CD28 x CD3 x IL-8

点击蓝字 关注我们 传播科学知识 促进同行交流 推动产业发展 服务国家战略  推荐阅读 这项研究开发了一种新型工程化细胞外囊泡（EV）平台，用于治疗炎症性肠病（IBD）。其核心创新在于双靶向策略：EVs表面表达PD-L1以激活PD-1免疫检查点，抑制过度活跃的T细胞信号传导；同时，囊泡内封装的miR-27a-3p通过靶向抑制线粒体蛋白PHB1，重塑T细胞代谢，减少致病性Th17细胞并促进调节性T细胞（Treg）分化。该方法突破了传统免疫抑制疗法的局限，展示了良好的靶向性和安全性，不仅在动物模型和人源类器官中有效缓解了肠道炎症、保护了上皮屏障，还通过转录组分析揭示了具体的分子机制。这项工作为T细胞驱动的炎症性疾病提供了精准的细胞自由疗法新范式。科学背景 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）是一组以慢性、复发性肠道炎症为特征的异质性疾病，主要包括克罗恩病（Crohn's Disease, CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）。这两种疾病尽管在临床表现和病变部位上存在差异，但其共同的核心病理特征在于肠道免疫系统的持续失调，导致对肠道菌群和自身抗原的异常免疫反应。CD通常表现为全胃肠道的透壁性炎症，常涉及回肠末端和结肠，而UC则局限于结肠黏膜层，从直肠向近端连续蔓延。全球范围内，IBD的发病率呈上升趋势，尤其在工业化国家，这与环境因素、饮食习惯和肠道微生物组的改变密切相关。据估计，全球IBD患者人数已超过700万，且年轻人群受影响最为显著，不仅导致严重的健康负担，还引发经济和社会问题，如频繁住院和生活质量下降。 从免疫学角度看，IBD的发病机制涉及复杂的先天性和适应性免疫反应失衡。在正常生理状态下，肠道黏膜屏障通过上皮细胞紧密连接、黏液层和抗菌肽维持耐受状态，防止有害物质和病原体入侵。然而，在IBD患者中，这种屏障功能受损，导致细菌产物如脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）易位，激活免疫细胞。CD的免疫景观以Th1和Th17细胞主导的促炎反应为特征，通过白细胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）和IL-23轴驱动，产生干扰素-γ（IFN-γ）和IL-17A等细胞因子，进而破坏上皮完整性并招募中性粒细胞。相比之下，UC则表现出更多类型2免疫和上下文依赖的Th17再激活，涉及IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子，导致嗜酸性粒细胞浸润和黏液分泌异常。尽管CD和UC在免疫表型上有所不同，但两者均存在CD4⁺ T细胞的核心失调，其中过量的肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）、IFN-γ和IL-17A破坏上皮紧密连接，同时调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）的FOXP3⁺亚群功能不足，无法有效抑制炎症。这些发现强调了IBD并非单纯的感染性疾病，而是免疫耐受崩溃的结果，提示治疗策略需从广谱免疫抑制转向靶向特定通路以恢复免疫平衡。 当前IBD的治疗格局主要包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂，以及生物制剂和小分子靶向药。生物制剂如抗TNF-α抗体（英夫利昔单抗、阿达木单抗）、抗IL-12/23抗体（乌司奴单抗）和抗整合素抗体（维多珠单抗）显著改善了患者预后，但仍有约30-50%的患者出现原发性无应答或继发性失效。这些药物主要通过阻断关键细胞因子或淋巴细胞迁移来抑制炎症，却往往伴随全身免疫抑制的风险，如感染和恶性肿瘤发生率增加。例如，抗TNF治疗虽能快速缓解症状，但长期使用可能导致机会性感染复发。小分子药物如JAK抑制剂（托法替布）进一步靶向细胞内信号通路，提供口服便利，但其疗效同样受限于患者异质性和不良事件。近年来，粪菌移植（Fecal Microbiota Transplantation, FMT）和饮食干预作为辅助疗法显示出潜力，但结果不一致，难以标准化。这些局限性突显了IBD治疗的“一刀切”模式已达到瓶颈，亟需精准医疗策略，能够根据患者的遗传、免疫和微生物特征进行个体化干预，从而在不损害系统免疫监视的前提下重塑肠道微环境。 在这一背景下，免疫检查点（Immune Checkpoints）作为外周耐受的关键调控者，逐渐成为IBD研究的焦点。程序性死亡受体-1（Programmed Death-1, PD-1）及其配体PD-L1（Programmed Death-Ligand 1）轴通过衰减T细胞受体信号传导维持耐受，具体机制涉及SHP2磷酸酶介导的CD3ζ、ZAP70和CD28去磷酸化，导致PI3K、AKT和ERK激活减少及细胞因子释放降低。临床证据显示，PD-1/PD-L1阻断在癌症免疫治疗中可诱发结肠炎，类似于IBD的病理，这反过来证实了该轴在肠道免疫稳态中的保护作用。在肠道中，PD-L1由上皮细胞和髓系细胞表达，促进黏膜耐受，其表达水平与疾病活动度相关。在UC患者中，黏膜PD-L1水平升高，而在CD中表达模式因解剖区室而异，提示恢复局部检查点约束可能重新平衡黏膜免疫。然而，当前的免疫检查点调节主要依赖系统性抗体，难以实现肠道局部递送，且可能引发全身副作用。因此，开发靶向肠道微环境的递送系统成为关键，例如工程化细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs），这些天然纳米颗粒可携带蛋白质和核酸，模拟细胞间通讯。 细胞外囊泡是细胞分泌的脂质双层囊泡，直径从30纳米到1微米不等，包括外泌体（Exosomes）和微泡（Microvesicles）。MSC来源的EVs保留了其亲本细胞的免疫调节特性，如抑制T细胞活化、促进Treg分化和分泌抗炎因子，同时具有更高的安全性和可扩展性，避免了MSC移植的致瘤风险。Wharton's Jelly来源的间充质干细胞（Wharton’s Jelly-derived Mesenchymal Stem Cells, WJ-MSCs）因其易于获取、低免疫原性和高增殖能力而备受青睐。这些细胞表达趋化因子受体如CCR2和CXCR4，有助于靶向炎症部位的黏膜组织。与合成纳米颗粒不同，MSC EVs不仅是载体，还能通过表面蛋白和内含物直接参与生物过程。例如，EVs可表达PD-L1以调控PD-1信号，同时携带微小RNA（MicroRNAs, miRNAs）以调节基因表达。然而，天然EVs的免疫调节效力有限，难以应对IBD的复杂病理，因此工程化改造成为趋势，如通过过表达特定蛋白或加载RNA来增强功能。 除了检查点调节，免疫代谢在IBD中的作用日益凸显，特别是线粒体功能障碍与T细胞命运的联系。Prohibitin 1（PHB1）是一种线粒体支架蛋白，在维持线粒体完整性和肠道屏障功能中发挥关键作用。在肠道上皮细胞和Paneth细胞中，PHB1保护线粒体免受氧化应激损伤，支持细胞存活。在CD4⁺ T细胞中，PHB1维持Th17细胞的生物能量程序，促进其糖酵解和氧化磷酸化，从而维持促炎表型。PHB1表达失调会导致线粒体质量控制异常，放大炎症反应。miRNAs作为短链非编码RNA，精细调控这些免疫代谢途径。miR-17~92家族通过靶向PI3K/AKT/mTOR信号轴，控制Th17/Treg平衡，其过表达可促进效应T细胞分化，而抑制则增强Treg功能。miR-27家族则影响线粒体质量控制和PHB1表达，例如miR-27a-3p可下调PHB1，潜在破坏Th17的能量供应。临床进展如obefazimod（一种miR-124诱导剂）在IBD试验中显示出疗效，进一步支持miRNA-based免疫调节的潜力。然而，miR-27a-3p在人CD4⁺ T细胞中的具体作用及其重编程效应表型的能力仍不明朗，这构成了一个重要的知识空白。 尽管IBD研究取得了显著进步，但仍面临多重挑战。首先，动物模型（如DSS诱导的结肠炎）虽能模拟人类疾病，但无法完全捕捉IBD的慢性复发性和遗传异质性，导致转化失败率高。其次，现有生物制剂的精准靶向性不足，常需联合用药，但缺乏预测生物标志物来指导选择。第三，免疫检查点和代谢通路的交互复杂，单一干预可能引发补偿性失调。例如，抑制Th17虽可缓解炎症，却可能削弱抗真菌免疫，增加感染风险。此外，工程化EVs的标准化难题——如产量、纯度和体内稳定性——限制了其临床应用。更重要的是，IBD的病因涉及遗传（如NOD2突变）、环境（如抗生素暴露）和微生物（如菌群失调）的多因素交互，当前疗法多针对下游效应，而未触及上游根源。这些空白凸显了开发多模态疗法的必要性，该疗法需同时调节检查点和代谢，以实现持久的免疫重编程。 在这一逻辑链条下，一个有趣的科学问题浮现：如何通过同步调控PD-1/PD-L1轴和线粒体代谢来重编程肠道CD4⁺ T细胞，从而恢复Th17/Treg平衡？具体而言，工程化EVs能否同时递送PD-L1蛋白以抑制T细胞受体信号，并加载miR-27a-3p以靶向PHB1，破坏促炎Th17的代谢依赖？这一问题的提出源于对IBD病理的深入理解：过度活化的效应T细胞不仅是炎症的驱动者，也是耐受崩溃的受害者。通过EVs实现局部递送，可避免系统性副作用，同时利用其天然生物相容性增强靶向性。初步证据显示，miR-27a-3p可能通过下调PHB1抑制PI3K/AKT通路，类似于miR-17~92的拮抗作用，从而促进Treg分化。在体外实验中，这种双功能平台已在人PBMC来源的T细胞中显示出抑制增殖和重塑亚群的潜力，例如减少IFN-γ⁺ Th1和IL-17A⁺ Th17的比例，同时扩增CD25⁺ FOXP3⁺ Tregs。单细胞RNA测序进一步揭示，这类干预可改变记忆T细胞谱，降低效应记忆（TEM）和终末效应（TEFF）亚群，转向中央记忆（TCM）和naive表型，提示潜在的长期耐受诱导。 这项研究的必要性在于其直接针对IBD治疗的痛点，提供了一种创新的精准策略。首先，它填补了miR-27a-3p在人T细胞中的功能空白，填补了免疫检查点与代谢交叉领域的知识断层。其次，工程化EVs平台具有多重优势：安全性高（避免病毒载体风险）、可扩展性强（MSC来源丰富），并能实现肠道局部作用，减少全身暴露。更重要的是，在临床前模型（如DSS诱导小鼠结肠炎）中，此类EVs已显示出改善体重减轻、疾病活动指数（DAI）、结肠缩短和组织学评分的疗效，同时降低髓过氧化物酶（MPO）活性，表明中性粒细胞浸润减少。这些结果不仅验证了可行性，还突显了其在难治性IBD中的潜力——当前约50%患者对现有疗法无效，该策略有望转化为二线或个性化治疗，降低手术需求和医疗成本。此外，这项工作对更广泛的免疫疾病（如自身免疫病和癌症）具有启示意义，推动EVs从实验室向临床的转化。 进一步审视，该研究的开展正值IBD领域向“免疫重编程”转型的关键时刻。传统疗法虽缓解症状，却往往维持慢性炎症状态，而新兴的细胞疗法（如CAR-T用于自身免疫）和基因编辑（如CRISPR）虽前景广阔，但安全性和成本仍是障碍。相比之下，双功能EVs提供了一种平衡创新与实用的路径，能同时利用PD-L1的检查点抑制和miR-27a-3p的代谢调控，实现协同效应。例如，PD-L1可快速抑制T细胞活化，而miR-27a-3p则从线粒体层面重塑细胞命运，防止炎症反弹。这种多靶点方法可能克服单一干预的局限，如抗TNF的继发失效或JAK抑制剂的感染风险。从转化角度看，该研究可为临床试验设计提供依据，例如结合患者分层（基于PD-L1表达或miRNA谱），实现个性化医疗。 然而，推进这项研究并非无挑战。EVs的体内药代动力学需优化，以确保其在肠道酸性和酶环境中的稳定性。miR-27a-3p的脱靶效应可能影响非T细胞，如上皮细胞，导致意外毒性，需要精细的剂量探索。此外，IBD的微生物-免疫轴复杂，EVs可能需与菌群调节联合使用，以增强疗效。尽管如此，这些挑战也凸显了研究的价值：通过系统评估，可开发出更安全的递送策略，如表面修饰以增强肠道滞留。同时，单细胞组学和类器官模型的应用将进一步阐明机制，验证EVs对人类组织的适用性。 总之，这项研究不仅是对IBD免疫病理的深入剖析，更是对精准疗法的创新探索。通过同步靶向PD-1/PD-L1和PHB1-miR-27轴，它有望重塑肠道免疫稳态，为数百万患者带来希望。在当前生物制剂时代渐趋饱和的背景下，这种工程化EVs平台代表了下一代治疗范式，不仅填补现有空白，还为更广泛的免疫调节应用铺平道路。其成功将证明，科学的辩证进步——融合检查点抑制与代谢干预——是攻克复杂炎症疾病的必由之路。（约1750字）实验方法 本研究采用以下关键实验方法，优先详细描述类器官相关技术。1. 类器官分离培养与检测技术 研究中构建了源自人结肠黏膜活检组织的类器官模型，用于模拟炎症性肠病（IBD）的病理微环境。该技术包括分离、培养和检测三个核心阶段。 分离过程： - 组织获取：从溃疡性结肠炎（UC）患者（n=3）的升结肠黏膜钳取活检样本，使用2.8 mm标准活检钳采集。目的是确保获得足够数量的隐窝上皮细胞，同时最小化对患者的侵入性损伤。 - 组织清洗与解离：样本在4°C下用含抗生素的PBS（磷酸盐缓冲液）清洗3-5次，去除血液和黏液。随后，使用胶原酶II型（浓度1 mg/mL，来源于Clostridium histolyticum）在37°C下消化20-30分钟。关键试剂解释：胶原酶II型特异性降解胶原蛋白基质，释放隐窝结构，避免使用胰蛋白酶以减少细胞损伤。 - 细胞收集：通过70 μm细胞筛网过滤，收集隐窝簇。目的是分离纯净的上皮干细胞群，去除间质细胞和碎片，确保类器官起始纯度>90%。 培养过程： - 基质接种：隐窝细胞与Matrigel（小鼠基底膜基质胶，浓度8-10 mg/mL）混合，每孔接种500-1000个细胞，在37°C固化30分钟。目的是模拟体内三维微环境，促进类器官自组装成囊状结构。 - 培养基配方：使用ENR基础培养基，添加表皮生长因子（EGF, 50 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）和R-spondin 1（500 ng/mL），补充B27、N-乙酰半胱氨酸（NAC, 1 mM）和青霉素-链霉素（1%）。培养基每2-3天更换一次。关键步骤解释：这些因子激活Wnt和Notch信号通路，维持干细胞自我更新和分化平衡；NAC抗氧化以提高存活率。 - 传代：当类器官直径达200-500 μm时，使用TrypLE Express酶消化5-10分钟，重新接种。目的是扩增模型并防止结构退化。 检测过程： - 形态学监测：使用倒置相差显微镜每日观察类器官大小、形态（囊状或芽状），目的是确认生长动态和分化状态。 - 免疫荧光染色：固定类器官（4%多聚甲醛，15分钟），通透（0.5% Triton X-100），一抗孵育（如E-cadherin 1:200，Ki-67 1:100），目的是评估上皮标志物表达和增殖活性，避免过度通透导致背景噪声。 - 功能评估：通过qPCR检测基因（如Lgr5、Muc2）和ELISA测量分泌因子（如IL-6、IL-8），目的是验证类器官的炎症响应和屏障功能。 - 特别注意：整个过程需严格无菌操作，使用生物安全柜；类器官批次间变异通过标准化起始细胞数（500个/孔）和培养基批次控制，以确保实验可重复性。2. 人原代外周血单核细胞（PBMC）分离与培养 从健康供体和IBD患者外周血中分离PBMC，用于免疫功能评估。方法：使用Ficoll密度梯度离心（1.077 g/mL，400 g，20分钟），收集界面层细胞。目的是获得高纯度单核细胞群，用于后续共培养或刺激实验。关键试剂：Ficoll-Paque PLUS，确保密度分离准确。细胞在RPMI-1640培养基中（含10% FBS），刺激后使用流式细胞术检测表型（CD4+、CD8+）。特别注意：避免血液样本超过6小时处理，以防细胞活力下降。3. 动物模型实验 采用小鼠模型验证肠道炎症响应，所有协议经首尔国立大学IACUC批准（No. SNU-230918-1-2）。关键步骤：使用DSS（葡聚糖硫酸钠，2-3%饮水诱导结肠炎），监测体重和疾病活动指数（DAI）。目的是评估类器官在体内的移植效果或药物响应。特别注意：DSS浓度需精确控制，避免过度毒性；动物福利通过每日观察确保。4. 伦理批准与样本来源 所有人类样本（健康供体血液、患者PBMC、UC活检）均获得相应IRB批准（Seoul National University IRB No. E2309/002-00; SNUH IRB No. 2012-115-1183; NYU Grossman IRB No. S12-01137），并获得书面知情同意。目的是确保样本来源合规，优先使用临床剩余样本以减少额外采集。科普知识展开：类器官技术原理 类器官是一种三维细胞培养系统，源自成体干细胞或诱导多能干细胞，能自组装成类似真实器官的微型结构（如肠道类器官模拟隐窝和绒毛）。其核心原理是利用基质胶（如Matrigel）提供细胞外基质支架，结合特定生长因子（EGF、R-spondin）激活信号通路（如Wnt/β-catenin），驱动干细胞增殖和分化成多种细胞类型（上皮、内分泌等）。相比传统二维培养，类器官更接近体内生理环境，可模拟疾病（如IBD的炎症反应）和测试药物，但挑战在于批次变异和缺乏血管/免疫成分。未来，通过微流控芯片集成可提升其动态功能。研究结果研究结果的系统呈现与深入讨论主要发现的逻辑梳理 本研究聚焦于通过基因工程和微环境调控增强人源脐带华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）来源的细胞外囊泡（EVs）的免疫调节功能，以治疗炎症性肠病（IBD），特别是溃疡性结肠炎。研究采用多阶段策略，从工程化WJ-MSCs开始，逐步验证EVs的体外和体内效应，并解析其分子机制。以下按实验逻辑顺序系统呈现主要发现。 首先，在细胞工程化阶段，我们通过BMI1过表达结合低氧预处理（Hypoxia）成功构建了BMI1-H-primed WJ-MSCs。RT-PCR和Western blot验证了BMI1的过表达，同时伴随衰老标志物p16INK4a的下调和细胞增殖能力的提升，证实了BMI1的抗衰老作用（补充图1a-c）。低氧诱导的HIF1α稳定进一步强化了预处理效果，且未损害细胞活力或增殖（补充图1d-f）。功能评估显示，BMI1-H-primed WJ-MSCs在体外显著抑制T细胞增殖，与常氧或单一预处理组相比，免疫抑制活性明显增强（补充图1g）。这表明双重调控策略有效提升了MSCs的免疫调节潜力。 其次，我们从这些工程化细胞中分离EVs（命名为BMI1-H-EVs），并通过透射电镜（TEM）和免疫金标记确认其典型杯状形态及CD81表达（补充图2a）。Western blot分析显示，BMI1-H-EVs保留了标准EV标志物（CD9、CD63、CD81），并上调关键免疫调节蛋白，包括TGF-β、IL-10、IDO和COX2（图1b-c及补充图2b-d）。值得注意的是，与293T细胞来源的EVs相比，WJ-MSC-EVs在细胞裂解液和EV组分中均表达更高水平的趋化因子受体CCR2和CXCR4（图1b），这增强了EVs靶向炎症肠道组织的能力，突显WJ-MSCs作为EV生产平台的优越性。纳米颗粒追踪分析（NTA）证实EVs尺寸分布相似，但BMI1-H-EVs产量更高（补充图2e）。 在体内模型中，我们采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型，通过腹腔注射评估BMI1-H-EVs的治疗效果（图1a）。与DSS单独处理或常氧EVs（N-EV）组相比，BMI1-H-EV治疗显著缓解了疾病症状：小鼠体重损失减少、疾病活动指数（DAI）评分降低（图1e-f），结肠缩短明显改善（图1g），组织学分析显示上皮结构保存更完整、隐窝损失和炎症浸润减少（图1h-i）。髓过氧化物酶（MPO）活性测定进一步证实了中性粒细胞积累的减少（图1j）。转录谱分析显示，尽管DSS模型整体T细胞相关变化有限，但BMI1-H-EV处理降低了促炎转录因子Tbx21（Th1标志）和Rorc（Th17标志）的表达，同时上调Foxp3（Treg标志）和Il10（抗炎因子）（补充图3a）。固有层分析表明，尽管总巨噬细胞数量未变，但EVs促进了M2样表型，伴随CD206和ARG1表达升高（补充图3b-e）。这些体内证据一致支持BMI1-H-EVs的抗炎效能。 在体外机制验证中，我们将BMI1-H-EVs与激活的人源外周血单核细胞（PBMCs）共培养，观察到CD4⁺和CD8⁺ T细胞增殖的强有力抑制（图1k及补充图4a-b）。流式细胞术显示，IFN-γ⁺ Th1和IL-17A⁺ Th17细胞频率降低，而CD25⁺ FOXP3⁺ Tregs增加（图1l及补充图4c-d）。此外，EVs重塑了记忆T细胞组成，减少效应记忆（TEM）和终末效应（TEFF）亚群，同时促进初始表型（图1m及补充图4e-f），表明其有效重编程黏膜免疫动态。 为解析分子基础，我们整合小RNA测序和转录组分析，比较BMI1-H-EVs与N-EVs。鉴定出26个显著富集的差异表达miRNA（DE-miRNAs）（图2a-b），并从BMI1-H-primed WJ-MSCs中识别1922个下调转录本，其中128个是18个DE-miRNAs的预测靶基因（图2c）。基因本体（GO）富集分析揭示这些靶基因与T细胞活化和增殖通路密切相关（图2d）。网络建模聚焦“αβ T细胞增殖调控”通路，识别出miR-27a-3p、miR-17-5p、miR-130a-3p和miR-15b-5p作为核心调控miRNA，靶向EBI3和IRF1等免疫调节基因（图2e）。qRT-PCR验证了这些miRNA在BMI1-H-primed WJ-MSCs中的上调（补充图5c）。通过转染合成miRNA模拟物，我们发现miR-27a-3p和miR-17-5p显著抑制激活的CD4⁺和CD8⁺ T细胞增殖（补充图5f）。进一步实验确认，这些miRNA在BMI1-H-EVs中选择性富集（图2f），并将合成miRNA加载到EVs后重现了T细胞抑制效应（图2g-i）。在CD4⁺ T细胞中，miRNA富集EVs下调TBX21和RORC，上调FOXP3和IL10，诱导Treg极化（图2j-k）。在Th1/Th17极化条件下，miR-27a-3p富集EVs强力抑制效应分化并增强Treg诱导（图2l-m）。通过PKH26标记EVs在PBMCs中的摄取（图2n）和RNA聚合酶II抑制剂DRB处理（图2o），证实了miR-27a-3p的EV介导转移。 最后，针对miR-27a-3p的机制，我们使用TargetScan、miRTarBase等工具预测其靶基因，筛选出18个重叠候选（图3a）。其中，PHB1（线粒体伴侣蛋白，调控T细胞活化和线粒体稳态）和GRB2（TCR适配蛋白）脱颖而出（图3b）。qRT-PCR显示miR-27a-3p富集EVs处理的PBMCs中PHB1和GRB2转录本下调（图3c），但Western blot仅一致显示PHB1蛋白表达降低（图3d），暗示PHB1为主要功能靶点。荧光素酶报告基因实验进一步证实，miR-27a-3p直接结合PHB1的3'非翻译区（UTR），显著抑制野生型构建体活性，而突变型无影响（图3e）。功能挽救实验显示，过表达PHB1可逆转miR-27a-3p对T细胞增殖的抑制（图3f）。通路分析提示，PHB1下调影响mTOR信号，导致T细胞代谢重编程（图3g）。这些结果确立了miR-27a-3p-PHB1轴在EV介导免疫调节中的核心作用。关键数据解读及其科学意义 上述发现通过严谨的数据支持，提供了深刻的科学洞见。首先，BMI1-H预处理提升WJ-MSCs的增殖和免疫抑制能力，反映了表观遗传调控（BMI1作为PRC1复合物组分抑制衰老基因）与微环境适应（低氧模拟炎症组织）的协同效应。这不仅验证了MSCs的可塑性，还为细胞疗法提供了增强策略，类似于以往研究中低氧预处理改善MSCs归巢和分泌谱的报道（如Koch et al., 2017）。关键数据如T细胞增殖抑制（补充图1g，抑制率>50%）和体内DAI评分降低（图1f，p<0.001）强调了其转化潜力，可能缓解IBD中T细胞驱动的炎症。 EVs的表征揭示了工程化对分泌组的重塑：上调TGF-β、IL-10、IDO和COX2（图1b-c）表明EVs富含抗炎介质，这与MSC-EVs的经典免疫调节模式一致，但CCR2/CXCR4的高表达（图1b）是独特优势，可能增强EVs向炎症部位的迁移，类似于趋化因子受体在细胞归巢中的作用。这在IBD背景下意义重大，因为肠道炎症部位易受CCR2配体（如CCL2）吸引，潜在提高局部疗效。体内数据中，结肠缩短减少（图1g，长度恢复>20%）和MPO活性下降（图1j，p<0.01）直接量化了炎症缓解，组织学评分（图1h-i）进一步定性证实组织保护。这不仅支持EVs作为无细胞疗法的安全性（避免细胞移植的肿瘤风险），还扩展了其在IBD中的应用，如补充现有抗TNF疗法。 转录和细胞表型分析（图1l-m，补充图3）显示EVs促进M2巨噬细胞和Tregs，同时抑制Th1/Th17，这重塑了促炎/抗炎平衡，符合IBD的免疫失衡病理。效应记忆T细胞减少（图1m）暗示EVs可能诱导免疫耐受，类似于调节性疗法（如抗IL-12/23）。科学上，这为EVs的“重编程”能力提供了证据，挑战了传统认为EVs仅被动传递分子的观点，转向主动调控免疫动态。 miRNA分析是机制核心：26个DE-miRNAs的富集（图2b）和GO通路关联（图2d）将EVs效应与T细胞生物学链接。miR-27a-3p和miR-17-5p的突出作用（图2e, f）通过体外T细胞抑制（图2i，增殖抑制率达60%）和极化转变（图2k-m，Treg增加2-3倍）得到验证。这些数据的科学意义在于揭示了EVs的“货物”决定其功能：miRNA作为短链调控分子，能高效靶向转录网络，提供比蛋白更持久的效应。miR-27a-3p的优越性（图2m）与文献一致（Takahashi et al., 2020），其在肠道炎症中的潜在作用（参考文献25,26）强化了其作为治疗靶点的价值。 最后，miR-27a-3p-PHB1轴的确认（图3）提供了分子级联解释：PHB1作为线粒体稳态的关键调节器，其下调（图3d）可能通过抑制mTOR通路（图3g）导致T细胞能量代谢障碍，从而抑制活化和增殖。荧光素酶实验的直接结合证据（图3e，活性降低>50%）和功能挽救（图3f）使这一机制高度可信。这不仅填补了EV-miRNA-T细胞互作的空白，还为靶向PHB1的药物开发（如小分子抑制剂）提供了新思路，潜在影响更广泛的自身免疫病治疗。 总体而言，这些数据通过多层次验证（细胞、动物、分子），从现象到机制，构建了完整证据链，支持BMI1-H-EVs作为高效、安全的IBD治疗策略，其科学意义在于桥接干细胞生物学、EVs技术和miRNA调控，推动精准免疫疗法发展。结果的局限性和可能的争议点 尽管本研究结果令人鼓舞，但存在若干局限性，需要在解读时谨慎对待。首先，实验模型的局限：体外研究主要依赖人源PBMCs和CD4⁺ T细胞，这忽略了肠道微环境的复杂性，如微生物组、上皮细胞和基质细胞的相互作用。DSS诱导的小鼠模型虽模拟急性结肠炎，但无法完全捕捉人类IBD的慢性、复发性和遗传异质性（如克罗恩病 vs. 结肠炎）。此外，腹腔注射EVs的给药路径虽有效，但肠道局部递送（如口服或直肠）可能更相关，本研究未探索，可能低估临床转化难度。 其次，数据的统计和生物学变异：所有体外实验基于3个独立PBMC供体（n=3），虽使用配对t检验或多因素ANOVA控制变异，但供体间免疫背景差异（如年龄、性别、遗传）可能导致结果泛化受限。动物实验样本量（未明确指定，但图中n通常为5-10）可能不足以检测细微效应，尤其在异质性小鼠群体中。分子机制中，虽然PHB1被确立为主要靶点，但GRB2转录下调未伴随蛋白变化（图3c-d），暗示潜在的转录后补偿或实验灵敏度问题，可能遗漏次要通路。 争议点包括：EVs的纯度和标准化。尽管使用NTA和标志物验证，但EV分离方法（如超速离心）可能混杂非EV颗粒或蛋白聚集体，影响功能解读。一些研究质疑EVs的免疫调节是否依赖于污染物（如可溶性因子），本研究虽通过EV特异性标记控制，但未进行严格的去除实验，可能引发争议。其次，miRNA富集的因果性：合成模拟物重现效应支持其作用，但EVs中其他miRNA或蛋白的贡献未完全排除，可能导致过度归因于miR-27a-3p。此外，PHB1作为靶点的争议：虽有文献支持其在T细胞中的作用，但其广泛表达于多种细胞类型，可能带来脱靶效应，如影响巨噬细胞或肠上皮，潜在副作用未评估。伦理上，使用人类PBMC需确保知情同意，而动物实验的3R原则（替代、减少、优化）虽符合，但长期毒性数据缺失。 最后，临床转化争议：MSC来源的EVs虽避免细胞移植风险，但规模化生产、存储和监管（如FDA对EVs的分类）仍是障碍。结果的抗炎效应对比现有生物制剂（如ustekinumab）时，疗效相当但缺乏头对头试验，可能被质疑为“me-too”而非突破。未来研究方向 展望未来，本研究为工程化EVs疗法开辟了多条路径，需通过更精细的实验推进转化。首先，优化模型系统：引入人源化小鼠模型或类器官共培养，整合肠道微生物组，以模拟更真实的IBD微环境。纵向研究DSS模型的慢性阶段，评估EVs的持久效应和潜在耐药性。其次，临床前毒理学：开展剂量递增试验，监测EVs的全身分布、器官积累和免疫原性，使用荧光标记或PET成像追踪归巢。此外，探索EVs的工程化升级，如表面修饰靶向配体（e.g., 抗整合素抗体）以增强肠道特异性递送。 在机制层面，进一步验证PHB1轴：使用CRISPR敲低或过表达PHB1的T细胞，结合代谢组学（如Seahorse分析线粒体呼吸）阐明下游通路。同时，筛选miRNA组合（如miR-27a-3p + miR-17-5p）以优化协同效应，并评估其在其他自身免疫病（如类风湿关节炎）中的普适性。临床转化方面，启动I期试验测试BMI1-H-EVs在中重度UC患者中的安全性，结合内镜和粪便生物标志物监测疗效。长期方向包括开发“现成”EV产品，通过标准化生产平台降低成本，并探索与现有疗法（如JAK抑制剂）的联合使用，以实现个性化IBD治疗。 总之，本研究不仅确立了BMI1-H-EVs的治疗潜力，还揭示了miR-27a-3p-PHB1轴的核心作用，为未来创新提供了坚实基础，推动从基础免疫学到临床应用的跃进。 （字数：约1450字）图表图注 图 1 用于DSS诱导结肠炎的BMI/缺氧预处理的华通氏胶来源MSC（WJ-MSC）衍生细胞外囊泡（EV）的治疗效果。 a 从BMI1过表达、缺氧预处理的WJ-MSC（BMI1-H-EVs）生成EV的示意图，及其在DSS诱导的结肠炎模型中的给药方案（使用BioRender.com创建）。b 293T、常氧MSC和BMI1-H MSC的细胞裂解物及EV中CXCR4、CCR2、TGF-β和IL-10的免疫印迹。GAPDH和CD63分别作为细胞裂解物和EV的上样对照。c 从常氧处理（N-EVs）、缺氧处理（H-EVs）、BMI1过表达常氧处理（BMI1-N-EVs）和BMI1过表达缺氧处理（BMI1-H-EVs）的WJ-MSC中分离的EV中CD63、TGF-β、IDO和COX2的免疫印迹。Calnexin作为阴性标记。使用ImageJ量化条带强度，并归一化至相应上样对照（细胞：GAPDH；EVs：CD63），显示相对值。d 实验方案概述。使用3% DSS诱导C57BL/6小鼠结肠炎7天，并在第1、3和5天腹腔注射EV。在第10天处死小鼠进行分析。e, f 每日监测体重减轻（e）和疾病活动指数（DAI）（f）以评估临床症状。g 指定组别的代表性结肠照片及结肠长度量化：对照（-）、DSS（+）、DSS + 常氧处理EV（N-EVs）和DSS + BMI1-H-EVs。h, i 结肠切片的苏木精和伊红（H&E）染色（h）及相应的组织学评分（i），评估组织结构、隐窝丢失和炎症浸润。比例尺：100 μm。j 小鼠结肠组织中的髓过氧化物酶（MPO）活性，反映中性粒细胞积累。小鼠数据以均值±标准差（SD）表示；n = 3只/组。k 基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的人PBMC来源T细胞（总T细胞、CD4+和CD8+）增殖实验，经抗CD3/CD28激活（act）并与naive EV（N-EVs）或BMI1-H预处理EV（BMI1-H-EVs）共培养。act.组代表无EV处理的激活PBMC。l EV处理后人CD4+ T细胞亚群的流式细胞术分析，包括IFN-γ+ Th1、IL-17A+ Th17和CD25+FOXP3+调节性T细胞（Tregs）。m 记忆T细胞表型的流式细胞术分析，基于CD45RA和CCR7表达的人CD4+和CD8+群体：初始（TN, CD45RA+CCR7+）、中央记忆（TCM, CD45RA-CCR7+）、效应记忆（TEM, CD45RA-CCR7-）和终末效应（TEFF, CD45RA+CCR7-）亚群。CD63作为EV标记。人数据显示为均值±SD；n = 3名独立供体（生物重复），每个实验进行三次技术重复。时间过程面板使用双向重复测量ANOVA（处理×天数）及Sidak’s多重比较在每个时间点分析；单时间点面板使用三组或以上时采用单向ANOVA及Sidak’s校正。p < 0.05, p < 0.01, **p < 0.001 图 2 PD-L1/miR-27a-3p工程化EV的构建与表征。 a 工程化EV生成示意图：使用慢病毒载体在WJ-MSC中过表达PD-L1，并转染miR-27a-3p模拟物，随后进行缺氧预处理以产生PD-L1/miR-27a-3p EV。b WJ-MSC细胞裂解物和EV中PD-L1蛋白的免疫印迹，比较对照、PD-L1过表达和PD-L1/miR-27a-3p EV组。c 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）量化EV的粒径分布和浓度。d 透射电子显微镜（TEM）图像显示EV的形态。比例尺：100 nm。e EV表面PD-L1表达的流式细胞术分析，使用结合EV的抗PD-L1抗体。f 从EV中提取的总RNA中miR-27a-3p水平的qRT-PCR分析，归一化至U6 snRNA。g EV中PHB1蛋白水平的免疫印迹，显示miR-27a-3p介导的下调。数据以均值±SD表示；n = 3次独立实验。p < 0.05, p < 0.01, **p < 0.001（单向ANOVA与Tukey’s校正）。 图 3 PD-L1/miR-27a-3p EV对人CD4+ T细胞的体外免疫调节作用。 a 激活的CD4+ T细胞与不同EV（N-EVs、PD-L1 EVs、miR-27a-3p EVs或PD-L1/miR-27a-3p EVs）共培养的示意图。b CFSE稀释法评估T细胞增殖，量化增殖指数。c 流式细胞术分析Th1（IFN-γ+）、Th17（IL-17A+）和Treg（FOXP3+CD25+）亚群的比例。d 蛋白质磷酸化分析显示ZAP70、AKT和ERK的磷酸化水平变化，归一化至总蛋白。e qRT-PCR检测PHB1 mRNA水平，归一化至GAPDH。f 线粒体膜电位（MMP）检测，使用JC-1染料，红色荧光表示高MMP，绿色表示低MMP。g 代表性流式图显示PD-1/PD-L1结合阻断实验，验证EV的PD-1依赖性作用。数据以均值±SD表示；n = 3次独立实验（每个供体3个技术重复）。使用单向ANOVA与Dunnett’s校正比较EV组与激活对照组。p < 0.05, p < 0.01, **p < 0.001。 图 4 PD-L1/miR-27a-3p EV在人源化结肠炎模型中的体内靶向性和疗效。 a 人源化小鼠模型建立和EV给药方案示意图：NSG小鼠移植人CD34+造血干细胞和自体外周血单个核细胞（PBMCs），诱导DSS结肠炎后静脉注射EV。b 活体成像显示Cy5.5标记的EV在结肠组织的积累，比较PD-L1/miR-27a-3p EV与对照EV。c 结肠组织切片的免疫荧光染色，显示EV（红色）、CD3+ T细胞（绿色）和DAPI核染色（蓝色）。比例尺：50 μm。d 体重变化曲线和e DAI评分，显示PD-L1/miR-27a-3p EV组的改善。f 结肠长度量化和g H&E染色切片，显示炎症减轻和组织结构恢复。比例尺：200 μm。h 结肠组织中人CD45+细胞的流式分析，量化Th1、Th17和Treg比例。数据以均值±SD表示；n = 5只/组。使用双向重复测量ANOVA（d, e）或单向ANOVA（f, h）进行统计分析。p < 0.05, *p < 0.01。 图 5 单细胞RNA测序揭示PD-L1/miR-27a-3p EV介导的T细胞重编程。 a UMAP图显示从人源化小鼠结肠分离的CD45+免疫细胞聚类，按处理组着色（对照、DSS、DSS + PD-L1/miR-27a-3p EV）。b 热图显示差异表达基因（DEGs），突出炎症（如IFNG、IL17A）和调节（如FOXP3、IL10）标记。c 选定基因（PHB1、PD-1、PD-L1、FOXP3）在T细胞亚群中的表达小提琴图。d 通路富集分析（GSEA）显示EV处理组中“T细胞耗竭”和“线粒体呼吸”通路的下调与上调。e 细胞间通信网络分析，显示PD-1/PD-L1和趋化因子信号的增强。数据基于n = 3只小鼠/组的单细胞数据，使用Wilcoxon秩和检验进行差异表达分析。*p < 0.05。 图 6 PD-L1/miR-27a-3p EV对IBD患者来源类器官的保护作用。 a 从IBD患者活检组织生成结肠类器官的示意图，并与EV共培养。b 明场图像显示类器官形态，比较对照、DSS损伤和EV保护组。比例尺：100 μm。c 活/死细胞染色（Calcein-AM/PI），量化存活率。d 通透性实验（FITC-葡聚糖扩散）评估屏障完整性。e qRT-PCR检测紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）mRNA水平。f 免疫荧光显示ZO-1（绿色）和F-肌动蛋白（红色）的定位。比例尺：50 μm。数据以均值±SD表示；n = 5名患者类器官（每个3个重复）。使用单向ANOVA与Tukey’s校正。p < 0.05, p < 0.01, **p < 0.001。 创新之处 这项研究的创新性主要体现在以下几个方面： 1. 构建了具有双重靶向机制的工程化细胞外囊泡（EV）平台 研究团队突破了传统单一机制的局限，开发了一种同时在表面展示PD-L1并封装miR-27a-3p的工程化EV平台。 * 表面调控（PD-L1）： 通过模拟免疫检查点配体，直接作用于活化T细胞的PD-1受体，利用SHP2介导的去磷酸化作用抑制ZAP70和AKT信号，从而即时下调T细胞受体信号。 * 胞内调控（miR-27a-3p）： 利用微小RNA干扰技术，特异性靶向并抑制线粒体支架蛋白PHB1（Prohibitin 1）。这一机制打破了Th17细胞依赖的生物能量代谢程序，从而在代谢层面重塑T细胞分化平衡。 这种“受体信号阻断+细胞代谢重编程”的协同策略，实现了对炎症性T细胞的深度调控，显著优于单一靶点的干预效果。 2. 揭示了PHB1作为调节Th17/Treg平衡的代谢关键靶点 研究深入探索了线粒体调节蛋白PHB1在辅助性T细胞（Th17）炎症功能中的作用。通过miR-27a-3p抑制PHB1，不仅抑制了Th17细胞的致炎性，还促进了FOXP3⁺调节性T细胞（Treg）的扩增。这一发现不仅验证了代谢重编程在免疫调节中的核心地位，也为治疗Th17驱动的自身免疫疾病提供了新的分子靶点。 3. 利用生物源性优势实现了精准的病灶归巢 与人工合成的纳米载体不同，该研究利用Wharton’s jelly间充质干细胞（WJ-MSC）来源的EVs作为载体。这些EVs保留了亲本细胞固有的趋化特性（如表达CCR2和CXCR4），能够通过化学趋化和PD-1依赖性机制，主动靶向并富集于炎症肠道组织。这种天然的归巢能力显著提高了药物在病灶部位的局部浓度，同时降低了全身性副作用的风险。 4. 创造了“免疫-代谢”双重调节的炎症缓解模型 该研究证明了通过同步干预免疫检查点（PD-1）和线粒体代谢（PHB1），可以在炎症微环境中重建免疫耐受。在人源化小鼠结肠炎模型及患者来源的类器官（Colonoid）实验中，该疗法不仅有效缓解了粘膜炎症，还维持了上皮细胞的活力和屏障完整性。这种兼顾抗炎效果与组织保护的治疗策略，为炎症性肠病（IBD）及其他T细胞驱动的炎症性疾病提供了一种具有临床转化潜力的细胞无依赖性免疫治疗新范式。不足之处研究不足之处与改进建议不足之处 工程化细胞外囊泡的生产规模化与标准化不足研究中采用的BMI1过表达和低氧预处理WJ-MSC衍生EVs（BMI1-H-EVs）在实验室规模下显示出增强的免疫调节特性，但生产过程缺乏详细的标准化参数描述，如EVs的产量、纯度和批次间变异。这可能导致临床转化时的可重复性问题。例如，Fig. 1b-c显示EVs中CXCR4、CCR2和TGF-β的表达水平在不同条件下有差异，但未量化EVs的均一性或纯度（如通过纳米颗粒追踪分析）。在体外实验中，EVs的剂量依赖性效应（如Fig. 1k-m的T细胞抑制）虽被观察，但未讨论生产规模放大时的潜在效率下降或污染物残留风险，这可能限制其在大规模临床应用中的可靠性。 动物模型的转化局限性研究主要依赖DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型（Fig. 1d-i），该模型虽能模拟急性炎症，但未能充分捕捉IBD的慢性复发性和人类免疫环境的复杂性，如Th1/Th17主导的CD与Th2/Th17混合的UC差异（Introduction中提及）。例如，Fig. 1j显示MPO活性下降，提示中性粒细胞浸润减少，但模型未使用人源化小鼠或慢性炎症模型，以验证EVs在持久T细胞重编程（如Fig. 1l的Treg增加）方面的长效性。此外，EVs通过腹腔注射给药（Fig. 1d），这与IBD的局部肠道靶向需求不符，未评估口服或局部递送的可行性，可能导致结果在临床环境中的适用性受限。 机制研究的深度和全面性不足尽管提出双靶向机制（PD-L1抑制PD-1信号 via SHP2-ZAP70/AKT，以及miR-27a-3p抑制PHB1以调控Th17/Treg平衡），但证据主要依赖于体外T细胞共培养（Fig. 1k-l）和免疫印迹（Fig. 1b-c），缺乏直接的分子机制验证。例如，miR-27a-3p对PHB1的抑制未通过敲除或过表达实验确认，且单细胞RNA测序仅报告了炎症和耗竭签名的下调，未深入分析miR-27a-3p在CD4+ T细胞中的特异性靶点（如Introduction所述PHB1在Th17生物能量学中的作用）。此外，EVs在肠道上皮细胞（如colonoids）中的作用（Fig. 1k-m）虽显示维持屏障完整性，但未探讨上皮-免疫细胞交互的信号通路，可能导致机制链条不完整，影响对T细胞重编程的全面理解。 患者来源样本的验证广度有限研究使用IBD患者来源的colonoid cultures（Results部分提及）验证EVs的上皮保护作用，但样本量较小（未明确n值），且仅限于体外培养，缺乏活体组织或不同IBD亚型（如CD vs UC）的比较。例如，Fig. 1k-m显示EVs对人PBMC来源T细胞的抑制效应，但未包括活动期与缓解期患者的样本差异，或对耐药患者的针对性测试。这限制了结果的临床相关性，特别是针对Introduction中提到的30-50%患者无应答问题，无法充分证明EVs在多样化患者群体中的普适性。 长期安全性和免疫原性评估缺失研究聚焦于短期疗效（如Fig. 1e-f的体重和DAI改善），但未系统评估EVs的长期安全性，包括潜在的免疫原性（如抗EV抗体产生）或脱靶效应（如对非T细胞的影响）。在人源化小鼠模型中，EVs的系统性分布和清除动力学未被量化，且缺乏对PD-1阻断潜在风险的讨论（如可能诱发自身免疫，如Introduction所述）。这在临床转化中是关键空白，可能忽略免疫监视失衡的风险。改进建议 优化EVs生产流程以实现标准化和规模化引入质量控制协议，如使用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）量化EVs的粒径分布和形态，并通过蛋白质组学（如质谱分析）评估批次间变异。建议在生产中标准化低氧条件（如固定HIF-1α水平）和BMI1转导效率，目标是实现>95%的EV纯度和可重复的>10^10颗粒/mL产量。通过小试放大实验（如生物反应器培养），验证规模化生产的可行性，并在方法部分报告批次一致性数据。这将提升EVs的临床级生产标准，便于与监管机构（如FDA）对接。 采用多模型验证以增强转化相关性扩展动物研究，包括慢性结肠炎模型（如CD45RB^hi T细胞转移模型）和人源化小鼠（植入人PBMC或肠道类器官），以模拟人类IBD的慢性特征和T细胞亚型差异。评估不同给药途径（如口服EVs包被或直肠灌注）的靶向效率，使用活体成像追踪EVs在肠道的积累（如荧光标记）。同时，进行剂量-效应研究，探索长期随访（>8周）以评估Treg稳定性。这有助于桥接动物数据与人类临床试验，确保EVs在持久炎症控制中的有效性。 深化分子机制的实验验证使用基因编辑技术（如CRISPR-Cas9敲低PHB1或miR-27a-3p过表达）直接验证miR-27a-3p对Th17/Treg平衡的影响，并通过代谢组学（如Seahorse分析）量化PHB1抑制对T细胞线粒体呼吸的效应。针对PD-1通路，进行磷酸化蛋白质组学确认SHP2介导的ZAP70/AKT去磷酸化。结合单细胞测序，分析EVs处理后T细胞的亚群转录动态（如Th17特异性基因IL17A的下调）。建议在体内模型中进行这些验证，以构建完整的机制链条，并使用路径分析工具（如KEGG）整合数据，提供更全面的分子图景。 扩大患者来源样本的临床验证增加患者队列，包括至少20-30例不同IBD亚型（CD、UC）和疾病活动度的样本，进行多中心collaboration以获取多样化的colonoid和PBMC来源。引入器官芯片（organ-on-chip）模型模拟肠道微环境，测试EVs对患者特异性T细胞的重编程效应。同时，开展回顾性分析，比较EVs对耐药 vs 一线治疗应答者的差异。这将提升研究的临床转化价值，并为个性化治疗提供依据。 纳入全面的安全性评估框架在体外和体内模型中，系统评估EVs的免疫原性（如ELISA检测抗EV IgG产生）和脱靶毒性（如肝肾功能指标）。进行毒代动力学研究，量化EVs的半衰期和组织分布，并监测长期免疫监视（如NK细胞活性）。建议在设计未来临床试验时，包括剂量递增阶段和独立安全监测委员会，参考国际指南（如ISCT EVs标准）报告不良事件。这有助于及早识别风险，确保治疗的安全性。科学价值 该研究开发了一种工程化细胞外囊泡（EV）平台，通过同时靶向免疫检查点（PD-1）和线粒体代谢（PHB1），为炎症性肠病（IBD）治疗提供了创新的精准免疫调节策略。其核心科学价值在于揭示了PD-1信号诱导T细胞失能与miR-27a-3p抑制PHB1重塑Th17/Treg平衡的协同机制，突破了传统广谱免疫抑制疗法的局限。该双靶向策略在临床前模型中显著缓解肠道炎症并保护上皮屏障，不仅为IBD及其他T细胞驱动的炎症疾病提供了潜在的高效疗法，也展示了工程化EV作为智能药物递送系统的巨大应用前景。 如果你想在此显示您的广告信息，请联系我们。  /  科学技术普及新媒体矩阵  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官及干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承类器官创新计划组织愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 合作品牌 2025年度 欢迎找到组织 类器官创新计划组织（Innovations in organoids organization）是由来自中国科学院、北京大学、清华大学、复旦大学和浙江大学等多个顶级研究机构的头部研究团队组织发起的，完全公益的，学术与研究技术交流合作组织，成员主要由来自类器官行业内的企业高管、技术经理、高级PI等构成。加入“类器官创新计划”后，您将以极低的成本实现类器官资源的互换与共享，基于肠道类器官和类器官创新计划组织微信公众号平台，您将获得来自全行业的赋能与指导，进行标准化的类器官制备与检测，保证您的研究顺利且高质量开展。我们会将你纳入本组织“技术研发”、“开源公益”和“产品服务”等多个微信群，这样您能够与所有参与计划的成员及时沟通，您所有的类器官问题都能最及时的得到解答和帮助，互换类器官品系和干细胞研究工具资源，解决技术难题，获得技术支持。我们已有上万个来自全国顶级类器官研究机构、大学和企业的注册认证会员，大家一起为类器官事业发展点燃星星之火，推动类器官产业发展壮大。我们还建立了AI知识问答和开源类器官分析工具等多个公益项目为类器官研究提供帮助，构建开放包容的领域生态。在这里,我们敢为人先，始终积极寻求更新类器官更优的解决方案，勇于突破经验与预想的界限，致力打造科学卓越的行业新标准。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn   组织愿景 1.共建开放协作生态：搭建行业资源共享平台，促进技术互通与经验共享，降低类器官研究门槛。 2.引领行业标准与规范：推动制定行业与国家工程标准，实现类器官培养与应用的规范化、全流程标准化。 3.打造国际学术资源枢纽：推动建设全球认可的类器官库与智库平台，加速技术向精准医学与药物研发转化。 4.驱动技术融合创新：推动整合生物材料、智能装备等工程技术创新，突破类器官规模化制备与功能重建瓶颈。 5.强化技术自主可控：推进国产化试剂、仪器研发与技术体系替代，保障核心研发链安全与战略主动权。 加入我们       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2025年9月10日 发表于 Annals of Hematology  摘要 嵌合抗原受体 (CAR) 疗法已在血液系统恶性肿瘤中展现出显著的临床疗效，证实了其治疗潜力。然而，治疗耐药性和可及性受限等挑战阻碍了其更广泛的应用。为了克服这些局限性，已提出了基于 CAR 的替代细胞疗法，包括 CAR-自然杀伤细胞 (CAR-NK)、CAR-巨噬细胞 (CAR-M) 和 CAR-树突状细胞 (CAR-DC)。与 CAR-T 相比，CAR-NK 细胞在细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性方面具有更高的安全性，同时具有天然的细胞毒性，使其成为一种很有前景的选择。尽管存在这些优势，CAR-NK 疗法仍受到组织浸润不足和转导效率低等问题的制约。CAR-M 细胞具有强大的浸润能力和作为抗原呈递细胞的功能，也具有良好的前景，但也面临着病毒转导效率不理想的挑战。CAR-DC 正成为一种极具前景的新兴疗法，目前正在积极研究中。本综述总结了CAR-T、CAR-NK、CAR-M和CAR-DC疗法的概况、当前的临床试验以及各自的优势和局限性。最后，我们讨论了这些不断发展的CAR细胞疗法亟待解决的关键挑战以及未来前景。 介绍 血液系统癌症是最常见的恶性肿瘤类型之一，近年来治疗领域的进展显著改善了患者的预后。CAR-T细胞疗法和免疫检查点抑制剂等新兴疗法正在重塑血液系统癌症治疗格局，对传统疗法形成补充。其中，CAR-T细胞疗法已展现出令人瞩目的疗效，尤其是在血液系统恶性肿瘤的治疗中，并越来越多地用于早期干预，为患者带来了新的希望。 嵌合抗原受体（CAR-T）是合成的模块化蛋白质，可引导免疫细胞针对特定靶点进行反应。这种适应性平台已在治疗血液系统恶性肿瘤方面展现出显著的临床疗效，其更广泛应用的潜力正推动着技术的快速进步以及学术界和生物制药领域的大量投资。1989年，G. Gross及其同事设计了第一个CAR结构并将其整合到T细胞中。迄今为止，CAR-T细胞已发展到第五代，并广泛应用于血液系统恶性肿瘤（图1和图2）；然而，它们仍然面临巨大的挑战。由于血液系统恶性肿瘤的独特特性，NK细胞和M细胞引起了人们的广泛关注。然而，新的挑战也随之出现，促使人们的关注点从直接细胞毒性转向抗原呈递细胞，例如树突状细胞（DC）。因此，基于CAR的免疫细胞疗法应运而生，包括CAR-NK、CAR-M和CAR-DC。在本文中，我们将回顾四种主要的 CAR 免疫细胞疗法，详细介绍它们的优点、缺点、相关临床试验以及针对这些缺点的潜在解决方案。 图1 TCR结构与CAR结构比较。CAR的基本结构主要包括胞外靶抗原结合结构域、铰链区、跨膜结合结构域、胞内信号传导结构域四部分。 图2 第1~5代CAR结构示意图。a第一代：通过将抗体的轻链和重链替换为可变区的单链（ScFv），构建不依赖MHC的嵌合TCR片段。b第二代：在第一代的基础上添加了CD28、4-1BB、ICOS、OX40等共刺激因子。c第三代：两种共刺激因子的组合可以同时增强CAR-T细胞的持续扩增和抗肿瘤能力，例如CD28和4-1BB的协同刺激可以优化CAR-T细胞功能，例如持久性和抗衰竭性。d第四代：引入促炎细胞因子，包括IL-12、IL-15、IL-17、IL-18等。e第五代：能够识别更广泛的抗原。 CAR-T CAR-T细胞疗法涉及对T细胞进行基因改造以表达CAR，从而能够靶向识别肿瘤细胞、激活免疫反应并破坏恶性细胞。CAR设计是CAR-T细胞疗法的关键部分（图1）。CAR需要比T细胞受体（TCR）更高的亲和力范围，这意味着CAR介导的细胞毒性依赖于更高的细胞表面抗原密度。CAR的优势在于其能够调节抗原密度，提供更强的信号强度，并弥补T细胞耗竭带来的功能缺陷。 CAR-T细胞疗法在临床上应用十分广泛，尤其在急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗中，其疗效也得到了广泛认可。CAR-T研究起步较早，目前有大量临床试验正在进行中。早期CAR-T临床试验集中于血液系统恶性肿瘤，主要靶点为CD19和BCMA，其中，靶向CD19的CAR-T在B细胞淋巴瘤中已显示出明显优于其他靶点的疗效，而靶向BCMA的CAR-T在治疗多发性骨髓瘤中已被证明更有效。随着临床研究的进展，针对单一抗原的自体CAR-T疗法已不能完全满足临床治疗的需求，针对多种抗原的CAR-T和同种异体CAR-T疗法越来越受到关注。此外，一些新的靶点，如GPC-3和BAFFR。 (NCT05620706) (NCT05370430) 已成为基于 CAR-T 疗法的有希望的候选药物。 面对问题 CAR-T细胞疗法在B-ALL和淋巴瘤中的成功应用，彰显了其在抗肿瘤治疗中的巨大潜力。然而，CAR-T细胞所处的免疫抑制肿瘤微环境、CAR-T细胞的毒性等挑战，也成为CAR-T治疗应用的障碍（图3）。 图3 CAR-T细胞疗法面临的问题。目前CAR-T细胞疗法面临的问题包括CAR-T细胞耗竭、抗原结合域的免疫原性问题、抗原逃逸、免疫抑制微环境以及CAR-T细胞的毒性。 与CAR-T细胞耗竭和扩增相关的挑战 CAR-T细胞疗法的疗效与CAR-T细胞在人体内持久性密切相关，而CAR-T细胞的耗竭和增殖是影响其寿命的重要因素。CAR-T细胞耗竭是指由于持续的抗原刺激、CAR共刺激结构域的过度信号传导，导致抗原特异性T细胞丢失的一种功能障碍状态。体外研究表明，PD-1、Lag3、Tim3、TIGIT和CTLA-4的上调是T细胞耗竭的标志，也是抗肿瘤功能丧失的主要原因。此外，细胞因子、转录因子和表观遗传修饰在CAR-T细胞耗竭的发展中起着重要作用。IL-5已被证明可以降低mTORC1活性，从而增强增殖潜能并减少细胞凋亡； IL-7 通过激活 STAT5 等通路促进 CAR-T 细胞在体内长期存活。转录因子，如 TOX、NR4A，以及 c-Jun 表达的调节，已被发现可提高 CAR-T 细胞对衰竭的抵抗力。在表观遗传学方面，DNA 甲基化是建立稳定基因沉默程序的关键表观遗传机制。在抗肿瘤反应高峰期间和之后，T 细胞会发生从头 DNA 甲基化，导致与衰竭相关的终末分化。这些表观遗传变化有助于形成前体衰竭 T 细胞状态（图4）。 图4 CAR-T细胞耗竭的机制。a体外研究表明，PD-1、Lag3、Tim3、TIGIT和CTLA-4的上调是T细胞耗竭的标志，也是抗肿瘤功能丧失的主要原因。b IL -5已被证明可以降低mTORC1活性，从而增强增殖潜力并减少细胞凋亡；IL-7通过激活STAT5等通路，有助于CAR-T细胞在体内长期存在。c转录因子，例如TOX、11NR4A和c -Jun表达的调节，已被发现可以提高CAR-T细胞对耗竭的抵抗力。d在抗肿瘤反应高峰期间和之后， T细胞会发生从头DNA甲基化，导致与耗竭相关的终末分化。 针对CAR-T细胞耗竭和扩增问题，首先是增强CAR-T细胞的增殖和分化活性。有研究表明，可联合溶瘤病毒通过协同作用增强CAR-T细胞在肿瘤内的转运和抗肿瘤活性 ；此外，CAR-T细胞扩增期使用的培养基可影响其在人体内的表现，因此，可通过优化培养基来增强CAR-T细胞的增殖和分化能力。另一种方法是添加促进未分化CAR-T细胞产生的细胞因子，如白细胞介素混合物，其可影响CAR-T细胞的记忆、增殖和分化能力，从而提高其在人体内持久性。二是靶向CAR-T细胞耗竭的过程。首先，通过靶向T细胞克服耗竭的内在途径，例如PD-1的持续表达与CAR-T功能障碍相关，因此可以从内部阻断PD-1以改善CAR-T功能。其次，可以通过CAR设计限制或破坏CAR与抗原的相互作用，减弱持续的抗原刺激，例如通过诱导“短暂休止”期来恢复耗竭T细胞的效应功能。此外，在CAR-T细胞中删除DNMT3A已被证明可以阻断多个调节人类T细胞分化的关键基因甲基化，防止CAR-T细胞耗竭并增强抗肿瘤活性。 抗原识别域的免疫原性 目前，大多数CAR-T细胞疗法采用鼠源CAR，而这些CAR会被人体免疫系统识别为外来物。这种识别会导致单链可变片段（scFv）等抗原识别结构域的免疫原性，并且是CAR-T细胞免疫原性及随后衰竭的主要因素。为了应对这一挑战，研究人员探索了使用纳米抗体和抗体人源化技术来降低CAR构建体的免疫原性潜力。 纳米抗体源自抗体重链可变区 (VHH)。它们最早由 Hamers-Castermans 等人在单峰骆驼中发现，随后广泛见于骆驼科和鲨鱼。然而，scFv 通常表现出较低的稳定性和抗原亲和力，并且容易聚集或错误折叠。这些限制可能是由于结构问题造成的，例如可变轻链 (VL) 结构域的折叠稳定性低以及可变重链 (VH) 和 VL 结构域之间界面处疏水残基的暴露。完全缺乏 VL 和恒定结构域的纳米抗体构象稳定，并保持与 scFv 相当的结合能力、特异性和溶解性。此外，它们不易聚集和错误折叠，并且与人类 VH 基因家族 III 具有高度序列相似性，这使它们免疫原性较低，更适合临床应用。此外，纳米抗体通常只需要对人源化序列进行微小修改。在评估 VHH 双可变重链结构域 (dVHH) NS7CAR-T 的临床前试验中，与基于 scFv 的 CD7 靶向 CAR-T 疗法相比，该构建体表现出对 CD7 的高特异性、增强的增殖能力和降低的与其他蛋白质的交叉反应性。在临床试验阶段观察到了良好的临床安全性，80% 的患者仅经历轻度 CRS，与基于 scFv 的 NS7CAR-T 治疗的报道相似。 源自鼠类的CAR-T和来自骆驼科的纳米抗体均非人类来源。非人类抗体可引发人类免疫反应，从而可能降低治疗效果。为了解决这个问题，研究人员采用了抗体人源化技术。常用策略包括互补决定区（CDR）、基于框架区（FWR）同源性的移植、种系人源化以及使用IgG衍生序列，具体方法的选择取决于具体应用。人源化技术可以优化抗体的免疫原性、特异性和亲和力。研究人员还开发了一种通用的人源化纳米抗体支架，该支架在通过CDR移植获得抗原特异性和亲和力的同时，仍保持结构稳定性。研究表明，人源CAR-T细胞治疗复发/难治性B细胞ALL的长期疗效优于鼠源CAR-T细胞疗法，人源组的CR率为75%，优于鼠源组。值得一提的是，人源化CAR-T细胞可作为鼠源CD19 CAR-T细胞治疗复发或失败后的挽救疗法。 抗原逃逸 抗原逃逸是肿瘤逃避免疫监视的常用手段之一。临床证据表明，部分接受CAR-T细胞治疗的急性B淋巴细胞白血病患者，尤其是长期使用CAR-T细胞的患者，会出现CD19阴性白血病复发。CD19阴性导致靶向CD19的CAR-T细胞无法发挥作用，这种现象称为抗原逃逸。研究发现，肿瘤细胞中的抗原逃逸与几种CD19剪接变体的表达有关，例如Δexon-2和Δexon-5/6，它们缺乏CD19的跨膜结构域，从而逃避CAR-T细胞的识别。CAR诱导的免疫压力会促进这些剪接变体的选择性表达，使肿瘤细胞能够逃避CAR-T细胞的监视。临床观察到的另一种抗原逃逸机制是谱系转换，这在接受 CAR-T 细胞治疗后发展为急性髓系白血病 (AML) 的混合谱系白血病 (MLL) 患者中很常见。这种现象可能与 KMT2A 重排有关。面对抗原逃逸，一种策略是同时靶向靶细胞表面的多种抗原。许多临床试验研究了同时靶向两种抗原的 CAR-T 细胞（例如 NCT05438368、NCT05437341、NCT05437328），即使一种抗原逃逸，这些细胞也能保持治疗效果。此外，CAR 分子可以设计为同时识别多种抗原，即“串联 CAR” 。研究表明，与单分子 CAR 相比，靶向 HER2 和 IL13Rα2 的串联 CAR T 细胞表现出增强的抗肿瘤活性和治疗效力。另一种策略是提高CAR-T细胞对低抗原密度靶点的反应性。研究表明，CAR的活性受抗原密度的影响，在CAR中添加免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）可以提高对低抗原密度肿瘤细胞的识别。此外，CD19 CAR-T细胞对耐药性低抗原密度肿瘤的反应减弱的原因是CAR信号传导不足。增强CAR信号强度可以提高CD19 CAR-T细胞对抗此类肿瘤的有效性。例如，CAR-T细胞疗法与增加靶抗原表达的药物联合使用，除了直接对淋巴瘤细胞去甲基化以抑制肿瘤生长外，地西他滨（DAC）还可以上调淋巴瘤细胞上CD19的表达； bryostatin 1可以上调CD22的表达，从而增强CD22 CAR-T的疗效，或阻止肿瘤细胞表面CD22的低表达。或者，可以通过改变CAR识别抗原的亲和力来降低CAR的密度阈值，特别是增强ScFv对其靶标的亲和力。 免疫抑制微环境 免疫抑制微环境（TME）是指肿瘤所在的内部环境，主要由肿瘤细胞、基质细胞（如癌相关成纤维细胞）、免疫细胞及其分泌因子、血管内皮细胞和细胞外基质（ECM）组成，是一个复杂的整合系统。这些免疫抑制成分与恶性肿瘤细胞密切相互作用，促进其存活和免疫逃逸。同时，它们会削弱CAR-T细胞的抗肿瘤功效，导致CAR-T细胞耗竭。 目前，在克服TME阻碍CAR-T疗法的障碍方面尚未取得突破；然而，一些有希望的策略仍在探索中。首先是针对TME中的免疫抑制细胞。关键的免疫抑制成分包括调节性T细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和髓系抑制细胞（MDSC）。对于Treg，CD74的敲除已被证明可以特异性地减少其在TME内的浸润，从而促进CAR-T细胞在肿瘤中的浸润和聚集。已有研究表明，阻断CD47/SIRPα和CD24 SIGLEC-10的信号传导可有效促进TAM对肿瘤细胞的吞噬作用。还可以通过开发分泌免疫刺激细胞因子的装甲CAR-T细胞（例如白细胞介素IL-12、IL-18或IL-15武装的CAR-T细胞）来调节微环境。第二种是调节代谢失调的策略，利用代谢途径促进记忆T细胞的形成或通过营养限制的TME逆转效应功能，这在临床试验中已显示出对CAR-T细胞肿瘤控制的良好改善。Morgane Boulch等人通过研究CAR4和CAR8 T细胞在TME中的不同作用，提出了一种深化T细胞与微环境相互作用并利用与其相互作用的细胞因子的方法。 CAR-T细胞的毒性 CAR-T 细胞疗法可能导致免疫反应过度激活，从而引发 CRS。CAR-T 细胞与靶抗原结合后会被迅速激活，导致大量颗粒酶 B、穿孔素、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌。细胞的颗粒酶 B 激活与 Gasdermin E (GSDME) 的广泛表达相关，后者会诱导细胞焦亡并促进损伤相关分子模式 (DAMP) 的释放。DAMP被模式识别受体 (PRR) 识别并触发巨噬细胞活化。目前的研究已发现 L-6、IL-10 和 IFN-γ 是参与 CAR-T 细胞相关 CRS 的关键细胞因子，其中 IL-6 是中心介质。IL -6 及其下游效应分子在 CRS 期间临床症状的发展中发挥重要作用。 IL-6 水平升高可诱导凝血级联反应，导致弥漫性血管内凝血和心肌功能障碍。此外，巨噬细胞和 CAR-T 细胞的共定位涉及 CD40L–CD40 相互作用，这直接诱导 IL-6 的产生。这表明存在潜在的 CAR-T 细胞-巨噬细胞调节轴。 为了预防和治疗CRS，可以采用针对与CRS发病机制有关的细胞因子（例如白细胞介素IL-1和IL-6）的治疗策略。例如，IL-1是参与CRS的重要细胞因子，因此IL-1受体拮抗剂阿那白滞素（Anakinra）可在一定程度上治疗CRS。同样，CRS主要由IL-6介导，IL-6受体拮抗剂已显示出缓解CRS的疗效。研究表明，CRS的严重程度与肿瘤负荷呈正相关，因此，在CAR-T细胞输注前可以进行传统的放疗和化疗，以减轻肿瘤负荷并预防CRS。 CAR-NK CAR-T 细胞面临的各种挑战促使人们对使用其他免疫细胞进行 CAR 疗法的兴趣日益浓厚，尤其是自然杀伤 (NK) 细胞。NK 细胞不受 MHC 限制，可以非特异性杀死肿瘤细胞，表现出强大的抗肿瘤活性。CAR-NK 细胞比 CAR-T 细胞具有一些显著优势，例如安全性更高，尤其是在细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性方面。CAR-NK 细胞不仅具有杀死肿瘤细胞的固有能力，还可以通过 CAR 进行基因改造以识别多种肿瘤细胞类型。这一点尤其有利，因为 NK 细胞受体可以识别多种肿瘤细胞上的配体，从而使 CAR-NK 细胞疗法成为一种具有巨大治疗潜力的有前途的方法。 CAR-NK 细胞的结构与 CAR-T 细胞相似，但通常使用更适合 NK 细胞的共刺激因子。例如，CD244 的上调可增强 NK 细胞的信号增强能力及其对肿瘤细胞的天然毒性。此外，DAP12 和 DAP10 参与 NK 细胞信号转导，因此，可以对 CAR-NK 细胞进行改造以整合这些信号分子。研究表明，基于 DAP12 的 CAR-NK 细胞比基于 CD3 的 CAR-NK 细胞（与 CAR-T 细胞类似）的效果更佳。 临床试验 目前CAR-NK主要在针对血液系统恶性肿瘤的临床研究中探索，包括B淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤，但大部分仍处于实验阶段，结果尚未公布（表1）。这些研究中最常见的靶点是CD19，主要用于B细胞淋巴瘤；其次是BCMA，主要用于治疗多发性骨髓瘤。其中，还有针对B细胞非霍奇金淋巴瘤的CD19/CD70双特异性抗体（NCT0566715）（NCT05842707）；针对多发性骨髓瘤的BCMA/GPRC5D双特异性抗体（NCT06594211）；以及针对急性髓系白血病的CD33/CLL1双特异性抗体（NCT05215015）。例如，在4-1BB共刺激CD19特异性CAR-NK细胞疗法治疗R/R大B细胞淋巴瘤的1期剂量递增试验中，8例患者重复接受CAR-NK细胞治疗。客观缓解率(ORR)为62.5%，完全缓解率(CR)为50%。37.5%的患者出现3级发热性中性粒细胞减少症，50%的患者出现3级血小板减少症。值得注意的是，未报告长期或延迟性血细胞减少症的病例。研究还表明，高剂量、重复给药对于获得更好的抗肿瘤疗效是必要的。此外，一项评估CD33靶向CAR-NK细胞疗法在R/R AML患者中的安全性和有效性的1期临床试验表明，CD33 CAR-NK疗法的安全性优于CAR-T疗法，并有助于减轻与NK细胞增殖受限相关的副作用。但其持久性尚需进一步提高。微小残留病阴性完全缓解(MRD-CR)率为60%。此外，70%的患者在第一轮CAR-NK细胞输注后2天内出现发热，除血液学毒性外，未观察到3级以上不良反应。 表1 近年来CAR-NK细胞治疗的临床试验 优势 与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞杀伤肿瘤具有双重肿瘤细胞杀伤机制，可有效杀伤一些不表达CAR识别的特异性抗原的肿瘤细胞。CAR-NK细胞保留了其固有的细胞毒性，使其能够通过天然机制杀死肿瘤细胞。同时，它还可以通过CD16发挥ADCC作用，杀死肿瘤细胞。CAR-NK细胞在人体内寿命较短，对健康组织的损害风险也较低。此外，由于细胞因子分泌不同，CAR-NK细胞诱发CRS的可能性较小。NK细胞主要分泌IFN-γ； CAR-T细胞分泌IL-1a、IL-1Ra、IL-2、IL-2Ra、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8、IL-10和IL-15，这些细胞因子都是与CRS高度相关的细胞因子（图5）。 图5 CAR-NK、CAR-M、CAR-DC优势比较 面对问题 CAR-NK细胞相对较短的寿命提高了其在人体内的安全，降低了对正常组织造成损害的可能性。然而，与此同时，CAR-NK细胞有限的持久性也在一定程度上限制了CAR-NK细胞治疗的疗效。为了增强CAR-NK细胞在体内的疗效，需要外部细胞因子的辅助。但这也带来了副作用，例如抑制调节性T细胞。 肿瘤靶向效率低 肿瘤靶向效率低一直是CAR细胞疗法面临的挑战。肿瘤微环境是导致CAR-NK细胞在肿瘤组织中靶向效率低的重要原因。首先，TME中的免疫抑制信号抑制了NK细胞对肿瘤细胞的清除。除肿瘤和基质细胞外，TME中的各种免疫细胞，如TAM、调节性T细胞和中性粒细胞，都会释放免疫抑制物质，阻碍NK细胞的抗肿瘤作用。其次，TME中营养物质的缺乏进一步阻碍了NK细胞清除肿瘤的能力。这是因为肿瘤爆发性生长导致氧气和营养物质的耗尽，导致TME缺氧且营养缺乏，从而损害NK细胞的正常功能。除了抑制NK细胞清除外，TME还影响检查点分子与CAR-NK细胞的相互作用。目前的策略主要涉及基因编辑，以去除NK细胞中的检查点成分。研究表明，删除检查点成分可有效增强CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。 慢病毒转导效率低 慢病毒转导是CAR-NK细胞疗法中广泛使用的基因修饰和递送方法。然而，NK细胞固有的抗病毒特性，使得慢病毒转导在CAR-NK细胞疗法中难以实现高效。目前，人们使用化学药剂来提高转导效率，例如硫酸鱼精蛋白或可用于去除细胞膜电荷的聚合物。在造血干细胞和祖细胞中，环孢素A和雷帕霉素被用来克服慢病毒的限制性障碍。 CAR-M 巨噬细胞是专门的吞噬细胞和抗原呈递细胞。它们分为M1和M2两种类型。M1巨噬细胞在肿瘤微环境（TME）中发挥促炎作用，并在抗肿瘤中发挥主要作用，而M2巨噬细胞则促进肿瘤转移、存活和生长。诱导M2巨噬细胞极化为M1巨噬细胞有可能逆转肿瘤微环境。因此，除了CAR-T和CAR-NK之外，CAR-M也应运而生，有望解决CAR-T和CAR-NK的难题。 由于巨噬细胞功能不同，CAR-M中CAR的构建与CAR-T和CAR-NK略有不同。CAR-M中的CAR构建体主要由scFv、靶向相应分子的CD8铰链区和跨膜结构域、以及CD3ζ胞内结构域组成。针对巨噬细胞功能，Morrissey等人引入了不同的胞质结构域。其中，由Megf10和FcRy结构域组成的CAR在吞噬抗原标志物方面表现出功效，而Bai1和MerTK结构域未能诱导巨噬细胞的吞噬活性。此外，研究人员还尝试使用炎症信号结构域，希望具有促炎作用，从而可以诱导M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞。例如，将TLR4和TLR2胞内信号结构域整合到CAR框架中，可以促进巨噬细胞产生CD86、MHC-II和TNF-α，加速肿瘤消退，这是M1巨噬细胞产生的特征。至于CD3ξ胞内结构域，过去主要用于CAR-T细胞中CAR的构建，但现在由于其优异的信号转导能力，也被广泛用于CAR-M细胞中CAR的构建。CAR-M CAR已发展到第二代，由诱导多能干细胞构建，具有结合CD3ζ和TLR4的胞内结构域。此外，它已被证明具有增强肿瘤细胞清除和调节肿瘤环境的能力。 优势 巨噬细胞是TME中最丰富的浸润性免疫细胞。肿瘤周围ECM形成的物理屏障是影响免疫细胞浸润的最重要因素。ECM由高度组织化的纤维分子、糖蛋白和其他大分子组成，其合成和降解主要受基质金属蛋白酶（MMP）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的调控，MMP可以降解ECM，TIMP是抑制MMP活性的重要酶家族。巨噬细胞是MMP的主要来源，这使其比T细胞和NK细胞具有更强的浸润ECM的能力，这赋予了CAR-M细胞疗法的优势。张某等利用这一优势，对CAR-M细胞疗法进行了系统性研究。设计了一种由胞外靶向HER2的scFv区和胞内活化的CD147组成的CAR-M，其能与HER2阳性靶细胞的活化CD147结构域一起触发下游信号通路，从而促进MMP的产生，甚至进一步促进T细胞的浸润，而CAR-M细胞的吞噬功能和炎症细胞因子的分泌不受影响。 巨噬细胞除了具有吞噬功能外，还能作为抗原呈递细胞。此外，CAR-M还能作为抗原呈递细胞，增强T细胞的毒性作用。与CAR-T细胞相比，CAR-M细胞在体内循环时间更短，非肿瘤毒性更低，因此不易诱发CRS。IL-6是一种可能引发CRS的细胞因子，而CAR-M细胞会产生IL-6，有趣的是，出现了两种不同的结果：接受CAR-147巨噬细胞治疗的小鼠的IL-6水平低于对照组，而CAR-iMac细胞则表现出IL-6产生增多。具体原因有待进一步研究（图5）。 面对问题 巨噬细胞作为免疫细胞，也面临病毒转导效率低的问题。目前主要采用腺病毒载体和Vpx改造的慢病毒进行转导，这在一定程度上可以克服巨噬细胞转导CAR效率低的问题。CAR-M细胞也面临扩增问题。巨噬细胞在体外或体外注射后并不能增殖，因此患者体内CAR-M细胞的数量有限。这种限制可能会影响治疗的疗效。此外，巨噬细胞在体内的迁移特性也会影响疗效。当CAR-M细胞体外注射时，它们最初倾向于穿过肺部，然后主要驻留在肝脏中。此外，CAR-M细胞数量的有限性进一步限制了其有效性。 临床试验 目前，CAR-M 的临床研究数量有限，已确定的有 7 项，其中 6 项针对实体瘤。剩余一项针对血液肿瘤复发/难治性 TCL，分为两部分。第一阶段评估靶向 CD5 的 CAR-M 药物 MT-101 的安全性、耐受性及适宜剂量；第二阶段基于第一阶段（NCT05138458）的对比实验，评估 MT-101 的安全性、耐受性和疗效。该临床试验正在进行中，预计将于 2025 年 10 月完成。CAR-M 在血液系统恶性肿瘤中的临床研究较少，需要更多试验来进一步探究 CAR-M 的抗肿瘤活性、治疗效果和安全性。 CAR-DC 树突状细胞（DC）是体内最强的抗原呈递细胞，人体内的树突状细胞大多处于未成熟状态。这些细胞具有很强的迁移能力和抗原吞噬能力，能够有效地吸收、加工和呈递抗原。在吸收抗原后，这些细胞会分化为成熟的树突状细胞（DC）。在成熟过程中，树突状细胞可以从暴露于抗原的外周组织迁移到次级淋巴器官，与T细胞接触并引发免疫反应，包括诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。 体外DC细胞主要来源于自体单核细胞生成。CAR-T载体DC具有特异性靶向癌细胞、吞噬细胞、呈递抗原以及诱导T细胞免疫反应等功能，目前被认为具有靶向多种癌症的潜力，但目前尚无相关研究发表（图5）。 CAR-DC的临床试验仍处于实验阶段。目前已有一项针对血液系统恶性肿瘤的临床试验：靶向CD19的CAR-T细胞和CAR-DC联合治疗复发和难治性B淋巴瘤（NCT05585996）。 结论 本综述概述了当前的CAR细胞疗法，包括其设计、正在进行的临床试验、应用以及在血液系统恶性肿瘤中的战略考量。此外，本文还对CAR-M、CAR-NK和CAR-T疗法进行了比较分析，重点阐述了它们在临床应用中各自的优势和挑战。尽管CAR-T细胞疗法广泛应用于血液系统恶性肿瘤，但仍面临诸多问题，例如抗原逃逸、细胞自身耗竭和扩增等。相比之下，CAR-NK和CAR-M疗法展现出良好的潜力：CAR-NK具有更高的安全性和天然的细胞毒性；而CAR-M在肿瘤微环境浸润和抗原呈递方面表现优异，与CAR-NK类似，但毒性更强。然而，CAR-NK和CAR-M都面临着诸如归巢效率和病毒转导等挑战。 展望未来，CAR-DC疗法凭借树突状细胞的抗原呈递能力，在理论上具有广阔的应用前景，但其疗效仍需进一步的实验验证。随着CAR细胞疗法的快速发展，跨学科技术创新将成为克服当前挑战、提升癌症患者治疗效果的关键。 总而言之，CAR细胞疗法代表着一个蓬勃发展的领域，从开创性的CAR-T疗法到近期发展的CAR-NK、CAR-M和CAR-DC疗法。持续的跨学科努力有望克服现有的障碍，并有望在血液肿瘤及其他领域的治疗中取得重大进展。 微信号：maple31415926

你有没有发现？年纪一上来，小毛病越来越多，感冒好久不好，精力也大不如前？其实这不是单纯的“老了”，而是我们的免疫力“盾牌”在悄悄生锈！央视早就点明：现在已经是免疫细胞治疗的时代，而NK细胞就是其中的“明星选手”，凭着超强的抗衰、抗癌本事，成了科研界的香饽饽。 年龄一涨，免疫细胞就“摆烂”？NK细胞偏要逆势而上 咱们总说“岁月不饶人”，其实最先被岁月“拿捏”的是免疫细胞。有项研究找了1068位健康人，从年轻人到老年人挨个观察，结果把大家都惊到了： - T细胞：作为免疫里的“主力军”，年纪越大越没战斗力，数量和本事都往下掉，这也是中老年人免疫力差的主要原因；- B细胞：负责“后勤保障”的体液免疫，还算靠谱，数量一直没变化，守住了免疫的基本防线；- NK细胞：最让人意外的“黑马”！作为固有免疫的关键力量，它的数量随着年龄反而总体上升，中年时稍微波动一下，但功能一直在线，堪称老年人抵抗感染、对付肿瘤的“关键防线”。 长寿的秘密藏在NK细胞里？百岁老人都靠它 一说到长寿，大家总想到遗传基因好、饮食习惯棒，却很少有人知道，NK细胞才是隐藏的“长寿密码”。科学家专门研究了138位健康人，年纪从4岁到106岁，其中还包括26位百岁老人，结果发现了惊人的规律： - 年轻人的NK细胞，杀肿瘤的效率大概有63%，战斗力满满；- 到了中年，直接“断崖式下跌”，杀伤效率只剩33%左右；- 而百岁老人的NK细胞，杀伤活性居然高达55%，比中年人还高出22%！ 这就说明，NK细胞的活性越高，身体抗疾病、缓衰老的能力就越强，这说不定就是长寿老人的共同秘诀呢！ 相关研究数据说明 这项针对淋巴细胞亚群参考范围和变化的研究，共招募了1068名健康中国成年人，其中男性731人（占68.45%），女性337人（占31.55%），平均年龄40.5±10.04岁。其中青年组（19-44岁）有781人（占73.13%），包括564名男性和217名女性，平均年龄35.4岁；中年组（45-64岁）有246人（占23.03%），包括134名男性和112名女性，平均年龄50.9岁；老年组（65-80岁）有41人（占3.84%），包括33名男性和8名女性，平均年龄71.6岁。卡方检验显示，三个年龄组的性别分布不均衡（p<0.001）。各组淋巴细胞计数和百分比的平均值及95%置信区间已列出，除了CD19+B细胞计数（p=0.383）、CD19+B细胞百分比（p=0.863）、CD3+CD4+T细胞计数（p=0.565）和CD4+CD28+T细胞计数（p=0.816）外，大多数指标在不同年龄组间存在差异。外周血中总T细胞（CD3+）、辅助性T细胞（CD3+CD4+）、细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）和自然杀伤细胞（CD16+CD56+）的绝对数量和百分比，以及活化T细胞（CD28+CD38+和HLA-DR）的绝对数量和百分比也均有记录。 回输NK细胞，能让免疫“返老还童”？试验结果太惊喜 人到中年，免疫力下滑、慢性炎症找上门，难道只能认命？针对健康中年人的对照试验，给出了让人振奋的答案：研究找了37位健康中年人，其中32人注射了高活性NK细胞，5人注射了安慰剂。没想到1周和4周后检测，结果超出预期： - 那些代表T细胞衰老的“坏指标”（比如CD28-、KLRG1+的CD4+T细胞和CD8+T细胞）明显减少，原本“老化”的T细胞居然重新焕发了活力；- 那些会加速衰老、引发慢性炎症的“捣蛋分子”（比如IL-6、IL-8这些衰老相关因子）也大幅降低。 还有一项体外研究也证实：5个人回输NK细胞后，血液里的衰老标志物（p16和β-半乳糖苷酶）都下降了，其中1人两次输注后，免疫衰老的缓解效果居然持续了一年多！ 真实案例：45岁肺癌患者，靠NK细胞重获新生 45岁的李先生是位职场精英，原本事业顺风顺水，却在体检时查出了中晚期肺腺癌。试过传统治疗后，效果一直不理想，一家人都陷入了绝望。 后来经人介绍，李先生抱着试一试的心态，选择了NK细胞治疗。医生先从他的外周血里提取出NK细胞，在体外进行扩增和激活，让这些细胞的数量和战斗力都翻倍，再重新回输到他体内。 没想到几个疗程下来，李先生的癌胚抗原数值明显下降，肺部的肿瘤也缩小了，精神状态一天比一天好，生活质量大幅提升，最后竟然重新回到了正常的工作和生活中。 这样的案例可不是个例，越来越多的临床研究都证明，NK细胞在癌症治疗中有着巨大的潜力，给很多患者带来了新的希望。 免疫年轻=长寿？NK细胞的本事可不止抗衰 你可能不知道，免疫系统的年轻程度，直接决定了我们能活多久、活得好不好： - 要是免疫系统提前衰老，全因死亡的风险会增加42%；- 而如果大脑和免疫系统都保持年轻，死亡风险能降低56%，这种保护作用，比其他器官单独的贡献可强多了。 NK细胞正是维持免疫系统年轻的“关键选手”，而且现有研究还发现，它在改善老年痴呆等和衰老相关的问题上，也有很大的潜在价值。 结语：定期补充NK细胞，给健康“上保险” 从央视认可的免疫治疗时代，到一项又一项实打实的科研证据，NK细胞的抗衰、抗癌能力已经被反复验证。它既能守住我们的免疫防线，还能逆转部分免疫细胞的衰老，给身体筑起一道“年轻屏障”。 对于那些追求健康、想延缓衰老的人来说，定期回输高活性NK细胞，或许是给未来健康“投资”的最佳选择——毕竟，只有免疫力在线，生命才有质量，日子才能过得有滋有味！ #NK细胞 #抗衰抗癌 #免疫力提升 #免疫细胞治疗 #健康长寿#干细胞存储 #抗衰防病 #细胞健康 #免疫细胞 #健康守护#iPSCs技术 #生命备份 #健康套餐 #肿瘤筛查 #医学科研#大健康产业 #细胞产品 #健康体检 #未来智人再生医学#科研试剂 #生物医药 #健康探索 #干细胞培养#中昱控股集团 #生命智码