MED24

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程蛋白激酶催化位点的高度保守性使得识别具有选择性的ATP竞争抑制剂成为一项具有挑战性的任务。在黏附激酶（FAK）的开发过程中，偶然发现了一类分子，它们虽然对FAK没有活性，但显示出抑制丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1-3（SRPK1-3）的活性和选择性。选择性的关键在于这类分子与SRPK家族中独特的非保守铰链区域进行相互作用。通过基于结构的药物化学研究，成功获得了一种SRPK抑制剂MSC-1186。该分子在纳摩尔水平表现出活性，并具有良好的选择性。与CLK抑制剂联用能够加速SR蛋白的磷酸化的降低。本文对MSC-1186的设计策略和优化路线进行了详细梳理，为类似项目的结构优化提供了宝贵的经验。图1. MSC-1186的优化过程自2001年FDA批准首个激酶抑制剂伊马替尼（imatinib，图2）以来，蛋白激酶已成为主要药物靶点。蛋白激酶通过将ATP的γ-磷酸转移到底物蛋白的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸上，从而调节细胞功能。研究针对蛋白激酶的关键致癌因素，如点突变激活、基因融合和脂质激酶扩增，并以此为基础开发特异性激酶抑制剂。已有70多个激酶药物在临床上获批，但很多药物由于缺乏选择性，因此限制剂量以及无法达到预期的靶向效果。使用非选择性激酶抑制剂来阐明特定激酶的生物学作用，往往会产生相互矛盾的结果和不明确的结论。因此，开发选择性的激酶抑制剂是临床前候选药物研发时面临的关键挑战。图2. 代表性的激酶抑制剂黏附激酶（FAK）属于非受体酪氨酸激酶家族，与癌细胞的生长、侵袭和转移密切相关。目前已有6个FAK激酶抑制剂进入了临床I/Ib期研究。PF-431396，defactinib以及其7-氮杂吲哚衍生物（图2）等FAK抑制剂，都存在选择性不足的问题。与FAK相比，丝氨酸-精氨酸蛋白激酶（SRPK）在癌症中的作用尚未完全明确。有研究表明SRPK在关键蛋白（如MYB、BRD4和MED24）剪接中起着重要作用，也参与调控VEGF。由于缺乏有效且具有选择性的SRPK抑制剂，因此对SRPKs在癌症剪接中的作用进行评估难度较大。已有几种可逆的SRPK抑制剂，如SRPIN340和SPHINX31（图3），但对CDK、MAPK、GSK和CLK等激酶家族也具有活性。SRPKIN-1（图3）因与SRPK蛋白的酪氨酸发生共价结合，增强了选择性。图3. SRPK抑制剂的化学结构近日，默克公司在JMC上发表了有关选择性SRPK抑制剂的研究。研究人员通过一类单齿FAK结构片段，成功将其转化为苯并咪唑-嘧啶骨架。这种骨架结构包含了“双受体铰链结合片段”，为高活性、激酶选择性和可逆的SRPK抑制剂奠定了基础。设计和优化过程总结如下：Hit发现氨基嘧啶结构是一种常见的与激酶铰链结合的片段，能够形成供体-受体-供体类型的相互作用。由于DFG序列前端存在较大的疏水残基，因此针对狭窄的后口袋区域进行结构设计，能够实现选择性，如p38抑制剂Skepinone-L（图2），就是利用铰链区域内独特的甘氨酸翻转来获得的选择性。MET抑制剂CLK-T3（图2）与蛋白形成单齿铰链型键合作用，是高选择性的关键。减少与铰链区的相互作用，同时与非铰链区的其他保守区域结合，已成为抑制剂研发的重要关注点。为了寻找FAK抑制剂，研究人员对片段库进行筛选。发现片段1与蛋白形成了单齿铰链结合，KD值为95μM，配体效率为0.46。图4A的X射线晶体结构显示吡啶上的N原子与Cys502形成氢键作用。此外，吡啶上2-CH与Cys502上O原子之间形成了非经典氢键作用。通过将片段1与7-氮杂吲哚类化合物2进行叠合，设计了N转移到四氮唑邻位的片段3（图4B）。图4.（A）片段1与FAK蛋白的晶体结构；（B）片段3结构的由来选用转染FAK质粒的HEK293T活性，进行生物活性测试。片段1和3的EC50分别为301μM和253μM。2-吡啶-苯并咪唑片段4的EC50为103 μM（图5）。将defactinib中与DFG-loop作用的结构引入到4上，得到5a，但活性基本丧失。将化合物5a对100个激酶进行活性筛选，发现对SRPK1和SRPK2的IC50为448nM和7.79μM。因此，对5a进一步进行结构修饰。图5. 片段4和5a的化学结构SAR研究对咪唑环上的取代基进行构效关系研究（表1），结果显示：（1）吸电子基团时，如氟原子（5c）取代SRPK1活性提高，氰基（5b）也可耐受；（2）给电子基团时，如R6位置为甲基（5d），R5位置为甲氧基（5f）没有优化SRPK1的活性；（3）R5位置为卤素（5g-5i）时，活性明显提高，且5i对两种激酶都显示出显著的效力（SRPK1 IC50=32nM和SRPK2 IC50= 672nM）。（4）基于5i的结构分析（下述），进一步设计衍生物（5j-5m）。R4为F原子（5m）时，获得活性最强的SRPK1/2抑制剂；（5）R5位置引入水溶性片段，如吗啉（5n），N-甲基哌嗪（5o）和N-甲基吡唑（5p）时，SRPK1活性耐受，但SRPK2活性降低。5i与SRPK1和SRPK1的结晶结构显示（图6），5i与经典嘧啶N-原子受体和非经典CH供体氢键朝向铰链区的ATP位点取向相同（SRPK1：Leu168和Glu166；SRPK2：Leu180和Glu178）；SRPK1（SRPK2）铰链区的甘氨酸残基Gly169（Gly181）上的NH原子发生翻转后，与咪唑上N原子形成氢键；但Leu168-Gly169酰胺骨架构象与其他抑制剂结合时不同（图7）。图6.（A）5i与 SRPK1的晶体结构（PDB：7ZKS）；（B）5i与 SRPK1的晶体结构Cl和F原子与SRPK1（SRPK2）的His170（His182）、Tyr227（Tyr239）和Leu231（Met243）形成范德华作用（图6）。吡啶环的N原子通过水的介导，与Glu217（SRPK1）和Glu229（SRPK2）形成氢键作用。磺酰胺的O原子不仅与苯并咪唑上的N原子存在分子内氢键，而且通过水分子的介导，与SRPK1（SRPK2）的His171（His183）和Gly169（Gly181）形成氢键。图7.（A）5i与其他抑制剂的蛋白晶体的Leu168和Gly169残基的叠合依据以上的构效关系研究，获得最有效的SRPK1/2衍生物5m。浓度为1μM时，在395面板上测试了5m的激酶选择性（图8）。结果显示5m对SRPK亚型1、2和3的效应水平A>85%，IC50分别为2.7nM、81nM和0.6nM。对其他激酶A<50%。图8. 5m对395个激酶的选择性5m与SRPK1晶体结构表明，其结合模式与5i相同（图9）。R4位置的F原子插入到Val223和Val167形成的疏水区域，并于Val167和Gly168形成范德华作用。图9.（A）5m与SRPK1的共晶结构；（B）显示蛋白结合表面以5h为进一步改造的起始分子（表2）。结果显示：（1）苯并咪唑NH被甲基化（化合物6），进而不能与分子内的磺酰胺形成分子内氢键，导致SRPK1活性损失2倍，但SRPK2活性与5h相似；（2）连接的NH被甲基化（化合物7），活性未发生变化；（3）将嘧啶上的一个N原子变为CH（8），与5h相比，化合物8对SRPK1的效力高出2倍，对SRPK2的效力更高，说明嘧啶的氢键不如预期的重要；（5）将苯并咪唑变为吲哚结构（9），失去SRPKs活性。构象分析发现化合物9的吲哚3位CH原子位于铰链区，此时丧失了与Leu168的氢键作用。从结构分析（图6和图9）看出，SRPK1（SRPK2）中的Phe165（Phe177）、Val145（Val157）和Ala496（Ala540）形成了一个亲脂性的口袋。基于此，对5h进一步进行修饰（表3），结果显示：（1）在嘧啶（化合物10）上引入溴原子，SRPK1活性增强2倍，而SRPK2活性没有受到影响；（2）将化合物5h的NH与嘧啶环进行环合（化合物11），降低旋转自由度，活性提高；（3）在化合物11上引入甲基（化合物12），使其深入到口袋中，但活性并未提高；（4）将化合物11的嘧啶环变为吡啶（化合物13），增强了亲脂性（logP>5），SRPK1活性降低，但SRPK2活性增强。理化性质及细胞活性细胞活性化合物5m活性最强，被命名为MSC-1186，化合物9用于阴性对照，命名为MSC-5360。采用SRPK活细胞结合检测实验（NanoBRET target engagement assays），测试MSC-1186对SRPK1和SRPK3细胞的活性，测定的EC50分别为98nM和40nM（图10）。由于SRPK1的NanoBRET实验未建成功，因此在裂解细胞中进行了检测，MSC-1186的EC50为149nM。采用ITC实验，测定SPRK2的KD为145nM。对135种激酶测试选择性。5μM的MSC-1186仅对MAPK14的活性降低了36%，对其他测试的激酶没有显著影响。图10.（A）MSC-1186对三种SRPK亚型的活性；（B）NanoBRET实验检测MSC-1186对135种激酶的选择性理化性质MSC-1186具有较低的溶解性，易被肝微粒体代谢（表4），因此不适合开展动物研究，但目前没有更好选择性的工具分子报道。与其他SRPK激酶抑制剂活性比较（表5）SRPIN340具有较好的选择性，但活性明显弱于MSC-1186。SPHINX31对SRPK1最有效，对SRPK2和SRPK3的作用较弱，并抑制CLK和DYRK等家族蛋白。SRPKIN-1活性高效、但选择性低。细胞功能特征为进一步验证MSC-1186的作用模式，研究人员分析了细胞中磷酸化pRSF4（pSRSF4）水平（图11）。SRPK抑制剂MSC-118和SRPIN340活性很弱。但与CLK激酶抑制剂T-025联用时，相较于单药使用T-025，活性显著增强。图11. MSC-1186，MSC-5360和SRPIN340及与CLK抑制剂T-025联用时对pSRSF4水平的影响为了进一步研究SRPK和CLK的协同效应，研究人员考察了化合物对高表达泛磷酸化SR蛋白（pan-phosphor-SR-protein，pSR）的HCT116细胞内SR水平和位置的影响（图12）。低磷酸化的SR蛋白主要分布在核斑点（nuclear speckle），而磷酸化的SR蛋白更均匀分布在核（nuclei）。MSC-1186和pan-CLK探针的阴性对照（CLK-T3）联用，未改变pSR水平或亚核定位活性。活性pan-CLK探针（CLKT3）与SRPK阴性分子MSC-5360以剂量依赖的方式降低了pSR水平，并改变了pSR信号在细胞核中的分布（图12C）。pSRSF4实验的结果相似，MSC-1186与CLK抑制剂CLKT3联合使用会导致pSR水平下降（图12D），且联合使用进一步促进pSR聚集。这些结果表明，SRPK/CLK抑制剂联合使用不仅抑制SRSF4的磷酸化，还影响SR蛋白的磷酸化和定位。图12. MSC-1186单独或联合CLK抑制剂对pSR水平和亚细胞定位的影响结论优化FAK活性时，偶然发现片段1具有SRPK活性。首先进行吡啶异构化（1→3），然后四氮唑转化为苯并咪唑（4），将4与defactinib的磺胺基团骈合，获得具有SRPK选择性的分子5a，SAR优化最终得到了高效及高选择性的SRPK抑制剂MSC-1186。开展了选择性SRPK和CLK抑制剂联用对剪接调控的研究，提供了药物联用的优势选择。MSC-1186已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01705请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就SRPK1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“SRPK”，选中关联“SRPK1（Homo sapiens）”搜索SRPK1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于SRPK1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类”的形式展示。3.在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到SRPK1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

该研究发现，脂肪组织Cdo1受到寒冷诱导上调，能够通过PPARγ/Med24/lipolysis信号通路，转录激活脂解基因ATGL和HSL的表达，从而增加小鼠脂肪组织脂解、寒冷耐受能力和能量消耗 脂肪组织分为三种类型，其中白色脂肪负责储存能量，棕色和米色脂肪可以将营养物质代谢产生的能量以热能的形式释放，用于维持体温。诱导棕色脂肪和米色脂肪的激活，可以增加机体能量消耗，是抵抗肥胖的有效策略。 在寒冷条件下，机体激活脂肪组织的脂肪分解（脂解）过程，分解甘油三酯产生甘油和游离脂肪酸，为整个适应性产热过程提供能量代谢的底物。一些游离脂肪酸还能作为配体，激活PPARα等核受体的功能，进而促进产热相关基因、脂肪酸氧化基因的表达，激活米色脂肪和棕色脂肪功能。ATGL（由Pnpla2编码）是催化甘油三酯分解第一步反应的限速酶。脂肪组织特异性敲除ATGL的小鼠更容易发生肥胖，寒冷耐受能力严重受损，同时伴随棕色脂肪的白色样改变。 HSL（由Lipe编码）负责催化甘油三酯分解的第二步反应。增加小鼠脂肪组织HSL的活性抑制了高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗以及肝脏脂肪变性。这说明脂肪组织脂解在调控机体适应性产热、能量代谢及影响肥胖发生发展中发挥重要作用。转录因子PPARγ可以促进ATGL和HSL的表达从而促进脂解，然而其具体调控机制尚未完全阐明。 2022年10月17日，复旦大学汤其群团队和上海体育学院郭亮团队在 Nature Metabolism 期刊合作发表了题为：Cdo1 promotes PPARγ-mediated adipose tissue lipolysis in male mice 的研究论文。 该研究发现，脂肪组织Cdo1受到寒冷诱导上调，能够通过PPARγ/Med24/lipolysis信号通路，转录激活脂解基因ATGL和HSL的表达，从而增加小鼠脂肪组织脂解、寒冷耐受能力和能量消耗，进一步抵抗小鼠肥胖及代谢紊乱。 研究团队为了深入研究米色/棕色脂肪激活的分子机制，分离了4℃冷暴露24小时和室温饲养小鼠的皮下脂肪组织以及分化成熟的棕色脂肪细胞（分化第6天）和前棕色脂肪细胞（-2天），进行RNA-seq检测。从中筛选鉴定出候选效应分子半胱氨酸双加氧酶1（Cysteine Dioxygenase 1，Cdo1）。 与室温组小鼠/前棕色脂肪细胞组相比，小鼠冷暴露24小时皮下脂肪组织/成熟棕色脂肪细胞中Cdo1表达显著增加。进一步的研究还发现，Cdo1主要在脂肪组织的成熟脂肪细胞中表达；饥饿同样能够促进脂肪组织Cdo1表达的上调；高脂肪饮食（HFD）诱导小鼠肥胖后则导致脂肪组织Cdo1表达的下降。 前人研究表明，Cdo1在小鼠脂肪组织、肝脏等器官存在较高水平的表达。Cdo1的全身性敲除小鼠出生后出现一定比例的死亡，存活下来的小鼠会表现为发育不良、骨骼弯曲、生长迟缓，这说明Cdo1对于机体的生长发育及正常生命活动十分重要。在3T3-L1脂肪细胞中，转录因子PPARγ和C/EBPα可以结合到Cdo1启动子上。这一研究提示Cdo1在脂肪组织中可能发挥着重要的功能。 Cdo1是生物体自身合成牛磺酸的关键酶。研究团队前期采用药理学手段，腹腔注射Cdo1代谢终末产物牛磺酸，发现牛磺酸可以促进小鼠脂肪组织棕色化进而抵抗肥胖，该研究工作于2019年发表在 Journal of Biological Chemistry 杂志。然而在生理条件下，Cdo1在脂肪组织发挥的具体作用及其分子机制有待深入研究。 在这项研究中，研究人员采用雄性的脂肪组织特异性敲除 Cdo1小鼠（Cdo1AKO）以及脂肪组织特异性Cdo1转基因（Cdo1TG）小鼠，对上述问题进行了深入的研究。 Cdo1催化的氨基酸代谢路径 研究人员发现，Cdo1AKO小鼠能量消耗降低，对寒冷刺激不耐受，脂肪组织脂解能力显著降低，棕色脂肪组织游离脂肪酸含量下降，更容易发生高脂饲料诱导的肥胖及肥胖相关的代谢紊乱（胰岛素抵抗、血脂异常、脂肪肝等）。RNA-seq显示，Cdo1AKO小鼠皮下脂肪组织脂解信号通路相关基因下调最为明显。然而Cdo1AKO小鼠脂肪组织牛磺酸没有明显变化，这可能是由于机体代偿性从血液循环中摄取更多的牛磺酸所致。 研究团队发现Cdo1在成熟脂肪细胞核存在定位，并且Forskolin、CL316,243介导的肾上素能信号通路能够促进Cdo1的核定位。进一步研究发现Cdo1能够通过和PPARγ及Med24相互作用，促进Med24招募到脂解基因ATGL和HSL的启动子上，从而转录激活上述脂解基因的表达。Med24是Mediator Complex核心亚基之一。Mediator Complex可以促进转录前起始复合物（Preinitiation complex，PIC）的形成进而促进基因的转录。 有趣的是，Cdo1酶活性缺失的突变体（Y157F）能够和野生型Cdo1一样促进Med24招募到脂解基因的启动子上并转录激活脂解基因。因此Cdo1调控脂解基因表达的功能可能不依赖于其氨基酸代谢酶的活性。此外， Cdo1TG促进雄性小鼠脂肪组织脂解，增加能量消耗及寒冷耐受能力，并抵抗高脂饲料诱导的肥胖及胰岛素抵抗等相关代谢紊乱。 该研究揭示了脂肪组织Cdo1在适应性产热及维持能量代谢稳态中的重要作用，发现了Cdo1/PPARγ/Med24/Lipolysis的转录调节新路径，阐明了氨基酸代谢酶Cdo1调控脂肪代谢的新功能和新机制，为预防和治疗肥胖提供了新的思路和潜在干预靶点。 Cdo1调控脂解的模式图（图片已获BioRender授权） 复旦大学基础医学院2019级博士研究生郭盈盈为论文第一作者。复旦大学基础医学院汤其群教授和上海体育学院运动健康学院郭亮教授为共同通讯作者。