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摘要:膜层析主要应用于下游处理过程中蛋白质和生物大分子的分离和纯化，也用于污水处理。膜层析被认为是柱层析的有效替代方法，因为它显著改善了亲和性、疏水性和离子交换的层析效果；文中详细讨论了膜层析在膜基质和膜设备方面的发展状况，并总结了蛋白质捕获和中间纯化、病毒、单克隆抗体纯化、水处理等应用。这篇综述将为膜层析的探索和潜在应用提供价值。 1.引言 传统的柱层析在蛋白质的吸附容量和分离精度方面具有优势；迄今为止，生物制剂的下游处理在很大程度上依赖于填充床树脂柱的使用。然而，传统柱层析通常存在较高的压降；颗粒内扩散导致溶质分子的积累，这使得处理时间增加，配基利用率低，处理时间长，限制了其生产率；与此同时，柱层析成本昂贵；生物制药生产过程的成本超过60%集中在下游的纯化和回收过程中，其中病毒的下游纯化占总生产成本的70%。 与传统柱层析相比，膜层析更适合大蛋白质的分离和纯化（MR > 250,000）；这些蛋白质很少进入色谱颗粒基质的孔中。对于在传统色谱介质中具有明显扩散限制的病毒和大分子，这一点尤其重要。尽管膜中的平衡结合容量通常较低，但膜孔中的溶质主要是通过对流输送到结合位点，减少了色谱过程的质量传递阻力（图1）。由于在质量传递方面的优势，膜层析是一种有效的从大容量进料中提取微量蛋白质的方法，它可以通过减少与吸附剂接触的时间来维持其天然构象，同时去除杂质，保持所需生物分子的生物活性。Moenster等人使用SartobindQ交换膜吸附器方法一步分离和纯化细胞溶菌酶G酰胺酶，与以前的多步纯化相比，减少了操作单元，并显著提高了下游处理效率。 图1 不同溶液传递模式的示意图：a 膜层析。b 填充床层析。 使用膜改变了填充要求，避免了床层压实，减少了缓冲液的用量，这减少了工业规模色谱处理的主要负担。与填充床系统相比，膜吸附更容易扩大规模；膜可以像卷纸一样卷起来，并以螺旋绕组的方式缠绕在模块周围，以非常小的体积实现大膜面积，仅通过增加膜面积就可以实现工业大规模生产；同时，膜吸附器可以与现有的色谱设备集成，降低投资成本。基于生物技术的膜过程可以根据蛋白质的电荷或大小在高流量和高纯度条件下进行分离。尽管膜层析可以通过洗脱和再生重复使用，但市场上大多数常见的膜吸附器是一次性的。这些优势使其在生物制药生产过程中的进一步研究和实际应用成为可能。然而，膜基质上的结合位点较少，膜的特定表面积小，膜结合强度低，这阻碍了其实际应用。直到2012年，商业规模的膜层析才被广泛接受。目前，膜层析已广泛应用于病毒和内毒素、单克隆抗体纯化、蛋白质捕获和中间纯化、水处理等领域。 2.膜层析分离机制 2.1.基本原理 膜层析技术实际应用的最大优势是，在非常大的横截面积比和低反压下，可以制造出毫米级的床层高度吸附装置。以下公式显示，装载时间取决于最大装载因子LF*（在100%容量利用率下加载的基质体积），线速度（cm/min）和床层高度H（cm），实际选择的容量利用率cu（%） 因此，在相同的容量利用率和处理能力下，膜扩散比树脂扩散更快。典型的过程数据显示，膜吸附器的通量比柱层析在流动模式下的通量高两个数量级。 使用非传统几何格式是膜层析的另一个主要优势，这对于树脂色谱来说是很难实现的。 膜吸附器常采用中空纤维、平板（通常为圆盘形）、径向流、螺旋缠绕、圆柱塞等膜形式（图2）。大多数膜吸附剂是堆叠的，其中中空纤维和堆叠圆盘膜吸附剂已在商业应用中使用。径向流和交叉流膜模块更容易应用于大规模工业生产，因为它们不易产生膜污染。 图2 常见的膜组件类型：a 堆叠圆盘。b 交叉流平板。c 中空纤维。d 螺旋缠绕。e 褶皱板。箭头表示整体流动方向。 膜层析有效地结合了高分辨率的液相色谱和高通量的膜。功能性大孔膜或微孔膜（孔径范围：0.65–3 µm ）代替了传统的树脂珠作为色谱基质。膜孔中含有能与目标物质结合的功能配基。在分离过程中，较小的分子更容易结合到膜孔的内部，因为它们可以进入膜孔，而较大的生物大分子更有可能结合到膜孔的入口。通过这种方式，目标物质从复杂混合物中分离出来。色谱填充料通常由堆叠的色谱膜组成，膜吸附剂充当短而宽的柱子，床层高度较短，降低了对耐压设备的要求。理想的吸附膜应具有亲水表面并保持中性以防止非特异性结合；在吸附、洗脱和再生的严苛条件下，膜应具有稳定的物理和化学性质及机械强度。 膜层析模块的流速范围从3.5 mL/min到50 L/min，体积从0.35 mL到5 L，因此涵盖了从实验室研究到工业规模应用。 2.1.1.离子交换膜层析 离子交换膜层析通过将带电配基耦合到刚性的机械支撑膜上，利用目标蛋白表面的电荷与膜上的带电基团之间的可逆静电相互作用；具有不同电荷条件但相似分子量的生物分子可以容易地被分离。即使样品只有一个氨基酸的差异，在适当的填充和工艺条件下也能被分离。作为众多下游过程的最后一步精制步骤之一，阴离子交换层析已被证明可以有效地去除现有病毒。目前，阴离子交换膜是单克隆抗体纯化的主要方法。 离子交换色谱配基决定了吸附剂和溶质分子之间的交换反应类型和程度。根据离子交换色谱配基的离子电荷特性，离子交换配基可分为阳离子交换配基和阴离子交换配基（表1）。 离子交换技术是一种高分辨率的纯化技术，具有强大的通用性、低成本和小的非特异性捕获，能够完全浓缩病毒载体，并且对病毒载体具有高动态结合能力，是任何其他色谱设备的两倍，比颗粒填充色谱设备高出40倍以上。研究表明，离子膜色谱的动态流速和体积至少比离子树脂色谱在分离大肠杆菌溶液时高一个数量级。溶菌酶通常带正电荷，常用作研究离子交换膜纯化性能的模板。Lee等人通过碱解聚丙烯腈纳米纤维。通过改变碱解聚丙烯腈纳米纤维的工艺参数，可以获得高孔隙率和高功能团密度的三维纳米纤维弱离子交换膜。一步纯化溶菌酶的效率高达98%，纯化比率达到63%。在放大过程中获得了类似的纯化结果，表明纯化技术的线性可扩展性。 2.1.2.亲和膜层析 亲和配基与蛋白质之间的特定生物特性由主要功能团决定，除了氢键和疏水多分子相互作用外，还基于范德华力和静电力相互作用。它基于蛋白质与特定配基之间的可逆生物特异性相互作用，赋予了分子水平上的生物特异性分离选择性；这允许从复杂的生物分子混合物中分离目标蛋白质，如抗体和抗原、酶和底物、激素和受体。与其他基于物理或化学属性分离蛋白质的技术相比，它是唯一基于蛋白质生物功能的方法。由于所需蛋白质分子与亲和配基之间强烈的相互作用，亲和层析通常需要严苛的操作条件来释放与配基结合的蛋白质分子。 亲和模式根据配基类型分类，包括免疫亲和、固定金属亲和和染料亲和（Cibacron Blue F3GA，Reactive Orange 4 ）。前者属于生物学特异性模型，后两者属于群体特异性亲和类型。固定金属离子膜的选择性可以通过使用特定的金属离子固定膜来改变和控制；Ni2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+是通常使用的金属离子，它们与核酸、氨基酸、蛋白质、肽等目标物质具有特定的相互作用。有报道称，通过金属亲和膜吸收成功地从复合饲料溶液中分离出重组DIII抗原，在疫苗开发领域具有巨大潜力。Braemer等人报道了一种CO2+固定金属亲和色谱。使用三个膜吸附单元在连续色谱系统中优化了从大肠杆菌裂解物中纯化重组广藿香合酶。 染料配基依赖于蛋白质和活性染料之间的可逆结合和选择性，具有易于固定化、成本低、结合量大和中等特异性的优势。CB F3GA与牛血清白蛋白（BSA）形成的配体-配基对是亲和色谱的经典模型之一。Cibacron Blue F3GA共价固定在通过同轴溶液吹塑制备的尼龙6-壳聚糖核壳纳米纤维垫上。实验结果表明，功能化纳米纤维垫具有高BSA吸附容量、高通量和低压降的优势。 Mustafaoglu等人报道了一种使用NBS（核苷酸结合位点）配基功能化的膜捕获小抗体分子的亲和纯化技术，通过将NBS配基、色氨酸与再生纤维素膜结合，制备了NBS靶向亲和膜柱，从含有多种污染物的复合培养基样品中纯化抗体，抗体的回收率和纯度均超过98%，NBS靶向亲和膜柱在膜层析平台上实现，促进了小分子亲和膜色谱的进一步研究。 2.1.3.疏水膜层析 在疏水膜层析的分离过程中，主要考虑膜上偶联的疏水配基与蛋白质分子表面的非极性区域之间的疏水作用。疏水配基连接到支撑膜上，生物大分子通过疏水作用吸附到配基上，并通过配基与生物大分子之间的相互作用分离目标大分子。色谱过程通常在高盐浓度下加载，并随着盐浓度的降低而洗脱。疏水膜通常具有优越的机械强度、稳定的物理化学性质和良好的膜耐久性。在处理高粘度进料时，膜吸附器的卓越机械性能非常重要。然而，疏水膜的水渗透性低，抗污染能力差，可偶联到配基的活性基团较少。通过在膜上引入亲水聚合物或环境特异性聚合物，可以增加疏水膜的亲水性，并提供活性基团以增加蛋白质吸附能力。 一些刺激响应性配基在疏水膜层析中使用，这些配基随着环境条件的变化而改变其构象，并能很好地调节配基的三维结构；近年来，环境响应性膜已广泛用于疏水作用色谱，以改进传统疏水膜层析的分离缺陷。温度是环境中容易控制的变量。环境响应性聚合物可以根据温度变化灵活地在不溶性和可溶性之间切换。环境响应性配基在加热时表现出疏水性，在低温释放吸附的目标蛋白质时表现出亲水性。聚(N-异丙基丙烯酰胺)是一种经典的温度敏感性聚合物，在水中含有临界溶解温度31–32℃。当温度高于临界溶解温度时，聚(N-异丙基丙烯酰胺)卷曲成不溶性构象；而当温度低于临界溶解温度时，聚(N-异丙基丙烯酰胺)显示出伸展构象。作为低成本材料且来源简单，滤纸具有良好的生物大分子相容性和良好的空气渗透性，是合适的疏水膜基质。Chen等人成功地将聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物接枝到滤纸的木质纤维表面，并获得了具有温度响应功能的疏水作用膜，这可以通过控制流动水相的温度来调节目标蛋白质的结合和释放。Vu等人通过原子转移自由基聚合在再生纤维素膜表面接枝聚N-乙烯基己内酯，制备了疏水作用膜吸附剂。在高离子强度下加载时，配基显示出脱水构象。在低离子强度缓冲液的洗脱过程中，配基显示出水合构象，对溶菌酶、IgG4和牛血清白蛋白有极佳的回收率。 基于结合和洗脱所需的更高结合能力和更大的膜表面积。Kuczewski等人开发了Sartobind Phenyl™膜吸附器，用于生物大分子的大规模纯化；疏水膜几乎没有扩散限制，减少了处理时间，并在蛋白质结合能力上与传统疏水作用色谱树脂相当，并且具有良好的分辨率。 3.多模式膜层析 为了提高蛋白质的纯度，通常会结合几种分离和纯化方法。Fan等人使用两步膜层析从人血浆中提取α1-抗胰蛋白酶。首先通过阴离子交换膜色谱在结合/洗脱模式下捕获血浆蛋白，然后通过流式疏水作用膜色谱进一步精细化。Cordova等人报道了一种串联膜吸附器Sartobind® S和Phenyl用于抗体-药物偶联物的纯化。Sartobind® S和Phenyl膜串联放置，将整个抗体-药物偶联物纯化过程集成到单一单元操作中。与传统的抗体-药物偶联物纯化方法相比，它节省了时间并节省了粗提物。多阶段膜层析，结合几种膜吸附剂来纯化物质，可以大大减少操作时间并提高纯化精度，是一种有前途的分离模式。通过结合使用，多个模块可以实现更高的动态结合能力或更高的流量，或两者兼有。 4.膜基质 4.1.天然聚合物材料 由于丰富的羟基，纤维素分离膜具有很强的亲水性，作为一种天然聚合物，具有价格便宜、来源广泛、多孔结构和高度抗非特异性吸附的优点，可以最小化纤维表面与溶质之间的非特异性结合。因此，大多数膜基质来自纤维素膜。然而，纤维素膜的化学和物理性质不稳定，这限制了这些膜的可重复使用性和使用寿命。在膜表面接枝和化学改性膜表面是制备色谱膜的主要方法。Ma等人将顺丁烯二酸酐连接到纤维素支撑膜上，制备了改性纤维素纳米纤维膜，显示出高溶菌酶吸附容量，并实现了蛋白质的有效纯化。Tafta等人报道了一种改性纤维素膜，该膜用硫酸纤维素修饰，显示出与流感病毒的高选择性伪亲和性，表面积设计得尽可能接近病毒，这大大提高了产品的选择性和回收率。在相同的回收率和纯度条件下，该膜对流感病毒的结合能力是商业膜的5倍（图3）。这有潜力为疫苗行业的优化和创新提供新的平台。 图3 a 病毒在传统树脂表面和SCMA膜上的吸附模型。b SCMA膜与市售硫酸化纤维素树脂的比较评估。 壳聚糖和甲壳素具有独特的可降解性和生物学效应。利用天然的壳聚糖/羧甲基壳聚糖混合膜作为基质，我们建立了基于壳聚糖的膜层析；通过膜层析成功地从它们的二元混合物中分离了卵清蛋白和溶菌酶。壳聚糖膜吸附剂已成功用于分离一些高附加值的生物产品，在废水处理中具有巨大的应用潜力。甲壳素膜能在酸性、碱性和常见的有机溶剂中稳定存在。同时，甲壳素膜的一个重要特性是它含有N-乙酰-D-葡萄糖胺单元，这是麦胚凝集素和溶菌酶的亲和配基；因此，N-乙酰-D-葡萄糖胺单元可以直接用于蛋白质的亲和分离，无需化学修饰。由于其在膜形成和纤维形成能力以及良好的亲水性方面的表现，壳聚糖受到了广泛关注。甲壳素和壳聚糖通常用作膜基质或膜涂层，已被证明能够在其他聚合物载体上改善膜性质。研究表明，壳聚糖改性的聚丙烯腈(PAN)纳米纤维膜能够有效地从复杂的藻类溶液中过滤磷酸钙。 4.2.聚合物膜 用具有良好化学抗性、机械稳定性、材料表面修饰能力和孔性质的聚合物材料制备的膜比其他膜基质更有优势，通常包括脂肪族聚酰胺（尼龙6、尼龙66）、纤维素（纤维素醋酸酯、纤维素硝酸酯）、芳香族共聚物（聚砜、聚醚砜）、碳氢化合物聚合物（聚偏二氟乙烯）、聚乙烯醇、合成共聚物。聚砜离子印迹多孔吸附剂膜用于从水中去除汞(II)。Yu等人通过紫外引发的自由基聚合方法在聚醚砜膜表面接枝了一层聚(甲基丙烯酸环氧乙酯)，并通过锌过氯酸盐催化的环氧化物开环反应，将赖氨酸分子共价固定在膜表面，并合成了一种氨基酸功能化、镧结合的膜吸附剂。Hamzah等人的基础膜是用15%聚砜通过相转化技术制备的，并通过将基础膜浸泡在壳聚糖溶液中来修饰膜表面。然后，使用戊二醛激活膜，并通过疏水性聚砜和亲水性壳聚糖的自组装将亲水性链段引入膜表面。开发了一种具有高特异性的胰蛋白亲和膜。Liu等人在尼龙膜表面沉积了多巴胺作为中间连接层，并通过Michael加成反应和/或Schiff碱反应共价接枝聚乙烯亚胺分子到多巴胺层。然后，通过L-半胱氨酸修饰聚乙烯亚胺-多巴胺/尼龙膜，制备了一种含硫醇功能的尼龙膜吸附剂，对黄曲霉素具有良好的去除能力和可重复使用性。聚合物混合涂层是一种有前途的膜制备策略，通过同时应用两种聚合物的某些或全部性质或相互补充，生产具有竞争力的膜，具有蛋白质结合能力，被证明优于商业树脂。 4.2.1.商业膜基质 商业膜基质的发展相对成熟；聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)和PVDF是常用的商业聚合物膜，具有良好的机械强度，是疏水性膜，亲水性差，缺乏反应位点，容易发生特异性结合；因此，大多数聚合物膜在使用前都经过修饰，很少直接用于分离和纯化。疏水性惰性膜可以通过涂层或辐射诱导引入亲水性功能聚合物来改善亲水性。在各种聚合物膜表面涂覆多巴胺是一种常见的提高亲水性的方法。因为多巴胺涂层具有很强的共价化学键，多巴胺涂层基膜成功地与聚乙烯亚胺、十二硫醇和组氨酸等配基连接，增强了膜的吸附能力。在碱性操作条件下，多巴胺可以在各种基材上通过形成强非共价键自聚合形成多巴胺层。Fan等人采用在商业疏水PVDF多孔膜上形成的多巴胺中间层，通过含初级胺基的聚烯丙胺偶联。多巴胺沉积后，商业PVDF膜的机械性能得到提升。由于多巴胺易于沉积在膜表面并进入膜孔，实现了PVDF膜的有效功能化和亲水性，获得了耐盐阴离子交换膜（图4）。蛋白质的反复结合和洗脱表明，耐盐阴离子交换膜吸附剂比商业吸附膜具有更高的重复使用率和更好的机械性能，并且在高效纯化单克隆抗体(mAb)方面具有极大的潜力。 图4 耐盐阴离子交换膜吸附器的制备示意图。 海藻糖醛是一种卓越的生物粘合剂。使用海藻糖醛作为中间层，通过Schiff碱反应将金属螯合配基、肽、磺酸和组氨酸键合到商业尼龙膜上，无需任何溶剂。金属亲和(Metal-affinity)、肽亲和(Pep-affinity)、阳离子交换和组氨酸亲和(His-affinity)膜吸附剂的制备，为不同膜吸附剂的制备创造了更多平台。 与其他常见的商业膜基质不同，Natrix HD-C膜是一种聚丙烯酸多孔水凝胶。水凝胶具有相互连接的多孔三维结构，这为高渗透性进料流体提供了便利的孔洞，并为蛋白质结合提供了可接近的表面积。与传统的阴离子交换树脂相比，Natrix HD-C膜在高负载能力和快速操作速度方面具有明显优势。下表总结了目前市场上一些类型的膜吸附剂（表2）。 4.2.2.静电纺丝膜基质 聚合物可以通过静电纺丝制成纳米纤维，与传统膜相比，具有更大的比表面积和更高的孔隙率，具有可调节的曲折开放孔结构，可从各种材料中规模化合成，增强了固定效率，并增加了可重复使用性和长期稳定性。基于涉及静电相互作用、染料-配基亲和性、疏水亲和性和靶向亲和性的不同驱动力，已经开发了各种新型静电纺丝纳米纤维色谱材料，用作蛋白质吸附剂。 Yang等人通过混合和静电纺丝将预功能化的季铵盐PAN共聚物整合到传统的PAN均聚物中，并设计了一种具有强烈阴离子交换功能的静电纺丝PAN基复合膜，该膜可以轻松定制以用于不同的分离目的。三羟甲基氨基甲烷功能化的静电纺丝PAN纳米纤维膜制备的亲和膜色谱具有强大的结合特异性和对相应目标的良好的吸附能力。通过接枝溴乙酸和乙二胺二盐酸盐对静电纺丝PAN纳米纤维膜进行功能化改性；制备了聚酸离子交换纳米纤维膜，用于蛋清中溶菌酶的纯化。Ng等人在壳聚糖分子改性的静电纺丝PAN纳米纤维膜上固定活性橙4，并成功制备了染料亲和纳米纤维膜。 乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)具有水不溶性和良好的亲水性，易于功能修饰，耐腐蚀和生物相容性；大量活性羟基也可以用于进一步衍生化，是制备色谱材料的理想选择。Fu等人结合原位修饰技术和混合静电纺丝技术；丁烷四羧酸(BTCA)作为接枝剂被引入到EVOH溶液中以制备纺丝溶液；纺丝过程后，原始BTCA和EVOH混合纳米纤维膜被干燥，然后在100°C下热固化；BTCA改性的EVOH纳米纤维膜(BTCA@EVOH NFM) - 基于阳离子交换色谱介质被制备用于蛋白质吸附和分离（图5a）。同时，他们还使用柠檬酸(CCA)作为改性剂，水和异丙醇的混合物作为纺丝溶液来准备EVOH纳米纤维膜；真空干燥后，浸入柠檬酸溶液中以改性膜表面；随后，通过热处理获得了CCA改性的EVOH纳米纤维膜(EVOH-CCA NFM)（图5c）；这两种膜对溶菌酶表现出异常优秀的吸附能力（图5b，d），这归因于向纳米纤维基质中引入大量羧基吸附基团（羧基）的协同效应；相对较长的碳链也可以作为间隔臂，可以减少吸附蛋白和吸附基团之间的空间位阻，从而大大改善蛋白质分子与活性吸附位点的结合。 图5 BTCA、CCA接枝剂EVOH纳米纤维膜的制备和功能化过程，以及吸附能力。a 制备的BTCA@EVOH NFM及其改性原理。b BTCA@EVOH NFM与平板膜和混合膜的吸附能力比较。c 制备的EVOH-CCA NFM及其改性原理，以及蛋白质吸附过程。d EVOH-CCA NFM与平板膜和混合膜的吸附能力比较。 新膜技术表面的改性和更高的比表面积为膜色谱的发展提供了新的前景；静电纺丝纳米纤维膜已在连续模拟移动床过程中使用，与传统膜吸附剂相比，提高了容量的同时保持了高吞吐量。 5.膜设备 目前，膜设备通常采用径向流形式，径向流膜色谱通道复杂且死体积大。膜厚度、不均匀的膜孔隙率和配基接枝可能导致流动阻力变化和不适当的对流，导致宏孔中的结合位点过早饱和；小孔的利用不足或不使用将降低膜的结合能力。同时，传统的膜色谱设备具有洗脱峰宽、分辨率低、无效体积大、流动路径复杂和分离性能差的优点。大多数设备仅设计用于实验室规模，并不用于大规模使用。 5.1.横向进料膜色谱 为了解决上述问题，研究人员提出了横向进料膜色谱（LFMC）。横向进料装置在流动分布、膜结合能力的利用率和峰分辨率方面优于叠盘装置。其优点包括无效体积低、易于返混，有助于形成更清晰和更好的峰分辨率，适用于高分辨率的组合洗脱模式和多组分蛋白分离。径向流装置和LFMC的流动路径示意图如图（图6）。基于LFMC的技术能够在大约165 kPa的压力下操作，在不到1.5分钟的时间内分析不同单克隆抗体样品中的聚集内容和类型。与HPLC相比，这种方法更有效。此外，LFMC的工作压力小于200 kPa，不需要昂贵的色谱系统高压泵。LFMC已被证明是一种适合快速高效分离的流动模式，并且可以在最大程度上最小化样品稀释。例如PEG化蛋白和单克隆抗体聚集物的分离。 图6 a 径向流膜色谱设备。b LFMC膜色谱设备。 Kawka等人使用一种综合方法，考虑了酶色谱和DNA消化步骤；使用含有Sartobind Q膜的LFMC设备进行腺病毒的纯化。设计的集成工艺开发方法将DNA去除提高了约80倍，灵活的洗脱操作产生了良好的DNA去除和高病毒回收。 5.2.其他改进 Chen等人设计了一种年流空心纤维膜色谱装置，从流体动力学的角度确保了溶质停留时间分布狭窄、死体积低、最小流体返混。在环流空心纤维膜色谱设备中引入插入件可以减少进料侧的无效体积。插入件的引入还导致进料侧的环流，改善了两侧的流动性能（图7）。环流空心纤维膜色谱装置可以实现近等电点蛋白的快速高分辨率分离，并且是堆叠盘组件的有效替代品。 图7 a AHMC的分解视图。b AHMC的流动路径图。 Ghosh等人提出了Z2色谱装置的流动分布，并结合LFMC和Z2来提高膜色谱的分离效率；设备中的流体流动路径有三层（图8）。 图8 a Z2 LFMC设备在三个层面上的理想流体路径图。b Z2 LFMC设备。 直接通道设计最小化了返混，膜堆的倾斜组合减少了溶质在设备中的停留时间。实验表明，该设备的分辨率与填充树脂色谱相似，流速是柱色谱的40倍，适用于在相同的流速和柱色谱下进行生物制药的高分辨率分离，显著提高了分离程度。Roshankhah等人通过阳离子交换Z2横向进料膜色谱（Z2 LFMC）纯化曲妥珠单抗；通过Z2 LFMC方法获得的曲妥珠单抗纯度等同于蛋白A色谱方法，但Z2 LFMC方法的回收率显著高于蛋白A方法，Z2 LFMC的洗脱速度更快。通过Z2 LFMC工艺获得的单克隆抗体的生产力是柱基纯化过程的三倍以上。 Madadkar等人提议在盘的前部或后部设置一个流向导向层。重新导向液流可以解决盘膜色谱中溶质停留时间长的问题，从而提高分离效率。Chen等人报告了一种从流体角度设计的环流空心纤维膜色谱装置；该设备解决了流体动力学差和无效体积的问题。Borneman等人设计了一种新型粒子装载膜吸附模块，通过缠绕吸附纤维，通过重新排列吸收剂纤维填充物。在缠绕过程中提高两个相邻环形纤维之间的间隔，增加了模块的孔隙率。更大的布局间距产生较少的流动阻力，并促进了纤维周围的流体流动，吸附性能和流速高度相关，从而实现了更快的吸附过程。 6.配基优化 为了获得理想的色谱结果，膜需要具有高内部表面积、易于功能化的先进多孔材料，具有高孔隙率、多样化的功能和可调节的孔隙率。膜孔径至少应该是目标物质平均直径的5倍。然而，过大的孔洞也可能导致配基接枝的总表面积减少，或者目标物质没有足够的时间与膜上的配基结合而丢失目标物质。 膜吸附剂的结合能力不仅取决于目标生物分子的大小和膜孔径大小，还取决于配基设计。研究表明，当通过离子交换膜色谱纯化病毒载体时，增加配基密度并不会导致病毒结合能力的相应增加。然而，当通过膜亲和色谱纯化时，配基密度的增加与结合能力的增加呈正相关。这些现象可以归因于生物大分子之间的空间位阻和空间排斥；配基的有效三维结构对于最大化回收率和容量很重要。 Yoshimoto等人报告了一种含有混合配基的阳离子交换膜。复合膜不仅含有疏水配基，还含有增强的离子交换基团，包含纤维素。与传统的阳离子交换膜相比，在更高的电导率下具有更高的蛋白质结合能力。尽管这种相位的确切相互作用和分离机制尚未完全阐明，但提出了一种双重作用机制。这种技术已有效地用于从高盐溶液中分离高价值蛋白。 与传统膜吸附剂相比，膜基质配基优化具有更大的比表面积、更高的配基密度和更好的三维结合环境。 6.1.间隔臂 膜表面具有用于混合物流的微孔或微孔结构，以及用于耦合功能配基的间隔臂或活性基团。当配基比例相当小的时候，由于空间位阻，目标蛋白质的生物位点难以与膜上的配基接触。过长的间隔臂会导致非特异性粘附，而过短的间隔臂则无效。同时，间隔臂促进配基旋转并推进配基-配基复合物的有利方向。过长的间隔臂会导致非特异性结合，而过短的间隔臂则无效。大多数选择具有6-10个碳原子的间隔臂。选择的间隔臂必须能够与配基和膜基质相互作用，但不应该有其他活性位点用于非特异性吸附。研究表明，间隔臂显著影响相关性质，如回收率、选择性和结合能力；然而，尚未进行系统实验研究间隔臂本身对非特异性结合的影响，从而影响蛋白质回收。 6.2.聚合物刷 聚合物刷是具有高接枝密度的聚合物链；强大的排斥力使独特的拉伸结构，增加了内部三维结构的体积。蛋白质通过疏水或静电非特异性相互作用，或通过受体和配基之间的特异性相互作用与聚合物刷结合。作为一种潜在的蛋白质结合介质，聚合物刷改性的膜表面可以增加亲和配基的表面浓度并优化纯化质量，这是蛋白质纯化的重要工具。Hu等人通过在聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯接枝的微孔聚丙烯膜上固定含有胆酸的聚合物刷。制备了一种含有聚合物刷的改性膜，用于白蛋白的亲和吸附。改性的微孔聚丙烯膜对白蛋白具有很强的亲和性，对血红蛋白的非特异性吸附很差。亲和膜的结合能力大约是单层的24倍。 7.应用 7.1.蛋白质捕获和中间纯化 膜层析是用于分离、纯化和回收蛋白质和酶的大规模分离方法，是一种综合性的蛋白质纯化技术。Honjo等人利用蛋白质和配基之间的亲和性合成了几种类似表面活性剂的配基；通过热诱导相分离将它们引入多孔聚合物膜中，制备了亲和膜。改性功能化的膜可以从细胞裂解液中选择性地纯化目标蛋白。 高纯度的藻蓝蛋白通常通过涉及不同柱层析方式的多个纯化过程获得，这阻碍了大规模开发。Mah等人使用商业PVDF膜，并通过两步疏水作用在几分钟内获得了分析纯的藻蓝蛋白；提供了一种简单高效的纯化方法。 Eldin等人分别在赛璐珞膜上接枝了甲基丙烯酸甲酯(MMA)和丙烯酸甲酯(MAA)，并在接枝膜上进一步固定Cu2+，制备了两种固定金属亲和膜，用于从BSA蛋白混合物中分离His标签的几丁质酶酶。PMAA接枝膜比PMMA接枝膜对几丁质酶酶的分离显示出更高的亲和性，但PMAA接枝膜的亲和优势较小。此外，在蛋白质洗脱过程中，两种亲和膜中均未检测到Cu2+泄漏，解决了金属离子泄漏的问题。 Teepakorn等人成功地使用强阳离子和阴离子交换膜色谱分离了两种等电点不同但分子量相似的蛋白质。对于乳铁蛋白(LF)和牛血清白蛋白BSA的混合物，使用阳离子交换膜时，LF完全吸附到膜上，BSA的单位面积通量最大；使用阴离子交换膜时情况正好相反。膜色谱分离BSA-LF混合物可以在高流速下操作，不影响任何选择性。 聚乙二醇化蛋白可以提高治疗蛋白的可接受性和临床效果，大多数聚乙二醇化蛋白通过柱层析纯化。Yu等人使用商业阳离子交换Sartobind S膜从天然溶菌酶和其他聚乙二醇化形式中分离了单聚乙二醇化溶菌酶。结果表明，Sartobind S膜可以很好地分离单聚乙二醇化溶菌酶、高阶聚乙二醇化形式和天然溶菌酶，是聚乙二醇化蛋白纯化技术的有效的替代品。 Shi等人通过溶胶-凝胶法在阳极氧化铝(AAO)膜上沉积二氧化硅，制备了具有均匀厚度和均匀孔隙分布的复合膜。通过戊二醛的活化，赖氨酸被固定在AAO-SiO2复合膜上作为配基。动态吸附结果表明，亲和膜已成功用于从血浆中去除胆红素。 单克隆抗体在当前生物制药行业中扮演着重要角色，因为它们可以大大减少药物的副作用。Masuda等人发现mAb1非对称表面电荷分布，在标准色谱条件下mAb1与阴离子交换树脂结合，无法实现分离和纯化效果。他们在标准色谱条件下使用Natrifo HD-Q阴离子交换膜吸附剂，成功地从病毒中分离出mAb1，解决了mAb1无法从阴离子交换树脂中分离的问题，并实现了令人满意的病毒清除率。疏水充电诱导色谱，作为一种多模式色谱技术，是抗体纯化的有效方法；Ma等人提出了一种可扩展的表面改性方法，用于制备疏水充电诱导色谱混合模式膜吸附剂。首先，商业再生纤维素膜通过二乙二醇二缩水甘油醚的阳离子开环聚合进行改性；然后，通过环氧基与四个巯基杂环配基中的硫醇基的开环反应进行改性。获得了具有典型疏水充电诱导色谱性能的膜吸附剂。实验结果表明，膜吸附剂可以实现高达96%的IgG单体抗体回收率。Sadavarte等人使用疏水膜色谱技术不仅直接从细胞培养上清中一步纯化人源化嵌合重链单克隆抗体，而且还从单体形式的人源化嵌合重链单克隆抗体中分离聚集体，大大提高了纯化效率。 7.2.病毒 膜层析作为一种有效的病毒纯化技术，已成功应用于工业生物制药。Hejmowski等人使用Mustang Q膜阴离子交换色谱富集完整的腺相关病毒颗粒。在洗脱过程中，电导梯度增加约1 mS cm–1步梯度可以更有效地分离膜介质中完整和空的腺相关病毒血清。这种洗脱方法可以应用于可扩展的过程，为其他腺相关病毒血清型的洗脱方法开发提供参考。 Fortuna等人使用带有Sartobind® SC膜吸附剂的三柱周期逆流装置，以联合洗脱模式连续纯化流感病毒A/PR/8/34病毒颗粒。有效利用的结合能力可以提高到80%，可以成功地作为细胞源性流感病毒颗粒的连续模式使用。 Lee等人报道了通过金属亲和膜色谱(在膜单元上固定Zn2+离子作为亲和配基)对腺病毒的抛光。膜的平均产量显著高于相同缓冲系统的树脂色谱。更重要的是，膜可以很好地分离有缺陷的腺病毒颗粒和完整的腺病毒。 7.3.水处理 结合了吸附优势和膜分离的膜吸附器，在水溶液中去除污染物方面受到了极大的关注。Fan等人在基础膜上涂覆多巴胺，然后接枝聚乙烯亚胺以制备膜吸附器。在流动模式下，从粗发酵溶液中捕获漆酶，并选择性地在膜吸附器上固定漆酶以构建生物催化膜。生物催化膜在仅重力作用下在水中展示了对双酚A的显著去除效率（图9）。使用酶固定化的生物催化膜从水中去除双酚A微污染物已被广泛研究。 图9 通过膜层析中固定化的漆酶从水中去除双酚A。 Sepesy等人合成了胺功能化的膜吸附器，在70 kPa下从酸性溶液中吸附Cu2+；过滤时间比当前的填充树脂柱技术快25倍。Hu等人设计了一个在碱性或酸性条件下稳定性良好的多孔聚(N-乙烯基咪唑)凝胶填充膜吸附器，并通过吸附过滤实现了水中阴离子染料的快速去除，并可使用NaOH溶液有效再生。 在地下室膜上涂覆或接枝壳聚糖大大改善了亲水能力，因为壳聚糖上丰富的羟基和氨基可以通过静电吸引或螯合与水中的重金属离子结合，例如水中的Cr6+、Cu2+、Cd2+和Pb2+，展示了在水处理中去除重金属离子的良好应用前景。Wang等人使用硅作为孔隙形成剂，通过浸渍沉淀法制备了连通性和对称性的壳聚糖微孔薄膜。实验结果表明，作为吸附层的膜对低浓度铜离子具有很好的吸附能力。随着床层厚度的增加，铜离子的负荷增加，为低浓度深度废水处理提供了潜在的替代技术。 聚乙烯醇的极好亲水性使其成为制备膜吸附器的竞争选择。de Almeida等人基于制备组氨酸改性的尼龙膜吸附器的内毒素；使用聚乙烯醇作为涂层聚合物和二恶烷作为间隔物对尼龙膜进行表面改性；将尼龙涂覆聚乙烯醇以减少非特异性吸附，并用于水溶液中去除内毒素。改性膜的使用寿命长达30个月，具有很高的稳定性。 Chen等人基于β-环糊精和沸石咪唑骨架-8(β-CD@ZIF-8)纳米颗粒，通过深层渗透合成-协同渗透反应的制造方法制备了一种PVDF复合膜；β-CD@ZIF-8沿膜厚方向锚定在每个膜孔中，并在PVDF膜孔中原位组装。借助膜孔的高比表面积和均匀性，提供了更多的活性位点；PVDF复合膜在废水中对重金属离子Pb2+和Cu2+显示出良好的吸附性（图10）。 图10 a PVDF上Zn(II)的组装：β-CD@ZIF-8/PVDF的制造。b ZIF-8的组装和β-CD的形成。c 膜的结构。d β-CD@ZIF-8结合的草图。e Pb2+和Cu2+的吸附机制。 Lee等人使用静电纺丝PAN纳米纤维膜作为膜基质，PAN膜被水解以获得P-COOH膜；然后，P-COOH膜与BSA偶联制备了阳离子交换纳米纤维膜(P-COOH-BSA)。由于牛血清白蛋白可以结合三价或二价金属离子，P-COOH-BSA膜在工业废水处理过程中对Ca2+显示出令人满意的结合能力。 目前，大多数膜吸附器仅适用于单一目标物质的水溶液，在复杂的水环境中将失去对目标物质的吸附性能，并对目标物质没有选择性。很少有在实际条件下进行吸附实验的报告。 7.4.其他应用 Wang等人研究了基于海藻酸钠亲和色谱膜的内置电极对锂硫电池中多硫化物离子严重穿梭效应的抑制效果。这是首次将用于蛋白质选择性吸附的膜用于电池领域。这一创新有望提高锂硫电池在实践中的稳定性，并为锂硫电池中PS穿梭提供简单且大规模的准备方法。Pei等人报道了一种用于锂同位素(7 Li和6 Li)吸附分离的膜色谱系统。它在色谱柱中填充了聚砜-GRAFT-4′-氨基苯基-15-冠-5-醚(PSF-G-AB15C5)多孔膜作为固定相。为了优化锂同位素的分离性能，设计了一个四级串联膜色谱系统。膜色谱系统对锂同位素的分离效率显示出更好的效果。 8.总结和展望 作为色谱柱填充物的有效替代品，过去对膜层析进行了广泛的研究，探索了病毒纯化的用途；纯化的病毒已被用于基因治疗和疫苗生产。目前，离子交换膜色谱用于生物制药工业中单克隆抗体生产过程的精制；疏水作用色谱膜吸附器通常处于流动模式，很少使用。目前，结合柱层析或单体柱的膜层析色谱过程已应用于生物生产过程领域，并在处理水中的微量有害物质（如重金属离子或染料）方面显示出良好的应用潜力。 鉴于膜材料的原材料制造成本相对较高，膜层析的纯化能力必须达到相对较高的值，或者具有较高的循环再用率，以确保低商业成本，具有相对较高的经济价值。正在开发可预测和高精度的理论模型，以更好地阐明潜在的质量传递现象，从而提高膜的分离性能。一次性膜吸附剂方法是目前色谱柱填充的一个小市场分支，从采用和评估的角度来看，在下游处理技术中，其发展更为先进。 膜的二维平面结构导致结合率低，膜的配基密度、孔径分布和厚度均匀性难以达到理想要求，这是膜色谱的主要限制。尽管存在众多挑战和障碍，过去十年的研究趋势表明，各种色谱膜的制备和应用已有许多改进。优化膜的结构和配基团的排列可以大大改善色谱膜的捕获。该行业仍然需要更多的革命性发展。值得指出的是，该主题的开发和工业研究被认为是保密的，尽管部分膜色谱技术已经商业化；可阅读的大多数文献处于实验研究阶段。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

常规的非复制线性mRNA分子的优化通常涉及5'/3'端非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF），并以实现持久高效的翻译为目的。目前针对线性mRNA的序列设计优化方案集中于优化ORF序列以提供稳定持久的翻译，并在此基础上形成更稳定的mRNA分子二级结构。与线性mRNA不同，除了ORF区域外，环状RNA（circRNA）通常含有用于非帽依赖性翻译启动的内部核糖体进入位点（IRES）基序。正确折叠的IRES功能基序用于募集翻译前起始复合物（PIC），也是实现circRNA高效翻译不可或缺的条件之一。由于缺乏专门用于circRNA的结构预测和序列设计工具，以及对circRNA序列中IRES和ORF区域之间交叉相互作用的理解不足，目前circRNA的序列优化严重依赖于大量重复性的模块化筛选。如果仍按照线性mRNA的优化思路，只关注ORF区域的优化将会忽视IRES基序与其他区域骨架序列在构成circRNA整体时所产生的不确定因素，影响整体的序列优化结果。2023年7月10日，斯微生物研发团队与来自“LinearDesign”主要设计团队的中国药科大学张亮教授和Coderna.AI创始人黄亮教授联合在预印本bioRxiv上发表了题为“Improving the Circularization Efficiency, Stability and Translatability of Circular RNA by circDesign（通过circDesign提高环状RNA的环化效率、稳定性和可翻译性）”的研究论文。在早前专门用于设计优化线性mRNA序列的高效人工智能（AI）算法“LinearDesign”的基础上，进一步推出了用于环状RNA结构预测与序列设计算法平台——“circDesign”，是有望提高编码蛋白质的环状RNA环化效率、稳定性和翻译效率，简化circRNA的序列优化设计的有效设计开发工具。在本研究中，设计者团队将circDesign算法应用于基于circRNA的狂犬病（RABV）和带状疱疹（VZV）疫苗的序列优化设计中，在小鼠模型中增强了circRNA的序列稳定性和翻译效率，成功验证了circDesign平台在circRNA序列设计优化上的有效性。作者说斯微生物创始人、董事长李航文博士表示，斯微生物在mRNA平台搭建上持续创新，自从将人工智能算法应用在线性mRNA的序列设计上以来，取得了显著的进展。目前将人工智能算法布局在环状RNA平台上，也是国际首个通过人工智能算法优化设计环状RNA的案例，同时是斯微生物创新实力的体现。文章第一作者，斯微生物mRNA平台研发负责人徐聪聪博士表示，此项与中国药科大学人工智能专家张亮教授，以及美国Coderna.ai公司人工智能专家黄亮教授的合作，进一步展现了人工智能算法在RNA领域应用的广阔前景，环状RNA作为一种新型RNA技术，未来在传染病预防性疫苗以及治疗性药物方面的开发方面可能与现有线性mRNA技术齐头并进，甚至在某些应用场景下具有独特的优势。本文的共同一作，circDesign算法开发人，LinearDesign共同一作，中国药科大学张亮教授认为此项工作在与斯微生物前期合作基础上产生了新的成果，针对环状RNA的序列设计需要考虑更多的因素，目前也在积极探索针对不同RNA平台的设计算法，希望人工智能技术能够加速RNA疫苗和药物的开发。CircDesign的应用概述和流程非复制线性mRNA的功能元件，包括5'-UTR和3'-UTR长度相对较短，约为100nt；而人工体外合成的circRNA通常需包含长病毒和细胞IRES序列，长度为500-800nt。IRES也需要不受其他序列的干扰完成独立有效的分层折叠才得以高效招募PIC进行翻译。基于这一特性，circDesign还着重考虑减轻ORF区域与IRES基序的交叉相互作用，以实现功能性IRES的有效折叠。同时circRNA残留的外显子片段（循环置换内含子-外显子（PIE）的残留片段）可能会给circRNA的整体功能带来不确定性，虽然目前未有深入研究报道该片段对circRNA整体功能的确切影响，但普遍认为这些片段会干扰其他元件的折叠，因此优化ORF区域时也需要采取一定的预防措施。CircDesign的基本应用流程主要有四步骤（图1a）：1. CircDesign首先基于给定的氨基酸序列，生成大量mRNA序列库；2. CircDesign基于最小自由能（MFE）*和密码子适应指数（CAI）*对circRNA的ORF区域序列进行筛选，考量ORF的稳定性和翻译效率，并将其与包括IRES、外显子片段在内的功能部分和骨架组装成完整circRNA分子；3. 在完整circRNA分子中评估IRES的位置熵（即circRNA的折叠 ）和circRNA的集合多样性，以及区域间相互作用。位置熵越低，IRES结构越保守；而集合多样性越低，表明circRNA整体结构一致性更高，更可预测。两者均有助于评估获得更高的结构严密性。区域间相互作用的评估主要目的为减轻ORF对IRES独立折叠的影响；4. 在上述筛选过程后，在体外、体内模型中对设计的circRNA进行进一步的筛选评价。“【最小自由能（MFE）】RNA 分子中碱基对以及核苷酸之间均是靠氢键进行连接的，通过破坏 RNA 二级结构中不同子结构中的氢键所需要的能量值可以得到这些子结构在组合时所需要消耗的能量，这个能量被称为自由能。RNA 分子结构之所以能够稳定，其原因就是碱基配对造成了能量的降低。因此，最小自由能算法认为，自由能趋向越小的时候RNA二级结构越稳定。【密码子适应指数（CAI）】密码子适应指数（CAI）是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度，取值在0~1之间。CAI可以用来评估外源基因在宿主内的表达水平，CAI越高，则外源基因在宿主内的表达水平越高。图1. circDesign方法概述和编码RABV-G的环状RNA分子设计流程以编码RABV-G为例的circRNA设计、合成和表征设计如上图1b所示，研究团队通过circDesign设计获得了6个编码RABV-G circRNA的ORF（CR1-CR6）序列，这6种设计均分布在低MFE区域。团队遵循了早前LinearDesign的实验设计原理，同时采用了分别来自赛默飞世尔（ThermoFisher）和近岸蛋白（Novoprotein）公开平台设计的基准ORF序列（CR-Ther，CR-Novo），并使设计的每个序列MFE值（CR2, CR3 // CR4, CR5）或CAI值（CR5, CR6, CR-Ther // CR1, CR2, CR-Novo）均尽量成对保持一致，在图1b中以绿色的颜色深浅表示组装后circRNA的集合多样性。随着ORF区域的MFE降低，circRNA的集合多样性降低，表明每个序列均有明确独立折叠的结构。研究使用来自柯萨奇病毒B3（CVB3）的IRES嵌入ORF上游驱动circRNA的蛋白质翻译。合成本研究中采用了I型内含子自剪接系统（Group I intron self-splicing system），利用核酶介导circRNA的环化。自剪切I型催化内含子（group I catalytic intron）通常被设计成分离的5'-内含子和3'-内含子两部分。在线性mRNA阶段时，分子两端由互补的同源臂组成，以促进活性核酶结构的折叠，并通过两个酯交换反应（Transesterification Reactions）以形成两个外显子片段（E1和E2）之间的连接。表征研究以CR3和CR-Novo为代表进行了参数检验表征和二级结构预测。通过circDesign设计的CR3，其ORF具有相对更低的MFE，同时与IRES基序的区域间相互作用更弱。从图1d所示两者的二级结构可以发现，浅灰色代表的IRES基序在两个circRNA中具有不同的折叠，同样在CR-Ther中也观察到次优ORF在一定程度上对IRES正确折叠的影响。图1e显示，CR-Novo比CR3具有更多的区域间碱基配对（红色连接线），CR3中主要表现为区域内的配对折叠（蓝色连接线）。在circRNA环化过程中，更紧凑的ORF折叠（区域内）对活性内含子的干扰相对较小，circDesign生成的序列（CR1-6）比CR-Novo和CR-Ther具有相对更高的环化效率（图2a）。图2b所示为室温下进行的非变性琼脂糖凝胶电泳结果，在相同的核苷酸长度下，circRNA的凝胶迁移率与其MFE值密切相关。具有最高MFE的CR-Novo序列在凝胶基质中表现出最慢的迁移率，而CR1-5由于其高度紧凑的折叠结构而具有更快的迁移率，表明优化的circRNA ORF序列在调节其折叠方式上的潜力。图2. circDesign设计的CR1-6及CR-Ther，CR-Novo的表征优化circRNA的体外稳定性针对优化后circRNA体外稳定性的检验主要分为热力学折叠（thermodynamic folding）、溶液内降解（in-solution degradation）以及细胞内衰变（intracellular decay）三项。热力学折叠通过加热溶液中的circRNA逐渐展开其结构，RNA结合的RiboGreen试剂的荧光强度相应减弱，并以此可计算出熔化温度（®Tm）的荧光强度曲线。从图2C可发现，与CR-Ther和CR-Novo相比，circDesign设计的CR1-6具有更显著的热力学稳定性，且可发现热力学稳定性与MFE值呈正相关，MFE值越低该序列的热力学稳定性越好。溶液内降解circRNA与线性mRNA一样，其化学不稳定性主要源于水解反应。本研究中使用了37°C下含有10 mM Mg2+的PBS缓冲液，模拟生理条件并加入circRNA样品孵育60小时。通过在不同时间点评估circRNA完整性，将得到的随时间变化的降解率拟合到单相衰变曲线中，以表现不同的降解动力学速率（图2d）。从图2d中可对比发现CR1-3大大扩展了半衰期（t1/2），将CR-Ther和CR-Novo的9.68小时和9.14小时提升到了15.56到20.62小时，表现出更显著的水解稳定性。细胞内衰变为了评估circRNA的细胞内半衰期，研究采用了逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）方法，在circRNA转染到人骨骼肌细胞（HSkMC）后的不同时间点（3、12、24、48和72h）定量从细胞中提取并检验circRNA的丰度。结果如图2e所示，所有测试的circRNA均表现出不同的衰变模式。由此可以发现，circRNA的细胞内降解可以通过调整其二级结构和翻译效率来控制。其中MFE值较低的CR1和CR3显示出更长的细胞内半衰期。综合条件下，CR3序列具有良好的稳定性和高翻译效率，能够抵抗化学降解和生物衰变。优化后circRNA的蛋白质编码和表达能力研究团队使用流式细胞术评估了HSkMC中转染circRNA的RABV-G表达水平，并以图2f呈现。由平均荧光强度（MFI）显示，CR1-5的蛋白质表达水平明显高于CR6和CR-Ther，其中CR-Novo显示出同样高于CR6和CR-Ther的蛋白质表达水平。这一结果表明，除CAI外需要考虑多种因素对circRNA整体表达能力的影响。研究人员进一步采用了核糖体分析（ribosome profiling）和多聚体分析法（polysome profiling）对CR3和CR-Novo进行并列比较。如图3d所示的RNA直接测序计数和核糖体测序计数表明，CR3的circRNA丰度和核糖体足迹丰度（ribosome footprints）更显著，决定其具有更高的翻译效率。通过二级结构成对可视化对比，可以推断circRNA丰度和核糖体足迹丰度的区别主要是由于部分被破坏的IRES基序阻碍了翻译机制的起始招募，导致较低的丰度。多聚体分析用于比较核糖体负载能力，由图3g显示，CR3中的核糖体载量高于CR-Novo，体现出相对更高的核糖体负载能力。图3. CR3和CR-Novo的翻译效率比较优化后circRNA狂犬病疫苗诱导的免疫效力研究团队通过小鼠模型肌肉注射编码RABV-G的circRNA疫苗评估不同设计方案circRNA的体内免疫原性。在起始剂量注射后第10天，与所有circRNA组相比，LR-Novo引起的抗体滴度略高，这可能是由于抗原的起效表达相对较快，尽管总体滴度仍然很低（图4b）。假病毒中和抗体滴度（pVNT）数据表明，circDesign优化序列组（CR1-4）可引起缓慢但更强更持久的体液免疫反应（图4d），且circRNA组在28天后均表现出pVNT的持续增加（图4e）。图4. circRNA狂犬病疫苗诱导的体内免疫反应在此基础上，研究团队一并设计了编码水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E（gE）作为第二抗原的circRNA疫苗（CV1-5）并进行了与circRNA狂犬病疫苗相对应的表征验证实验。实验中同样发现circDesign优化的序列CV1-5诱导了更强的水痘带状疱疹病毒gE特异性T细胞反应，验证了circDesign针对编码不同抗原circRNA时具有稳健的设计优化有效性。总结斯微生物联合中国药科大学设计的名为“circDesign”的新算法工具，通过本研究论文提供支持该算法用于优化序列增强稳定性和翻译效率的证据，将有望成为环状RNA治疗产品合理有效的设计优化工具，大大简化环状RNA的设计优化过程。但本文也强调，目前circDesign算法仅对特定的ORF序列进行了广泛的探索，还未涉及优化circRNA的其他功能区域，如IRES基序。这是由于病毒或细胞衍生的IRES基序通常对序列操作敏感，在结构域折叠良好时才具有募集PIC并完整组装的功能。目前只需要在分子水平上阐明IRES的结构-活性，就可以在circDesign算法中实现IRES序列的自下而上搜索或优化。参考资料[1] Improving the Circularization Efficiency, Stability and Translatability of Circular RNA by circDesign | bioRxiv. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.09.548293v1.full[2] Zhang H, Zhang L, Lin A, Xu C, Li Z, Liu K, Liu B, Ma X, Zhao F, Jiang H, Chen C, Shen H, Li H, Mathews DH, Zhang Y, Huang L. Algorithm for Optimized mRNA Design Improves Stability and Immunogenicity. Nature. 2023 May 2. doi: 10.1038/s41586-023-06127-z.