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IDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛报名即将截止！（报名即将截止，扫码报名）摘要p53蛋白是人体内十分重要的肿瘤抑制因子，通过调节细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡等作用发挥肿瘤抑制功能。突变后的p53蛋白不仅具有显性负性效应（dominant negative effect，DN）抑制野生型p53蛋白功能，而且还通过功能获得性效应（gain of function，GOF）调节细胞代谢、侵袭、迁移等方式促进肿瘤的发生。p53蛋白在超过50%的肿瘤组织中发生突变，是肿瘤细胞区别于正常细胞的一个特异性药物靶点。因此，针对突变p53蛋白开发新型抗癌药物一直是研究的热点。长期以来，由于突变p53蛋白表面较为光滑，缺乏药物结合口袋，使其被认为是一个不可成药的靶点。随着高通量筛选技术的发展以及对突变p53蛋白结构的深入了解，许多靶向突变p53蛋白的小分子化合物被报道并在体外展现出较好的抗肿瘤活性，多款基于突变p53蛋白研发的化合物已经进入临床试验阶段。本文就靶向p53蛋白治疗肿瘤的直接和间接策略进行综述，重点针对突变p53蛋白重激活剂与降解突变p53蛋白的小分子化合物作用机制进行梳理，以期为后续开发靶向突变p53蛋白药物的创新提供帮助。正文p53蛋白是由TP53基因编码的53 ku蛋白，与p63蛋白和p73蛋白同属于p53样转录因子家族，其活性对于预防肿瘤的发生和发展至关重要。自1979年p53蛋白首次以癌蛋白抗原被报道以来，经过40多年的研究，人们不仅重新发现了p53蛋白的抑癌功能，而且认识到TP53基因是迄今为止发现与人类肿瘤相关度最高的基因。p53蛋白在生物体内可以暂停细胞周期进程，启动分子应答机制对损伤的DNA进行修复，并参与细胞分化、细胞凋亡等多种途径。同时，野生型p53蛋白调控着生物三大物质的代谢，通过限制细胞核酸物质的合成与对葡萄糖的摄取等作用抑制细胞生长。总之，p53蛋白可以看作是细胞内一个复杂而庞大的信号转导与调控网络的中心枢纽，在使细胞能够各司其职发挥正常功能方面起着重要的作用。在无应激的哺乳动物细胞中，p53蛋白通过不断的泛素化和26S蛋白酶体系的降解维持在较低水平，在应激状态下，p53蛋白可经过一系列如磷酸化、乙酰化、甲基化等蛋白质加工过程后被激活。正因为p53蛋白有着难以取代的重要作用，因此它一旦发生突变对细胞正常功能的影响是巨大的。突变后的p53蛋白不仅会丧失原本抑癌功能，同时还会进一步促进肿瘤的发生发展。研究表明，约50%的人类癌症中发现了突变p53蛋白，其主要突变类型为错义突变。科学家们尝试了多种靶向突变p53蛋白治疗癌症的策略，目前以恢复突变p53蛋白野生型构象及MDM2与p53蛋白相互作用抑制剂为代表的药物研究取得了较大突破。01p53蛋白的结构与功能1.1　p53蛋白的结构p53蛋白在人体内以四聚体的形式发挥作用，单体间通过反向α螺旋和反向β折叠相互作用形成二聚体，二聚体借助平行的螺旋-螺旋接触面形成四聚体，其结构类似一个十字架。每个单体由393个氨基酸残基组成，从N端到C端依次可分为反式激活结构域（TAD）（1~61）、富脯氨酸结构域（PXXP）（62~94）、DNA结合域（DBD）（95~292）、低聚结构域（OD）（326~356）、羧基端结构域（CRD）（357~393）（图1）。TAD区包含TAD1（1~40）和TAD2（41~61），介导p53蛋白的转录活性。TAD1和TAD2不仅可以共同调节一些常见基因的转录，也可以相互独立介导不同基因的反式激活。此外，p53蛋白N端还包含泛素连接酶MDM2的结合位点，MDM2可以与p53蛋白相结合并对其进行泛素化标记，进而使p53蛋白被蛋白酶体降解。富含脯氨酸的结构域（62~94）以PXXP序列重复多次（P，脯氨酸；X可以是任何氨基酸），该区域与p53蛋白介导的细胞凋亡和生长抑制有关。DBD可以与DNA进行序列特异性结合（95~292），它包含1个中央样免疫球蛋白β夹层支架、环状片螺旋结构和2个大环状结构，该区域在整个进化过程中高度保守，大约80%的TP53基因突变都发生在该区域。DBD后面是连接区域（293~325）以及OD（326~356），其中OD是p53蛋白四聚体化从而发挥功能所必需的，此外OD还包含一个核输出信号序列。CRD（357~393）是高度非结构化的，涉及多个不同的作用，如DNA结合、赋予蛋白质稳定性、辅助因子招募等。图1  p53蛋白结构示意图Fig. 1  Schematic diagram of p53 protein structure1.2　p53蛋白的功能p53蛋白是人体内十分重要的抑癌转录因子。正常情况下，细胞中的p53蛋白维持在一个较低的水平，这主要是由体内E3泛素连接酶MDM2介导完成的。p53蛋白与MDM2形成的反馈调节通路，导致细胞内p53蛋白的半衰期为6~20 min。各种各样的细胞应激如DNA损伤、端粒侵蚀、代谢改变、缺氧、有丝分裂纺锤体功能异常以及几种不同的致癌基因如Ras、Myc和Ets的突变激活等均可以引起机体针对MDM2和p53蛋白的修饰，这些修饰抑制了MDM2的活性，导致p53蛋白水平升高并激活，启动了一系列不同的转录程序。每一种应激压力都由一组不同的蛋白质检测，这些蛋白质向MDM2和/或p53蛋白发出信号并对其进行修饰。根据修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）和细胞类型（如分化状态、细胞是否转化或正常、细胞是否正在分裂或休眠），启动一个p53蛋白介导的信号通路（图2）。图2  p53蛋白的功能Fig. 2  Function of p53 proteinp53蛋白是细胞中维持稳态的重要肿瘤抑制因子。在整个生命周期中，细胞都面临着持续的压力（内源压力、外部压力），每一种压力都由一组不同的蛋白质检测，这些蛋白质向MDM2和/或p53蛋白发出信号并对其进行修饰。启动一个p53蛋白介导的信号通路诱导细胞凋亡、衰老、分化等多种作用。激活状态下的p53蛋白通过与DNA序列（称为p53反应元件或p53结合位点）特异性结合诱导下游靶基因p21、PUMA、NOXA的表达，促进细胞凋亡、衰老、细胞周期阻滞、代谢改变、血管生成等多种作用，此外p53蛋白并非所有功能都是通过充当转录因子来实现的，比如细胞质中（尤其是定位于线粒体）的p53蛋白也参与调节糖酵解、氧化磷酸化、活性氧和自噬等。除了直接调节肿瘤细胞代谢外，p53蛋白还可以通过影响肿瘤微环境抑制肿瘤的发生，其中很重要的一点是调节微环境中的免疫细胞，目前大量证据表明，p53蛋白可以影响免疫系统功能，通过调节肿瘤相关免疫细胞的代谢活动进而影响肿瘤发展。02p53蛋白主要突变类型与特征自从在人类结肠癌中首次发现TP53突变基因以来，大量DNA测序项目已经检测了所有人类癌症中TP53基因的突变频率。总的来说，TP53基因突变的频率通常取决于癌症的类型，睾丸畸形癌中突变最少（1%~3%），浆液性卵巢癌中突变最多（100%）。组织和细胞类型都影响TP53基因突变的频率，多种突变类型导致p53蛋白原本功能的丧失。在整个TP53基因突变类型中，缺失、插入、移码和无义突变的发生率为10%，大多数情况下导致蛋白质不能产生或迅速被降解。其余90%的突变类型为错义突变，在这些突变中，90%定位于DBD，其中175、245、248、249、273和282氨基酸位点是其热点突变，p53R175H与p53R273H分别为p53蛋白错义突变的第一和第三大类型，其β片层结构都被很好地保存了下来，疏水表面变大，环的灵活性变高，从而易于在细胞内积聚。其次作为p53蛋白第二大错义突变类型的p53R248Q，热稳定性较低，可通过与STAT3结合并使其磷酸化，从而持续激活STAT3信号通路促进癌细胞的迁移。事实上与野生型p53蛋白相比，大多数突变p53蛋白除丧失与DNA结合及调控转录的能力最终导致抑癌功能丧失外，还会获得新的致癌活性以促进癌症的进展，称为功能获得性效应（gain of function，GOF），突变p53蛋白的GOF活性在1993年首次得到证实，当时Dittmer等报道了p53R175H和p53R273H的异位表达赋予了p53蛋白缺失细胞在软琼脂中形成集落和在裸鼠中形成异种移植瘤的能力，此后，包括使用细胞培养系统和小鼠模型以及临床研究在内的大量证据表明，许多p53蛋白错义突变均具有GOF活性以促进癌症的发生。到目前为止，已经报道了多种突变p53蛋白GOF活性，包括促进细胞增殖、转移、基因组不稳定性、代谢重编程、肿瘤微环境重塑、免疫抑制和癌症治疗抵抗。03靶向突变p53蛋白治疗肿瘤的策略寻找靶向突变p53蛋白的药物一直是治疗癌症的研究热点。然而，野生型p53蛋白和大多数突变p53蛋白缺乏结合口袋或变构位点，阻碍了常规的药物设计，因此经常被认为是“不可成药的”靶点。更重要的是，在人类肿瘤中已经发现2 000多种p53蛋白的突变形式，它们的结构、稳定性和生物学功能各不相同，几乎不可能用单一药物靶向所有p53蛋白的突变形式，对于每一种p53蛋白突变体，可能需要专门的药物治疗。本文主要梳理了两种靶向突变p53蛋白以治疗癌症的策略：a. 恢复突变p53蛋白野生型构象；b. 降解突变p53蛋白（图3）。并简要介绍了3种间接靶向突变p53蛋白治疗癌症的策略。尽管几十年来科学家们提出了各种各样针对突变p53蛋白治疗癌症的方式，但截至目前仍没有开发出一款疗效较为理想的药物，也正因如此，科学家们对p53蛋白的研究热情持续未减，未来无论哪种治疗策略及药物，若可以有效靶向突变p53蛋白治疗癌症，都将对人类医学产生划时代意义。图3  恢复或降解突变p53蛋白治疗癌症的策略Fig. 3  Strategies for cancer therapy targeting degradation or restoration of wild-type conformation of mutated p53 protein（a）突变p53蛋白被p53蛋白激活剂恢复为野生型构象后被导入细胞核并四聚化，获得与其靶基因（如p21、Bax、PIGs、PAI）结合的能力，诱导肿瘤抑制反应（细胞周期阻滞、凋亡和衰老），抑制肿瘤发生。（b）突变p53蛋白不仅失去了与肿瘤抑制基因结合的能力，而且还获得了转录激活致癌基因（如NF-κB2、BRCA1）的功能，以诱导肿瘤的发生。突变p53蛋白降解剂可直接与突变p53蛋白结合，诱导其降解并抑制肿瘤的发生。3.1　恢复突变p53蛋白野生型构象p53蛋白属于热敏蛋白，突变后具有折叠与去折叠两种状态转换的能力，因此是否可以利用一些小分子化合物逆转突变构象，使突变p53蛋白重新恢复其野生型构象或功能呢？通过计算机对数千种化合物进行高通量筛选，发现极少数化合物似乎有这一能力，通过恢复突变p53蛋白的特定野生型功能，如诱导凋亡、促进细胞周期阻滞和抑制癌细胞增殖，证实了这种“突变体再激活”。3.1.1　COTI-2COTI-2是通过计算机高通量筛选发现的一种具有口服活性的第三代胺苯硫脲化合物（图4）。已被证明能与突变p53蛋白结合，恢复突变p53蛋白野生型活性，并使野生型p53蛋白靶基因表达正常化。除此之外，COTI-2似乎也能独立于p53蛋白发挥作用，该化合物可激活AMPK、抑制mTOR通路、诱导肿瘤细胞DNA损伤引起复制应激。COTI-2的这些不依赖p53蛋白发挥的效应可能进一步促进其抗癌作用，因为研究发现，诱导DNA损伤和复制应激会引起细胞凋亡，而抑制mTOR信号传导是一种成熟的治疗癌症的策略。图4  突变p53蛋白重激活剂结构示意图Fig. 4  Schematic diagram of reactivator structure of mutated p53 protein与上述活性一致，Synnott等发现COTI-2可抑制多种恶性肿瘤细胞系和动物模型中肿瘤的生长，并且在研究的动物模型中具有良好的耐受性，没有发病或体重减轻的不良现象出现。Salim等发现，COTI-2可作为单一药物通过两种途径对多种头颈部癌细胞发挥明显的抗肿瘤作用，一方面COTI-2显著增强了对顺铂和/或辐射出现耐药性的头颈部癌肿瘤细胞对这些治疗的敏感性，另一方面COTI-2可在TP53基因缺失或突变的头颈部癌细胞中诱导凋亡，而在含野生型p53蛋白的头颈部癌细胞中，COTI-2诱导衰老而非凋亡，这可能是由于COTI-2可增强含野生型p53蛋白的细胞中p21表达，而p21是这些细胞中已知的衰老诱导物。除此之外，Maleki等还发现，在乳腺癌细胞系中表达突变p53蛋白的细胞系比含有野生型p53蛋白的细胞对COTI-2更敏感。目前，COTI-2正在进行一项针对复发性妇科癌症治疗的临床I期试验，初步药代动力学评价显示，口服该化合物的药峰时间（Tmax）在15~90 min之间，半衰期为8~10 h，并且其耐受性良好，最常见的不良反应为恶心、呕吐、疲劳和腹痛。在接受治疗的24名患者中，只有2名（8%）需要减少剂量。然而，到目前为止在参与试验的妇科癌症患者中，还没有肿瘤消退的证据。总之，COTI-2在多种含突变p53蛋白的肿瘤细胞中具有非常有效的治疗效果，即使这些肿瘤细胞对顺铂和辐射具有固有的耐药性，此外，该药物似乎以一种新颖的方式发挥其作用，包括重新激活野生型p53蛋白靶基因，诱导肿瘤细胞凋亡等。事实上，COTI-2在含野生型TP53基因的肿瘤细胞中同样诱导许多凋亡基因上调，但细胞凋亡并不明显，很可能是因为这些促凋亡基因并没有在蛋白质水平上被COTI-2诱导。3.1.2　2-磺酰嘧啶p53Y220C突变是p53蛋白第9大突变类型，位于p53蛋白S3/S4环和S7/S8 环之间的220位酪氨酸突变成为半胱氨酸。p53Y220C突变不仅直接破坏突变氨基酸与周围氨基酸Leu145和Thr155之间的氢键，而且降低了p53Y220C cluster区域的折叠片S3和S8之间的氢键数量，使p53Y220C突变所形成的亲水性空腔变大，加速了水分子进入该蛋白质内部，大大降低p53蛋白的热稳定性。为了能够找到具有较好靶向这种特殊突变活性的小分子化合物，Bauer等通过差示扫描荧光法（DSF）筛选了一个旨在结合p53Y220C突变诱导产生的空腔配体文库，发现了一个2-磺酰嘧啶小分子PK11000（5-氯-2-甲磺酰吡啶-4-羧酸）（图4），它可将突变p53Y220C蛋白融化温度明显提高（ΔTm>1.2K），并且根据光散射法测定蛋白质聚合动力学怀疑PK11000与突变p53蛋白属于共价结合。然而后期发现PK11000还可以使细胞内其他突变类型的p53蛋白融化温度升高，证实其稳定突变p53蛋白活性不是通过与p53Y220C突变腔结合而实现的。Synnott等发现，2-磺酰嘧啶在生物环境条件下仅与高度亲核的半胱氨酸发生SNAr反应，因此是选择性化学修饰蛋白质的有用工具。通过HSQC NMR数据及ESI质谱，证实了PK11000对p53Cys182和p53Cys277的特异性烷基化作用，PK11000对Cys182和Cys277的特异性修饰可在不损害p53蛋白与DNA亲和力的情况下提高蛋白质稳定性。PK11007为PK11000的类似物，是温和的硫醇烷基化剂（图4），相对于PK11000具有更好的抗癌活性，这可能与其膜透性改善（疏水性更强）、巯基反应活性提高（吸电子取代基更强）和烷基化选择性增加（4-氟苯取代导致亲核芳香族取代的空间位阻）等有关，此外PK11007还可通过两条途径发挥抗癌作用，即p53蛋白依赖和p53蛋白非依赖途径。PK11007可选择性结合暴露于突变p53蛋白表面的两个半胱氨酸即Cys182和Cys277从而稳定突变p53蛋白，并不损害其DNA结合活性。在一些癌细胞系中，不稳定的突变p53蛋白被PK11007重新激活，导致p53蛋白靶基因如p21和PUMA的上调从而引起细胞凋亡。然而更普遍的是，PK11007可独立于p53蛋白通过消耗细胞内的谷胱甘肽，诱导细胞内活性氧水平的高度升高及内质网（ER）应激造成细胞凋亡，PK11007和其他2-磺基嘧啶化合物作为抗癌药物的先导具有很大的潜力。3.1.3　异硫氰酸苯乙酯（PEITC）PEITC大量存在于豆瓣菜和十字花科蔬菜中（图4），对多种肿瘤细胞表现出生长抑制活性，尤其对表达突变p53R175蛋白的肿瘤细胞具有优先抑制活性。p53R175H突变是人类癌症中最常见的p53蛋白错义突变，估计为5.6%的发生率。事实上，PEITC已经在临床I期和II期试验中进行了研究，作用机制包括恢复突变p53蛋白野生型构象、抑制肿瘤细胞迁移、诱导II期解毒酶、细胞周期阻滞和诱导氧化应激促进凋亡等。此外，PEITC处理还会使突变p53R175蛋白对MDM2依赖的蛋白酶体降解敏感。Lam-Ubol等将蛋白酶体抑制剂MG132或特异性MDM2抑制剂Nutlin-3与PEITC分别或共同处理SK-BR-3细胞。发现与单独PEITC处理相比，MG132或Nutlin-3均可以使SK-BR-3细胞全裂解液（WCL）中突变p53蛋白显著积累。这一结果表明，突变p53R175蛋白稳定性降低是由于MDM2依赖的蛋白酶体的降解。这可能是由于PEITC将突变p53R175蛋白恢复为野生型构象，而野生型p53蛋白在细胞内受MDM2的调控。Choudhury等用PEITC处理SK-BR-3细胞时，发现高浓度（≥8 μmol/L）的PEITC会引起突变p53R175蛋白发生聚集。由于蛋白质聚集物会引发自噬清除，Bommareddy等便研究了突变p53R175蛋白的降解是否经历自噬。他们将8 μmol/L PEITC和氯喹（CHQ）共同处理SK-BR-3细胞，在细胞裂解液中发现突变p53R175蛋白水平较单独PEITC处理时明显升高，而用4 μmol/L PEITC做相同处理时突变p53R175蛋白水平并无明显差异，这表明了高浓度PEITC可能诱导突变p53R175蛋白发生聚集并自噬。PEITC诱导的自噬，突变p53R175蛋白的再活化及其随后对降解途径的敏感性均有助于其依赖突变p53蛋白发挥抗癌活性。近年来科学家们的研究方向主要集中于从化学文库中寻找能重新激活突变p53蛋白的小分子化合物。然而，以膳食为基础预防或治疗突变p53蛋白的研究仍然很少。PEITC的发现提供了第一个突变p53蛋白被饮食中化合物激活的例子，对癌症预防和治疗具有重要意义。3.1.4　三氧化二砷（ATO）p53蛋白突变类型高达数千种，多为错义突变，由于在其DBD缺乏广泛适用的变构调控位点，这就使得针对突变p53蛋白的治疗显得尤为棘手。尽管Zinc（NSC319726）靶向锌配合位点已经显示了具有拯救突变p53蛋白的活性，但其对突变p53R175蛋白具有高度特异性并影响p53蛋白DNA结合活性。还有一个值得注意的结合位点，涉及到一个远离DNA结合表面的裂缝，目前已经开发出多种可插入这个缝隙的小分子如PK083、PK15796等，从而稳定突变p53蛋白。然而遗憾的是，这种结合裂隙是p53Y220C突变所特有的，并不适用于其他p53蛋白突变体。因此还需不断寻找靶向突变p53蛋白新的变构位点化合物。ATO是一种治疗急性早幼粒细胞白血病的药物，可通过与半胱氨酸反应拯救结构突变型p53蛋白。砷结合突变p53蛋白的晶体结构揭示了一个隐藏的变构位点，该位点位于远离突变p53蛋白DBD区的ABP口袋，涉及三个砷配位半胱氨酸。砷结合并稳定了突变p53蛋白DBD区的环-片-螺旋基序和整个β夹层结构，赋予结构突变型p53蛋白热稳定性和转录活性，值得注意的是，砷与ABP口袋中的半胱氨酸三联体的特异性结合不同于其他作用于突变p53蛋白半胱氨酸的小分子化合物，如APR-246，后者杂乱地结合暴露于蛋白质表面的半胱氨酸。但砷结合的半胱氨酸三联体同样可能存在于其他蛋白质中，从而使ATO产生独立于突变p53蛋白的抗癌活性或细胞毒性。在细胞和小鼠异种移植模型中，ATO重新激活了突变p53蛋白野生型活性并抑制肿瘤的发生。在对ATO介导拯救的25个人类癌症中最常见突变p53蛋白实验中发现，所有的结构突变型p53蛋白都可以被拯救，尽管程度不同。有趣的是，接触突变型p53蛋白p53S241F、p53R248W也显示出被拯救的迹象，这说明某些接触突变型p53蛋白活性丧失也是由于构象改变引起的。尽管ATO对结构突变型p53蛋白具有普遍的拯救作用，但它们的野生型活性并不总是被有效地恢复，因为除了整体折叠外，局部p53蛋白DNA结合表面的完整性也决定了ATO拯救转录活性的效率。ATO联合维甲酸治疗APL为癌症治疗提供了新思路。令人鼓舞的是，ATO的治疗潜力在血液和一些实体肿瘤的临床实验中已有报道。目前一项针对含有突变p53蛋白的血液系统恶性肿瘤的I期临床试验正在进行。3.2　降解突变p53蛋白TP53基因的错义突变产生异常蛋白质，其抑癌功能被取消的同时也可获得促进肿瘤细胞侵袭、转移和化疗耐药的能力（GOF），最近的研究结果表明，突变p53蛋白的敲除降低了携带突变p53蛋白的肿瘤细胞的致癌特性。因此，确定突变p53蛋白稳定/降解的特异机制以及识别不改变野生型p53蛋白水平而使突变p53蛋白降解的化合物是至关重要的。靶向降解突变p53蛋白可能是开发新型抗癌药物的一种有前景的方法。3.2.1　藤黄酸（GA）GA是从甘草干乳胶中分离出来的一种黄酮（图5），在体内外均表现出强大的生物活性，如激活凋亡途径、诱导细胞周期阻滞、抑制端粒酶和拓扑异构酶II活性以及抑制血管生成等。迄今为止的所有研究都表明，GA是一种有效的抗癌剂，通过不同的机制具有不同的分子靶点。作为抗肿瘤候选药物，GA目前正在进行中国食品和药物管理局批准的II期临床试验。GA可以抑制含有野生型p53蛋白的肿瘤细胞生长，这是由于其可以抑制MDM2表达，增加肿瘤细胞内野生型p53蛋白水平，从而发挥抑癌作用。然而，半数以上的人类癌症中发现了突变型p53蛋白，有趣的是，GA对MDM2的影响在含有突变型p53蛋白的细胞中是不同的，Qin等发现在GA处理后的MDA-MB-435细胞中，MDM2蛋白水平和p53-MDM2相互作用均未受到显著影响，尽管已有报道MDM2可促进突变型和野生型p53蛋白的降解，但越来越多的研究表明，作为E3泛素连接酶的MDM2在突变型p53蛋白的降解中并不那么重要。而另一种突变p53蛋白降解途径，涉及分子伴侣Hsc70和Hsp90以及泛素/蛋白酶体系统的密切合作，这种降解途径的重要点在于伴侣相关泛素连接酶CHIP，CHIP通过与Hsc70和Hsp90的羧基端结合，与E2酶一起介导分子伴侣结合目标蛋白的泛素化，并诱导蛋白酶体降解目标蛋白。Hsc70和Hsp90在内的多种分子伴侣可特异性识别突变型p53蛋白，并在增强突变p53蛋白的稳定性中发挥重要作用。Liu等发现，GA可以通过调节这些分子伴侣进而达到降解突变p53蛋白的目的，GA可以上调Hsc70，下调Hsp90的表达，而对CHIP的蛋白质水平没有显著影响，进一步的免疫沉淀表明，GA改变了突变p53蛋白和分子伴侣之间的相互作用，呈浓度依赖性地破坏Hsp90与突变p53蛋白相互作用，并促进Hsc70/突变p53蛋白和CHIP/Hsc70/突变p53蛋白复合物的形成。随后Wang等在MDA-MB-435细胞中转染CHIP siRNA后，用GA处理相关细胞时发现伴侣相关泛素连接酶的消失导致突变p53蛋白水平的增加，这一发现强调了GA降解突变p53蛋白的机制，即GA通过上调与突变p53蛋白特异性结合的分子伴侣，并与CHIP、E2酶、26S蛋白酶体一起介导突变p53蛋白的泛素化降解。除此之外GA还可以增加携带突变p53蛋白的癌细胞对化疗药物的敏感性。这可能是由于突变p53蛋白本身就是克服肿瘤耐药性的药物开发潜在靶点，GA显著降低了肿瘤细胞中突变p53蛋白水平，从而使其对化疗药物的敏感性增加。3.2.2　YK-3-273YK-3-237为combretastatin a4（CA-4）的硼酸查尔酮类似物（图5），是SIRT1酶激活剂并对广泛含突变p53蛋白的肿瘤细胞表现出抗增殖活性。SIRT1酶是针对p53K382残基上的一个众所周知的去乙酰化酶。无论是野生型还是突变p53蛋白的去乙酰化都明显依赖于SIRT1酶的催化。野生型p53K382残基的乙酰化被认为是其保持稳定的重要决定因素，突变p53蛋白高度稳定的机制目前尚不清楚，但Alves-Fernandes等发现，在TNBC细胞中，小分子化合物YK-3-237激活了SIRT1酶活性降低了突变p53蛋白的乙酰化，使突变p53蛋白水平明显下降。Rozenberg等通过real-timePCR定量分析发现，YK-3-273在肝癌细胞系HUH-7中可诱导GADD45、PTEN和PERP mRNA的表达，在乳腺癌细胞系T47D中，可诱导GADD45和p21 mRNA的表达，在鼻咽癌细胞系CNE-2中，诱导p21 mRNA的表达，在3种不同的TNBC细胞株HS578T、MDA-MB-468和SUM149PT中诱导野生型p53靶基因PUMA和NOXA的表达，这些结果提示，YK-3-237介导的去乙酰化可抑制突变p53蛋白在多种肿瘤细胞中的功能，并特异性释放突变p53蛋白对野生型p53靶基因的转录抑制。然而，YK-3-237激活SIRT1酶的分子机制需要进一步阐明。最近报道称，YK-3-237只有在蛋白质被7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）标记的情况下才能激活其SIRT1酶活性，不能针对新生p53蛋白发挥作用。此外，YK-3-237还能激活人SIRT2酶活性，降低了细胞中α微管蛋白水平。通过SIRT2酶脱乙酰作用减少α微管蛋白可能与降解突变p53蛋白，上调野生型p53蛋白靶基因的表达共同发挥抗肿瘤作用。但是目前SIRT1酶在人类癌症中的作用还存在争议，已有报道称SIRT1酶抑制剂和激活剂（如白藜芦醇）都能抑制人类肿瘤细胞株的生长。虽然最近已经开发了几种SIRT1酶激活剂，但这些化合物的抗癌作用尚未见报道。鉴于SIRT1酶在癌症、衰老、糖尿病和神经元疾病等许多生物过程中的作用日益增加，YK-3-237可能会是一个很有研究和开发价值的小分子化合物。3.2.3　他汀类（Stains）突变p53蛋白在肿瘤细胞中的稳定存在对其GOF活性至关重要，然而目前对突变p53蛋白稳定/降解的特异机制还知之甚少。通过高通量筛选，发现了Stains降胆固醇药物可作为结构突变型p53蛋白的降解诱导物，并且对野生型p53蛋白和接触突变型p53蛋白的影响很小。突变p53蛋白本质上是不稳定的，因为细胞中E3泛素连接酶MDM2及CHIP均可以诱导其降解，但是在肿瘤细胞中，突变p53蛋白却可以与多种分子伴侣如Hsp90、Hsc70、DNAJA1等相互作用从而保持稳定的状态。甲羟戊酸途径在结构突变型p53蛋白的稳定以及GOF活性中发挥重要的作用。结构突变型p53蛋白可以结合并激活SREPB转录因子，从而上调参与甲羟戊酸途径的多种酶合成大量的5-磷酸甲羟戊酸（MVP），而 5-磷酸甲羟戊酸的上调又可以反过来促进结构突变型p53蛋白与DNAJA1等多种分子伴侣的相互作用，从而使结构突变型p53蛋白在肿瘤细胞中保持稳定的状态，就这样形成了一个正反馈循环。并且5-磷酸甲羟戊酸还可以通过调节蛋白质的异戊二烯化，促进肿瘤细胞黏附、迁移和增殖过程中靶蛋白的膜附着。HMG-CoA还原酶是催化甲戊酸途径的第一步限速酶，Stains药物通过抑制HMG-CoA还原酶活性，特异性减少细胞内5-磷酸甲羟戊酸的生成，抑制结构突变型p53蛋白与分子伴侣DNAJA1相互作用，从而使结构突变型p53蛋白被细胞内E3泛素连接酶MDM2及CHIP介导的泛素化标记并降解。Stains药物可以抑制对癌症进展至关重要的两种细胞活动——蛋白质异戊二烯化和突变p53蛋白的稳定化，它是一款较为理想的靶向结构突变型p53蛋白的小分子抑制剂。此外，Stains药物还可使含突变p53R172H蛋白的肿瘤细胞对阿霉素敏感，这表明了Stains药物可作为独立或与其他化疗药物联合治疗肿瘤的潜在作用。然而，Moon等发现在小鼠模型中只有阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的日剂量分别达到30 mg/kg和10 mg/kg时才会有较好的抗肿瘤效果，这相当于约140 mg和约50 mg的人体剂量，高于成人规定的临床剂量，这也是为什么Stains药物治疗癌症的临床试验结果存在争议。因此目前最重要的是发现降低Stains药物剂量的同时仍保留其诱导突变p53蛋白降解能力的方法。通过Stains药物抑制甲羟戊酸途径-DNAJA1轴诱导结构突变型p53蛋白降解可能代表了一种有希望的治疗癌症的策略。3.3　间接靶向p53蛋白治疗肿瘤的策略3.3.1　重新激活被抑制的野生型p53蛋白功能在保持野生型TP53基因表达的肿瘤细胞中，最广泛采用的治疗方法是抑制野生型p53蛋白的降解。野生型p53蛋白降解的机制涉及E3泛素连接酶MDM2对其泛素化标记，最终导致野生型p53蛋白被细胞自身蛋白酶体所降解。MDM2介导的泛素化依赖其与野生型p53蛋白的直接结合，促使人们寻找抑制MDM2-p53结合的小分子作为稳定野生型p53蛋白并使其恢复效力的工具。于是大量靶向MDM2蛋白以重新激活野生型p53蛋白功能的小分子应运而生（表1）。表1  MDM2/MDMX-p53抑制剂及其作用机制Table 1  MDM2/MDMX-p53 inhibitors and their mechanisms of action3.3.2　利用miRNA抑制含突变p53蛋白的肿瘤发生miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的单链RNA分子，主要功能为抑制其靶mRNA的转译或促进其降解，因此，miRNA水平的改变可以通过转录后机制进一步影响蛋白质水平。野生型p53蛋白可通过直接激活转录或促进成熟来调节miRNA水平，而突变p53蛋白会导致p53/miRNA轴的失调和其他miRNA的上调，从而赋予额外的致癌能力，如体细胞重编程等（表2）。此外，最近一些研究聚焦于循环miRNAs，探索其诊断和预后潜力，表明miRNAs的潜在临床应用价值。miRNAs可能是一种有效的癌症治疗工具。3.3.3　利用合成致死抑制含突变p53蛋白的肿瘤发生与直接靶向突变p53蛋白药物相比，合成致死方法对p53蛋白结构的依赖较小，这表明它可以广泛作用于多种p53蛋白突变类型。根据肿瘤细胞中所含突变p53蛋白功能丧失（loss of function，LOF）和GOF的不同，可使用不同的策略（表3）。04总结与展望p53蛋白是人体内天然免疫和抗肿瘤反应的重要组成部分。其突变不仅会造成原本抑癌功能的丧失，甚至还会出现一些促进癌症发生的新功能。几十年来，科学家们为了战胜突变p53蛋白提出了各种各样的观点，除上文提到的几种策略外，还提出从水解的突变p53蛋白中提取特异性肽作为新抗原由抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）提供给B细胞和T细胞以激活免疫反应，利用靶向突变p53蛋白的小分子设计蛋白质水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）化合物以降解突变p53蛋白等多种方式，达到治疗癌症的目的。然而目前绝大多数针对突变p53蛋白的药物仍处于初级阶段，没有一款上市，因此现在就断定针对突变p53蛋白的治疗会对癌症有效还为时过早，但是一旦有针对突变p53蛋白疗效较好的化合物出现，就有可能开创癌症治疗新时代，特别是在p53蛋白功能障碍在人类癌症中如此普遍存在的情况下。总的来说，突变p53蛋白是一个有吸引力的癌症治疗靶点，随着针对突变p53蛋白的治疗策略及药物不断开发，根据患者的TP53基因突变情况设计个性化的治疗方案将成为可能。来源：生物化学与生物物理学进展作者：王若亚  张鸳  张继虹  俞飞文章内容由药精通Bio小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如需转载必须经过同意并按要求在转载文章最前方添加“药精通Bio”公众号，谢谢！ENDIDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛报名即将截止！（扫码立即领取限量免费参会名额）

衰老是一种机体组织、器官、细胞多维度稳态失衡、功能退化的过程，其诱因复杂、表现多样，使人们对衰老的研究需要利用各种模型来模拟人体生理、病理过程，以此来揭示衰老机制，指导抗衰老策略。衰老的特征（Front. Cell Dev. Biol. 2022）体外模型类型特征复制性衰老：RS复制衰老模型饱和密度降低，细胞表面积、体积增加，细胞周期停滞，端粒缩短。化疗诱导衰老：CIS羟基脲诱导ROS增加，细胞增殖减少。Aβ1-42寡聚体AD模型ROS增加，PAI-1和p21的mRNA水平升高，SIRT1水平降低。D-半乳糖诱导ROS增加，炎症水平升高，p16、p21、p53基因表达增加，NRF2、HO-1减少。阿霉素诱导（DAN拓扑异构酶抑制剂）细胞周期停滞，DNA损伤增加，端粒缩短，p16lnk4a基因表达增加。Palbociclib诱导（CDK4/CDK6抑制剂）G0/G1停滞，细胞生长停滞Rb蛋白表达减少，IL-6、IL-8、CXCL1分泌增加。应激诱导早衰：SIPSX射线诱导不可逆的G1周期停滞，DNA损伤，IL-1β、IL-6、IL-8分泌增加紫外线（UVB）诱导生长停滞，线粒体DNA缺失衰老相关基因表达增加。H2O2诱导G1期停滞，端粒缩短，p21、gadd45基因表达增加t-BHP诱导生长停滞，线粒体DNA 4977-bp片段缺失，p21waf-1过度表达，Rb蛋白磷酸化受阻，衰老基因表达增加。乙醇诱导生长停滞，线粒体DNA 4977-bp片段缺失，p21waf-1过度表达，pRb无法磷酸化衰老相关基因表达增加。高氧诱导G1期停滞，端粒缩短，蛋白降解增加，脂褐质/蜡样质积累。癌基因诱导衰老：OISMos-过表达模型生长停滞，DNA损伤，p16INK4a上调，SA-β-gal阳性染色增加。B-RAF V600E模型细胞周期停滞，p16INK4a上调，SA-β-gal阳性染色增加。H-RAS G12V模型p16INK4a上调，Rb磷酸化程度降低，SA-β-gal阳性染色增加。抑制DNA甲基转移酶5-aza-2'-脱氧胞苷诱导模型生长抑制，p16表达增加，p53表达减少。抑制端粒酶活性SYUIQ-5诱导生长抑制，p16、p21、p27表达增加。细胞周期蛋白E过表达细胞周期停滞，DNA损伤增加。IMR90 ER: RAS模型生长停滞，衰老相关分泌表型（SASP）标志物表达增加。来自老年捐赠者具有衰老表型的iPSC衍生神经元来自老年供体的iPSC衍生神经元，具有衰老相关基因表达。具有衰老表型的诱导神经元来自老年供体成纤维细胞，具有年龄更依赖型转录组特征。体内模型类型特征快速衰老模型SAMPSAMP6：老年骨质疏松模型骨形成减少，骨髓脂肪增加，PPARγ、Sfrp4表达增加。SAMP8：AD模型年龄相关的学习、记忆障碍，Aβ沉积，自噬功能异常。SAMP10：神经退行性病变自发性大脑退化，学习、记忆、情绪障碍。理化因素诱导模型D-半乳糖ROS增加，炎性水平升高，线粒体功能障碍，细胞凋亡增加，p21、p53基因表达上调。AICI3认知功能显著降低，短期记忆受损、焦虑加剧、空间和参考记忆下降。D-半乳糖+AICI3记忆缺陷，神经元损伤，海马区caspase-3过度表达。D-半乳糖+NaNO2认知、记忆障碍，氧化应激增加，海马CA1、CA3、CA4区神经元损伤，精子质量下降，睾丸形态恶化。铁辐射感应持续性DNA损伤反应，SASP标记增加，IL-8产生增加。O3诱导胸腺萎缩，体重减轻，探索活性减少，氧化损伤增加。Wrn基因敲除：Werner综合征Wrn-/-，Trec-/-白发，脱发，白内障，骨质疏松，T2D，端粒缩短。Wrn△hel/△hel严重的心脏间质纤维化，胰岛素抵抗，高甘油三酯血症，癌症发病率增加，ROS增加，DNA损伤增加。Lmn突变：HGPSLmna L530P/L530P严重生长迟缓，脱发，骨质疏松，肌肉萎缩。Lmna HG/+生长缓慢，骨质疏松，脱发，偏脂营养不良。lmna G609G/G609G不孕，体重减轻，生长迟缓，脊柱弯曲，血管钙化，骨密度降低，胰岛素样生长因子减少。Zmpste24 -/-严重生长迟缓，扩张性心肌病，脂肪营养不良，肌肉营养不良，过早死亡。其他基因相关模型BubR1 H/H大脑胶质增生、白内障、心率失常，皮肤变薄，血管弹性降低，纤维化受损。Ndufs4 -/-利氏综合征相关神经退行性改变，嗜睡，共济失调，体重减轻，过早死亡。ERCC1 -/-ERCC1 △/-生长迟缓，共济失调，视力丧失，小脑发育不全，脑病，肾功能衰竭。Sod1 -/-白内障，听力丧失，皮肤变薄，脂质代谢紊乱，伤口愈合缺陷。Klotho -/-心血管损伤，动脉硬化，皮肤萎缩，肺气肿Xpd TTD/TTD骨质疏松，骨质硬化，脊柱后凸，恶病质，白发，不育，寿命缩短。mtDNA Polγ突变（PolG）体重减轻，脱发，听力丧失，骨密度的降低，贫血，心肌病。PolgA mut/mut骨质疏松，脊柱侧弯，贫血，心脏增大，生育能力降低。Nfkb1 -/-骨质疏松，脊柱后凸，骨质疏松，组织炎症，中枢神经系统神经胶质增生，寿命缩短。Terc -/-器官功能受损，组织萎陷，生育能力降低，寿命缩短。3xTg-ADAD模型记忆障碍，认知缺陷，突触功能障碍，海马神经元异常兴奋，淀粉样斑块和p-Tau沉积。Tg2576AD模型认知障碍，记忆丧失，氧化性脂质损伤，大脑炎症。长寿动物裸鼹鼠寿命长，健康，死亡率低。涡虫DNA修复机制高效，端粒酶活性强，具有非常好的再生能力，被认为是永生的。蝾螈‍清除衰老细胞能力、再生能力强。乌龟ROS清除速度快，端粒酶活性强，DNA修复机制高效。转基因延缓衰老Ames侏儒鼠，Prop1 df/dfProp1基因隐性点突变，垂体发育受损，体型变小，PI3K-Akt-mTOR通路下调。Snel侏儒鼠，Pit1 dw/dwPit1基因自发突变，垂体发育受损，体型变小，免疫衰老减少。参考资料Carrasco, E. et al. The role of T cells in age-related diseases. Nat. Rev. Immunol. 22, 97–111 (2022).decline in ageing. Nature 590, 122–128 (2021). 56. Brauning, A. et al. Aging of the immune system: focus on natural killer cells phenotype and functions. Cells 11, 1017 (2022)Franco, A. C., Aveleira, C. & Cavadas, C. Skin senescence: mechanisms and impact on whole-body aging. Trends Mol. Med. 28, 97–109 (2022). Sabbatini, M. et al. Aging hampers neutrophil extracellular traps (NETs) efficacy. Aging Clin. Exp. Res. 34, 2345–2353 (2022)Li, X., Li, C., Zhang, W. et al. Inflammation and aging: signaling pathways and intervention therapies. Sig Transduct Target Ther 8, 239 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01502-8 van de Wal, M. A. E. et al. Ndufs4 knockout mouse models of Leigh syndrome: pathophysiology and intervention. Brain 145, 45–63 (2022).Davies DM, van den Handel K, Bharadwaj S and Lengefeld J (2022), Cellular enlargement - A new hallmark of aging? Front. Cell Dev. Biol. 10:1036602. doi: 10.3389/fcell.2022.1036602·········点亮在看，传递信息♥

关注并星标CPHI制药在线       青蒿素（Artemisinin）是从菊科植物黄花蒿叶中提取的含过氧化基团结构的倍半萜内酯化合物。青蒿素的主要衍生物包括蒿甲醚（Artemethere）、蒿乙醚（Arteether）、青蒿琥酯（Artesunate）、二氢青蒿素（Dihydro artemisinin）等。青蒿素类药物主要以治疗疟疾为主，随着研究的不断深入，研究发现青蒿素类化合物还有许多其他作用，如抗肿瘤、抑菌杀虫、解热、抗炎、免疫调节等。药理作用1抗疟作用研究发现，青蒿素类化合物发挥抗疟活性的作用机制包括：①青蒿素在血红蛋白Fe2+的催化下，发生过氧桥键断裂，生成氧和碳自由基，这些自由基可以随有机烷基化结合位点附近的氨基酸残基，阻断疟原虫的营养吸收，同时迅速形成自噬泡将缺乏营养而导致氨基酸饥饿的原虫排出体外，发挥消灭疟原虫的作用；②在一定量Fe2+的催化作用下，青蒿素产生以碳为中心的自由基，被激活的青蒿素依靠其疏水骨架靶向作用于疟原虫钙ATP蛋白6（PfATP6），引起疟原虫胞浆内钙离子浓度上升，发挥杀虫抗疟作用。③青蒿素类药物对疟原虫配子体也具有杀灭作用，能够抑制不同阶段的配子体发育，快速杀死疟原虫的初期配子体，同时截断未成熟配子体的发育。       2抑菌、杀虫作用青蒿素类注射液对猪的多种血液寄生虫病都具有良好的防治效果，特别是对猪附红细胞体、猪弓形体、猪巴通氏体、猪锥虫病等都有较好的治疗作用，同时对鸡的球虫病等也有很好的疗效。青蒿素及其衍生物可阻断虫体早期阶段的营养物质的消化吸收代谢，造成氨基酸缺乏，最终导致虫体的细胞膜受损而死亡。进一步研究发现，青蒿素及其衍生物能有效抑制球虫裂殖子微线基因相关 mRNA 的转录和表达，从而达到减少球虫数量的目的。此外，青蒿素类还能有效促进机体内淋巴细胞的转化，显著增加血液中红细胞、白细胞和血红蛋白数量。另有研究发现，青蒿素可改变线粒体的膜电位，使其在细胞周期的G0/G1期停滞，最终导致杜氏利什曼原虫前鞭毛体细胞死亡。       3解热、 抗炎作用青蒿及其衍生物对缓解热应激也有积极效果。研究结果显示，与处于热应激环境中相比，当饲粮中添加酶解青蒿后可以显著提高肉鸡对饲料中粗脂肪、粗蛋白和有机物的表观利用率，使肠道中酶活性增加，对缓解鸡热应激有积极的效果。在肉鸡饲粮中添加酶解青蒿可以缓解热应激引起的血液 pH 值升高、生产性能下降及血清中皮质酮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高，并且可以通过提高血清和肝脏抗氧化酶活性及调节相关mRNA 表达水平发挥增强抗氧化能力及缓解热应激的作用。有学者研究并比较了青蒿素和二氢青蒿素的抗炎作用及其分子机制：二氢青蒿素通过下调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达，抑制巨噬细胞释放炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和炎症介质 NO 而发挥抗炎活性；而青蒿素可能通过代谢为二氢青蒿素而发挥抗炎作用。研究发现青蒿素可通过调节核转录因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路来发挥抗炎作用。       4抗肿瘤作用目前普遍认为青蒿素类化合物能够发挥抗肿瘤作用的机制为：①抑制新生血管生成；②诱导细胞凋亡；③阻滞细胞周期；④Fe2+介导的细胞毒作用；⑤与致癌基因和抑癌基因相关；⑥作用于特殊靶蛋白；⑦对抗多药耐药。研究发现，青蒿素衍生物可在体外抑制宫颈癌 HeLa细胞的增殖并促进其凋亡，其作用机制分别与下调细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）蛋白磷酸化水平和上调p38 蛋白磷酸化水平有关。双氢青蒿素能抑制人胶质瘤 U251 细胞增殖的机制与其抑制 Wnt/β-catenin 通路，从而抑制上皮间质转换（EMT）进程有关。抑制胰 腺癌 JF-305 细胞增殖的作用机制可能与其升高 JF-305 细胞中活性氧（ROS）的水平引起的线粒体凋亡途径有关。青蒿琥酯诱导人胃癌 HGC27 细胞凋亡可能与抑制Wnt/β-catenin 信号通路活化有关。       5免疫调节作用研究结果表明，青蒿素及其衍生物不仅能够直接作用于T淋巴细胞，而且能显著抑制T 淋巴细胞丝裂原 ConA 诱导的小鼠脾 脏淋巴细胞的增殖。青蒿素的衍生物青蒿琥酯可通过降低大鼠脑水肿指数和血脑屏障通透性，阻碍内皮细胞紧密连接蛋白 Occludin 和 ZO-1 蛋白表达的下调，同时减轻蛛网膜下出血后模型大鼠早期脑组织损伤，提高神经功能。研究发现，青蒿素对实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）大鼠具有免疫调节作用，其机制与其通过直接或间接降低血清R97-116 抗体水平、抑制淋巴结单个核细胞分泌 γ干扰素（IFN-γ）和IL-17促炎性因子有关。青蒿素能明显抑制刀豆蛋白 A（ConA）诱导的 T 淋巴细胞增殖，减轻 IV 型或迟发型超敏反应（DTH）模型小鼠免疫器官的脏器指数，减轻耳肿胀度，推测青蒿素是通过下调机体细胞免疫应答发挥免疫抑制作用。此外，青蒿素及其衍生物对系统性红斑狼疮具有较好的疗效，研究发现双氢青蒿素通过上调DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达和下调 Gadd45a 表达，升高系统性红斑狼疮（SLE）小鼠 CD4+ T细胞基因组 DNA 甲基化水平，从而减少自身免疫抗体产生，进而发挥治疗 SLE 的作用。剂型虽然青蒿素类药物抗疟作用突出且具其他药理功能，但在临床上，青蒿素类药物大多存在溶解度差、生物利用度低、首过效应高、疟原虫复燃率高、给药频繁等问题，因此，青蒿素类药物的剂型研究成为当前热点。随着制药科技的发展，很多新技术运用到青蒿素及其衍生物的制剂中来，为青蒿素多方面的治疗作用提供了可能的途径，如纳米制剂、固体分散体、包合物、微乳、经皮给药制剂等。       1纳米制剂纳米给药系统为一系列粒径在纳米级的新型微小给药系统的统称，根据纳米颗粒分散运动状态及其性质的特殊性，纳米给药系统主要有纳米粒、脂质体、纳米乳、聚合物胶束、纳米混悬剂等。该系统具有良好的肿瘤靶向性，较长的体内循环时间，易被细胞摄取，可控制药物释放以及改善药物溶解度，增加药物稳定性等特点。①纳米乳 (nano emulsion) 是由表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相组成的一种稳定透明的胶体分散系统，其粒径在10～100 nm之间。有学者在研究用青蒿琥酯治疗牛、羊泰勒焦虫病及双芽焦虫病时，乳化剂选择聚山梨醇酯-80，助表面活性剂选择正丁醇，油酸乙酯为油相制备青蒿琥酯纳米乳注射剂。解决了青蒿琥酯在水中的溶解度不大、口服不能避免肝 脏的首过效应、市售青蒿琥酯钠盐放置不稳定、临床使用不方便的问题。②纳米粒（nanopartilcles，NP）由天然或合成高分子材料制成，是一种粒径介于1～100nm固态胶体粒子，包括纳米球（Nanospheres）和纳米囊（Nanocapsules）。活性组分（药物、生物活性材料等）溶解、包裹于粒子内部，或者吸附、附着于粒子表面。利用改良自乳化/溶剂扩散法将青蒿琥酯制成适用于人体可生物降解的纳米粒，并将肿瘤细胞表面特异性的可识别配体 Tf 结合在载药纳米载体上，实现对肿瘤组织（细胞）的靶向治疗，动物体内实验表明该新型纳米制剂具有血液及骨髓的靶向性。采用初生态微晶法制备了载有蒿甲醚的纳米胶囊，能解决蒿甲醚不溶于水、代谢快及利用率低的缺点，可显著提高药效。③纳米脂质体。纳米结构脂质载体 (nanostructured lipid carrier，NLC) 是以一定比例的液态油或其他不同的脂质 (如卵磷脂、甘油三酯等 )为载体，将药物包裹于类脂核中的固态胶体给药体系，粒径在50～1000nm之间的一种新型纳米给药系统。有学者采用动物肿瘤膜型研究双氢青蒿素纳米脂质载体与双氢青蒿素混悬液对肝癌瘤株的抑制作用，证实双氢青蒿素纳米脂质载体较普通混悬液对白血病细胞 K562及胶质瘤细胞U87具有更强的增殖抑制作用，为开发高效低毒的双氢青蒿素抗癌药物提供依据。利用青蒿琥酯纳米脂质体干预血管内皮 生长因子 (VEGF) 及血管内皮 细胞生长因子受体2(VEGFR2) 在HepG2 中的表达，证明青蒿琥酯纳米脂质体能够抑制肿瘤血管的生成达到抗肿瘤作用，且作用强于青蒿琥酯原料药，有应用于肝癌治疗的潜在价值。       2固体分散体固体分散体是指药物高度分散在适宜的载体材料中类似于液体系统形成的一种固态物质。固体分散体使得药物以无定型太、微晶态、分子分散态或胶体分散态存在，分散度很大，当与胃肠中液体接触后，溶出速度加快，药物的吸收加快，生物利用度提高。根据载体性质的不同和释药特点的不同，固体分散体又分为速释型固体分散体、缓控释型固体分散体和肠溶型固体分散体。①速释型固体分散体是利用亲水性载体材料制备的固体分散体。药物在载体材料中高度分散，由于载体材料的亲水性，药物具有良好的润湿性，使药物达到快速释放，提高了药物的溶解度、加快药物溶出速率，提高了药物的生物利用度。这对于难溶性药物而言，是解决溶出问题非常好的方案，例如有学者将低水溶性药物双氢青蒿素用聚乙烯吡咯烷酮作为载体制备成固体分散体，用X射线衍射（XRD）和差示扫描热量法（DSC）进行了对比检测，发现双氢青蒿素以非晶体复合体存在，并且溶解度比原料药增加了50倍，生物活性明显提高。②缓控释型固体分散体是以水不溶性或脂溶性载体制备的固体分散体。这种体系可以看作是溶解扩散体系。③肠溶型固体分散体是利用肠溶性载体制成便于肠道释放的固体分散体，由于载体材料溶解的特殊pH 条件，使得结肠靶向释药型固体分散体可在胃和小肠不释放或较少释放，到达结肠才快速释药。       3环糊精包合物环糊精包合物是将药物分子作为砌块进入环糊精超分子体系，构建出的有复杂结构和特殊功能的组装体，从而使难溶性药物被环糊精包合后，增强在水中的溶解度和稳定性，从而改善药物的生物利用度。采用蒸发沉淀法分别制得了青蒿素纳米粒以及青蒿素 β-环糊精包合物，两者均能显著提高青蒿素的溶解度以及溶出速率。有学者合成青蒿琥酯-环糊精的键接前药，采用MTT法进行细胞活性测定，证明该系列新化合物具有良好的抗结直肠癌活性，且具有一定靶向性。       4经皮给药制剂经皮给药制剂是指将药物制备成经皮肤给药的制剂，目前有软膏剂和压敏胶贴片两种。这种制剂能使药物迅速穿透皮肤，进入血液循环而起全身治疗作用，避免了肝脏的"首过效应"和胃肠道的破坏。有学者制备了蒿甲醚可溶解微针透皮贴片，与肌内注射相比，生物利用度相近的情况下，血药浓度更加平稳，开发出具有缓释效果的抗疟新剂型。       参考资料：       [1]李海波,秦大鹏,葛雯,王振中,曹亮,肖伟,于洋,姚新生.青蒿化学成分及药理作用研究进展[J].中草药,2019,50(14):3461-3470.       [2]张文飞,管武太,陈芳,张世海,邓跃林,史合群,许国焕.青蒿素及其衍生物在畜禽生产中的应用研究进展[J].饲料工业,2019,40(15):22-27.DOI:10.13302/j.cnki.fi.2019.15.004.      [3]李文婷,张国丽,张锐武,段国蕾,杨兆祥.青蒿素类药物新剂型研究进展[J].农村经济与科技,2019,30(12):299-300.       作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。【企业推荐】智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~