合抑制CDK7、CDK12和CDK13类似，用共价抑制剂THZ531选择性地抑制CDK12和CDK13会降低T-ALL178中超级增强子基因的表达（图5A）。与THZ1不同的是，THZ1降低了Pol II CTD的Ser2、Ser5和Ser7残基的磷酸化，导致Ser2磷酸化的选择性丧失和Pol II延伸的整体损害，以及超级增强子调控的谱系转录因子RUNX1、TAL1和MYB的表达减少，最终导致Jurkat T-ALL细胞在体外的存活率下降。双等位CDK12失活突变可以增加融合诱导的嵌合开放阅读框产生新抗原，促进肿瘤的免疫原性，其特征是T细胞渗透和抗PD1免疫检查点抑制剂治疗的阳性反应，这增加了CDK12和CDK13抑制剂用于临床治疗以提高肿瘤免疫原性的可能性。【选择性“CTD激酶”的抑制剂】通过抑制其他Pol II CTD残基的磷酸化来直接调节Pol II活性的蛋白激酶，可能是针对肿瘤异常转录的另一种途径。激酶的小分子抑制剂，如PAN-PLK抑制剂和GSK3β抑制剂，可能通过靶向调控失调的转录循环而发挥抗肿瘤作用。四、且听风吟，静待花开。目前广泛应用的大部分抗癌药物都是1975年以前开发的，医疗需求和临床转化之间的不平衡激发着无数肿瘤研究者探索新药的热情。作者Ricky Johnstone教授十分看好靶向转录调控联合其他药物用于肿瘤的治疗，这也许是未来的趋势。在肿瘤细胞中失去基因表达的正常转录控制可能是由遗传和表观遗传异常所介导，这些异常扰乱了在单个细胞内和不同细胞群体同时运行的众多转录周期。靶向转录周期的治疗利用了肿瘤的转录成瘾。靶向转录周期的治疗旨在破坏癌基因驱动的转录网络，使基因表达重新正常化。但是考虑到这些药物毒副作用，我们还需要探索一系列额外或替代的治疗途径来靶向肿瘤中的转录失调。近年来靶向转录失调的药物不断壮大，但其中大多数靶向的是药物tCDK和含有溴域的蛋白质的一小部分。因此我们还需要探索其他治疗方式（单一药物或与现有治疗相结合）。使用小分子激动剂或抑制剂对转录磷酸酶活性的治疗调节可能在转录成瘾相关肿瘤中是有效的。通过共靶向不同的tCDK，转录周期调节因子的双重靶向可以通过调节细胞凋亡或其他重要的功能途径，避免对单一药物产生耐药。联合治疗还可以使化合物在比单一药物更低的浓度下使用，从而减轻毒性。联合疗法也有望克服单一疗法的疗效限制。除了CDK12抑制剂和PARP抑制剂的联合治疗外，tCDK抑制剂与传统和新型抗癌疗法的联合治疗已经在临床前进行了探索。CDK9抑制剂已被证明能够使血液肿瘤细胞对BH3模拟物敏感、以及髓母细胞瘤细胞系对顺铂和BRD4抑制敏感。以CDK9和其他非tCDK激酶为靶点的广泛激酶抑制剂也是临床研究的热点：CDK9和Lyn/FYN抑制剂TG02的组合目前正处于针对间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤患者的I期试验。全基因组CRISPR/CAS9筛查方法和高通量药物筛查可用于确定肿瘤特有的脆弱性和相互依赖关系，这可用于新的联合治疗方法。另一种更有选择性地干扰肿瘤相关转录和限制药物毒性的方法是破坏由tCDK组成的致癌复合体。这些方法旨在选择性地阻断致癌转录调节器之间的相互作用，从而防止一般转录机制的招募。最近，使用靶向抑制剂（SR-0813)或化学降解剂(SR-1114)破坏ENL YEATS结构域也被强调为阻断MLL驱动的转录的机制，在临床前MLL-AML模型中，ENL YEATS选择性抑制剂XL-13M与BET和DOT1L抑制剂有协同作用。这些新的靶向策略是对现有方法的补充，这些方法可以选择性地取代转录调控因子并防止Pol II的招募，或者选择性地靶向关键功能结构域。这些治疗方式允许转录过程的单独调节，而不影响目标蛋白的总细胞活性。通过这种方式，能够有效降低转录干扰的毒性。在细胞中数千个转录循环可能不是简单地以完全独立的方式起作用，而是通过染色质结构或无膜相分离隔室而连接在一起。因此，致癌转录循环的靶向治疗可能同时影响多个循环，这一点可以通过靶向形成相凝聚物或开发优先分配为核凝聚物的小分子抑制剂而加以利用。基因组元件产生依赖关系形成对tCDK的转录反应，但转录后调控机制，如RNA剪接、加工、输出等可能发挥同样重要的作用，并决定着临床治疗结果。mRNA衰退可能使特定的转录本易于受到转录扰动的影响。因此共转录过程可能与直接干扰POL II转录周期的药物一起作为靶点，并可能在抗肿瘤方面产生令人意想不到的治疗效果。共转录事件与POL II转录周期的调节是相互作用的。因此，选择性靶向剪接体或不同的共转录复合体可能提供了另一种不依赖于直接抑制tCDK的方法来干扰转录周期。总结以转录周期为靶点在肿瘤学中作为一种治疗手段具有很大的前景。因此，我们必须进一步了解控制转录周期的分子机制，并确定关键原则，即一个细胞中多个转录周期的单独属性如何与共转录过程一起塑造细胞对扰动发生反应。利用新的技术（如单细胞测序、单分子成像和CRISPR-Cas9基因组编辑等）将加深我们对转录周期调控的理解，使合理设计治疗肿瘤的策略具有重大临床意义。文章信息源于公众号抗体圈，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读