DCP2

去年的旧文曾提到Alicia Bicknell认为拥有高核糖体载量的编码序列展现出更高的翻译依赖的 mRNA 降解速率，在特定时间内，产生更少的蛋白。4月23号，Cell Repoorts上出现一篇非常有意思的文章：Attenuating ribosome load improves protein output from mRNA by limiting translation-dependent mRNA decay，定睛一看，通讯作者正是Alicia Bicknell，原来她是Moderna公司的人，怪不得PPT做的满满的M风。这篇新文章正是对她去年在会议上提出的观点的证据支撑。我们今天就来好好聊聊这篇对mRNA序列设计极具指导意义的研究。外源合成的 mRNA 进入细胞质后，蛋白质合成总量取决于蛋白质合成速率和 mRNA 半衰期。蛋白质合成速率取决于参与翻译的 mRNA 分子比例、处于翻译活性状态的核糖体数量以及这些核糖体的延伸速度。mRNA 半衰期由依赖于翻译（translation-dependent）的降解机制和独立于翻译（translation-independent）的降解机制决定。真核生物内源性 mRNA 主要存在两种常见的降解方式，均依赖于缩短 3'端 polyA 尾巴来启动降解（deadenylation dependent decapping reaction）。以酵母细胞为例，去腺苷酸化由 Pan2/Pan3 complex 和 Ccr4/Pop2/Not complex 来执行。完成去腺苷酸化以后，mRNAs 会发生两种可能的降解途径，一种在 exosome 的作用下，从 3' 至 5'启动降解；另外一种是更加常见的降解途径,在去帽酶的作用下（Dcp1/Dcp2），去掉帽子结构，然后被 Xrn1 从 5'至 3'降解。当蛋白翻译发生异常情况，提前终止（premature termination of translation）时，还会触发特殊的独立于去腺苷酸化的 mRNA 降解机制，mRNAs 会遭受独立于去腺苷酸化的去帽反应，或者快速的 3'-5'降解，或者核酸内切酶切割(endonuclease cleavage)。酵母细胞内源性 mRNA 降解途径长久以来，人们已经利用内源性转录组对 CDS 序列与蛋白产出之间的关系进行广泛研究。然而，内源性 mRNA 在多个参数上存在差异，包括氨基酸序列、密码子选择、CDS 长度、UTR 序列和长度以及细胞内翻译位置。这使得任何一个参数对蛋白质合成产量的作用变得非常复杂。此外，外源合成的治疗性 mRNA 与内源性 mRNA 的不同之处在于，它们通过内吞途径进入细胞质，它们不被剪接，不被核 RNA 结合蛋白包被，并且通常包含修饰的核苷酸（例如，1-甲基假尿苷）以降低先天免疫刺激。因此，我们不能将源自内源转录组（或质粒编码的 ORFeomes）的调控原理直接推及到外源 mRNA 上。在 mRNA 疫苗/药物的设计中，mRNA 序列设计是万本之源。你所选择的 CDS 序列和 UTR 序列会直接影响到靶蛋白合成产量和表达持续时间，从而影响给药频率和治疗效果。因此，我们必须建立 mRNA 序列和蛋白合成产量（蛋白合成速率和 mRNA 半衰期）之间的精确关系。   不同的 CDS 序列，不同的半衰期，不同的蛋白总产出。研究人员设计了 30 个 mRNA，它们具有相同的 UTR，拥有不同的 CDS 序列，均编码 eGFP 蛋白。根据密码子最适性和 CDS 二级结构共分为六组，每组内包含不同的 CDS 序列。（1）高等密码子适应性+高度二级结构（2）中等密码子适应性+高度二级结构（3）高等密码子适应性+中度二级结构（4）中等密码子适应性+中度二级结构（5）中等密码子适应性+低度二级结构 (6) 低等密码子适应性+低度二级结构将上述这些 mRNA 转染 HeLa 细胞和 HEK293 细胞，结果发现，这些 mRNA 的蛋白表达总量在组间差异很大，组内类似，这说明密码子适应性和二级结构在不同类型的细胞中均对 mRNA 的蛋白表达产量造成影响。具有更高密码子适应性和更高结构含量的 CDS 序列设计可实现最大的总蛋白质输出。此外，研究人员还发现采用 LNP 将上述 mRNA 递送进老鼠体内，其蛋白表达总量与 CDS 序列之间的关系与细胞水平类似。将所有 30 个 mRNA 以等摩尔浓度电穿孔至 HEK293 细胞中，然后定时收集进行 RNA-seq 分析。根据这些 RNA-seq 时间趋势线计算出的物理 mRNA 半衰期（无论翻译状态如何的半衰期）与根据 GFP 荧光曲线拟合得出的功能 mRNA 半衰期非常一致。于是，研究认为，这些 mRNA 构建体的蛋白质合成受到 mRNA 物理半衰期的限制，而与衰变前的非翻译状态或者任何其他的抑制机制无关。与总体蛋白合成趋势一样，mRNA 半衰期同样表现出组间差异大，组内相似的特征。   翻译和去腺苷酸化影响 mRNA 降解抑制剂乳酰米霉素（LTM）会抑制 mRNA 的翻译起始。通过添加或者不添加乳酰米霉素，研究人员利用 RNA-seq 时间趋势图计算出翻译依然的 mRNA 降解和不依赖于翻译的 mRNA 降解。结果发现，低密码子适应性+低二级结构的 mRNA 降解主要依赖于翻译，而高等密码子适应性+高度二级结构 mRNA 的衰减几乎完全独立于翻译。采用 3' 反向脱氧胸苷 (InvdT) 修饰可抑制 mRNA 3'末端发生去腺苷酸化反应。与观察到的翻译依赖性衰减类似，低密码子适应性+低二级结构的 mRNA 降解主要依赖于去腺苷酸化，而高等密码子适应性+高度二级结构 mRNA 的衰减几乎完全独立于去腺苷酸化。翻译依赖性降解和去腺苷化依赖性降解之间的密切相关性表明翻译依赖性降解主要通过去腺苷化依赖性机制完成的。   高核糖体负荷导致更快速的 mRNA 降解不同组别的 mRNA 具有不同的核糖体负载，并且与密码子最优性和结构呈负相关。比较核糖体负荷与 mRNA 半衰期表明，平均核糖体负荷最高的 mRNA 半衰期最短，相反，平均核糖体负荷最低的 mRNA 半衰期最长。核糖体负载也与总蛋白输出也呈负相关。核糖体负载是与 CDS 长度（对于所有测试的 mRNA 都相同）、翻译起始以及延伸速率相关。检测 GFP mRNA 的延伸速率和起始速率发现两个不同的群体：（1）mRNA 子集 1（表示为实心圆圈）包含来自较高密码子适应性和较高二级结构的 22 个 mRNA，其延伸率范围为每秒 0.6 至 0.7 个密码子（，起始速率范围为每分钟 0.8 至 1.3 个核糖体。（2）mRNA 子集 2（表示为空心圆圈）包括低密码子适应性和低二级结构组的所有成员以及来自中等密码子适应性组的其他三个 mRNA。这组 8 个 RNA 显示出缓慢的延伸速率，范围为每秒 0.3 至 0.4 个密码子，这必定是其核糖体负载相对较高的原因。mRNA 子集 2 的翻译起始率也明显较低（每分钟 0.4-0.7 个核糖体），尽管还不足以抵消延伸对核糖体负载的影响。这些低起始率可能是缓慢延伸的次要效应。在 mRNA 子集 1 中，所有 mRNA 都具有相似的延伸率，但起始速率的多样性更大，并且起始速率与稳态核糖体负载呈正相关。延伸速率解释了 mRNA 子集 1 和 mRNA 子集 2 之间核糖体负载的差异，而起始速率解释了 mRNA 子集 1 内 mRNA 之间核糖体负载的差异。无论是由缓慢延伸驱动（ mRNA 子集 2 中的所有 mRNA）还是快速启动（mRNA 子集 1 中具有高核糖体负载的那些）导致的高核糖体载量均与更快的 mRNA 降解相关。   密码子最适性和二级结构影响翻译起始速率mRNA 子集 1 中的 mRNA 与治疗性 mRNA 设计最相关。对于这些序列来说，不同的起始速率导致核糖体负载的差异，并且与翻译依赖性 mRNA 衰减率呈现相关性。为了研究为什么子集 1 mRNA 表现出不同的起始率，按平均密码子适应性（sRSCU）对该子集中的所有 mRNA 进行分组。子集 1 内的 12 个中 sRSCU mRNA（平均 sRSCU 约 0.8）的起始速率比子集中 10 个高 sRSCU mRNA（平均 sRSCU 约 0.97）快 1.2 倍。子集 1 中不存在低 sRSCU mRNA。然而，sRSCU 差异不太可能是 mRNA 子集 1 中起始速率差异的原因，因为，较高的密码子最适性导致更快的起始速率。“翻译斜坡”模型是指前 10 个密码子的低最适性减慢了核糖体从起始密码子 (AUG) 附近的解离，从而限制了后续密码子的组装速率。然而，观察到前 10 个密码子的平均 sRSCU 与 mRNA 子集 1 的起始率之间存在负相关 。因此，全局密码子最优性和局部密码子最优性似乎都无法解释在子集 1 中观察到的 mRNA 之间的起始速率差异。从 mRNA 5' 端开始的 35nt 区域的 MFE，以评估编码区开头附近的局部结构与起始率之间的关系。结果发现，负 MFE 值越大，表明局部结构越高，起始率越低。局部二级结构和起始率之间的这种关系也解释了之前局部 sRSCU 和起始率之间令人困惑的关系（在前 10 个密码子中 sRSCU 较低的 RNA 上观察到较高的起始率）——最优性越高的人类密码子往往越 GC 丰富，因此往往会增加 RNA 二级结构。总体而言，这些观察结果表明 mRNA 子集 1 的起始率和核糖体负载的差异可能是由起始密码子附近的二级结构驱动的。   小结直观上，最大化核糖体密度（产生更大的多核糖体）似乎可以最大化治疗性 mRNA 的总蛋白输出。然而，当前的研究表明，拥有最大的多核糖体的治疗性 mRNA 由于其半衰期显着缩短而产生较低的总蛋白输出。因此，高核糖体密度并不等于高蛋白质产量。而且，核糖体密度（通常通过 riboseq 测量）并不能准确衡量 mRNA 整体“翻译效率”。最适性差的密码子会影响治疗性 mRNA 的延伸率。当一个或多个密码子最适性足够差以至于出现显著的缓慢延伸，这可能导致非常大的多核糖体和起始抑制（如在 mRNA 子集 2 中观察到的）。相反，对于中度至高度最适性密码子富集的 mRNA，其延伸率受到的影响最小。对于这些 mRNA，起始速率是核糖体负载差异的主要驱动因素。因此，起始速率是优化核糖体负载和最大化总体蛋白质输出的可调杠杆。对于此处测试的中度至高度优化的 mRNA（mRNA 子集 1），决定起始率的主要因素可能是起始密码子周围的局部结构程度。一句话，CDS 序列的密码子最适性和二级结构会通过调节 mRNA 半衰期来影响蛋白表达总量。这种对 mRNA 半衰期的影响是由 CDS 依赖性翻译动力学差异介导的。具体来说，表达量最高的 mRNA 具有适度的起始速率（每分钟约 1 个核糖体）、适度的核糖体负载（每 170 nt 约 1 个核糖体）以及非常低的翻译依赖性衰减率。高核糖体负载，无论是由高起始率还是低延伸率引起，都会因翻译依赖性 mRNA 衰减增加而导致治疗性 mRNA 的总体蛋白质输出减少。因此，除了避免次优密码子之外，调节起始速率以实现适度的核糖体负载和更长的 mRNA 寿命是最大化治疗性 mRNA 蛋白质输出的关键。如果无法实现这一点，通过 3' 端修饰阻断去腺苷化也可能对某些 mRNA 有益。未来还需要研究确定独立于脱腺苷化和独立于翻译的 mRNA 衰减因素，从而提供进一步延长 mRNA 半衰期的方法。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：所有真核生物的mRNA都在5'端被加帽。mRNA加帽与转录同步进行，该过程分为三步。加帽过程的中间体，和未加帽的5’-三磷酸RNA一样，对去帽和某些已知因素导致的降解都具有抵抗性，导致人们认为mRNA5’端最终都会完成加帽过程。这种观点最近才发生了重大的变化。一个新的酶家族，包括酵母蛋白Rai1, Dxo1/Ydr370C和哺乳动物蛋白DXO/Dom3Z已经得到确认和鉴定。这些酶可以将加帽异常的mRNA转化为5'-单磷酸RNA，后者进而被5'-3'外切核糖核酸酶降解。其中一些酶本身也具有5'-3'外切核糖核酸酶活性，可以直接清除未正确加帽的mRNA。对这些酶的研究，使人们认识到不是所有mRNA加帽过程都会完成，并确定了真核生物mRNA加帽过程的质量控制机制。本文就这一领域的最新进展作一简要综述。 1.引言所有真核生物的mRNA的5’端都会被加帽，这一过程发生在转录起始后不久。帽子结构包含N7位点的甲基化鸟苷酸，并通过一个特殊的5’-5’焦磷酸键，与RNA的5’端核苷酸连接（m7GpppN)。加帽对mRNA的稳定性、剪接、聚腺苷酸化、出核，以及翻译效率至关重要。帽子结构的去除是一个高度调控的过程，由脱帽酶Dcp2和Nudt16催化完成。这些酶将7-甲基-二磷酸鸟苷从mRNA上酶切下来，生成5’-单磷酸mRNA。接下来，该5’-单磷酸结构会被5’-3’外切核糖核酸酶Xrn1特异性识别和酶切，引发RNA降解并脱帽。加帽过程分三步进行。第一步，起始转录产物的5’端三磷酸被转化成二磷酸键；接下来一个单磷酸鸟苷分子连接到该二磷酸末端；最后，鸟嘌呤碱基N7位点发生甲基化，从而形成成熟的帽子结构。在酵母中，加帽过程由单独的三种酶催化完成，而在哺乳动物中，第一、二步反应是由一个双功能的酶来催化的。加帽过程中间体以及未加帽的初始转录产物，可抵抗由Xrn1酶引起的降解，因为该酶特异性识别5’单磷酸位点。而脱帽酶 Dcp2/Nudt16识别的是成熟的、甲基化的帽子结构，所以并不能将这些加帽中间体或未加帽的初始转录产物转化成可降解的单磷酸RNA。鉴于这些原因，人们曾认为mRNA总是会被正常加帽，因为非正常加帽的mRNA分子并不能被一些已知的因素降解，从而被注意到。近年来，该观点发生了翻天覆地的转变。酵母中Rai1蛋白的酶功能得到确认，它可以将初始转录产物或者未甲基化的帽子结构（加帽中间体）5’端的三磷酸基团，转化成单磷酸基团，进而被降解。这些发现引发了mRNA加帽过程的质量控制机制。因此，我们将简要回顾这一领域的最新进展。2.mRNA加帽过程质量控制机制的发现酵母Rai1蛋白（Rat1相互作用蛋白1），已经被认为可以结合并激活5’-3’外切核糖核酸酶Rat1/Xrn2，Rat1/Xrn2在聚合酶II（PolII）转录终止中起重要作用。Rai1的首个三维结构是以Rat1/Xrn2复合体的形式被测定的。但是，其结构表明Rai1具有某种酶活活性。在表面观察到一个大口袋，远离Rat1/Xrn2结合区域（图1a）。这个大口袋区域包含诸多保守位点，提示其可能作为活性位点存在。随后的研究一致表明Rai1具有焦磷酸酶活性，且都归因于这个大口袋活性位点。该活性将5’-三磷酸RNA转化为5’-单磷酸RNA。和Xrn1一样，Rai1相关的外切核糖核酸酶Rat1/Xrn2特异性地识别5’-单磷酸的RNA底物，而不能识别和酶切5’-三磷酸RNA。Rai1酶活的确认提示这类RNA可被Rai1-Rat1/Xrn2复合物降解。在这一线索的基础上，后续的研究表明，Rai1还可以催化加帽中间体-未甲基化帽子结构的降解。在帽子结构甲基化缺陷菌株里，敲除Rai1基因显著增加了mRNA的半衰期，说明细胞里的Rai1蛋白在非正常加帽mRNA的清除过程中发挥了关键的作用。重要的是，更多的研究表明mRNA加帽是一个高度调控的过程，并不总能正确完成，这与之前的设想完全相反。在寡营养条件下，虽然Rai1基因敲除菌株的加帽机制是完整的，但非正常mRNA的相对比重依然显著增加。综上的这些证据揭示了mRNA加帽的质量控制机制。图1 Rai1及其同系物催化反应的结构基础(a)Rai1的结构(由PyMOL生成，网址http://www.pymol.org)。红色圈出的为活性位点，箭头所示为Rai1与Rat1/Xrn2相互作用的区域。(b) DXO/Dom3Z与帽子结构模拟物m7GpppG形成的复合物的结构。(c) DXO/Dom3Z与寡核苷酸复合物的结构。(b)和(c)的结构大致有一定相关性，即沿垂直轴旋转了45。(d) DXO/Dom3Z的活性位点。图中展示了帽子结构和第二个核苷酸的位置，粉色框里表示的是第一个核苷酸的位置。红色字母“W”表示进攻水或羟基，红色箭头表示亲核攻击的方向。图(b) - (d)引用自Jiao et al.(2013)。(注:此图例中对颜色的解释，请读者参考本文网络版) 3.酵母和哺乳动物中mRNA加帽过程的质量控制Rai1的同源蛋白存在于大多数真核生物中。尽管这些同源蛋白的序列相似度并不是很高，但Rai1活性位点相关的残基序列高度保守。这意味着Rai1同源蛋白也具有相似的酶活性，真核生物中的mRNA加帽控制机制是一致的。迄今为止，已被研究的Rai1同源蛋白有2个，这使得研究者对酵母中mRNA加帽质量控制机制有了更深入的认识，并推动了哺乳动物中这一机制的确认和表征。大多数的真核生物中仅有一种Rai1同源蛋白，但在某些真菌（如酿酒酵母）中，还存在其它种类的Rai1同源蛋白。该蛋白（Ydr370C）与Rai1序列相似度为20%。与Rai1类似，Ydr370C对含未甲基化帽子结构的RNA也具有脱帽活性。此外，Ydr370C还具有5’-3’核酸外切酶活性。正因为Ydr370C可以独立降解未甲基化mRNA，因此被称作脱帽外切核糖核酸酶1，即Dxo1。和Rai1不同，未检测到Dxo1/Ydr370C具有任何焦磷酸化酶活性。在正常生长条件下，敲除Rai1或Dxo1/Ydr370C都没有检测到mRNA水平的变化。但是，同时敲除这两种基因则会观察到未正确加帽mRNA比例的显著增加，表明这两种蛋白在酵母mRNA加帽质量控制过程中都发挥着必要的作用，且某种程度上来说二者是互补的。哺乳动物中Rai1的同源蛋白是Dom3Z。研究发现，它是Rai1和Dxo1/Ydr370C的杂合形式，同时拥有对5’-三磷酸或未甲基化帽子RNA的焦磷酸化酶和脱帽酶活性，且具有5’-3’外切核糖核酸酶活性，因此后续更名为DXO。这些活性使得DXO/Dom3Z可以独立降解未加帽的、或者未甲基化加帽的RNA。敲除细胞中的DXO/Dom3Z，对成熟加帽的mRNA水平没有影响，但观察到未正确加帽mRNA的显著增加。这些都表明在哺乳动物中存在mRNA加帽控制机制，且DXO/Dom3Z在其中发挥了关键作用。细胞中，Rai1-Rat1/Xrn2复合物、Dxo1/Ydr370C和DXO/Dom3Z的位置是不同的。Rai1-Rat1/Xrn2仅分布在细胞核中，DXO/Dom3Z主要在细胞核中，而Dxo1/Ydr370C则主要在细胞质中。分布位置的不同，说明mRNA加帽过程质量控制发生的位置不同，在哺乳动物中该过程发生在细胞核内，而在酵母中则细胞核内和细胞质都会发生。这可能也是酵母和哺乳动物细胞中mRNA出核方式不同的原因。在这两种有机体中，都存在一个保守的TREX（转录/导出）复合物，在mRNA出核中发挥关键作用。在酵母中，TREX募集是伴随着转录过程的，而在哺乳动物中，TREX复合物的募集是剪接和5’-帽子结构依赖性的。因此，哺乳动物mRNA出核的过程其实扮演着一个额外的mRNA加帽控制检查点的角色，它可以阻止非正常加帽的mRNA进入到细胞质中。酵母中缺乏这一机制，可能需要依靠细胞质中的Dxo1/Ydr370C来保证正确的加帽。体外实验中，Rai1对含有成熟甲基化帽子结构mRNA的脱帽活性最低，而Dox1/Ydr370C和DXO/Dom3Z的活性则相对极高。而在细胞内该脱帽活性被抑制，因为帽结合蛋白会优先与成熟帽子结构结合从而保护其免遭降解。体外试验中，不论细胞核还是细胞质中的帽结合蛋白（CBP20和elF4E），都可以有效抑制DXO/Dom3Z的脱帽活性。除此之外，DXO/Dom3Z对三甲基化帽子（m2,2,7GpppN）RNA也具有脱帽活性，并可能调节细胞内三甲基化加帽富鸟苷酸的小核RNA。4.Rai1及其同系物催化的结构基础Rai1及其同系物的结构包含两个高度扭曲的β-片和几个α-螺旋，他们覆盖了β-片的一些暴露的表面。活性位点位于整个蛋白结构的中心，位于β-片之间的交界面 (Fig. 1a)）。活性位点包含四个高度保守的基序，在DXO/Dom3Z中对应的是Arg132（基序I），Gly188-Tyr-Phe-Glu192（基序II，GΦXΦE，Φ为芳香族或疏水性氨基酸残基，X为任意氨基酸），Glu234-Val-Asp236（基序III，EhD，h为疏水性残基），Glu253-Leu-Lys255（基序IV，EhK）。Rai1及其同系物的结构与其它已知的蛋白结构上不具有同源性，但和D-(D/E)XK核酸酶的结构略有关联。尽管如此，Rai1同系物和这些核酸酶在序列上几乎没有相似性，且相似度主要限于基序III（EhD）和基序IV（EhK）上的天冬氨酸残基，在所有这些酶中，该残基作为金属离子结合位点。突变研究表明，Rai1及其同系物具有的所有三种酶活性，即：脱帽、焦磷酸化和5’-3’外切核酸酶活性，均来自这一活性位点。脱帽酶Dcp2是将m7Gpp帽子从mRNA5’端酶切下来，与之不同的是，Rai1及其同系物酶切的是第一和第二核苷酸之间的磷酸二酯键，从而释放出甲基化或非甲基化的GpppN帽子。对DXO/Dom3Z结构的研究，为Rai1及其同系物的酶催化机理提供了分子学基础。DXO/Dom3Z与模拟帽子m7GpppG（图1b）及寡核苷酸（图1c）形成的复合物的结构表明，加帽mRNA分子结合活性位点口袋，其中帽子（m7GpppG）和第一个核苷酸位于一侧，RNA分子的剩余部分位于另一侧，催化体系还包含位于中间的两个金属离子。Arg132（基序I）的侧链识别帽子结构的磷酸基团，金属离子与基序II、III、IV的侧链残基，第一第二核苷酸之间的磷酸基团，以及基序IVLeu254主链的羧基发生配位作用。基于这一结构信息，有人提出：其中一个金属离子激活水分子或羟基离子，其随后攻击第一和第二核苷酸之间的易裂磷酸键，在该基团5’端进行切割并释放游离GpppN。Lys255（基序IV）的侧链稳定了催化过程中的氧负离子中间体（图1d）。这种双金属离子催化机制在核酸酶中广泛存在。DXO/Dom3Z的结构表明，结合帽子和第一核苷酸的活性位点，也包含了5’末端核苷酸（pN1）或焦磷酸基团，催化5’端单磷酸或三磷酸RNA降解释放出pN1或焦磷酸基团，产生5’-3’前核糖核酸酶和焦磷酸酶活性。因此，Rai1及其同系物的三种看似不同的活性都使用了相同的催化机制，并且催化的产物取决于不同底物的不同结合模式。5.结束语与以往的认知不同，如今已知真核生物中mRNA的加帽过程并不总是能被完成。非正确加帽可能来自于加帽过程中的偶发错误，而加帽质量控制机制可以纠正这些错误。且/或，后续的证据表明，这是加帽过程主动调控的结果。例如，已有报道指出importin-α激活帽子甲基化。Myc调节许多mRNA帽子甲基化，而营养缺陷条件导致帽子甲基化比例普遍降低。mRNA加帽的调控因子和质量控制机制一起，可能为基因表达提供另一层调控。最近的研究极大地促进了我们对真核生物中mRNA加帽质量控制的了解。然而，目前对这一过程的理解还远远不够。例如：Rai1、Dxo1/Ydr370C和DXO/Dom3Z底物特异性的分子基础仍不清晰。是否可以通过已知的加帽质量控制因素清楚5’-二磷酸RNA，即加帽过程中产生的另一种中间体，还有待观察。重要的是，关于Rai1及其同系物如何与其它因素相互作用，以协调加帽质量控制与其它细胞过程，我们知之甚少。例如，在酵母中，已经证明Rai1-Rat1/Xrn2复合物与PolII的转录机制相关，且Rat1/Xrn2会在转录过程中就清除掉不正确加帽的初级转录产物。在哺乳动物中是否也是如此还未可知，如果也是，那么是哪些因素负责调动DXO/Dom3Z。这些问题的答案都还有待进一步研究。mRNA加帽在诸多细胞过程中发挥着重要的作用，而加帽过程质量控制机制的明确，为帽子结构紊乱异常及探究帽子结构在这些细胞过程中的功能提供了一种新颖的思路。DXO/Dom3Z的敲除就是一个例证，使得人们认识到，在哺乳动物中mRNA加帽与mRNA剪接和多聚腺苷酸化的关联比以往认为的还要密切。在这个方向上的进一步研究将带来对mRNA帽子结构生理作用更深入的理解。原文来源：mRNA quality control at the 5' end.J Zhejiang Univ Sci B.2014 May;15(5):438-43.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

特斯拉的马斯克说：“医学的未来是mRNA，基本上你可以使用mRNA治愈一切”。沉寂数十载，一朝声名大噪。新冠疫情的到来让一直“寂寂无名”的mRNA技术崭露头角，实现了从实验室到临床的突破。mRNA疫苗作为一种特殊的药物，通过在人体内表达目标蛋白起到特定效应，以应用在肿瘤疫苗、基因编辑、CAR-T细胞治疗、蛋白替代疗法及其他传染病预防性疫苗领域。图1 mRNA诱导的细胞和体液免疫反应[1]翻译效率和免疫原性是mRNA行使功能的两大关键因素。自体免疫蛋白如RIGI和IFIT识别异常加帽的mRNA，降低了外源mRNA在细胞内的活性和半衰期，使得mRNA药物/疫苗在体内难以发挥作用。因此，优化mRNA帽结构（加帽）对于提高mRNA疫苗的生物活性和降低免疫原性是至关重要的。IVT核心技术壁垒——“加帽”mRNA“加帽”技术，即对mRNA的5'端帽子结构修饰技术。在真核细胞中，成熟的mRNA具备一些关键的结构元件来发挥相关的功能，而体外转录的mRNA，则是通过模拟内源性mRNA的结构来发挥作用。成熟mRNA的结构主要有五个部分，从5'到3'包括：5'帽子结构（5'Cap）、5'非翻译区（5'UTR）、编码蛋白的开放阅读框、3'非翻译区（3'UTR）和一个PolyA尾。图2：mRNA结构式[2]真核生物mRNA的5’端通常具有桥接的7-甲基鸟苷(m7G)帽子结构（Cap0），Cap0结构中m7G后面第一个核苷的2'羟基甲基化后形成Cap1结构(m7GpppmN)。现有研究发现，5'端帽子结构可以调节mRNA的剪切成熟，并帮助RNA转录产物穿过核膜的选择性孔道而进入细胞质。此外，5'帽子结构还可以保护mRNA不被核酸外切酶降解，与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体，并协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。通常情况下，Cap结构可以与真核起始因子4E(eIF4E)在翻译起始阶段相互识别，开启后续翻译过程，同时Cap1结构能够极大降低mRNA在体内的免疫原性。图3：mRNA起始蛋白翻译机制[3]在体外转录制备mRNA有不同的“加帽”方法，包括酶加帽、共转录加帽等。酶法加帽是较为传统的加帽方式，该方法需在T7聚合酶参与的IVT反应结束后，先纯化获得未加帽的mRNA，再通过牛痘病毒加帽酶（兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性）产生Cap0，再通过2’-O-甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸转化为Cap1，再次纯化获得最终的mRNA。该过程使总体工艺步骤变得复杂、引入更多的杂质，增加了QA/QC质检项。图4：mRNA疫苗生产流程[4]一步法共转录加帽，就是在T7聚合酶参与的IVT反应体系中直接加入帽类似物，实现一步法获得含Cap1结构的mRNA，全程只需一次纯化。这种“一锅法”反应减少了制备步骤，进而有效缩短整体处理时间、简化纯化步骤，减少所需酶的数量。因此，化学法共转录加帽在工艺上相对简单，引入杂质少，能够迅速提升mRNA疫苗和药物的产能。目前，一步法共转录加帽正在逐步成为了mRNA制备工艺的主流技术路线。帽类似物介绍mRNA的CAP1帽子结构最早在1975年就已经被文献报道了其结构。经过多年的发展，帽类似物也从前一代的ARCA发展成为目前主流的三核苷酸帽类似物（CAP GAG）。在1984年的文献中，两种CAP1帽类似物CAP GAG以及CAP GAU的结构以及合成路线就已经被详细报道，并且在2009年这种三核苷酸CAP1帽类似物（CAP GAG）被报道可用于T7 RNA聚合酶的一步法共转录加帽体系制备mRNA。2020年，这种CAP1帽类似物（CAP GAG）也成功的应用在了新冠mRNA疫苗中。图5：帽类似物研究历程CAP GAG 以及CAP GAG（3'OMe）帽类似物CAP GAG是单一组分的帽类似物，结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，产品用于起始序列为5'-AG…的DNA模板，通过一步法共转录加帽产生天然的Cap1结构。Pfizer–BioNTech的COVID-19 mRNA疫苗是利用CAP GAG帽类似物进行共转录加帽。另外，CAP GAG（3'OMe）帽类似物结构为m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，此帽类似物相对于CAP GAG来说，具有抗反向转录作用，在有一些DNA模板或者特殊序列中表现出更好的生物学效果。以上两种帽类似物是目前mRNA制备中最常用的加帽试剂，目前国内已经有多个mRNA疫苗公司使用该产品开发的疫苗进入到临床实验。申基生物可大量提供高品质的CAP GAG和CAP GAG（3'OMe），货号分别为CAP3011和CAP3111。图6：CAP GAG和CAP GAG (3'OMe)结构式以及模板体系推荐示意图CAP GAU帽类似物CAP GAU结构为m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU，专为自复制RNA(saRNA)设计的，该saRNA基于正义RNA病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、塞姆利基森林病毒(SFV)和辛德比斯病毒(SIN)的基因组，这些正义RNA病毒基因组起始是一个5'-AU…Cap1 mRNA。Ziphius公司开发的自复制mRNA疫苗—ZIP1642采用的就是CAP GAU进行共转录加帽，此款自扩增 RNA 疫苗可以在较低剂量下诱导等效或更有效的免疫反应。图7：CAP GAU结构示意图[1]CAP GAG(m6A) 帽类似物mRNA中内部碱基的修饰会影响细胞中mRNA的命运，最普遍的碱基修饰是mRNA的5'端，即与7-甲基鸟苷帽相邻的第一个编码核苷酸处。m7G帽后的第一个核苷酸是2'-O-甲基腺苷（Am），它可以在N6位被未知的核质甲基转移酶进一步甲基化，形成m6Am。研究发现，Cap1 (m6A)帽类似物可以增加mRNA的稳定性和翻译效率。2017年的Nature文献报道了5′Cap中的m6Am控制mRNA的稳定性。2018年的Science报道了5′Cap中的m6Am在mRNA的翻译过程中有重要的作用。其主要原因可能是Cap1 (m6A)帽类似物在体内具有更高的稳定性，不容易被DCP2等脱帽。图8：CAP 1 (m6A)修饰的报告基因mRNA在老鼠体内具有更好的翻译效率[8]CAP GGG 以及CAP GGG（3'OMe）帽类似物除CAP GAG系列帽类似物以外，申基生物也可提供CAP GGG以及CAP GGG（3'OMe）结构的帽类似物。图9：CAP GGG以及CAP GGG（3'OMe）结构示意图帽类似物结构设计帽类似物结构本身包含很多可修饰位点，如糖环、磷脂键、碱基取代等等，结合帽类似物特异结合蛋白eIF4E的晶体结构，可以设计更多效果更好的新型帽类似物。当然，新型结构的帽类似物需要考虑：mRNA转录效率、加帽率、稳定性、翻译效率、免疫原性等关键因素。图10：帽类似物结构可修饰位点一步法共转录加帽工艺研究1、DNA模板常用的一步法共转录体系的DNA模板序列有三种，分别为：① 5’-TAATACGACTCACTATAGGG…-3’（图11），其中标黄区域为T7启动子区域；图11：起始序列为GGG的DNA模板IVT示意图② 5’-TAATACGACTCACTATAAGG…-3’（图12），其中标黄区域为T7启动子区域；图12：起始序列为AGG的DNA模板IVT示意图③ 5’-TAATACGACTCACTATAAT…-3’（自复制RNA的常用模板，图13），其中标黄区域为T7启动子区域；图13：起始序列为AT的DNA模板IVT示意图2、IVT反应体系① 针对GGG模板，经我们大量实验验证，20 μL共转录体系推荐如下：在上述体系下获得产量约在50-100 μg/20 μl体系，通常所获得的产物加帽率在95%以上。如增加GTP含量可显著增加产量，但会导致加帽率下降。② 对于共转录体系，我们更推荐AGG模板，在此模板下，经大量实验验证，20 μL共转录体系如下：在上述体系下获得产量约在150-200 μg/20 μl体系，通常所获得的产物加帽率在95%以上。Cap用量对产量有所影响，推荐使用终浓度为8-10mM。因此，如果是5-GGG…起始的DNA模板，我们推荐可以做一个点突变，将模板突变为5’-GAG…，可以大大提高共转录加帽效果。③ 对于自复制RNA共转录体系，我们推荐AT模板，在此模板下，经大量实验验证，20 μL共转录体系如下：由于自复制RNA模板序列通常较长，IVT产量及产物完整性较常规模板低。注：1. 反应体系受酶活、体系buffer、模板长度、模板序列影响较大。推荐体系中酶量需视具体试剂盒而定，不同厂家试剂盒的酶活单位定义不同，以上体系仅作参考。2. 在不同模板、不同酶体系下，需要适当调整NTPs及模板用量。3、mRNA IVT效果评价① IVT产量经过大量实验验证，化学法共转录可以获得与普通IVT相当的Cap1 mRNA产量，20μL下产量对比如图14所示：图14：化学法加帽IVT与普通IVT产量对比示意图② 产物完整性通过比较不同长度模板化学法共转录产物的完整性，我们发现mRNA产物的完整性均在85%以上，如下图所示：图15：不同长度的模板化学法加帽IVT mRNA产物的完整性示意图③ 产物加帽率经过大量实验验证，一步法共转录产物的加帽率可稳定在98%以上，如下图所示：图16：质谱检测化学法加帽mRNA产物的加帽率④ 产物生物活性将共转录得到的GFP mRNA转染进入细胞24h后，通过观察细胞内GFP的荧光（图17）发现未加帽的mRNA在细胞内几乎无表达，而化学法加帽的mRNA与酶法加帽的mRNA在细胞内的表达相当。图17：转染不同mRNA细胞内GFP荧光表达情况申基生物—— T7共转录试剂盒申基生物成功研发的T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit（货号：10111）对体外共转录加帽反应体系进行了优化，1 μg的模板投入量可以产生150-200 μg的RNA。本试剂盒可一步完成mRNA原液的体外转录以及加帽。与酶法加帽对比，共转录加帽操作便捷、减少工艺复杂度，同时在保证加帽稳定（加帽效率95%以上）的情况下引入更少杂质。此外，本试剂盒利用N1-Me-pUTP替换天然的UTP，可极大降低产物的免疫原性！申基生物作为拥有核心技术的mRNA疫苗上游原料供应商，现阶段已开发出来核苷酸、修饰性核苷酸、化学法加帽类似物等mRNA核心疫苗原料。同时，基于公司成熟的修饰性核苷酸、帽类似物类产品的研发以及规模化GMP产品的生产能力，还可以为客户定制合成具有自主知识产权的新型修饰核苷酸以及帽类似物。申基生物帽类似物产品订购信息申基生物修饰核苷酸产品订购信息申基生物核苷酸产品订购信息申基生物成品mRNA订购信息申基生物其他产品订购信息申基生物帽类似物以及修饰核苷酸定制服务产品订购咨询400-885-0615     13851752674（微信同步）15996265832（微信同步）参考文献：[1]Fang E ,  Liu X ,  Li M , et al. 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