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摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）是一类生物制药，其中细胞毒性剂与单克隆抗体（mAbs）偶联，允许靶向药物传递。目前的异质性ADCs（在随机可变位置偶联）存在稳定性、可重复性、效力等问题。最近的进步已经导致了通过位点特异性偶联的均质ADC制剂的开发，允许控制药物-抗体比率。这些方法增加了ADC制剂的治疗窗口、效力和批次间一致性。抗体在Fc区域携带一对异质性N-糖链，这对抗体功能至关重要。通过糖基工程已经实现了药物偶联，包括使用内切β-N-乙酰葡萄糖胺酶（ENGases）和单糖基转移酶突变体。在本文中，我们总结了不同的糖基工程方法用于抗体-药物偶联，并讨论了它们对下一代均质ADCs开发的优势。 1.引言 抗体-药物偶联物（ADCs）是通过将细胞毒性剂与单克隆抗体（mAbs）偶联而制备的一类靶向疗法。截至2021年1月，已有九种ADCs正在使用，超过80种ADCs处于临床试验中。目前商业化的ADCs是异质性的（在随机可变位置偶联），因为有效载荷是通过抗体的氨基或硫醇基团偶联的，导致药物-抗体比率和连接位点的变化。这种非选择性方法不是最优的。异质性ADCs存在可重复性、效力和稳定性问题，可能带来显著风险，阻碍了临床开发。因此，目前期待新一代改进的ADCs。为了最大化下一代ADCs的可重复性、耐受性、效力和治疗窗口，非常需要开发能够产生均质ADC制剂的方法。 IgG普遍在Fc区域的Asn297上携带一对N-糖链，由于其复杂的生物合成过程，这在很大程度上是异质性的。糖链结构在抗体功能中起着至关重要的作用。例如，Fc N-糖链上核心岩藻糖的缺失可导致抗体依赖性细胞毒性（ADCC）增强100倍。在非人细胞中生产的mAbs表达的糖链结构在人类血清IgGs中不常见，导致严重的免疫原性。此外，据报道，商业化的曲妥珠单抗的N-糖链结构在不同批次之间存在差异。因此，调节Fc N-糖链结构非常重要。最近，使用内切β-N-乙酰葡萄糖胺酶（ENGase）突变体的IgG糖基工程变得可能，这可以提供具有均质糖链结构的抗体制剂。这种方法的扩展将允许生产具有糖链连接的均质ADC制剂。在N-糖链位点偶联有效载荷是理想的，因为Fc N-糖链位于Asn297，远离抗原结合区域。因此，这种糖链的修饰不会影响抗原结合能力。 最近，我们通过ENGase突变体介导的糖基工程实现了均质ADC制剂的制备。除了ENGases，还有其他方法可以将有效载荷偶联到抗体的糖基部分。在这里，我们总结了基于糖基工程的均质ADC制备方法，并特别关注我们的方法。 Shino Manabe教授于1996年在东京大学Kenji Koga教授的指导下获得了博士学位。在此期间，她加入了哥伦比亚大学Gilbert Stork教授的研究小组，担任研究员，并在天然产物合成领域工作。之后，她转到RIKEN工作，并在日本科学技术振兴机构的胚胎科学与技术（PRESTO）计划中任职。在那段时间里，她获得了日本药学会青年科学家奖。目前，她是星药科大学全职教授，同时在东北大学药学研究生院及药学部药物开发研究中心任职。她的主要研究兴趣涉及糖缀合物合成技术的开发展。 山口义树教授于1998年在日本东京大学药学研究生院（导师为Isao Shimada教授和Yoji Arata教授）获得了博士学位。他继续在同一研究小组作为博士后研究员，然后作为研究员进行研究。从2001年到2007年，他在名古屋市立大学（Koichi Kato教授）担任讲师，之后他转到RIKEN，先是作为结构糖生物学团队的团队领导（2007-2017年），然后在合成细胞化学实验室继续研究（2017-2018年）。2018年，他转到东北医疗药科大学，担任他目前的教授职位。他目前正在研究糖缀合物和糖结合蛋白的三维结构和功能。 2.使用ENGase/ENGase突变体的抗体糖基工程  2.1.ENGase突变体的作用  ENGases是水解酶，能够切断N-糖链N,N'-二乙酰壳二糖核心中的β-1,4-糖苷键。从不同来源分离出多种ENGases。ENGases催化的水解机制涉及壳二糖核心中第二个GlcNAc残基的邻近基团参与（方案1）。在活性位点中氨基酸的位移产生了ENGase突变体，这些突变体抑制了糖链水解活性，但仍具有糖链转移活性（表1）。因此，ENGase突变体将糖链整体转移到糖链截短的抗体上，从而生产具有均质糖链结构的抗体。在ENGases中，EndoS和Endo S2突变体特别用于抗体糖链重塑，因为它们对IgG具有高亲和力（方案2）。 方案 1. EndoS 和 Endo S2 内切酶的糖链水解机制。 方案 2. 使用内切酶/内切酶突变体制备具有均质糖链结构的抗体的策略示意图。括号内显示的是异质性组分。 首先，在水解过程中通过底物辅助催化生成一个恶唑啉中间体。高能态的糖链恶唑啉是ENGase突变体介导的糖链转移反应的良好糖链供体。因此，在水解原始异质糖链后，EndoS/Endo S2突变体和糖链恶唑啉可以结合，介导后者转移到IgG分子上，从而提供具有均质糖链结构的抗体。准备的具有均质糖链的抗体揭示了糖链的重要性以及糖链结构与抗体功能（包括稳定性、ADCC活性和与Fcγ受体的结合能力）之间的关系。 2.2.ENGase突变体介导的糖链转移反应条件 ENGase突变体介导的糖链转移反应的条件必须仔细优化。在没有ENGase突变体的情况下，糖链恶唑啉在碱性条件下与赖氨酸氨基基团反应（方案3）。我们通过亲水作用色谱（HILIC）的UPLC分析实现了这一副反应的实时监测。这种方法可以用来监测和优化反应。优化后，我们将反应介质的pH设定为6.5。在这些条件下，氨基被质子化以减少亲核性。由于糖链恶唑啉在pH 6.5下不稳定，因此在反应过程中分批添加以保持足够的浓度。 方案 3. 糖链氧化哌啶酮与氨基之间的副反应。 此外，选择合适的ENGase突变体是一个重要问题。虽然Endo M N175Q经常用于GlcNAc肽的糖链转移，但这种突变体对携带核心岩藻糖的抗体的糖链转移效果不佳。我们使用了Endo CC1，它具有与Endo M N175Q相似的特性，但热稳定性更高，用于添加到缺乏核心岩藻糖的抗CCR4抗体。 2.3.高效糖链转移的方法 为了避免副反应，我们使用唾液酸糖肽（SGP）1作为供体，而不是高反应性的恶唑啉2。因为SGP 1不是过渡态模拟化合物，其反应性与恶唑啉2相比低。因此，糖链转移需要高浓度的SGP 1。另一种避免副反应的方法是结合两种ENGase突变体和SGP 1（方案4）。在这两种ENGase突变体中，Endo M N175Q用于生成活性糖链中间体，推测是恶唑啉，尽管确切结构未被鉴定。生成的活性糖链中间体使用ENGase突变体EndoS D233Q进行原位糖链转移。这一程序降低了恶唑啉浓度，从而抑制了副反应。这种方法的其他优点是避免了相对不稳定的恶唑啉的分离，并且恶唑啉的制备和糖链转移可以在一锅操作中进行。 方案 4. 通过结合两种内切酶突变体，在一锅操作中原位生成氧化哌啶酮和糖链转移反应。 尽管ENGase突变体的水解活性受到抑制，但由于剩余的水解活性，糖链转移产率有时仍然不足。使用固定化ENGase突变体的流动化学是提高产率的关键技术。虽然使用固定化Endo M N175Q的流动反应产率可以高于90%，但在静态条件下产率低于90%。固定化的ENGase可以回收利用，这也是一个优势。 2.4.均质ADC的制备 基于上述协议，通过携带有效载荷偶联功能团的糖链恶唑啉，可以准备均质ADCs（方案5）。在唾液酸糖链3的唾液酸的羧基上，通过使用苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基磷酰六氟磷酸盐（PyBOP）形成酰胺键引入叠氮基团。然后，根据Shoda协议在水中通过脱水反应制备恶唑啉4（方案6）。最后，需要进行双正交反应以将有效载荷添加到连接位点，从而实现均质ADC的制备。 方案 5. 糖链偶联均质ADCs制备策略的示意图。括号内显示的是异质性组分。 方案 6. 制备携带叠氮基团的糖链氧化哌啶酮。 曲妥珠单抗是一种与HER2抗原结合的mAb，广泛用于治疗乳腺癌和胃癌。曲妥珠单抗也常在ADC研究中使用。通过EndoS D233Q将携带叠氮的糖链转移到曲妥珠单抗后，每个抗体上安装了四个叠氮基团。通过与张力炔烃的双正交反应，将带有溶酶体酶cathepsin B可切割的Val-Cit（瓜氨酸）连接子和单甲基auristatin E（MMAE）5载荷偶联（图1）。MMAE是一种有效的抗有丝分裂药物，源自海洋生物中的肽类，已被固定在琼脂糖上，并且与糖结合域融合的EndoS D233和D233Q已被固定在纤维素上。如上所述，这些固定化的ENGase突变体有效地转移糖链。固定化野生型EndoS与上述ENGase突变体的结合允许进行抗体糖基工程，而无需纯化糖链截短的抗体。此外，在ADC brentuximab vedotin中，并且目前在几种使用的ADCs中使用。 图 1. 用于糖链偶联ADC的载荷。 我们通过UPLC、MS和肽图谱确认了所准备ADC的均质性。完整MS清楚地显示了4:1的药物-抗体比率。流式细胞仪表明，ADC的结合亲和力与天然曲妥珠单抗相同。此外，ADC对高HER2表达的乳腺癌SK-BR-3细胞或胃癌OE-19和N-87细胞系具有高度的细胞毒性。特别是，SK-BR-3细胞的IC50与MMAE本身相同（0.3 nM）。另一方面，ADC对低HER2表达的乳腺癌MCF-7和胃癌MKN-45细胞系没有细胞毒性。这些结果证明了糖链偶联ADC的有效性。 已经报道了用于均质糖链偶联ADC制备的类似方法。在二醇基团氧化裂解后，使用腙键引入叠氮基团（图2）。糖链转移后，有效载荷6被偶联，ADC对SK-BR-3细胞系显示出强大的细胞毒性。 图 2. 用于载荷偶联的糖链氧化哌啶酮水合物。 心房利钠肽用于治疗充血性心力衰竭等心血管疾病。然而，心房利钠肽在体内的半衰期很短（2.4±0.7分钟）。通过EndoS D233Q/Q303 L突变体的糖基工程，将PEG 7与心房利钠肽偶联。ADC的半衰期延长至14.9天，并且降低血压的效果维持超过28天。 3.抗体糖基工程的其他方法  3.1.1,2-顺式二醇的氧化断裂  由于岩藻糖和唾液酸含有邻位顺式二醇，通过NaIO4的选择性氧化断裂可以产生无甲壳类动物Dolabella auricularia的甲壳素，这些甲壳素被称为多拉定。可被组织蛋白酶裂解的连接子首次由研究小组开发。 由于抗体没有甲酰基团，生成的甲酰基团可以作为在糖基部分专一性地固定载荷的官能团。唾液酸的无环二醇基团与其他单糖相比具有更大的灵活性和无阻碍性；因此，唾液酸可以在相对温和的条件下被氧化。然而，抗体通常含有低水平（<10-14%）的唾液酸。为了增加唾液酸含量，可以通过商业可获得的半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶，使用尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）和胞苷酸唾液酸（CMP-唾液酸）作为糖基供体，来延长寡糖链。使用NaIO4处理HPCM2（一种抗磷脂IgM），用于糖链125I和111In的偶联。这些偶联抗体被证明保留了它们的结合亲和力。相比之下，通过赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的偶联降低了它们的亲和力。体内生物分布和肿瘤定位数据表明，通过糖链放射性标记的抗体可能对免疫扫描成像有益。 这些方法要求抗体长时间暴露于低pH值、剧烈的氧化条件，以及对氨基酸残基（如半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸）的修饰，这可能会引起潜在问题。3.2.唾液酸转移的修饰 由于唾液酸转移酶对唾液酸C-5和C-9位置的修饰具有耐受性，可以将9-叠氮基团功能化的CMP-唾液酸转移至糖链（方案7）。利用唾液酸转移酶的耐受性，可以在糖链上引入叠氮基团以备ADC制备。为了增加唾液酸含量，使用半乳糖基转移酶和UDP-半乳糖添加半乳糖。然后，使用重组α-2,6-唾液酸转移酶I和9-叠氮-CMP-唾液酸，将带有叠氮基团的唾液酸并入。二苄基环辛基羰基（DIBO）基团中的炔烃与叠氮烃通过无铜Huisgen反应（炔烃-叠氮环加成）反应，并可用于生产生物缀合物。修饰抗体的唾液酸部分C-9的叠氮基团可以使用FITC、生物素或水合霉素等DIBO修饰的反应。制备的ADC在体内以剂量依赖性方式显示出细胞毒性。 方案 7. 使用9-叠氮基唾液酸和唾液酸转移酶的均质糖链偶联ADC。括号内显示的是异质性组分。 3.3.改良的半乳糖转移 由于半乳糖基转移酶能够容忍改良的半乳糖基供体结构，因此可以通过半乳糖基转移酶添加带有功能团的半乳糖。C2-酮半乳糖或叠氮-GalNAc已通过β(1,4)Gal-T1-Y289L半乳糖基转移酶突变体并入。半乳糖被半乳糖苷酶处理和β(1,4)Gal-T1-Y289L转变为带有叠氮基团的GalNAc（方案8）。然后，放射性同位素或细胞毒性化合物可以添加到叠氮基团上。还报道了另一种方法（方案9），在EndoS处理后，叠氮-GalNAc被转移到GlcNAc上，产生短糖链结构。这两种均质糖链偶联抗体在异种移植小鼠模型中显示出比异质赖氨酸偶联抗体更多的积累。 方案 8. 使用半乳糖基转移酶突变体的ADC制备方法。括号内显示的是异质性组分。 方案 9. 使用半乳糖基转移酶突变体的替代ADC制备方法。括号内显示的是异质性组分。 4.总结与展望  在这里，我们总结了抗体糖基工程技术和开发均质ADC制剂的方法。由于对ADC和抗体药物的需求持续增加，了解糖链功能至关重要。尽管已经报道了不同的均质ADC制备方法，但本文报道的化学-酶法途径具有许多优势。由于N-糖链位于Fc区域，有效载荷的偶联不会干扰抗原结合。此外，糖链原本就存在于Fc区域，因此引入的突变或外来序列的免疫原性不是问题。 目前，许多ADC和治疗性抗体生产的商业制造过程使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。然而，这种系统的生产力仍然很低。因此，正在研究CHO细胞的替代品，如微生物蛋白生产系统、蚕和酵母。这些系统产生的抗体带有高甘露糖糖链。正在探索通过糖基重构技术将高甘露糖型糖链转变为人类型复杂型糖链，以降低抗体生产成本的尝试。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）以及当前的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是人类历史上影响最大的冠状病毒，尤其是后者，它为人类疫苗学带来了革命性的变化。由于其高度传染性，这种病毒迅速在全球传播，并在2020年3月被宣布为大流行。疫苗通常需要超过10年的时间来开发。因此，目前还没有针对SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗。目前，世界卫生组织（WHO）已批准10种疫苗用于针对SARS-CoV-2的紧急使用。病毒样颗粒（VLP）是类似原生病毒的纳米颗粒，但不包含病毒基因组。由于其自我佐剂特性，VLP已被广泛探索用于疫苗开发。然而，没有一种针对SARS-CoV-2的批准疫苗是基于VLP的，而且只有4%的临床试验中的疫苗候选是基于VLP的。在当前的综述中，我们集中讨论了针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗候选物开发的主要进展，包括临床和临床前研究，以提供对针对冠状病毒的基于VLP的疫苗的全面概述。 1.引言 在严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）出现之前，已知的人冠状病毒（HCoV），如HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1，仅会引起上呼吸道感染，这种感染约占普通感冒的15%至30%。SARS-CoV于2003年首次被确认为严重急性呼吸综合征（SARS）流行病的病原体，其源头可追溯至2002年底中国的广东省。早期SARS-CoV感染通常会导致类似流感的症状，如发热、寒战、头痛、肌肉疼痛和腹泻。SARS-CoV感染已知会导致高热（超过38摄氏度）和肺炎，这可能发展为严重的急性呼吸综合征，导致呼吸衰竭和死亡，没有呼吸机的帮助。据报道，SARS-CoV感染了29个国家的8000多人，导致774人死亡（9.6%的死亡率）。这激发了全世界科学家的兴趣，以了解免疫力以指导针对冠状病毒的疫苗开发。这场流行病持续了8个月，世界卫生组织（WHO）于2003年7月5日宣布结束。SARS-CoV感染的控制主要是通过公共卫生措施和对患者的严格隔离来实现的。 中东呼吸综合征（MERS），也称为骆驼流感，是2003年SARS-CoV爆发后出现的另一种致命的呼吸系统疾病。MERS的病原体是另一种冠状病毒，称为MERS冠状病毒（MERS-CoV）。该病毒于2012年在沙特阿拉伯首次被发现。截至2022年2月，MERS-CoV感染在27个国家报告，有2585例实验室确诊病例和890例相关死亡，这对应于已识别病例的34%死亡率。在所有报告的病例中，有2184例发生在沙特阿拉伯，有812例相关死亡，或37.2%的死亡率。 骆驼被认为是MERS-CoV的宿主，病毒主要是在沙特阿拉伯通过人-骆驼频繁接触而从动物传播给人类。大多数涉及人际传播的报告病例是通过医护人员与感染患者的密切接触在医院获得的。迄今为止，尚无针对MERS-CoV感染的特定治疗或疫苗。尽管死亡率很高，但由于MERS-CoV似乎不容易在人与人之间传播，因此MERS-CoV并没有受到太多关注。尽管MERS-CoV爆发主要在阿拉伯半岛流行，但几年前韩国的一次爆发始于一位访问中东并被MERS-CoV感染的商人。他回到韩国后，一系列人际超级传播事件被触发，最终导致186例病例和38例相关死亡（20%死亡率）。病毒传播到第二代和第三代接触者立即引起了对MERS-CoV多重突变的担忧，这可能导致了增强的人际传播。 自2019年底以来，另一种新的大流行冠状病毒已经出现。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）最初是从中国湖北省武汉市分离出来的。尽管SARS-CoV-2感染的死亡率（2%）明显低于SARS-CoV（10%）和MERS-CoV（20-37%），但SARS-CoV-2的传播率异常高，其受体结合域（RBD）与人类血管紧张素转换酶2（hACE2）受体的结合亲和力比SARS-CoV的RBD高10-20倍。截至2021年12月28日，SARS-CoV-2已感染全球超过2.82亿人，导致超过500万人死亡。到2022年4月1日，SARS-CoV-2已感染超过4.88亿人，造成超过600万人死亡。SARS-CoV-2的死亡率已显著降低，从1.8%（2019-2021）降至0.5%（2022年至今）通过使用疫苗。 疫苗通常需要10-15年的时间才能开发出来，直到被批准用于人类。然而，由于这场大流行的严重性，COVID-19疫苗的开发正在以极快的速度进行，特别是临床阶段大大加快了。迄今为止，世界卫生组织（WHO）已批准10种疫苗的使用，分别是BNT162b2（辉瑞-BioNTech）、mRNA-1273（Moderna）、AZD1222（阿斯利康）、Ad26.COV2.S（强生）、Covishield（印度血清研究所）、BBIBP-CorV（国药）、Covaxin（印度生物技术）、Coronavac（科兴）、COVOVAX（印度血清研究所）和Nuvaxovid（诺瓦瓦克斯）。此外，目前有153种疫苗候选正在进行临床试验，196种候选正在进行临床前试验。尽管SARS-CoV-2大流行给世界带来了非常严重的社会和经济影响，但它也给疫苗开发带来了革命性的变化，包括临床试验指南的快速发布、监管审查和批准流程的加快。此外，联合临床试验加速了新型COVID-19疫苗进入临床应用的过程。值得一提的是，这场大流行还允许在人类疫苗历史上首次使用基于mRNA的疫苗（辉瑞-BioNTech的Comirnaty）。 在所有批准的COVID-19疫苗中，没有一个是基于病毒样颗粒（VLP）的。在当前的综述中，我们集中讨论了针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的基于VLP的疫苗候选物开发的主要进展，包括临床和临床前研究。Scopus和谷歌搜索引擎被用来实现与这些冠状病毒的基于VLP的疫苗相关的期刊文章的全面覆盖。此外，还讨论了SARS-CoV-2候选疫苗的最新进展，并与WHO COVID-19疫苗追踪器和景观进行了交叉检查。本综述旨在提供对针对冠状病毒的基于VLP的疫苗的全面概述。 2.β-冠状病毒的分子特征 SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2是感染人类的β-冠状病毒。这些病毒包含一个长度分别为29.7、30.1和29.9 kb的单链、正义RNA基因组。所有这些冠状病毒在5'-非翻译区（5'-UTR）都含有一个帽子结构，包括一个转录调节序列（TRS）和一个3'聚腺苷酸（poly(A)）尾巴。整个基因组直接作为mRNA发挥作用，编码开放阅读框（ORFs）ORF1a和ORF1b，然后由病毒NSP3（PL蛋白酶）和NSP5（3CL蛋白酶）处理成各自的非结构蛋白（NSP）。另一方面，结构蛋白由亚基因组RNA（sgRNAs）编码，这些是在合成负义RNA链期间产生的，其中病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）可以在结构蛋白5'端的每个TRS上暂停，然后是RdRp的分离和重新定位到位于5'-UTR的领袖TRS，从而在NSP和部分结构蛋白上创建主要缺失。这创建了一组将转录成结构蛋白的mRNA，包括刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）蛋白，以及每种冠状病毒特有的辅助蛋白。 在病毒组装期间，N蛋白结合并包裹病毒基因组，形成核糖核蛋白（RNP）复合体，然后突出到含有S、E和M蛋白的内质网-高尔基中间区室（ERGIC）的膜上，形成完整的病毒粒子，通过胞吐作用从宿主细胞释放。S蛋白是最重要的成分，负责病毒的附着、融合和进入宿主。因此，S蛋白是开发针对冠状病毒的疫苗的主要靶标。天然S蛋白本质上是三聚体，每个亚基由两个域组成，称为S1和S2。S1包含一个N端域（NTD）和一个RBD，负责病毒附着到宿主受体。虽然SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD识别存在于肺和小肠上皮细胞中的高密度的人类血管紧张素转换酶2（ACE2），但MERS-CoV通过二肽基肽酶4（DPP4）与其宿主结合，后者在下呼吸道更为丰富。S2另一方面，介导膜融合以允许病毒进入宿主。 大多数疫苗，包括临床试验中的候选疫苗，使用整个刺突（S）蛋白或至少是刺突1（S1）亚基的RBD。RBD，一个由223个氨基酸（a.a.）组成的蛋白质亚基，在SARS-CoV-2感染中发挥直接作用，因为它结合到存在于包括肺和胃肠道上皮细胞在内的大多数人类细胞类型的人类ACE2受体，然后促进病毒进入宿主。因此，针对S1蛋白RBD区域的抗体被证明是有效的中和抗体。 3. 病毒样颗粒的特征 病毒样颗粒（VLPs）是由一个或几个病毒结构蛋白形成的非传染性纳米颗粒，它们在形态上类似于原生病毒，但没有病毒基因材料。VLPs最初是在1968年在患有唐氏综合症、白血病和肝炎的患者的血清中发现的。最早的两个VLPs是从乙型肝炎病毒（HBV）衍生的，并在1980年代中期在大肠杆菌和酿酒酵母中表达。VLP的自组装驱动因素是病毒包膜或衣壳蛋白。VLP主要由静电和疏水力维持在一起，通过其他分子相互作用（如二硫键）进一步增强，形成强大但略有弹性的结构。通常，有两种类型的VLPs，一种只包含病毒衣壳或核衣壳蛋白，另一种包含嵌入在通常来自宿主的脂质膜中的病毒糖蛋白。虽然非包膜VLPs通常包含刚性的衣壳结构，呈二十面体或杆状，但包膜VLPs大致呈球形，没有固定形状，大小范围广泛。VLPs可以根据其结构复杂性进一步细分为不同的组。衣壳蛋白可以排列成三层。单蛋白VLPs具有相对简单的结构，而多蛋白VLPs包含独特的结构组分，如存在几个不同的衣壳层。其他如源自人类免疫缺陷病毒（HIV）-1和流感病毒的VLPs具有包含环绕衣壳结构的病毒表面抗原的脂质包膜。 由于通常有数百个衣壳或糖蛋白副本形成每个VLP，所需的表位可以融合到VLPs上以高密度展示，这可能有助于诱导更强的免疫反应。例如，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）VLP是由180（T=3）或240（T=4）个HBcAg衣壳蛋白亚基形成的，并且每个VLP能够展示高达240个外源表位。 3.1.VLP作为疫苗开发平台 迄今为止，已建立了多种平台，以期获得高效且安全概况的疫苗。灭活疫苗是通过化学或热应力处理生产的。与减毒疫苗相比，灭活疫苗的安全性更高。然而，由于灭活处理，它们的免疫原性通常降低。另一方面，蛋白质亚单位疫苗相对安全，能够诱导免疫记忆反应。然而，几乎必须使用佐剂。虽然病毒载体疫苗将编码抗原的基因传递到目标细胞，但由于宿主免疫系统在之前接种期间发展，会迅速清除病毒载体，因此重复使用相同的病毒组分将导致效率降低。此外，对病毒载体疫苗（特别是复制型疫苗）的安全性存在争议。与此同时，mRNA疫苗和DNA疫苗将遗传物质传递到目标细胞，以产生重组病毒抗原，从而诱导特定的免疫反应。尽管mRNA疫苗安全，生产相对快速且成本低廉，但由于RNA不稳定，需要冷链系统。尽管DNA疫苗稳定，但通常效果较差。由于VLP坚固且具有自我佐剂特性，基于VLP的疫苗可能很容易成为针对冠状病毒最有效的疫苗之一。 VLP已被用作乙型肝炎病毒（Engerix®和Recombivax HB®）和人类乳头瘤病毒（Cervarix™和Gardasil®）的疫苗。此外，基于VLP的疫苗，如戊型肝炎病毒（HEV）Hecolin和HBV ABX203（HeberNasvac®）也已获得许可，用于人类预防和治疗戊型肝炎和慢性乙型肝炎。VLP类似于病原体，并包含保守的病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式可以被宿主免疫系统迅速识别。通过克隆病毒结构基因并利用原核或真核表达系统来生产VLP。VLP的产生是为了在其表面展示目标病原体的抗原决定簇。基于VLP的疫苗的目标是提高针对展示的抗原的免疫反应，这些抗原可以是肽或整个抗原。 VLP可能对结合的抗原诱导强烈的先天和适应性免疫反应。VLP也可以装载免疫调节剂，如先天免疫系统刺激物，以诱发更有效的免疫反应。因此，它们是理想的抗原载体，比基于整个病原体的疫苗（如活减毒病毒疫苗）更安全。 重组VLP疫苗的构建利用了具有自我组装能力的病毒结构蛋白的核苷酸序列知识，以展示病原体的抗原决定簇。已开发出基于原核细胞、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞的个体异源蛋白表达系统，这些系统允许在实验室和工业规模上生产携带目标抗原的VLP。已建立具有扩大潜力的高产量VLP生产，并可以支持在大流行环境中使用这些技术。 不同的表达系统各有优缺点。例如，细菌表达系统（如大肠杆菌）在最短时间内以高产量生产非包膜VLP特别有用。然而，它们不适合生产包膜VLP，容易误折叠，且无法进行翻译后修饰（PTM），这对于许多基于真核生物的抗原（如SARS-CoV-2的S蛋白）很重要。另一方面，哺乳动物细胞表达系统可以进行所有PTMs，缺点是成本高且耗时长。因此，已经探索了结合两种表达系统的策略，在其中SARS-CoV-2抗原在哺乳动物细胞中产生，然后与大肠杆菌生产的异源VLP结合。 然而，并非所有基于真核生物的免疫原性表位都需要PTMs。例如，在大肠杆菌上生产的SARS-CoV HRC1 B细胞表位和SARS-CoV-2受体结合基序（RBM）在用于免疫小鼠和兔子时仍能诱导病毒中和抗体。 正如在哺乳动物细胞、酵母、昆虫和植物表达系统中也可以用于生产包膜和非包膜VLP，并具有执行PTMs的能力。然而，这些表达系统通常与人类和哺乳动物细胞不同地糖基化蛋白质。例如，酵母倾向于进行高甘露糖糖基化，而昆虫细胞糖基化含有α1,3-连接的岩藻糖残基，同时缺乏末端唾液酸。无论如何，已进入临床试验的基于酵母、植物和昆虫细胞生产的VLP疫苗候选物表明，糖基化类型可能不会对SARS-CoV-2表位的免疫原性造成不利影响。 到目前为止，已有35个病毒家族的110种病毒蛋白能够组装成VLP。几种基于VLP的疫苗目前正在进行不同的生产和批准阶段。VLP疫苗的优点包括其高特异性、效率和良好的药代动力学特性。以前的研究表明，与其他携带抗原的颗粒混合物相比，VLP能在不到10分钟的时间内到达淋巴结。毫无疑问，基于VLP的疫苗为免疫预防策略的发展提供了新的可能性，包括无注射剂型。无注射疫苗可以通过鼻内或口服途径给药。这对于大规模动物养殖行业尤为重要，因为对大量动物进行注射是非常费力的。 3.2.VLP作为免疫原 病毒衣壳由重复的蛋白质结构组成，可以触发先天免疫，并由B细胞产生中和抗体。树突细胞（DCs）是抗原呈递细胞（APCs）的重要组成部分，它们连接先天和适应性免疫。DCs可以通过巨胞饮和吞噬作用摄取100-500 nm大小的颗粒，如VLPs。DCs通过相同的模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）和C型凝集素受体（CLRs），与VLPs相互作用。给药后，基于VLP的疫苗被APCs如DCs识别，并运输到次级淋巴组织，如脾脏。DCs对VLPs的识别和摄取促进了DCs的成熟（图1）。这些事件导致产生促炎因子，如TNF-α和IL-1β，以招募更多的APCs，并增加DCs中的溶酶体蛋白水解活性。随后，基于VLP的疫苗被加工成小肽，并作为MHC-肽复合物呈现在DCs表面。同时，B和T细胞通过DC表面存在的淋巴细胞共刺激分子，如CD40、CD80和CD86被激活。MHC II类肽和共刺激蛋白激活CD4+ T辅助细胞，促进B和T细胞的增殖和分化。 图 1 病毒样颗粒（VLPs）诱导的免疫反应。1：VLP与树突细胞（DC）上的模式识别受体（PRRs）发生作用，例如Toll样受体（TLR）。然后DC通过吞噬作用或微囊泡作用吞噬VLP。2：这导致DC成熟，随后分泌促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β），以招募更多的抗原呈递细胞（APCs），包括DC和巨噬细胞。3：被DC吞噬的VLP随后被酶消化成短肽，这些短肽与主要组织相容性复合体I类（MHC I）和II类（MHC II）结合，并被运输到DC表面。4：在MHC II上展示的短肽，与CD40和CD80/86一起，然后与辅助性T细胞（Th）上的T细胞受体（TCR）、CD40L和CD28相互作用。这促进了Th细胞增殖和分化为1型（Th1）和2型（Th2）Th细胞。5：同样，在DC上的MHC I展示的肽段，与CD40和CD80/86一起，与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）上的TCR、CD40L和CD28相互作用。在Th1的帮助下，原始CTL增殖并分化为效应CTL和记忆CTL，分别提供即时和持久的细胞免疫。7：另一方面，原始B细胞通过B细胞受体（BCR）与血液中携带或DC传递的完整VLP相互作用。在Th2的帮助下，B细胞分化为浆细胞，这些细胞积极分泌抗体，以及记忆B细胞，这些细胞提供针对VLP上存在的抗原的持久体液免疫。 基于VLP的疫苗是优秀的候选疫苗，负责刺激细胞和体液免疫。例如，两剂HBcAg-zDIII（寨卡病毒包膜蛋白III域）VLP疫苗可以触发体液和细胞免疫。另一项研究还揭示了猪细小病毒（PPV）基于VLP的疫苗能够激活MHC I和II途径，刺激体液和细胞免疫。此外，还有几份报告称，基于VLP的疫苗可以独立于T辅助细胞刺激抗体产生和细胞毒性T细胞激活。即使没有佐剂，也有报道称基于VLP的疫苗可以诱导体液和细胞免疫，尽管佐剂可以显著增加其免疫原性。 4. 针对冠状病毒的VLP疫苗开发 由于这些传染病的严重性，全世界的科学家一直在不懈地努力开发针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的疫苗。已报道了多种基于VLP的疫苗候选物（表1）。除了SARS-CoV-2外，大多数报道的研究都处于开发的初步阶段。 表1 针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的VLP疫苗候选物的初步研究 缩写词：E（包膜蛋白）；HA（血凝素）；hACE2（人类血管紧张素转换酶2）；IAV（流感A病毒）；M（膜蛋白）；M1（基质蛋白1）；N（核衣壳蛋白）；PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）；RBD（受体结合域）；RBM（受体结合基序）；S（刺突蛋白）；VLP（病毒样颗粒）。 4.1. 针对SARS-CoV的VLP疫苗 尽管自2003年7月以来没有报告过爆发，但已发表了有关SARS-CoV基于VLP的候选疫苗的数据。Pimentel等人开发了一种展示来自S蛋白C末端七肽重复序列（HRC1）的重组SARS-CoV B细胞表位的VLP。当将10μg的肽纳米颗粒在没有佐剂的情况下腹腔注射到小鼠体内时，观察到了积极的体液反应。广泛使用杆状病毒-昆虫细胞表达系统或杆状病毒表达载体系统（BEVS）来生产包含S蛋白的SARS-CoV VLP疫苗。含有基质M1佐剂的疫苗（1μg的SARS-CoV S）能够在BALB/c小鼠中诱导中和抗体反应。在另一项研究中，使用BEVS生产了包含SARS-CoV S蛋白和流感M1蛋白的重组SARS-CoV VLP疫苗。在没有佐剂的情况下，肌肉注射或鼻内注射0.8μg的S蛋白的SARS-CoV VLP疫苗能够保护小鼠免受SARS-CoV的致命挑战。观察到4μg的S蛋白剂量能够将肺部病毒滴度降低到不可检测的水平，保护小鼠免于体重减轻，并诱导高水平的抗SARS-CoV中和抗体。 此外，哺乳动物细胞也被选为生产VLP。Lokugamage等人开发了在哺乳动物细胞中传播的VLP作为SARS-CoV疫苗候选物。该研究中由哺乳动物细胞产生的嵌合VLP比使用BEVS生产的SARS-CoV VLP更具免疫原性。嵌合VLP是通过在293 T细胞中共表达SARS-CoV S、E、M和N蛋白以及小鼠冠状病毒（鼠肝炎病毒）产生的。当雌性BALB/c小鼠用1μg的嵌合VLP免疫时，抑制了肺部SARS-CoV的复制。另一项研究中，用BALB/c和C57BL/6小鼠免疫另一种嵌合SARS-CoV VLP（由S、E、M和N组成），以剂量依赖性方式诱导血清中和抗体，使用明矾佐剂进一步增强。VLP处理的SARS-CoV感染肺部的组织学中观察到显著的嗜酸性粒细胞，表明激活了先天和适应性免疫反应。 SARS-NC基因编码N蛋白（46 kDa），负责病毒复制和宿主细胞周期干扰。这种蛋白具有高度免疫原性，已成为设计有效疫苗的靶标。通过透射电子显微镜显示，在CHO细胞中表达的N蛋白自组装成VLP。用N蛋白免疫的小鼠展示了高水平的特异性SARS-CD8+ T细胞反应和抗体滴度，通过联合使用编码N蛋白的重组质粒、编码XIAP的重组质粒和montanide/CpG进一步增强。 4.2. 针对MERS-CoV的VLP疫苗 已开发并评估了多种MERS-CoV VLP疫苗，并在动物中进行了评估。BEVS被用来生产包含S蛋白的MERS-CoV VLP疫苗。与MatrixM™佐剂（基于皂甙的）配制的疫苗能够在BALB/c小鼠中诱导中和抗体反应。随后使用相同疫苗的研究表明，接种10μg的MERS-CoV S纳米颗粒的小鼠产生的抗MERS-CoV S抗体滴度显著高于较低剂量（1和3μg）。 同样，使用BEVS开发了一种包含修饰的MERS-CoV S蛋白（与H5N1的HA531-568融合）和禽流感基质1蛋白（H5N1）的嵌合VLP。在用1μg的嵌合VLP肌肉注射并用100μl的明矾和10μg的CpG佐剂的BALB/c小鼠中检测到显著的S特异性IgG和中和抗体。由S、E和M蛋白组成的MERS-CoV VLP疫苗在猕猴中刺激了IgG产生和病毒中和抗体，滴度高达1:40。同一研究小组评估了一种新的嵌合VLP疫苗，由MERS-CoV S蛋白的RBD和犬细小病毒VP2结构蛋白组成，其中嵌合VLP在小鼠中诱导了针对RBD的特异性体液和细胞免疫反应。 除了BEVS，Kim等人展示了一种使用铁蛋白作为分子支架自组装的新型细菌MERS-CoV抗原VLP。在大肠杆菌中表达了与RNA相互作用域（人类赖氨酸-tRNA合成酶）和细菌铁蛋白融合的MERS-CoV RBD。用该纳米颗粒免疫的小鼠的血清能够在竞争ELISA中抑制MERS RBD与hDPP4受体之间的相互作用。最近，Kato等人构建了包含在蚕幼虫和Bm5细胞系中通过表面活性剂处理和机械挤出生产的MERS-CoV S、E和M蛋白的VLP。与培养细胞相比，蚕幼虫对于重组蛋白生产是有用的，因为它们可以使用简单的人工饲料饲养，具有大规模生产重组蛋白的能力，包括VLPs。 4.3. 针对SARS-CoV-2的VLP疫苗 4.3.1. 初步阶段的SARS-CoV-2 VLP疫苗候选物 当前的COVID-19大流行挑战了国际科学界，在尽可能短的时间内找到针对SARS-CoV-2感染的有效疫苗。Hennrich等人开发了一种针对SARS-CoV-2的两合一安全复制子和VLP mini spike疫苗。在研究中，嵌合mini spike [由来自狂犬病病毒（RABV）糖蛋白的跨膜干序列链接的RBD组成]被纳入到缺乏其天然糖蛋白的囊泡性口腔炎病毒（VSV）构建中（VSVΔG），即VSVΔG-mini spike-eGFP。当与VSV G一起拯救时，mini spike在宿主细胞表面膜上以及分泌的非传染性VLP的包膜上显示了三聚体蛋白的SARS-CoV-2 RBD。含mini spike的VSVΔG不传播，并且能够诱导强烈的免疫反应。单一剂量（1 × 10^6感染颗粒）的VSV复制子疫苗（VSVΔG-mini spike-eGFP），当与VSV G补充时，在转基因K18-hACE2小鼠中刺激了高滴度的SARS-CoV-2中和抗体，这些抗体保护了小鼠免受SARS-CoV-2的挑战。 Tan等人基于在合成VLP平台上展示RBD，使用SpyTag/SpyCatcher技术开发了基于RBD的COVID-19纳米颗粒疫苗候选物，该平台为SpyCatcher003-mi3。在一次加强方案中，低剂量的RBD-SpyVLP能够在小鼠和猪中诱导高水平的针对SARS-CoV-2的中和抗体。这种RBD-SpyVLP还能与恢复期患者的单克隆抗体反应，这些抗体识别了RBD-Spy VLPs上的重要表位。此外，它具有热稳定性，并且可以以冻干形式全球分发。Liu等人基于在大肠杆菌中表达的噬菌体AP205 VLP展示SARS-CoV-2的尖峰RBM构建了疫苗候选物。RBM被融合到由二聚体衣壳蛋白组成的AP205 VLP的C末端。该疫苗能够诱导产生高水平的IgG抗体，这些抗体能够识别真核细胞表达的RBD和S蛋白的SARS-CoV-2。此外，这些抗体能够中和SARS-CoV-2，并且可以大规模生产用于免疫。 Mohsen等人通过将受体结合基序（RBM）遗传融合到黄瓜花叶病毒（CuMVTT）上，构建了COVID-19疫苗候选物。这种马赛克疫苗，即CuMVTT-RBM，在大肠杆菌中产生。每个CuMVTT-RBM VLP大约展示70-90个RBM抗原，对兔子和小鼠具有高度免疫原性，诱导产生的中和抗体能够与其他值得关注的变异体（包括野生型、K417N、E484K、N501Y、K417N/E484K/N501Y和L452R/E484Q）的突变RBD发生交叉反应，其亲和力超过了恢复期人类血清中的抗体。此外，Mohsen等人展示了一个概念验证，其中2升的发酵体积产出了0.5克CuMVTT-RBM，相当于在1000升的发酵中可以产出2500万剂。而且，基于CuMVTT-RBM VLP的疫苗在4摄氏度下储存至少14个月是稳定的。Mohsen等人的研究实际上基于Zha等人的早期研究，其中在真核细胞中生产的RBD而不是RBM，使用琥珀酰亚胺6-（β-马来酰基丙酰胺）己酸酯（SMPH）化学交联到大肠杆菌生产的CuMVTT。在CuMVTT VLPs上高度重复展示的RBD在小鼠中诱导了高水平的RBD特异性中和抗体，这些抗体阻止了SARS-CoV-2与hACE2受体的结合。 Newcastle病病毒样颗粒（NDVLPs）展示了前融合稳定的SARS-CoV-2 S ectodomain（S2P），即S2P-NDVLP，作为疫苗候选物进行了研究。对小鼠进行S2P-NDVLP的主要注射显示出显著更高的中和滴度（几何平均ID50为386），与用可溶性S2P蛋白免疫的小鼠相比（几何平均ID50为17）。在使用2到250微克剂量的S2P-NDVLP进行加强免疫两周后，中和滴度增加到2125-4552。 虽然其他研究使用了S RBD蛋白，Chu等人构建了一种在昆虫细胞中生产的基于流感基质1蛋白的VLP，以展示SARS-CoV-2的完整S、S1或S2。表达完整S和S1的VLP成功地诱导了能够部分抑制RBD与hACE2结合的病毒中和抗体，在替代病毒中和测试中表现出活性。 除了在异源VLPs上展示SARS-CoV-2 S蛋白外，很少有研究报告了生产同时表达病毒S、E和M蛋白的SARS-CoV-2 VLPs。Swann等人在哺乳动物HEK-293 T细胞中共表达S、M和E病毒蛋白，生产了模仿实际病毒的SARS-CoV-2 VLPs。VLPs在环境条件下干燥后保持结构完整性（通过原子力显微镜确认），这可能有利于作为疫苗应用时的运输和储存。另一项由Xu等人报告的研究表明，M和E蛋白的表达对SARS-CoV-2 VLPs的有效形成和释放至关重要。Xu等人在HEK-293 T和Vero E6细胞中表达了S、M、E和N蛋白，其中在Vero E6细胞中产生的VLPs的形态被认为比在HEK-293 T细胞中产生的更稳定和统一，TEM分析显示了大小均匀的VLPs，具有独特的冠状结构，表明SARS-CoV-2包膜上的最佳尖峰三聚体形成。还报告了一个工程化的酿酒酵母平台（D-Crypt™），用于共表达三种蛋白（S、E和M），随后自组装成SARS-CoV-2 VLPs。然而，这些SARS-CoV-2 VLPs的免疫原性尚未报告。 4.3.2. 临床阶段的SARS-CoV-2 VLP疫苗候选物 截至2022年4月，共有153种SARS-CoV-2疫苗候选物正在进行临床开发，196种候选物处于临床前开发阶段。目前正在进行临床评估的疫苗中有六种是基于VLP的（表2）。与SARS-CoV和MERS相比，由于SARS-CoV-2的爆发，SARS-CoV-2基于VLP的疫苗的开发速度更快。疫苗研究和商业开发的进程平均需要10到15年的时间，并且有22%的机会完成临床阶段（临床试验I、II和III期），这需要至少80亿美元的投资。最近的SARS-CoV-2爆发将时间线缩短到12-18个月，这得益于新的公共/私人资金的建立和全球协调计划，以对抗SARS-CoV-2大流行。这些计划包括世界卫生组织的团结疫苗试验、Operation Warp Speed (OWS) 和 Accelerating COVID-19 Therapeutic Interventions and Vaccines (ACTIV) 合作伙伴关系，以及国立卫生研究院 (NIH) 的 Rapid Acceleration of Diagnostics (RADx)。处于人体临床试验中的候选疫苗在I期中接受了安全性、副作用、耐受性、免疫原性和有效剂量的评估。在II期中，将进一步在更多的参与者中研究免疫原性、安全性和有效性。之后，在III期临床试验中，将在数千名个体中评估疫苗的有效性和副作用。迄今为止，已有9种COVID-19疫苗通过了III期试验，并已获得世界卫生组织的全球紧急使用批准。最后阶段，IV期试验将在获得国家监管机构批准后进行。药物警戒将涉及在更广泛的人群中长期进一步监测疫苗。 COVIVAXX是一种结合的SpyCatcher::VLP疫苗，该疫苗利用SpyBiotech的专利SpyCatcher/SpyTag超级胶蛋白技术，在乙型肝炎表面抗原（HBsAg）VLPs表面呈现SARS-CoV-2的RBD。该疫苗针对SARS-CoV-2 S蛋白的RBD，该蛋白与SpyTag肽融合。SpyCatcher/SpyTag技术已广泛用于疫苗开发，允许通过特定方向/表位呈现的不可逆共价键在VLPs上高密度展示抗原。由于HBsAg VLP是一种已获得许可的疫苗，在人类中已证明具有高度的免疫原性和安全性，它可以作为一个非常吸引人的通用即插即用载体，用于任何感兴趣的抗原，如疟疾。疫苗中的HBsAg-SpyCatcher组分在Hansenula polymorpha中生产，RBD-SpyTag组分在Pichia pastoris中生产。该疫苗可以大规模生产。在动物中，报告了100%的血清转换，并检测到针对S蛋白RBD的高抗体滴度。目前，澳大利亚正在进行I/II期试验（ACTRN12620000817943; ACTRN12620001308987）。非临床研究表明，对HBsAg的预先存在的免疫不会影响VLPs的免疫原性。COVIVAXX疫苗只需要正常的冷藏温度2到8摄氏度。I期临床研究是随机的、安慰剂对照的，涉及18-45岁的健康成年人。评估了接种5和25微克疫苗/安慰剂后的安全性和免疫原性结果。这之后是II期研究，涉及另一组18-79岁的健康参与者，比较了接种5或25微克疫苗的安全性和免疫原性结果，疫苗在28天间隔内接种，与安慰剂进行了比较。临床研究共招募了280名参与者。预计将在印度和欧洲进行III期试验。 表2 针对SARS-CoV-2的临床试验中的VLP疫苗 来源：改编自WHO. 缩写词：E（包膜蛋白）；IM（肌肉注射）；M（膜蛋白）；N（核衣壳蛋白）；RBD（受体结合域）；S（刺突蛋白）；SC（皮下注射）；VLP（病毒样颗粒）。 另一种潜在的SARS-CoV-2基于VLP的疫苗是Medicago的CoVLP，在澳大利亚杂草Nicotiana benthamiana中生产。植物的疫苗短暂生产是一种快速、可扩展且有效的技术，用于应对由流感病毒或SARS-CoV-2引起的大流行。CoVLP疫苗包含自组装的VLPs，由稳定前融合S蛋白的三聚体组成，在VLP表面形成，与ASO3和CpG佐剂配方。从II期临床试验中获得了CoVLP SARS-CoV-2的安全性和免疫原性数据。在II期临床研究中，疫苗作为两次肌肉注射，相隔21天，以三种不同剂量（3.75、7.5或15微克），单独或与AS03或CpG1018佐剂一起给予。在接种第二剂佐剂CoVLP SARS-CoV-2 21天后，检测到细胞（IFNγ和IL-4）和体液（抗S IgG和中和抗体）反应。研究还揭示了与从COVID-19感染中恢复的受试者血清相比，AS03佐剂疫苗（3.75微克）诱导了10倍更高的中和抗体滴度。没有报告严重不良事件，并且反应原性通常轻度至中度，持续时间短暂。CoVLP SARS-CoV-2目前在III期临床试验（NCT04636697）中，该试验在北美、拉丁美洲和欧洲招募了30,918名参与者。 另一个基于植物的疫苗候选物KBP-201由英美烟草公司（BAT）生产，目前正在进行I/II期临床试验（NCT04473690）。尽管KBP-201由RBD和改良烟草花叶病毒（TMV）的化学结合形成的嵌合VLP（cVLP）组成，但该疫苗候选物被归类为蛋白质亚单位而不是基于VLP的疫苗。 VBI Vaccines Inc.已加入国家研究委员会的SARS-CoV-2疫苗开发计划。使用基于小鼠白血病病毒（MLV）的包膜病毒样颗粒（eVLPs）生产SARS-CoV-2疫苗候选物，VBI-2900由两种疫苗组成：VBI-2901和VBI-2902。VBI-2901是一种三价泛冠状病毒疫苗，表达SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白，而VBI-2902是一种单价疫苗，表达SARS-CoV-2 S蛋白的前融合稳定形式。临床前数据显示了eVLPs在小鼠中高抗原表达效力。包含与VSV-G的跨膜细胞质末端域融合的SARS-CoV-2 S的外细胞域的修饰S蛋白，使MLV-Gag eVLPs上的S表达产量和密度高。与Alum磷酸盐佐剂单剂量eVLPs（VBI-2902a）相比，SARS-CoV-2患者的中和抗体反应水平高。数据还揭示了VBI-2902a在仓鼠挑战模型中安全且高效。VBI-2902a正在进行持续的临床评估，作为针对SARS-CoV-2的单剂量疫苗，与VBI-2905a一起。VBI-2902a的I/II期研究（NCT04773665）于2021年3月启动，是随机的、观察者盲的、安慰剂对照的。该研究评估了VBI-2902a的安全性、耐受性和免疫原性，剂量为1和2剂量（28天间隔）方案，每剂量5微克S蛋白，与安慰剂相比。最初的I期阶段已招募61名健康、未接种疫苗的成年人，年龄在18-54岁之间。所获得的数据显示5微克VBI-2902a耐受性良好，并在所有受试者中诱导了强大的免疫反应，水平高于恢复期患者血清中观察到的水平。此外，没有与疫苗相关的安全问题。 ABNCoV2是另一种经过临床测试的SARS-CoV-2基于VLP的疫苗，由Bavarian Nordic开发。ABNCoV2是通过结合独特的果蝇S2昆虫细胞蛋白生产（ExpreS2）和AdaptVac生产的专有衣壳VLP（cVLP）在大肠杆菌中生产。在果蝇细胞Drosophila melanogaster中生产的RBD抗原在大肠杆菌中生产的Acinetobacter phage AP205衣壳样颗粒上展示，通过分裂蛋白Tag/Catcher确保RBD抗原的单向和高密度展示。临床前数据显示，ABNCoV2在小鼠模型中高度免疫原性，其中ABNCoV2疫苗的单次注射在小鼠中诱发的病毒中和抗体滴度与SARS-CoV-2恢复期患者中发现的相似。当进一步增强加强剂量时，病毒中和滴度可以上升到1:10,000以上。I期临床试验（NCT04839146）评估了ABNCoV2两剂量（剂量范围从6到70微克）的安全性和耐受性，有和没有MF59佐剂在健康成年志愿者中单中心、开放标签试验中。来自人体试验的初步数据已确认其诱导强烈和广谱抗体水平的能力，优于目前批准的疫苗，同时还提供了有利的安全性概况。值得强调的是，数据证实了ABNCoV2疫苗触发针对SARS-CoV2的几个变体的中和抗体的产生，包括武汉、阿尔法、贝塔和德尔塔变体。最近，II期临床试验（NCT05077267）已开始招募参与者，以评估ABNCoV2疫苗（剂量为100微克）在血清阴性和血清阳性参与者中的安全性、耐受性和免疫原性。 虽然大多数临床试验中的基于VLP的疫苗基于SARS-CoV-2的RBD或S蛋白，但土耳其科学技术研究委员会开发了一种包含病毒的M、N、E和HexaPro S抗原的VLP疫苗，用K-3CpG ODN佐剂。疫苗的给药途径与其他临床测试的VLP疫苗不同，这种SARS-CoV-2疫苗是皮下注射的。SARS-CoV-2疫苗的I期试验（NCT04818281）设计为双盲、随机、安慰剂对照，并涉及两种不同剂量（10和40微克）。另一方面，II期试验（NCT04962893）招募了330名18至59岁的成年人，他们健康或患有医学上稳定的慢性疾病。受试者以1:1:1的比例分为两组，接受两剂VLP疫苗用于武汉（40微克）或VLP疫苗用于武汉+阿尔法变体（40微克）或VLP疫苗用于阿尔法（英国）变体（40微克），免疫间隔21天。 最近加入到临床试验中的疫苗候选物是烟台帕特柔斯生物技术公司开发的LYB001，它包括在氢氧化铝配方中展示的RBD的VLP载体。5 LYB001被设计为三剂疫苗，将进行随机、双盲、安慰剂对照的I期（NCT05125926）和II/III期（NCT05137444）临床试验。I期临床试验预计将涉及100名18-59岁的成年参与者，以评估LYB001在高剂量（50微克）下的安全性、反应原性和免疫原性概况，前提是在低剂量（25微克）下有良好的7天安全性和反应原性概况。II/III期试验预计将招募1900名成年参与者进行免疫原性和安全性测试，其中III期试验将开放标签进行扩展的安全性评估，这将在所有参与者接种第三剂疫苗后的360天安全性观察完成后进行。 4.3.3. 临床前阶段的SARS-CoV-2 VLP疫苗候选物 目前有18种基于VLP的COVID-19疫苗候选物处于临床前阶段（表3）。ContiVir，来自马克斯普朗克研究所的分拆公司，已经生产了一种冠状病毒VLP疫苗候选物。冠状病毒VLP是使用ContiVir的创新技术生产的，这些技术利用完全连续的管状生物反应器高效生产VLP，并使用基于尺寸的捕获色谱步骤，称为体积排除色谱（SXC），用于纯化冠状病毒VLP。IrsiCaixa艾滋病研究所、巴塞罗那超级计算中心（BSC）和动物健康研究中心（IRTA-CReSA）启动了一个项目，专注于开发SARS-CoV-2疫苗，将SARS-CoV-2 S蛋白展示在HIV的VLP上。另一个由Navarrabiomed进行的临床前项目使用了人类和杆状病毒表达系统，通过SARS-CoV-2 S、M和E蛋白的组成性表达分泌VLP。此外，他们还使用非复制性慢病毒假型S蛋白表达其余的结构蛋白。BIRB796也被纳入疫苗配方作为佐剂，以增强T细胞反应。同样，坦佩雷大学使用了展示重组S蛋白的杆状病毒载体。Saiba GmbH开发了一种潜在的疫苗，使用了专利的CuMVTT技术展示RBD，其中高度重复的RBD附着在CuMVTT上，显著提高了能够中和SARS-CoV-2的抗体。尽管是最早的SARS-CoV-2基于VLP的疫苗候选物之一，但由于缺乏资金，该疫苗候选物未能进入临床试验，这导致他们转而开发在安全性、效率、稳定性、成本效益和便携性方面更好的“第二代”疫苗。 表3 针对SARS-CoV-2的临床前VLP疫苗 来源：改编自WHO. 缩写词：CMV（巨细胞病毒）；E（包膜蛋白）；GBM（胶质母细胞瘤）；HIV（人类免疫缺陷病毒）；M（膜蛋白）；N（核衣壳蛋白）；RBD（受体结合域）；RCB（参考细胞库）；S（刺突蛋白）；VLP（病毒样颗粒）。 同时，伯尔尼生物技术公司和瑞士生物技术中心正在合作开发一种基于RBD VLP的COVID-19疫苗，该疫苗从人类细胞系平台表达，已在体内模型中显示出令人印象深刻的效力。亚利桑那州立大学的研究人员还开发了至少两种VLP疫苗平台：M20-234 L，其中使用粘液瘤病毒表达所有四个主要结构蛋白的部分：S、M、E和N；以及包含这些蛋白的质粒驱动的VLP生产。Imophoron与布里斯托大学合作生产的另一种潜在的基于VLP的疫苗候选物基于ADDomer™多表位展示系统，使用能够形成十二面体VLP的腺病毒的五边形基蛋白展示SARS-CoV-2的S蛋白， 具有热稳定性特性，不需要冷链储存。 几乎所有的疫苗都使用冠状病毒株特异性的S表面抗原。OSIVAX与3P生物制药公司合作，使用OSIVAX的oligoDOM®技术开发基于VLP的疫苗（OVX313），基于一种新型专有的自组装蛋白序列，带有带正电荷的尾部，展示SARS-CoV-2的高度保守的N蛋白，这可以触发强大的B细胞和T细胞免疫反应。OSIVAX旨在开发一种广谱冠状病毒疫苗，OVX-CoV，能够针对SARS-CoV和SARS-CoV-2。同时，另一种针对DCs的基于SARS-CoV-2 S蛋白的VLP疫苗正在曼尼托巴大学开发，其中Delta变体的假型VLP（PVLP）在人类巨噬细胞和DCs中诱导了更高水平的TNF-α、IL-1β和IL-6。ARTES Biotechnology已经开始基于其技术平台开发SARS-CoV-2疫苗候选物：SplitCore和METAVAX®。SplitCore使用分裂的HBcAg VLPs（cVLPs）作为抗原展示载体，展示SARS-CoV-2的S和N蛋白，而METAVAX使用基于H. polymorpha生产的鸭肝炎B小表面抗原的eVLPs在其N和C末端展示S和N蛋白。虽然VBI-2902a和VBI-2905a正在进行I/II期临床试验，但另一种eVLP疫苗候选物，VBI Vaccines Inc.的VBI-2901，表达SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的S蛋白，仍处于临床前阶段。来自设拉子大学的Ghorbani等人使用计算方法鉴定表位，以构建针对SARS-CoV-2的理想疫苗候选物在植物衍生的VLPs中。然而，实际的生物学研究尚未报告或公开。除了上述提到的，根据世界卫生组织发布的COVID-19疫苗追踪器和格局，还有三个基于VLP的疫苗候选物目前处于临床前阶段，分别来自Mahidol University、Doherty Institute、圣保罗大学和ExcepGen。但是，这些项目的细节尚未向公众发布。 5.结论 尽管VLP作为疫苗平台具有优势，但与蛋白质亚单位、病毒载体、DNA、RNA和灭活病毒疫苗相比，它没有受到太多关注。基于VLP的疫苗已被证明对HBV（Engerix®、Recombivax HB®和HeberNasvac®）、HEV（Hecolin）和人类乳头瘤病毒（Cervarix™和Gardasil®）有效。在六种处于临床阶段的基于VLP的疫苗中，只有CoVLP Medicago已进入III期试验，并预计将于2022年4月完成。由于VLP具有高度免疫原性、自我佐剂性和多功能性，如果加大开发力度，基于VLP的疫苗可能很容易成为对抗冠状病毒最有效的疫苗之一。 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：自复制RNA疫苗(SAM)已有3款产品获批上市或紧急使用，目前还有许多正处于临床试验阶段的候选疫苗。Harrisvaccines （2015年被Merck动保公司收购）开发的 iPED+ 猪流行性腹泻疫苗是美国首款获批上市的SAM疫苗，由一种繁殖缺陷型病毒样 RNA 复制子颗粒组成，能够表达猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 的 Spike 蛋白，已经有两百万剂疫苗用于猪仔免疫接种。GEMCOVAC-19（Gennova Biopharmaceuticals）是印度获批的首款用于紧急使用的新冠SAM疫苗。2023年11月27日，日本厚生劳动省批准了CSL与Arcturus therapeutics联合开发的ARCT-154，一种用于18岁及以上成人初次接种和加强接种的自扩增mRNA (saRNA)新冠疫苗，成为全球首款获批上市的新冠SAM疫苗。与早期包封自复制RNA的病毒样颗粒载体不同，新冠SAM疫苗采用是脂质纳米颗粒递送载体。 我们知道，SAM疫苗是利用源自甲病毒非结构蛋白（nsPs）聚合成的RNA聚合酶来扩增编码抗原的mRNA。nsPs可以源自多种甲病毒，但是，一般SAM疫苗的nsPs源自委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）减活株TC-83。甲病毒RNA已被证明会发生重组。例如，西方马脑炎病毒可能起源于东部马脑炎样病毒和辛德比斯样病毒之间发生的一个古老重组事件。最近，有报道巴西和海地的马亚罗病毒(MAYV)重组体，还发现了基孔肯雅病毒(CHKV)分支之间的重组。由此来看，我们会非常担忧源自甲病毒的SAM疫苗是否会跟野生型病毒之间发生重组事件，从而产生具有复制能力的嵌合病毒？ 甲病毒的重组能力表明SAM疫苗存在理论上的安全风险。流行的野生型甲病毒可能会感染SAM疫苗接种者，从而可能在接种者体内产生一种包含野生型甲病毒基因和SAM疫苗基因的新型嵌合甲病毒。这种新型嵌合甲病毒存非常大的健康威胁和环境隐患，因为甲病毒感染会引起从脑炎到关节炎的非常严重的疾病症状。近日，瓦赫宁根大学病毒学实验室和研究中心Gorben P. Pijlman团队在Molecular Therapy [影响因子12.1] 发表文章：Safety concern of recombination between self-amplifying mRNA vaccines and viruses is mitigated in vivo，对基于TC-83毒株的SAM疫苗与野生型甲病毒、冠状病毒之间的重组事件展开评估，结果显示SAM疫苗接种者体内出现嵌合重组病毒的概率极低，不必过分担心。 01  干扰重复感染可减轻病毒/SAM共复制 SAM疫苗和野生型甲病毒之间的重组需要两种来源的RNA在同一细胞进行复制。干扰重复感染（Superinfection exclusion）是一种已被病毒感染的细胞，无法被相同或者类似病毒感染的现象。与野生型甲病毒（TC-83、BFV、CHIKV、BFV）单独感染Vero 细胞相比，当SAM疫苗转导和野生型甲病毒（TC-83、BFV、CHIKV、BFV）感染同时发生，野生型病毒在Vero 细胞中的滴度出现明显降低。SAM疫苗转导可减弱野生型甲病毒的重复感染，但是无法彻底阻断重复感染。 尽管存在干扰重复感染现象，但是在大约7%细胞中可观察到SAM和野生型病毒共复制。在共感染\转导细胞上清液中，可检测到野生型病毒结构蛋白包封的SAM。考虑到TC83-RNA被TC-83结构蛋白包封，TC-83病毒感染会提供最高的SAM包封效率。其他病毒感染（BFV、CHIKV、BFV）会导致SAM出现交叉包封，因此，其他病毒感染细胞时，SAM包封效率会稍微降低。如果先进行野生型病毒感染，再发生SAM疫苗转导，那么细胞将会发生最高水平的共复制和SAM包封效率。干扰重复感染的现象会极大地阻碍SAM和野生型病毒的共复制，然而，在体外Vero细胞感染中，使用高感染复数MOI和适当的时间点，在某种程度上可以克服干扰重复感染现象。 02  SAM疫苗与GETV病毒体外发生重组产生嵌合病毒 SAM-mCherry VRP 转导与野生型甲病毒感染之间间隔1h，将共感染/转导的Vero细胞上清与Hela或者△G3BP Hela细胞孵育，以此评估共感染/转导引发的重组嵌合甲病毒。所有野生型甲病毒均可在Hela细胞中复制，但是，在△G3BP Hela细胞中，由于缺乏病毒复制依赖的G3BP，多种类型的甲病毒无法完成复制，只有TC-83、BEBV、SFV可完成独立于G3BP的复制（nsP3-高变结构域提供独立于G3BP的复制）。 源自Vero细胞的共野生型甲病毒感染（依赖G3BP复制）/SAM转导的上清液与Hela或者△G3BP Hela细胞孵育，传代三次。由于基于TC-83的SAM具有nsP3的高变结构域，因此，当重组嵌合病毒出现时，△G3BP Hela细胞才会出现病毒复制引发的细胞病变CPE效应。只有源自Vero细胞的共GETV（盖他病毒）感染/SAM-nLuc上清与△G3BP Hela细胞孵育（96孔板）观察到CPE效应。 有意思的是，共GETV感染和脂质体介导的SAM-mCherry并未在△G3BP Hela细胞中触发CPE效应。最后，通过RNA测序分析发现重组嵌合病毒基因组包含的重组位点位于SAM上靶标基因和GETV nspP4之间，还包括SAM亚基因组启动子和GETV亚基因组启动子，源自SAM的5'UTR和源自GETV的3'UTR。此外，在哺乳动物和蚊子细胞中评估SAM-mCherry/GETV嵌合病毒的复制适应性。在所有的细胞系中，嵌合病毒复制滴度要明显低于减毒TC-83毒株。这可能是由于嵌合病毒基因组序列中存在异源UTR或者亚基因组启动子，抑制了病毒复制能力。在Chao Ball 库蚊种蚊子细胞中，嵌合病毒无法进行复制。 03  体内未检测到重组嵌合病毒 研究人员在三种小鼠模型中，检测SAM疫苗和野生型甲病毒之间是否会在体内发生重组。SAM-mCherry VRP和GETV共同注射进入野生型C57BL/6J（甲病毒关节炎标准模型伴随短暂的病毒血症）、重组激活基因1缺失RagI-/-小鼠（由于缺乏功能性B细胞和T细胞，表现出持久的病毒血症）、I型干扰素受体缺陷Ifnar-/-小鼠（高水平病毒血症，致死模型）。GETV的感染，并未对SAM造成显著影响。在小鼠足部和腹股淋巴沟中同时检测到SAM和GETV RNA，Ifnar-/-小鼠中表现出更高水平的SAM和GETV RNA。 将在特定时间点收集到的血清样本经过传代培养，然后同Hela或者△G3BP Hela细胞孵育。由于血清中存在GETV，在Hela细胞中可引发CPE效应。然而，不管源自任何类型的小鼠或者任何时间的血清样本，均未在△G3BP Hela细胞中引发CPE效应。上述结构充分说明血清样本中不存在类似体外实验中产生的嵌合病毒。 04  SAM疫苗与冠状病毒之间未形成重组嵌合病毒 冠状病毒为增强适应性，本身会发生重组，形成嵌合病毒。这样就带一个问题：冠状病毒是否会同编码冠状病毒抗原的SAM疫苗之间发生重组？ 研究人员评估了猪流行腹泻病毒（PEDV）与SAM编码的PEDV Spike蛋白之间的重组可能性。由于Spike蛋白S2 结构域890位置发生R to G 碱基置换，PEDB DR13 Spike可介导发生独立于胰蛋白酶的病毒感染，相比之下，PEDV CV777仅在胰蛋白酶存在情况下才能感染细胞。SAM和PEDV CV777共复制并不会导致干扰重复感染现象，PEDV CV777病毒扩增滴度也不会受到SAM影响。在胰蛋白酶存在或者不存在情况下分别将SAM和PEDV CV777共复制细胞上清与Vero细胞孵育。由于PEDV CV777，在胰蛋白酶存在情况下，才会观察到CPE效应。当不存在胰蛋白酶的情况，并未观察到CPE效应。这就说明PEDV CV777与编码DR13 Spike或者S2的之间并未重组产生独立于胰蛋白酶感染细胞的冠状病毒嵌合体。 05  总结 这项研究首次证实基于甲病毒的SAM疫苗与甲病毒之间在适宜的体外条件下可发生罕见的重组事件，从而产生具有复制能力的甲病毒嵌合体。测序表明在SAM 靶标基因和GETV nsP4基因之间存在重组位点。嵌合甲病毒基因序列包含SAM疫苗和GETV的亚基因组启动子。在相同情况下，并未在其他种类的甲病毒与SAM疫苗之间发生重组事件。有意思的是，研究人员并未在三种类型的小鼠模型中检测到具有复制能力的嵌合甲病毒。最后，编码冠状病毒的SAM疫苗与冠状病毒之间不会发生重组。 尽管SAM疫苗与野生型甲病毒之间可能发生的重组事件是一个潜在的安全隐患，但是，存在一系列的壁垒使得此重组事件发生的概率极低： 第一，干扰重复感染会极大地降低SAM和甲病毒在同一个细胞中发生复制的概率。 第二，在哺乳动物细胞中，SAM疫苗会触发CPE效应，因此，在接种疫苗后，发生转导的细胞数量会稳定地下降。在接种疫苗后第60天，机体内仍可检测到SAM。组织中的甲病毒RNA随着时间也会发生稳定下降，一直持续到第100天，仍可检测到。这样的话，甲病毒要想和SAM疫苗发生重组必须在一个极其狭窄的时间窗口才可实现。 第三，在体外可以通过高感染复数MOI来实现共感染/转导，克服干扰重复感染，然而，很难在体内实现类似情况。 第四，甲病毒感染通常会快速触发机体产生中和性抗体IgM/IgG。因此，即便机体内出现嵌合甲病毒，也是被相同的抗体快速中和掉。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。