RN7SL1

细胞外囊泡(EVs)是细胞自然释放的颗粒总称。生物体液中最丰富的EVs直径约为50到150 nm。其携带各种成分，包括蛋白质、核酸、脂类和代谢物等，在健康和疾病状态下充当细胞间通信的媒介，影响各种细胞间的生物学活动。囊泡根据其生物发生分为微泡（ectosomes）和外泌体（exosomes）两种类型，在生物体内发挥重要作用。本文主要综述了EVs在免疫系统中的作用，包括先天免疫与炎症、获得性免疫、免疫调节和抗肿瘤等，展现出较好的生物医学应用前景。图1：细胞外囊泡的主要形式  01  先天免疫与炎症所有参与炎症的免疫细胞都能分泌囊泡，EVs在炎症过程中扮演多种角色。EVs可以通过传递介体(生物活性脂类、急性期蛋白质和细胞因子)、危险信号、酶和RNA来发挥促炎作用。在脓毒症(一种由细菌等病原微生物侵入机体引起的全身炎症反应)中，EVs在不同的阶段发挥着抑炎和促炎作用。抗炎作用主要是由于含HSPA12B的内皮细胞来源的EVs降低了巨噬细胞对内毒素的反应性，下调NF-κB通路炎症因子的表达。此外EVs还可以携带C-反应蛋白（CRP）、补体因子和补体调节蛋白参与先天免疫细胞的激活、分化等过程。 图2：内皮细胞分泌的囊泡改变巨噬细胞对LPS刺激的反应。  02  适应性免疫在适应性免疫中，EVs主要参与T、B淋巴细胞的发育，抗原递呈给淋巴细胞和免疫突触形成等过程。在T细胞发育过程中，胸腺上皮细胞来源的EVs携带组织限制性抗原到胸腺常规树突状细胞(cDCs)用于抗原递呈，通过这种方式，EVs可以促进对自身抗原特异的T细胞的阴性选择。在B细胞发育的过程中，最近的报道显示用抗IgM抗体或交联CD24的抗体刺激小鼠B细胞淋巴瘤细胞系，能触发产生携带BCR和CD24的囊泡，这种囊泡可以刺激其他受体B细胞，从而加快B细胞激活过程，但这种EVs介导的BCR转移的作用可能在体内B细胞发育或激活的时间和空间上有些局限，因此只有少部分(5%-20%)B细胞通过这种机制获得激活。 图3：CD24刺激供体细胞导致GFP标记的质膜和IgM转移到受体细胞。细胞外囊泡在适应性免疫中最重要的作用是参与抗原递呈过程，在1996年发现B细胞来源的携带功能性多肽-MHC(pMHC)的囊泡，可以将抗原直接递呈给T细胞，首次发现了EVs在抗原递呈中的作用。接着发现携带pMHC的EVs附着在树突状细胞(DC)的表面，抗原提呈效果会明显增强。这可能是变装后的DC集中了大量EVs相关的pMHC用于免疫突触的形成和T细胞的激活。最近，囊泡参与交叉递呈过程也引起了较大的关注。MHC-I类复合体上外源抗原与CD8+T细胞的交叉递呈在抗病毒和肿瘤免疫、疫苗免疫应答和诱导耐受中起重要作用。含pMHC的外泌体致敏树突状细胞可成功激活初始CD8+T细胞，发挥交叉递呈过程。 图4：细胞外囊泡在抗原递呈中的作用  03  免疫调节囊泡表面有许多参与免疫调节的分子，如CTLA4、PD-L1、FASL和胞外酶CD39和CD73等。调节性T(Treg)细胞通过分泌表面带有CD73的囊泡，发挥免疫抑制作用，胞外酶CD73催化产生的腺苷可以与T细胞表面的受体结合，抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和树突细胞的抗原递呈。此外，干细胞来源的EVs的免疫调节作用也逐渐受到人们关注，干细胞和祖细胞来源的EVs可以抑制多种免疫细胞(包括T细胞和B细胞、自然杀伤(NK)细胞、DC以及单核细胞和巨噬细胞)的功能。其发挥功能的机制主要包括通过腺苷A2A受体诱导T细胞凋亡，对B细胞中PI3K–AKT通路的下调作用，通过转化生长因子β（TGF-β）抑制下游信号通路对NK细胞的抑制作用以及与DC和巨噬细胞上相应受体结合发挥免疫调节作用。利用这些机制对相应疾病的治疗展现出很好的前景。 图5：细胞外囊泡的免疫调节功能  04  抗肿瘤反应EVs相关免疫反应研究最多的领域是抗肿瘤免疫。肿瘤细胞来源的EVs在肿瘤微环境中参与免疫细胞之间的相互作用。主要通过作用于NK细胞、髓系抑制细胞(MDSCs)和调节性B细胞等来抑制抗肿瘤免疫反应。而在肿瘤微环境中的巨噬细胞、DC、NK细胞和T细胞释放的囊泡参与抗肿瘤免疫过程。肿瘤细胞来源的EVs携带一系列免疫调节分子介导免疫抑制过程，研究发现在囊泡表面携带免疫抑制性细胞因子TGF-β，可以激活Treg细胞和MDSCs 发挥抑制抗肿瘤免疫过程。此外，EVs携带的免疫检查点分子(如PDL1)干扰抗肿瘤免疫和免疫治疗的反应，例如，在黑色素瘤患者中，肿瘤细胞通过释放携带PDL1的囊泡导致全身免疫功能抑制。最新研究报道，肿瘤来源的EVs还携带肿瘤相关抗原，被APC摄取后可能会刺激肿瘤特异性CD8+T细胞反应，起到抗肿瘤的作用。随着对DC疫苗的深度研究，发现DC来源的囊泡(DCsEVs) 可以表达MHCI和MHCII分子、共刺激分子CD80/86和黏附分子ICAM1等，并且能直接或间接的激活T细胞。因此，DCsEVs作为肿瘤疫苗已被应用到黑色素瘤和肺癌患者中，并已进入临床实验。图6：免疫细胞相关囊泡在肿瘤微环境中的作用  05  治疗前景在过去的几年里，EVs的治疗潜力已经被人们广泛关注。目前，EVs被认为是治疗免疫或炎症性疾病的潜在免疫疗法，并也应用到疾病的诊断和检测中。最近，囊泡形式的疫苗被开发用于预防和治疗疾病，囊泡形式的疫苗有一个适当的尺寸对于免疫细胞的递呈，并能携带TLR激动分子，激活先天免疫反应。并且研究发现免疫细胞来源的囊泡用于疫苗的包封具有提高抗原递呈效率的优势。囊泡这些特点已经在两种获得许可的奈瑟菌脑膜炎疫苗中应用。最近，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞来源的EV也引起了极大的关注，这些EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，从而可以诱导表达其同源抗原的肿瘤细胞死亡。即使在实体瘤的情况下，它们也具有治疗潜力，在实体瘤中，CAR-T细胞对肿瘤的穿透性差限制了CAR-T细胞的疗效，相比之下，EVs由于体积小，能够跨越生物屏障，可以有效地穿透实体肿瘤。在最近的一项研究中，CAR-T细胞被改造成高水平表达内源性非编码RNA-RN7SL1，其通过与模式识别受体RIG- I和MDA5结合激活信号通路，肿瘤微环境中天然免疫细胞高效摄取含有RN7SL1的CAR-T细胞来源的EVs，导致MDSC发育受限和免疫抑制转化生长因子β（TGF-β）产生减少，但增强DC细胞共刺激和抗原递呈，有很好的抗肿瘤效果。 图7：基因工程改造细胞释放囊泡的抗肿瘤作用小结本篇文章中我们概括了囊泡在免疫系统中应用的一些关键进展。介绍了利用基因工程手段进行修饰，得到携带靶向和治疗性分子的囊泡，并且囊泡也可以进一步修饰携带理想的药物，因此在生物医学上有很大的应用前景。结合目前的临床前实验结果，囊泡将成为下一代免疫治疗的新星。但目前对囊泡系统和深入信息的了解还有所欠缺，并且一些具体的免疫调节方式也不明确，因此需要进一步深入的研究和探索。相信未来EVs在免疫治疗、生物检测和疾病治疗中会大放异彩。参考文献：[1] Buzas E I. The roles of extracellular vesicles in the immune system[J]. Nature Reviews Immunology, 2022.[2] Qian K, Fu W, Li T, et al. The roles of small extracellular vesicles in cancer and immune regulation and translational potential in cancer therapy[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2022.[3] Beltraminelli T, Perez C R, De Palma M. Disentangling the complexity of tumor-derived extracellular vesicles[J]. Cell Reports, 2021.

作者：张长风 博士（蒲公英特约撰稿人）来源：蒲公英Ouryao前言2022年是现实意义上的CART商业化第一年。2021年两款CART产品在我国上市获批，而2022年则是商业化真正展现对细胞治疗全行业影响的年份。此外，随着抗疫形势的变化，新冠相关的疫苗、检测试剂盒等产品的热度逐渐归于正常，医药行业的关注重点又一次回到了肿瘤治疗这个历久弥新的议题上。这两个因素共同促进了CART行业的再次发展，也重塑着CART行业的行业态势。因此，我们对2022年CART领域的行业新进展进行盘点，从血液瘤、实体瘤、通用CART、体内CART制备、非肿瘤疾病这5大领域，与大家一起回顾过去的一年中都有哪些影响深远的重大事件。血液瘤科研与临床的思维碰撞血液瘤治疗是CART类产品的立身之本，也是受商业化影响最为显著的领域。在2022年，虽然也有诸如GPRC5D、CLL-1这类新靶点CART的相关进展，但行业主旋律依然是集中在商业化产品的最大“痛点”——CART治疗无效或短期复发。以CART治疗效果最好的急性淋巴细胞白血病（ALL）为例，只有50%的患者能在1年后依然保持缓解，高肿瘤负荷患者的话，数字则会进一步降低到30%。因此，如何强化已有产品的疗效，进一步加固血液瘤这个“基本盘”，从而扩大营收，才是2022年CART在血液瘤领域研究的重点。CART治疗无效或短期复发的原因主要有两个，肿瘤降低靶抗原的表达（也称抗原逃逸），或者CART在体内无法维持。传统的解决策略主要是增加靶点（如不同CART续贯治疗或双靶点CART），或者增加功能元件（如新的共刺激域）。而在2022年，商业化带来了更广泛的临床应用与临床人员的深度参与，也带来了许多立足于临床的新思路。众多从临床和转化医学角度出发的新方法被付诸实施。提高肿瘤表面靶抗原表达水平是扭转抗原逃逸最直接的方法。其着眼点不是如何改造CART去对付肿瘤，而是改造肿瘤来配合CART。2022年产生了不少基于此思路的新方法。例如给骨髓瘤患者使用γ-分泌酶抑制剂，因为γ-分泌酶会将骨髓瘤细胞表面的靶点BCMA切除，使其脱离肿瘤细胞变成游离状态，而抑制γ-分泌酶就可以提高骨髓瘤细胞的BCMA表达，以强化BCMA CART的疗效。类似的，苔藓抑素1则可以提高CD22的表达，因此可以很好的配合CD22 CART。通过临床常用药物来强化CART维持性一直是医生们的期望，而这一期望也在2022年逐渐变为现实。此类药物包括BTK抑制剂依鲁替尼或免疫调节剂来那度胺，其中涉及到的强化机理很多，包括增强T细胞的活性、促进免疫突触形成、或者降低肿瘤的PD1表达等等。重要的是，这个策略的效果正在临床上得到印证。例如，宾夕法尼亚大学报道的采用CD19 CART联合依鲁替尼治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）的2期临床效果就非常显著，CART回输4年后依然有70%的患者保持CR。这大大超过了CD19 CART在CLL上的平均疗效。反而是一直备受期待的CART与PD1抗体的“强强联合”，其效果并不尽如人意。例如在一个mesothelin-CART联合K药治疗间皮瘤患者的1期临床中，大多数患者的肿瘤都进展了。采用药物与CART协同杀瘤是很有挑战性的，因为大多数能杀肿瘤的药物也都能杀CART。如何调和这个矛盾一直是个难题，但在2022年则有了新突破。BCL-2抑制剂维奈托克是应对ALL等血液瘤的利器，但CART本身也会受到维奈托克的影响。而通过在CART上过表达BCL-2突变体F104L（维奈托克无法识别F104L），就可以构建维奈托克耐药型CART，从而实现两者的联用并形成协同疗效。这一策略与敲除CART的CD52表达后联用CD52单抗颇有些类似之处，并且理论上可以扩展到一大批药品与CART联用的场景中。让CART分泌具有协同效应的药物是提升CART疗效的一大经典手段。传统的分泌型CART包括分泌细胞因子（例如IL-12或IL-18，此类CART也被称为TRUCK）、双抗类药物、PD1抗体片段等。而在2022年，更多种类的分泌型CART正在进入我们的视野内。例如，分泌RNA类药物RN7SL1的CART不仅可以强化自身功能，还可以激活宿主免疫系统参与杀瘤。而分泌幽门螺杆菌蛋白的CART也可以达到同样的“旁观者效应”。监管机构会担心这些分泌产物的毒性问题，那么，以Uni-Vect为代表的诱导型分泌技术则正好可以解决这个问题。Uni-Vect可以让这些分泌产物仅在CART接触肿瘤时才会产生，从而限制药物暴露的范围和时间，提高产品安全性。在不久的将来，这些新型治疗策略必将快速进入临床应用。实体瘤疗效为王实体瘤治疗一直被誉为细胞治疗领域“皇冠上的明珠”，吸引着无数研究者和科技公司对其发起冲击。有人难以理解，在血液瘤上无往不利的CART，为何面对实体瘤时总是一副有心无力的样子。其实，如果稍微回顾下历史就不难发现，作为一种起源于造血干细胞移植的疗法，CART从娘胎里就带着克制血液瘤的特性。而相对的，CART越适应在血液系统中的搏杀，也就会越不适应大相迥异的实体瘤环境。因此，如果要对抗实体瘤，那么对CART深刻而系统的改造就必不可少。而2022年，围绕着“如何让CART实体瘤中更有效”这个核心问题，一系列的新策略和新技术被陆续投入实践。给药剂量是任何一款药品的重要参数，而2022年的一项研究成果表明，实体瘤治疗中采用的CART剂量有可能是远远不足的。从解剖生理学角度对比荷瘤小鼠与人体可以得知，CART在小鼠体内迁移至肿瘤部位的效率比在实体瘤患者体内高1万倍。换言之，对于CART来说，小鼠实验与人体实验的剂量换算系数是1万。而目前常用的剂量换算系数往往介于十到一百之间。这很好的解释了为何CART在小鼠实验中大杀四方，而一到实体瘤患者体内就既无疗效、也无毒性：剂量不足。剂量不足的原因一方面是CART难以浸润实体瘤，更重要的是，CART不能在实体瘤部位获得有效扩增，而外周血又缺乏抗原刺激。对于一款依赖自发扩增来提高局部有效剂量的“活药”来说，不能扩增无疑是斩断了CART的一条臂膀。为了解决这个问题，一系列方法被开发出来以增加CART的局部有效剂量。IL-2等γ链细胞因子很早就被用于促进细胞疗法的体内扩增，但其作用太过广泛，因此具有全身毒性。通过在CART上表达正交IL-2受体、让此类IL-2只能被CART识别和利用，这就在保持IL-2药效的同时避免了毒性。此外，提供额外的抗原刺激也是一个很有前景的策略。例如，通过白蛋白-磷脂多聚体构建的两亲配体向抗原呈递细胞（APC）递送CART相关抗原，在淋巴结中形成表达CART相关抗原的APC群落，从而形成一个既有抗原表达又适宜T细胞扩增的CART“加油站”，就可以有效提升CART的血药浓度。采用RNA纳米微粒递送抗原也能达到类似的效果。细胞耗竭是CART对抗实体瘤疲软的重要原因。2022年的一项研究标明，耗竭来自于持续、长期的肿瘤抗原刺激，而解除耗竭的方法之一就是让CART从与肿瘤的搏杀中脱离，来一次强制“休假”。具体实现的手段多种多样，比如蛋白激酶抑制剂达沙替尼。达沙替尼可以阻断CAR信号通路，但不会杀死CART，药物消除后CART会恢复功能。事实证明，这种强制“休假”会带来很多好处，包括恢复记忆细胞表型、逆转耗竭相关的表观遗传学修饰、恢复抗肿瘤活性等等，让CART再次焕发活力。这倒是应了那句老话，“不会休息的人就不会工作”。通用CART一直在路上2022年对中国通用CART领域是具有特殊意义的一年——我国首个通用CART批件花落北恒生物。但若放眼全球的话，通用CART领域虽也屡有进展，整体情况却是落后于市场预期的。毕竟，如果单论发展速度，自体CART从2012年首例CR患者到2017年上市一共用了5年。而通用CART首CR患者出现于2015年，距今已7年有余，首款产品获批上市仍是遥遥无期。不能上市销售，通用CART最大的优势——成本低廉——也就无从谈起了。因此，不同于步入商业化时代的自体CART，整个通用CART领域仍处于研发时代或前IND时代，相关进展与成果也带有鲜明的前IND时代特色。技术方面，Beam公司的胞嘧啶碱基编辑技术当属2022年的最大亮点。目前的通用CART都依赖于crispr/cas9等基因编辑技术，这些基因编辑技术都需要诱导DNA双链断裂。而只要有DNA双链断裂，就一定伴随着染色体易位等一系列问题。这是从科学原理上就存在的缺陷。但是，碱基编辑技术则不会有类似问题，因此更适合通用CART的开发。2022年12月，在补充提交了基因编辑安全性相关的数据后，Beam公司的通用型CD7 CART获得FDA颁发的IND批件，用于治疗T-ALL。因此，我们有望于近几年内看到相关的临床结果。不过，比起安全性，疗效才是通用CART与它的自体兄弟同台竞技的立身之本。通用CART领域先驱Cellectis公司在2022年完成了旗下产品UCART-19针对成人ALL的跨国多中心临床，并获得了48%的CR率。整体效果还是不错的，但依然非常依赖CD52单抗，并且疗效维持也依然得靠造血干细胞移植。更重要的是，这个结果和Cellectis公司2020年报道的数据几乎没什么区别，或者更直白一点，没什么进展。Cellectis公司还公布了另一款产品UCART-123的研究成果，该产品可应用于急性髓系白血病和母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，并且效果不错。但是，这真的重要吗？眼看着自体CART在商业化浪头上赚的飞起，而自己仍然在一个个早期临床中奋斗拼搏，这就是2022年通用CART行业现状的一个缩影。体内CART制备药剂学带来的未来之星体内CART（in vivo CART，指给患者注射药物，药物与患者体内T细胞结合并形成CART）的原初概念几乎与CART一样古老。但早期in vivo CART的方法太过粗暴，例如给患者局部注射质粒后给予透皮电击来实现体内电转，效率低而且顺应性极差，因此逐渐淡出人们的视野。但随着CART行业的不断推进，越来越多的药剂学人才加入CART大军，带来了以剂型和给药系统为主的研发新思路。有意思的是，这些药剂学理念的引入，让in vivo CART这个本已式微的概念意外的焕发出了第二春，并隐隐有成为下一代CART发展方向的势头。2022年体内CART的发展几乎全部都与新型给药方式相关，包括纳米脂质体颗粒（LNP）、水凝胶、纤维蛋白胶等多个种类。CART行业先驱者卡尔·朱恩院士采用靶向CD5的LNP颗粒来特异性识别宿主体内T细胞，利用LNP递送CAR mRNA给T细胞，从而在体内形成FAP-CART来治疗心肌纤维化。整个策略大获成功。LNP递送原理类似电转，但效率更高。最重要的是，LNP不依赖透皮电击这个缺乏可行性的法子，因此大大扩展了in vivo CART的适用范围。此外，采用靶向CD4/CD8的慢病毒或腺相关病毒回输人体，也可以实现in vivo CART制备。同样来自于药剂学与CART的学科交叉，水凝胶或纤维蛋白胶等新型给药系统也展现了在CART领域极为优异的应用前景。水凝胶或纤维蛋白胶可以将CART包裹其中，从而为CART提供适宜的微环境以及额外的营养物质。此外，这种给药方式对人体的刺激也要小得多，非常适合进行肿瘤局部给药，或者术后肿瘤清扫。最重要的是，无论是LNP、水凝胶或纤维蛋白胶，均经历了多年的发展，并拥有完整的理论体系、人才团队与技术储备。这种本身就非常成熟的领域一旦与CART产生交集，就极有可能迸发出巨大的能量，产生“1+1>2”的效果。其实，这也符合一般药品的研发规律——在药品研发科学家完成了第一乐章的独奏以后，也该轮到药剂学家出场了。毕竟，药物开发从来就不是单打独斗的事情。非肿瘤疾病新瓶装旧酒 or 老树发新芽细胞治疗出现之初其实并不局限于肿瘤治疗，而是包括了艾滋、脑卒中、心衰、GvHD等多个领域。只不过，血液瘤领域的巨大成功，让这些昔日战友淹没在了CD19 CART的光环之下。而在2022年，当血液瘤CART步入商业化、行业开始追寻下一个“蓝海”的时候，CART在非肿瘤领域的应用就自然而然的从蛰伏转入了复苏。CART应用于非肿瘤领域主要包括两种形式，一是成熟的CART产品扩展新的适应症，即所谓“老药新用”，二是基于CART技术、针对非肿瘤适应症开发的全新产品。老药新用的情况集中在自身免疫疾病领域，相关产品主要包括CD19 CART和BCMA CART两款。而这方面的代表性事件，就是2022年8月驯鹿生物的BCMA CART伊基仑赛扩展新适应症视神经脊髓炎谱系疾病，成为了国内首张CART治疗自身免疫病的IND批件。事实上，由于大量自身免疫病都与B细胞相关，因此除了伊基仑赛的新适应症以外，我们还看到了CD19 CART应用于红斑狼疮、华氏巨球蛋白血症等疾病的进展。最重要的是，老药新用不需要开发新产品，可以直接使用已有CART产品的生产线、临床经验和申报资料，属于难得的“短平快”类药品开发项目。非肿瘤疾病领域的新型CART也在2022年取得了颇多进展。上文中提到的靶向FAP CART治疗心肌纤维化就让心血管医生不得不好好审视一下CART这款一般意义上的抗癌药。此外，靶向Dsg3 CART治疗自身免疫病天疱疮（此类CART也被称为CAART）、靶向CD45 CART配合异体干细胞移植完成深度骨髓清除、CAR-Treg产品治疗移植后排异和I型糖尿病等，都逐渐出现在人们的视野内。当然，CART在这些非肿瘤领域的应用会碰到诸多技术性和执行性的难题，因为这些适应症必然拥有与癌症治疗所不同的治疗诉求和用药禁忌，这都需要慢慢厘清。但是，就如2012年CART首次踏入ALL领域时一样，非肿瘤领域应用这扇大门一旦打开，就很难再关闭上了。而在各个非肿瘤领域的遍地开花，也最终会让CART从一款药物的名字，真正的成为一个药品类别的名称。小结2022年是CART产品的第一个十年。目前，我国医药行业已经充分认识到了细胞治疗产品的巨大潜力，越来越多的人才与资金也在不断注入到这个领域中来。对业内公司而言，对行业进展的系统性盘点可以帮助企业捋清行业发展方向，调整自身战略布局，并为自家产品制定清晰的开发计划。最新推荐/Recommendation/展望制药行业2023，做确定的自己逐条点评 | 药品管理法实施条例（征求意见稿）2022制药行业「大事件」盘点生产人员“阳了”、产品质量该如何评估？十年的GMP，它老了吗？点击下方卡片关注蒲公英 别忘了加星标哦~声明：本文内容仅代表作者个人观点，不代表任何组织或企业，如有不恰当之处，敬请指正。原创作品如需转载，请注明作者及来源：蒲公英Ouryao。