KIFC3

Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。今年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。 ——背景—— 分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？ ——CRBN靶蛋白空间探索—— 计算挖掘：作者以CK1α的β-hairpin G-loop为查询模板（该模板由I35到E42八个氨基酸组成，包含5个上游残基（G-5）和2个下游残基（G+2）），在蛋白质结构数据库（PDB）和AlphaFold2（AF2）预测的人类蛋白质中进行搜索，选择与查询模板的均方根偏差（RMSD）小于0.75Å且与CRBN无空间位阻基序，并去除其中主要定位于细胞外的蛋白质，最终确定了1424种含有CRBN兼容β-hairpin G-loop的蛋白质，其中成功召回了含有已知β-hairpin G-loop底物（图1）。 图1.A.G-loop模板C.可能与CRBN兼容的G-loop蛋白 实验验证：作者在CAL51细胞中表达TurboID-CRBN，并提前加入CELMoDs，使与CRBN邻近的蛋白质发生生物素化，亲和纯化后进行质谱分析。以DMSO处理的对照细胞为参考，作者检测了化合物处理后蛋白质的富集情况，发现多种蛋白质在化合物存在下发生富集，包括已知的G-loop蛋白（CK1α,WEE1，GSPT1）和新发现的G-loop蛋白（NEK7、MNAT1、PPIL4和CHD7）（图2）。 图2.TurboID实验结果 NanoBRET和TR-FRET实验验证：之后作者将关注点置于蛋白激酶上，这些激酶的N-lobe具备与CK1α同源的G-loop。作者选取了在TurboID实验中呈阳性的激酶（CK1α、WEE1、NEK7、SCYL1）以及其他一些激酶（CAMK2D、CK1δ、LIMK1、PLK3、STK4、TRIB1、TRIB3），通过NanoBRET和TR-FRET实验，最终确定了9种激酶（CK1α、WEE1、NEK7、SCYL1、CK1δ、LIMK1、PLK3、TRIB1、TRIB3）能够在CELMoDs存在下与CRBN形成三元复合物。此外，当把G-loop上的甘氨酸突变为天冬酰胺后，NanoBRET信号消失，这充分表明了G-loop在三元复合物形成过程中的关键作用。 接着，作者进一步将研究范围拓展至先前未曾探索的结构域（RRM、WW、BRK、LIM-ZF、RINGZF、kinesin和HUP结构域），从中挑选出部分蛋白进行NanoBRET实验，以验证其与CRBN/CELMoD三元复合物的形成状况，确定了8种非激酶蛋白（如PPIL4、MNAT1、WBP4、LIMD1、CHD7、ASS1、HNRNPD、KIFC3等）能够与CRBN形成三元复合物（图3）。 图3.NanoBRET实验结果 小结：作者借助计算手段在人类蛋白质组中挖掘出与CRBN结合相关的β-hairpin G-loop，确定了1424种含有CRBN兼容β-hairpin G-loop的蛋白质，它们分布于多种蛋白质类别和结构域类型之中，其中一大类是已知的C₂H₂锌指蛋白。 通过邻近连接实验（Turbo-ID）、NanoBRET和TR-FRET等实验，验证了多种新型β-hairpin G-loop蛋白与CRBN的相互作用，证实了G-loop基序的序列多样性，明确了不同的G环靶标需要不同的化学物质来与CRBN结合。 ——helical G-loop motifs的发现—— 通过对CK1α-Lenalidomide-CRBN三元复合物进行分析，作者确定G-loop参与蛋白-蛋白相互作用贡献最大的5个残基（G-3、G-2、G-1、G和G+1），以此为依据重新定义G-loop并进行挖掘，采用RMSD截止值为0.5Å，排除与CRBN空间位阻不兼容以及位于细胞外结构域的基序，从而得到1633种预测的G-loop蛋白，其中包含184种含有helical G-loop的蛋白质（图4）。 图4.helicalG-loop蛋白 NanoBRET实验：作者针对预测含有helical G-loop的mTOR-FRB结构域开展NanoBRET实验，验证了其与CRBN和化合物Cpd.1的三元复合物形成情况。在突变甘氨酸残基G2092后检测信号变化，证实了mTOR-FRB helical G-loop作为CRBN识别基序的作用；对预测含有helical G-loop的酪氨酸激酶LCK、HCK和LYN（其helical G-loop位于激酶C-lobe的αEF螺旋远端）进行NanoBRET实验，观察到这三种激酶可被不同的小分子诱导，与CRBN形成三元复合物，并且突变G-loop甘氨酸残基能够消除三元复合物的形成，从而验证了预测结果（图5）。 图5.激酶与CRBN的邻近 晶体结构测定：作者解析了DDB1ΔB-CRBNΔ1-40、Cpd.1和mTOR-FRB2022-2114三元复合物的晶体结构（2.95Å），揭示了helical G-loop在复合物中的作用机制，即helical G-loop在mTOR-FRB的四螺旋束顶端通过其C末端CULT结构域与CRBN相互作用，形成与β-hairpin G-loop相似的主链相互作用，且由于螺旋折叠的变化，其G-4残基的主链几何形状与β-hairpin G-loop不同，导致化合物界面更紧凑。 小结：作者发现了一种新的helical G-loop基序，存在于184种蛋白质中，扩展了CRBN-neosubstrate的范围，超越了β-hairpin G-loop。通过生物信息学预测和实验验证，确定了1633种蛋白质原则上可通过G-loop基序被分子胶降解剂（MGD）诱导招募至CRBN，其中1424种含有β-hairpin G-loop，184种含有helical G-loop。mTOR-FRB结构域中的helical G-loop通过C末端CULT结构域与CRBN/CELMoD相互作用形成三元复合物，其招募依赖于甘氨酸残基G2092；酪氨酸激酶LCK、HCK和LYN也可与CRBN/CELMoD相互作用。 参考文献： [1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933. 作者：任宇浩 审稿：郭   政   编辑：郭   政 GoDesign ID：Molecular_Design_Lab （ 扫描下方二维码可以订阅哦！） 点击阅读原文即可查看文献链接 Andy M. Lau et al.