DXO

引言RNA修饰作为一种关键的表观遗传调控机制已经被广泛研究。迄今为止，已经发现了几百种RNA化学修饰，包括N1-甲基腺嘌呤（m1A）、N6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）等。近年来，越来越多的研究揭示：真核生物mRNA的5’末端除了存在典型的m7G加帽修饰外，还存在多种新型的5’端非典型加帽修饰，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、 脱磷酸辅酶A（dpCoA）等等。其中NAD+帽子修饰RNA（NAD-capped RNA）已经在不同生物体中被广泛鉴定到，包括在原核生物（如大肠杆菌、枯草杆菌、委内瑞拉链霉菌和沙眼衣原体）、真核生物（如酵母、哺乳动物细胞和植物）以及古细菌中。研究发现，不同生物体中的NAD-RNA种类各异。细菌中的编码蛋白mRNA和一些小型调控RNA、古细菌和真核生物中不同类型的RNA都已经被证明存在NAD+加帽修饰，强调了研究NAD-RNA生物合成、代谢和功能的重要性。2024年3月15日，北京大学生命科学学院和北大-清华生命科学联合中心陈雪梅课题组在Nature Communications发表了题为Toll/interleukin-1 receptor(TIR) domain-containing proteins have NAD-RNA decapping activity 的研究论文，该研究首次发现来自细菌和古细菌的TIR结构域蛋白具有强烈的NAD-RNA脱帽酶活性，能够从NAD+帽子修饰中去除NAM基团，产生一种新的非典型加帽修饰RNA（即环化ADPR-RNA或者其变体）。同时，研究还发现该TIR结构域蛋白介导的NAD-RNA脱帽活性高度依赖于谷氨酸残基催化位点，且在促进TIR结构域蛋白寡聚的条件下表现出增强的活性。TIR结构域蛋白显示出特异于其他已知脱帽酶的性质，即可以特异性地作用于NAD-RNA，而不作用于其他非典型帽子修饰的RNA。目前已经确定有两类NAD-RNA脱帽酶，分别在原核和真核生物中被相继发现。第一类脱帽酶（Class-I）以大肠杆菌的Nudix水解酶NudC为代表，其可以通过裂解NAD+帽子内部的焦磷酸键，释放烟酰胺单核苷酸（NMN），从而产生一个5’单磷的RNA（p-RNA）。真核生物中的NudC同源蛋白（如酵母中的Npy1和哺乳动物细胞中的Nudt12/16）也已经被证明是NAD-RNA的脱帽酶。第二类脱帽酶（Class-II）是以酵母、拟南芥和哺乳动物中的DXO/Rai1家族酶为代表的一类酶，其可去除整个NAD+帽修饰，生成p-RNA。酵母中的5’-3’外切核酸酶Xrn1和Rat1也可以以同样的方式去除NAD+帽子修饰，但主要作用于线粒体NAD-RNA。然而，NudC和DXO/Rai1两类酶也可作用于FAD帽子修饰和dpCoA帽子修饰的RNA，并非特异地作用于NAD-RNA。本研究证明，AbTir在细菌体内具有功能——在大肠杆菌中诱导表达AbTir蛋白可抑制细胞生长，显著降低游离NAD+和NAD-RNA的水平。全转录组范围内的NAD-RNA测序分析表明，大肠杆菌中一小部分涉及“分子运输”和“氧化还原酶活性”的基因产生的NAD-RNA易受到AbTir的靶向。本研究首次证明了TIR结构域蛋白具有NAD-RNA脱帽活性，提示它们在体内可能也参与NAD-RNA的动态调控，为后续研究NAD-RNA的生物学功能提供了良好的基础。有趣的是，TIR结构域蛋白被频繁报道参与生物体的抗病免疫过程，然而其背后的作用机制尚不完全清楚。本研究结果暗示TIR结构域蛋白可能通过影响NAD-RNA的表达水平在生物学抗病免疫中发挥作用，进一步的研究将有助于挖掘生物体抗病免疫新机制。三种不同的NAD-RNA脱帽机制总结（Credit: Nature Communications）原文链接https://www.nature.com/articles/s41467-024-46499-y责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要:真核生物转录的早期阶段包括两个主要事件：新合成mRNA的加帽，以及RNA聚合酶II从启动前复合物到生产性延伸状态的转变。加帽检查点模型意味着这些事件是紧密耦合的，这对于确保新合成mRNA的正确加帽是必要的。最近的发现还表明，加帽机制对转录和整个基因表达过程具有更广泛的影响。这些现象的分子基础将在本文中被讨论。1.引文真核生物mRNA的一个特征是5’端存在帽状结构。该结构由倒置的7-甲基鸟苷组成，其与新合成的转录子的第一个转录核苷酸相连，随后被帽结合蛋白复合物（CBC）结合。帽状结构的主要功能是通过保护mRNA免于5’核酸外切酶降解，以此来稳定新生的转录子。此外，帽状结构有助于聚集用于拼接、3’端加工、导出和翻译所需的因子。mRNA 加帽机制具有三种基本活性：RNA 5’三磷酸酶（RT）、鸟苷酸转移酶（GT）和RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶（RNMT）。在酵母中，有3种独立的酶负责这些活动。RNA 5’三磷酸酶（RT）和鸟苷酸转移酶（GT）在酿酒酵母中结合在一个功能复合物起作用，但在粟酒裂殖酵母中分别发挥作用。在后生动物中，前两种活性由相同的加帽酶（CE）进行，而甲基转移酶（RNMT）活性存在于 RNMT-RAM 复合物中，其中RNMT是催化亚基，RAM 是激活RNMT活性的活化亚基。此外，加帽机制包括帽子特异性mRNA-甲基转移酶 CMTR1和CMTR2（CMTr），以及最近描述的腺苷N6-甲基转移酶（CAPAM）。真核生物的mRNA加帽过程并不总是进行至完成。在哺乳动物中，DXO/Dom3Z和XRN家族蛋白在5’端加帽质量控制中用作监测蛋白质。特别是，脱帽外切核糖核酸酶DXO会降解加帽但未甲基化的早期mRNA。在酿酒酵母中，RNA加帽质量控制存在部分冗余机制：Rai1-Rat1和Ydr370C/Dxo1。当加帽和转录机制紧密耦合时，加帽发生。下面，我们描述了关于加帽过程和转录事件之间联系的观点。表1显示了在不同物种中参与建立这种联系的因素列表。2.加帽检查点模型RNA聚合酶II（Pol II）依赖型转录是一个由多种因素和信号调节的复杂过程，其中涉及多个检查点，以确保正确的mRNA合成和mRNA-蛋白质复合物的组装。主要检查点包括正确的mRNA加帽、剪接和3’端形成。真核生物转录发生在以下基本阶段：起始前复合物的组装、起始、延伸和终止。起始到延伸的转变进一步分为“早期延伸”和“生产性延伸”。这两个子阶段由RNA聚合酶II的暂停进行区分：在大约20-60个核苷酸转录后，RNA聚合酶II停止合成，直到特定信号出现。对hsp模型基因这一现象的早期研究表明，停顿与mRNA帽状结构的形成有关。加帽检查点模型表明RNA聚合酶II在启动子近端区域暂停，以确保在生产性延伸开始之前mRNA加帽。早期延伸的停止确保了加帽酶的聚集，这反过来又吸引了其他因素来取消早期延伸的停止。随着RNA聚合酶II穿过暂停区域，加帽逐渐发生：最近的暂停RNA大部分没有加帽，而更远端的完全加帽。在此上下文中，加帽意味着添加鸟苷，而其在转录过程中甲基化的时间点尚未确定。这就是为什么“加帽”在下文中指的是添加鸟苷的事件，并特别指出了其甲基化的情况。即使在暂停阶段，有几个因素可以确保进行适当的转变。转录起始后，DRB敏感型诱导因子（DSIF）结合RNA聚合酶II，并将负延伸因子（NELF）聚集到染色质。后者导致转录暂停，在此期间加帽机器聚集。在早期延伸过程中，RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）在第5个丝氨酸残基处被细胞周期蛋白依赖型激酶7（Cdk7）磷酸化，其是TFIIH的一个亚基。磷酸化的RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）和DRB敏感型诱导因子（DSIF）的Spt5亚基聚集加帽机器。加帽酶的聚集可以缓解负延伸因子（NELF）的作用，并为正转录延伸因子（P-TEFb）加载提供平台。后者使RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）、DRB敏感型诱导因子（DSIF）和负延伸因子（NELF）的第2个丝氨酸残基磷酸化。结果，磷酸化的负延伸因子解离，暂停的RNA聚合酶II被释放到生产性延伸中（图1）。3.加帽机器的功能取决于转录mRNA加帽装置和早期伸长因子在细胞核中显示出紧密的联系。连接这些机器的核心参与者是RNA聚合酶II C末端结构域（Pol II CTD）和Spt5。事实上，带有截断CTD的RNA聚合酶II显示了加帽缺陷。RNA聚合酶II C末端结构域具有特定的磷酸化模式，这取决于转录过程的阶段，而加帽酶（CE）的聚集和功能取决于该模式。正是磷酸化的CTD将转录与加帽耦合。更准确地说，它在第5个丝氨酸残基处的磷酸化（而不是在Ser2处）激活了加帽活性。启动子上的第5个丝氨酸残基磷酸化提供了正确的早期mRNA加工。第5个丝氨酸残基磷酸化的RNA聚合酶II已被证明可与加帽机器和TFIIH激酶共纯化。最近的研究表明，Ser7磷酸化对于加帽也很重要：鸟苷酸转移酶 Ceg1与酵母中的RNA聚合酶II相关联是必要的。裂变酵母中的Ser5磷酸化RNA聚合酶II C末端结构域和Spt5与鸟苷酸转移酶 Pce1和三磷酸酶Pct1相互作用。在芽殖酵母中，RNA鸟苷酸转移酶 Ceg1与Ser5磷酸化CTD结合，并将Cet1三磷酸酶聚集到RNA聚合酶II，并且还表明Ceg1和Abd1直接独立地与磷酸CTD结合。Ser5磷酸化对于RNGTT结合及其在哺乳动物中的活性也很重要。人类RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶（RNMT）募集还依赖于Ser5磷酸化[46]，RNMT与加帽酶和RNA聚合酶II的伸长形式形成三元复合物。小鼠加帽酶Mce1的鸟苷酸转移酶结构域与磷酸化的CTD结合。此外，哺乳动物鸟苷酸转移酶通过与Ser5磷酸化CTD结合以变构方式激活。因此，加帽机器与Ser5磷酸化Pol II CTD的连接是一个保守的特征。然而，哺乳动物加帽酶中CTD结合位点的位置和组成与酵母加帽酶中的位置和组成不同，后者识别相同的CTD一级结构。在芽殖酵母中，所有3个加帽酶被聚集到转录基因的5’端需要Kin28。这是负责Ser5磷酸化的主要激酶（后生动物中TFIIH的Cdk7亚基的同源物）。抑制人Cdk7活性导致加帽酶聚集减少，从而减少mRNA加帽，并增加RNA聚合酶II启动子-近端暂停。正如预期的那样，在生产性延伸期间，起作用的Pol II CTD磷酸酶拮抗CE结合。因此，磷酸酶FCP1对于哺乳动物中CE与Pol II CTD的解离是必要的。然而，单独磷酸化的Pol II CTD不足以实现高效加帽。有一种CTD独立但Pol II介导的机制，与CTD依赖性过程并行工作，以确保最佳的加帽。酵母中的mRNA加帽酶需要两个界面才能与Pol II相互作用：Ser5磷酸化CTD和Rpb1的多螺旋足域。后者有助于CE与Pol II相互作用的特异性。足部结构域或其相关因子的突变导致Ser5磷酸化增加。在酿酒酵母中，Cet1和Ceg1以异四聚体Cet12Ceg12形式与Pol II相互作用。Ceg1与磷酸化的Pol II CTD之间的相互作用已得到充分研究，但Cet1也与CTD外部转录的Pol II复合物形成广泛的相互作用。Ceg1似乎是可移动的，并且在转录复合体中采用多种构象。还观察到Ceg1与Pol II亚基Rpb7的接触。因此，CTD非依赖性和CTD依赖性网络共享机制的组合在激活共转录加帽。另一个有助于加帽机器募集的转录因子是Spt5蛋白，它是早期Pol II伸长因子DSIF的亚基。Spt5携带CTD，其作用类似于Pol II CTD。Spt5和Pol IICTD对于CE的招募很重要。在裂变酵母中，三磷酸酶Pct1和GT Pce1独立地与伸长因子Spt5结合。在芽殖酵母中，Spt5有助于mRNA加帽酶 Cet1、Ceg1和Abd1的稳定募集。有实验证据表明“Spt5 CTD代码”的概念，类似于Pol II CTD的概念。根据这一概念，Spt5 CTD在结构上是灵活的，可以采用由特定细胞Spt5CT受体蛋白模板化的不同构象；此外，Spt5CTD 重复的苏氨酸磷酸化刻有一个二元开关，由不同的CTD受体读取，每个受体都有自己独特的方式。与Pol II CTD不同，P-TEFb磷酸化Spt5 CTD阻断了Spt5-Pce1相互作用。值得注意的是，CE招募的方式可能是物种特异性的。在芽殖酵母中，帽甲基转移酶Abd1直接与磷酸化的丝氨酸5 CTD Pol II相互作用，而裂变酵母中的帽甲基转移酶Pcm1在与Cdk9/Pch1（P-TEFb）的复合物中募集，Cdk9/Pch1显然将加帽装置靶向转录复合物。一个以上的一般转录因子参与适当的加帽。这是TFIIB尖端区域，这是丝氨酸5 CTD Pol II磷酸化和mRNA加帽的适当水平所必需的。在哺乳动物中，第一和第二转录的核苷酸也可以被CMTR1和CMTR2酶O-2甲基化。这种修饰在翻译启始和转录本识别为先天免疫中的“自我”方面具有作用。在转录早期将CMTR1招募到Ser5磷酸化的Pol II CTD中。最近，发现了一种新的甲基转移酶CAPAM。它催化第一个转录的腺苷N6-甲基化。CAPAM被鉴定为Ser5磷酸化CTD相互作用因子1（PCIF1）。虽然最初发现CAPAM对模型基因的RNA聚合酶II依赖性转录有负面影响[68]，但后来的全转录组分析显示其对转录有基因特异性影响。因此，CE与Pol II和Spt5之间存在许多相互作用。这些互动对于CE的招募和功能至关重要。加帽机器与转录装置之间的连接是双峰的。一方面，Pol II CTD可以作为将mRNA 5’端和CE结合在一起的支架，从而提高加帽效率；另一方面，转录因子可以变构地增强加帽机器的活性。4.加帽装置对转录的影响加帽酶（CEs）与转录机制之间的关系是相互的。加帽酶与CTD Pol II的相互作用增强了加帽，但加帽酶也会影响转录。如初始所示，Cet1抑制转录再启动，并降低RNA聚合酶II在启动子-近端区域的积累，该区域独立于mRNA加帽活性。Ceg1刺激早期伸长，其突变体在此过程中存在缺陷。最新发现表明，Cet1-Ceg1复合物和DSIF刺激Pol II启动子逃逸并转移到伸长。酵母甲基转移酶Abd1对启动子的Pol II募集具有基因特异性刺激作用。Abd1对转录的刺激发生在甲基化缺陷突变体中，因此与加帽本身无关。Abd1中的条件突变体在某些基因上与启动子结合的Pol II以及在其他基因的启动子清除或早期伸长方面存在缺陷。Abd1 耗竭导致 CTD Ser5的高磷酸化。裂变酵母加帽-甲基转移酶Pcm1将P-TEFb招募到染色质中。当这种连接被破坏时，Cdk9没有被正确招募，Pol II延伸受到严重影响。Cdk9与RNA三磷酸酶Pct1的相互作用也在粟酒裂殖酵母中进行了描述。加帽酶沿基因的分布意味着它们会影响转录的后期阶段。在酵母中，Cet1和Ceg1的全基因组占用仅限于转录起始位点，而Abd1的占用率在下游110 bp处达到峰值，CBC的占用率随后升高。据推测，Ceg1-Cet1加帽装置与转录复合物解离，因为Ser5磷酸化在延伸过程中减少，而酵母Abd1帽甲基转移酶延长了与Pol II CTD的相互作用。人类加帽酶存在于5‘末端和整个基因中，甚至包括poly（A）位点下游超过千碱基的3侧翼区域。因此，加帽因子会影响转录延伸、终止、和mRNA 3’端加工。酿酒酵母Cet1 N端结构域（NTD）促进染色质转录（FACT）的募集或促进染色质转录（FACT），从而增强在Pol II参与活性基因的转录延伸，独立与mRNA加帽活性。Cet1 N端结构域的缺失会损害染色质转录的靶向，从而降低Pol II在转录伸长中的参与度，从而导致Pol II的启动子近端积累。在哺乳动物中，CE在NELF的帮助下抵消转录抑制[28，82]。哺乳动物RNMT-RAM也促进Pol II依赖性转录。RNMT-RAM对转录的影响是直接的并且独立于mRNA加帽、稳定性和翻译。RNMT-RAM结合早期mRNA的整个长度并招募与转录相关的蛋白质。因此，已经发现加帽酶调控转录，并且该调控独立于其酶活性。这种效应的机制似乎是基因和物种特异性的。加帽-转录相互作用的另一个重要参与者是CBC。它与早期转录活动也具有互惠关系。CBC参与转录因子的招募和转录的调节过程。CBC与酵母中的CTD激酶相互作用，其消耗影响CTD Ser2和Ser5的磷酸化水平。在哺乳动物中，CBC通过NELF和P-TEFb的募集刺激转录延伸，并且对CTD Ser2磷酸化很重要。在酿酒酵母中，CBC招募Ctk2或Bur2（P-TEFb的直系对照）。Abd1和CBC对于激酶Ctk1和Bur1的募集很重要，这两者促进了延伸和CE释放。mRNA CBC还通过其与酿酒酵母体内Mot1p的相互作用刺激启动子处的预启动复合物的形成。Mot1p是一种转录调控子，可积极或消极地以一种基因特异性方式调节Pol II转录基因表达。CBC通过阻碍终止因子Pcf11p和Rna15p（裂解因子CFIA的亚基）的募集来抑制弱终止子。因此，CBC在转录过程中具有多重功能。最近，聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2被描述为CBC的一种新型伴侣。这些蛋白在转录的早期延伸共同作用，它们的消耗会影响果蝇中的Ser5 CTD Pol II磷酸化。5.加帽作为基因表达的调控步骤近年来，已经出现了一些例子说明mRNA帽状结构形成受到不同信号的调节。这些信号调节mRNA帽状结构形成的速率和程度，导致基因表达的变化。第一个被描述的调节加帽的例子是c-myc依赖性活化。c-Myc调节许多转录子的帽状结构形成。c-Myc增加了催化活性CE向Pol II及其靶基因的募集。此外，c-myc导致帽状结构甲基化增加，这对c-myc依赖性基因调控做出了重大贡献，并且增加的帽状结构甲基化与TFIIH和P-TEFb活性的c-myc依赖性增强有关。由于7-甲基鸟苷帽状结构是有效翻译所必需的，因此增强的甲基化帽状结构形成也将蛋白质产量从c-myc响应基因水平的提高到超过转录诱导的水平。因此，无论转录增强本身如何，加帽的调节都是增强蛋白质合成的一种方式。另一个例子是E2F1转录因子，它通过依赖于Pol II磷酸化的机制促进帽状结构的形成。加帽由信号通路调节。例如，RNMT在细胞周期中被CDK1-细胞周期蛋白B1磷酸化并激活。这导致帽状结构甲基转移酶活性升高，同时转录在有丝分裂后G1期开始时重新开始。这是协调mRNA加帽与转录爆发的方法。在酵母中，营养饥饿导致帽状结构甲基化普遍减少。据报道，输入蛋白α刺激一般帽状结构甲基化。相反，CE mRNA-cap通过调节果蝇中的PKA活性来正向调节Hh信号活性。因此，mRNA加帽的调控因子，加上加帽质量控制机制，也许提供了另一层基因表达的调控。6.结论和前景上述加帽检查点模型已在许多研究中得到证实。然而，目前的加帽/转录相互作用模型尚未完成。有一些问题需要进一步调查。未来一个重要的挑战是澄清将加帽与转录暂停和延伸联系起来的因果关系。加帽蛋白和转录机器之间的广泛相互作用网络尚不清楚。因此，对新生mRNA进行CBC募集的机制知之甚少，监测去帽机器的募集也是如此。物种和基因特异性相互作用特别令人感兴趣。加帽和转录机器具有一些物种特异性特征，例如存在相当数量的后生动物特异性因子和种内副群（表1）。此外，高等真核生物CE的非催化调控域具有高度的多样性，即使在密切相关的物种中。这些事实可能意味着，在与转录装置的特定相互作用中，这些因子和结构域都有参与。上面一些例子提到了物种特异性连接，包括哺乳动物/酵母CE与磷酸-CTD Pol II相互作用的不同位点，芽殖/裂变酵母中GT-RT与Pol II相互作用的不同方式，哺乳动物中存在NELF-CE相互作用，以及转录机制中Abd1 / Pcm1的不同靶标。加帽机制功能中的基因特异性已经在一些例子中进行了描述，例如前面提到的c-myc和E2F1依赖性加帽调节。其他基因特异性转录因子也可以以类似的方式起作用并调节局部加帽。加帽因子也可能是基因特异性信号通路的靶标，例如RNMT的NTD，其携带多个修饰位点。加帽步骤并不总是进行至完成。一个重要的尚未解决的问题是，这是否仅仅是加帽过程固有的低效率的结果，还是调节早期mRNA加工的调控活动。如果后者是正确的，那么所涉及的成分是什么，以及如何做出决策：哪些早期mRNA应该加帽？先前的加帽模型表明，加帽通过阻止mRNA降解，在调控因表达方面起着“被动”作用。现在很明显，加帽可以被修改为“主动”调节mRNA或选定的子集的命运。目前尚不清楚哪组基因和转录因子参与调节加帽。需要更多的研究来更深入地了解信号通路对加帽的影响以及加帽调控在整个基因表达中的作用。原文来源：Interplay of mRNA capping and transcription machineries.

摘要：所有真核生物的mRNA都在5'端被加帽。mRNA加帽与转录同步进行，该过程分为三步。加帽过程的中间体，和未加帽的5’-三磷酸RNA一样，对去帽和某些已知因素导致的降解都具有抵抗性，导致人们认为mRNA5’端最终都会完成加帽过程。这种观点最近才发生了重大的变化。一个新的酶家族，包括酵母蛋白Rai1, Dxo1/Ydr370C和哺乳动物蛋白DXO/Dom3Z已经得到确认和鉴定。这些酶可以将加帽异常的mRNA转化为5'-单磷酸RNA，后者进而被5'-3'外切核糖核酸酶降解。其中一些酶本身也具有5'-3'外切核糖核酸酶活性，可以直接清除未正确加帽的mRNA。对这些酶的研究，使人们认识到不是所有mRNA加帽过程都会完成，并确定了真核生物mRNA加帽过程的质量控制机制。本文就这一领域的最新进展作一简要综述。 1.引言所有真核生物的mRNA的5’端都会被加帽，这一过程发生在转录起始后不久。帽子结构包含N7位点的甲基化鸟苷酸，并通过一个特殊的5’-5’焦磷酸键，与RNA的5’端核苷酸连接（m7GpppN)。加帽对mRNA的稳定性、剪接、聚腺苷酸化、出核，以及翻译效率至关重要。帽子结构的去除是一个高度调控的过程，由脱帽酶Dcp2和Nudt16催化完成。这些酶将7-甲基-二磷酸鸟苷从mRNA上酶切下来，生成5’-单磷酸mRNA。接下来，该5’-单磷酸结构会被5’-3’外切核糖核酸酶Xrn1特异性识别和酶切，引发RNA降解并脱帽。加帽过程分三步进行。第一步，起始转录产物的5’端三磷酸被转化成二磷酸键；接下来一个单磷酸鸟苷分子连接到该二磷酸末端；最后，鸟嘌呤碱基N7位点发生甲基化，从而形成成熟的帽子结构。在酵母中，加帽过程由单独的三种酶催化完成，而在哺乳动物中，第一、二步反应是由一个双功能的酶来催化的。加帽过程中间体以及未加帽的初始转录产物，可抵抗由Xrn1酶引起的降解，因为该酶特异性识别5’单磷酸位点。而脱帽酶 Dcp2/Nudt16识别的是成熟的、甲基化的帽子结构，所以并不能将这些加帽中间体或未加帽的初始转录产物转化成可降解的单磷酸RNA。鉴于这些原因，人们曾认为mRNA总是会被正常加帽，因为非正常加帽的mRNA分子并不能被一些已知的因素降解，从而被注意到。近年来，该观点发生了翻天覆地的转变。酵母中Rai1蛋白的酶功能得到确认，它可以将初始转录产物或者未甲基化的帽子结构（加帽中间体）5’端的三磷酸基团，转化成单磷酸基团，进而被降解。这些发现引发了mRNA加帽过程的质量控制机制。因此，我们将简要回顾这一领域的最新进展。2.mRNA加帽过程质量控制机制的发现酵母Rai1蛋白（Rat1相互作用蛋白1），已经被认为可以结合并激活5’-3’外切核糖核酸酶Rat1/Xrn2，Rat1/Xrn2在聚合酶II（PolII）转录终止中起重要作用。Rai1的首个三维结构是以Rat1/Xrn2复合体的形式被测定的。但是，其结构表明Rai1具有某种酶活活性。在表面观察到一个大口袋，远离Rat1/Xrn2结合区域（图1a）。这个大口袋区域包含诸多保守位点，提示其可能作为活性位点存在。随后的研究一致表明Rai1具有焦磷酸酶活性，且都归因于这个大口袋活性位点。该活性将5’-三磷酸RNA转化为5’-单磷酸RNA。和Xrn1一样，Rai1相关的外切核糖核酸酶Rat1/Xrn2特异性地识别5’-单磷酸的RNA底物，而不能识别和酶切5’-三磷酸RNA。Rai1酶活的确认提示这类RNA可被Rai1-Rat1/Xrn2复合物降解。在这一线索的基础上，后续的研究表明，Rai1还可以催化加帽中间体-未甲基化帽子结构的降解。在帽子结构甲基化缺陷菌株里，敲除Rai1基因显著增加了mRNA的半衰期，说明细胞里的Rai1蛋白在非正常加帽mRNA的清除过程中发挥了关键的作用。重要的是，更多的研究表明mRNA加帽是一个高度调控的过程，并不总能正确完成，这与之前的设想完全相反。在寡营养条件下，虽然Rai1基因敲除菌株的加帽机制是完整的，但非正常mRNA的相对比重依然显著增加。综上的这些证据揭示了mRNA加帽的质量控制机制。图1 Rai1及其同系物催化反应的结构基础(a)Rai1的结构(由PyMOL生成，网址http://www.pymol.org)。红色圈出的为活性位点，箭头所示为Rai1与Rat1/Xrn2相互作用的区域。(b) DXO/Dom3Z与帽子结构模拟物m7GpppG形成的复合物的结构。(c) DXO/Dom3Z与寡核苷酸复合物的结构。(b)和(c)的结构大致有一定相关性，即沿垂直轴旋转了45。(d) DXO/Dom3Z的活性位点。图中展示了帽子结构和第二个核苷酸的位置，粉色框里表示的是第一个核苷酸的位置。红色字母“W”表示进攻水或羟基，红色箭头表示亲核攻击的方向。图(b) - (d)引用自Jiao et al.(2013)。(注:此图例中对颜色的解释，请读者参考本文网络版) 3.酵母和哺乳动物中mRNA加帽过程的质量控制Rai1的同源蛋白存在于大多数真核生物中。尽管这些同源蛋白的序列相似度并不是很高，但Rai1活性位点相关的残基序列高度保守。这意味着Rai1同源蛋白也具有相似的酶活性，真核生物中的mRNA加帽控制机制是一致的。迄今为止，已被研究的Rai1同源蛋白有2个，这使得研究者对酵母中mRNA加帽质量控制机制有了更深入的认识，并推动了哺乳动物中这一机制的确认和表征。大多数的真核生物中仅有一种Rai1同源蛋白，但在某些真菌（如酿酒酵母）中，还存在其它种类的Rai1同源蛋白。该蛋白（Ydr370C）与Rai1序列相似度为20%。与Rai1类似，Ydr370C对含未甲基化帽子结构的RNA也具有脱帽活性。此外，Ydr370C还具有5’-3’核酸外切酶活性。正因为Ydr370C可以独立降解未甲基化mRNA，因此被称作脱帽外切核糖核酸酶1，即Dxo1。和Rai1不同，未检测到Dxo1/Ydr370C具有任何焦磷酸化酶活性。在正常生长条件下，敲除Rai1或Dxo1/Ydr370C都没有检测到mRNA水平的变化。但是，同时敲除这两种基因则会观察到未正确加帽mRNA比例的显著增加，表明这两种蛋白在酵母mRNA加帽质量控制过程中都发挥着必要的作用，且某种程度上来说二者是互补的。哺乳动物中Rai1的同源蛋白是Dom3Z。研究发现，它是Rai1和Dxo1/Ydr370C的杂合形式，同时拥有对5’-三磷酸或未甲基化帽子RNA的焦磷酸化酶和脱帽酶活性，且具有5’-3’外切核糖核酸酶活性，因此后续更名为DXO。这些活性使得DXO/Dom3Z可以独立降解未加帽的、或者未甲基化加帽的RNA。敲除细胞中的DXO/Dom3Z，对成熟加帽的mRNA水平没有影响，但观察到未正确加帽mRNA的显著增加。这些都表明在哺乳动物中存在mRNA加帽控制机制，且DXO/Dom3Z在其中发挥了关键作用。细胞中，Rai1-Rat1/Xrn2复合物、Dxo1/Ydr370C和DXO/Dom3Z的位置是不同的。Rai1-Rat1/Xrn2仅分布在细胞核中，DXO/Dom3Z主要在细胞核中，而Dxo1/Ydr370C则主要在细胞质中。分布位置的不同，说明mRNA加帽过程质量控制发生的位置不同，在哺乳动物中该过程发生在细胞核内，而在酵母中则细胞核内和细胞质都会发生。这可能也是酵母和哺乳动物细胞中mRNA出核方式不同的原因。在这两种有机体中，都存在一个保守的TREX（转录/导出）复合物，在mRNA出核中发挥关键作用。在酵母中，TREX募集是伴随着转录过程的，而在哺乳动物中，TREX复合物的募集是剪接和5’-帽子结构依赖性的。因此，哺乳动物mRNA出核的过程其实扮演着一个额外的mRNA加帽控制检查点的角色，它可以阻止非正常加帽的mRNA进入到细胞质中。酵母中缺乏这一机制，可能需要依靠细胞质中的Dxo1/Ydr370C来保证正确的加帽。体外实验中，Rai1对含有成熟甲基化帽子结构mRNA的脱帽活性最低，而Dox1/Ydr370C和DXO/Dom3Z的活性则相对极高。而在细胞内该脱帽活性被抑制，因为帽结合蛋白会优先与成熟帽子结构结合从而保护其免遭降解。体外试验中，不论细胞核还是细胞质中的帽结合蛋白（CBP20和elF4E），都可以有效抑制DXO/Dom3Z的脱帽活性。除此之外，DXO/Dom3Z对三甲基化帽子（m2,2,7GpppN）RNA也具有脱帽活性，并可能调节细胞内三甲基化加帽富鸟苷酸的小核RNA。4.Rai1及其同系物催化的结构基础Rai1及其同系物的结构包含两个高度扭曲的β-片和几个α-螺旋，他们覆盖了β-片的一些暴露的表面。活性位点位于整个蛋白结构的中心，位于β-片之间的交界面 (Fig. 1a)）。活性位点包含四个高度保守的基序，在DXO/Dom3Z中对应的是Arg132（基序I），Gly188-Tyr-Phe-Glu192（基序II，GΦXΦE，Φ为芳香族或疏水性氨基酸残基，X为任意氨基酸），Glu234-Val-Asp236（基序III，EhD，h为疏水性残基），Glu253-Leu-Lys255（基序IV，EhK）。Rai1及其同系物的结构与其它已知的蛋白结构上不具有同源性，但和D-(D/E)XK核酸酶的结构略有关联。尽管如此，Rai1同系物和这些核酸酶在序列上几乎没有相似性，且相似度主要限于基序III（EhD）和基序IV（EhK）上的天冬氨酸残基，在所有这些酶中，该残基作为金属离子结合位点。突变研究表明，Rai1及其同系物具有的所有三种酶活性，即：脱帽、焦磷酸化和5’-3’外切核酸酶活性，均来自这一活性位点。脱帽酶Dcp2是将m7Gpp帽子从mRNA5’端酶切下来，与之不同的是，Rai1及其同系物酶切的是第一和第二核苷酸之间的磷酸二酯键，从而释放出甲基化或非甲基化的GpppN帽子。对DXO/Dom3Z结构的研究，为Rai1及其同系物的酶催化机理提供了分子学基础。DXO/Dom3Z与模拟帽子m7GpppG（图1b）及寡核苷酸（图1c）形成的复合物的结构表明，加帽mRNA分子结合活性位点口袋，其中帽子（m7GpppG）和第一个核苷酸位于一侧，RNA分子的剩余部分位于另一侧，催化体系还包含位于中间的两个金属离子。Arg132（基序I）的侧链识别帽子结构的磷酸基团，金属离子与基序II、III、IV的侧链残基，第一第二核苷酸之间的磷酸基团，以及基序IVLeu254主链的羧基发生配位作用。基于这一结构信息，有人提出：其中一个金属离子激活水分子或羟基离子，其随后攻击第一和第二核苷酸之间的易裂磷酸键，在该基团5’端进行切割并释放游离GpppN。Lys255（基序IV）的侧链稳定了催化过程中的氧负离子中间体（图1d）。这种双金属离子催化机制在核酸酶中广泛存在。DXO/Dom3Z的结构表明，结合帽子和第一核苷酸的活性位点，也包含了5’末端核苷酸（pN1）或焦磷酸基团，催化5’端单磷酸或三磷酸RNA降解释放出pN1或焦磷酸基团，产生5’-3’前核糖核酸酶和焦磷酸酶活性。因此，Rai1及其同系物的三种看似不同的活性都使用了相同的催化机制，并且催化的产物取决于不同底物的不同结合模式。5.结束语与以往的认知不同，如今已知真核生物中mRNA的加帽过程并不总是能被完成。非正确加帽可能来自于加帽过程中的偶发错误，而加帽质量控制机制可以纠正这些错误。且/或，后续的证据表明，这是加帽过程主动调控的结果。例如，已有报道指出importin-α激活帽子甲基化。Myc调节许多mRNA帽子甲基化，而营养缺陷条件导致帽子甲基化比例普遍降低。mRNA加帽的调控因子和质量控制机制一起，可能为基因表达提供另一层调控。最近的研究极大地促进了我们对真核生物中mRNA加帽质量控制的了解。然而，目前对这一过程的理解还远远不够。例如：Rai1、Dxo1/Ydr370C和DXO/Dom3Z底物特异性的分子基础仍不清晰。是否可以通过已知的加帽质量控制因素清楚5’-二磷酸RNA，即加帽过程中产生的另一种中间体，还有待观察。重要的是，关于Rai1及其同系物如何与其它因素相互作用，以协调加帽质量控制与其它细胞过程，我们知之甚少。例如，在酵母中，已经证明Rai1-Rat1/Xrn2复合物与PolII的转录机制相关，且Rat1/Xrn2会在转录过程中就清除掉不正确加帽的初级转录产物。在哺乳动物中是否也是如此还未可知，如果也是，那么是哪些因素负责调动DXO/Dom3Z。这些问题的答案都还有待进一步研究。mRNA加帽在诸多细胞过程中发挥着重要的作用，而加帽过程质量控制机制的明确，为帽子结构紊乱异常及探究帽子结构在这些细胞过程中的功能提供了一种新颖的思路。DXO/Dom3Z的敲除就是一个例证，使得人们认识到，在哺乳动物中mRNA加帽与mRNA剪接和多聚腺苷酸化的关联比以往认为的还要密切。在这个方向上的进一步研究将带来对mRNA帽子结构生理作用更深入的理解。原文来源：mRNA quality control at the 5' end.J Zhejiang Univ Sci B.2014 May;15(5):438-43.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。